Spektroskopische Studien zur Untersuchung von Protein-Ligand-Bindungswechselwirkungen und Proteindynamik an der Dengue-Virus NS2B-NS3-Protease

Abstract

Um zur Entwicklung wirksamer Inhibitoren der NS2B-NS3-Protease des Dengue-Virus (DENV-PR) beizutragen, wurden unterschiedliche fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen durchgeführt. Zunächst wurden die Bindungswechselwirkungen zwischen der DENV-PR und allosterischen Inhibitoren untersucht. Hierzu wurde ensemblespektroskopisch untersucht, ob die Ligandenbindung Änderungen der photophysikalischen Parameter einer an das Enzym gebundenen Farbstoffsonde hervorruft. Hierbei konnten spektroskopische Parameter, welche sensitiv auf die Ligandenzugabe reagierten, identifiziert werden. Diese Änderungen waren auf Einzelmolekülebene nicht nachweisbar, sodass die Bindungskinetik nicht quantifiziert werden konnte. Chase Experimente ergaben, dass die Bindungswechselwirkungen reversibel sind. Alternativ hierzu wurden farbstoffmarkierte allosterische Inhibitoren gegen die Wildtyp-PR titriert und die entsprechenden Bindungswechselwirkungen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie visualisiert. Da festgestellt wurde, dass die hierbei beobachteten Interaktionen unspezifisch waren, wurde dieser Ansatz nicht weiterverfolgt. Schließlich wurde die Proteindynamik der DENV-PR untersucht. Mithilfe von Einzelmolekül-FRET-Messungen (smFRET) in Lösung konnte ein Konformationsgleichgewicht, welches durch die Zugabe eines kompetitiven Inhibitors in Richtung der geschlossenen Konformation verschoben wurde, beobachtet werden. Demgegenüber scheint die Zugabe eines allosterischen Inhibitors den offenen Zustand zu begünstigen. smFRET-Messungen an immobilisierten Molekülen erlaubten die Quantifizierung der Proteindynamik. So wechselt das Enzym ca. 3,7-mal pro Sekunde von der geschlossenen in die offene Konformation, wohingegen der entgegengesetzte Übergang ca. 2,7-mal pro Sekunde stattfindet. Folglich verweilt die PR zu ca. 60 % im offenen Zustand.

Various fluorescence spectroscopic investigations were conducted to aid the development of effective inhibitors for the NS2B-NS3 protease of the dengue virus (DENV-PR).

Initially binding interactions between DENV-PR and allosteric inhibitors were examined. Using fluorescence spectroscopic ensemble measurements, it was tested whether ligand binding causes changes in the photophysical parameters of a dye bound to the enzyme. Indeed, spectroscopic parameters that were sensitive to ligand binding were identified. Since these alterations were not observable at single-molecule level, binding kinetics could not be quantified. Chase experiments demonstrated reversibility of the binding interactions.

Alternatively, dye-labelled allosteric inhibitors were titrated against wild type PR using fluorescence correlation spectroscopy to monitor binding interactions. However, this approach was not pursued further as the interactions observed were unspecific.

Single-molecule FRET (smFRET) measurements in solution revealed the presence of a conformational equilibrium of DENV-PR. Competitive inhibitors shifted the equilibrium towards the closed conformation, while allosteric inhibitors seemed favoring the open state.

smFRET measurements on immobilized molecules allowed quantification of protein dynamics, showing the enzyme switches from closed to open conformation approximately 3.7 times per second, whereas the reverse transition occurs 2.7 times per second. Accordingly, PR adopts the open state with a probability of approx. 60 %.