Bedeutung des β2-Integrins αMβ2 für die Differenzierung myeloider Zellen und für Neutrophilenfunktionen im Aspergillose-Mausmodell

Abstract

Beta2-Integrine sind Leukozyten-spezifische Adhäsionsmoleküle, die aus einer Beta-Kette (CD18) und einer von vier Alpha-Ketten (CD11a, CD11b, CD11c, CD11d) bestehen – LFA-1, Mac-1, p150,95 und CD11d/CD18. Diese Heterodimere sind von entscheidender Bedeutung für die effiziente Bindung von Zellen an die extrazelluläre Matrix und für die Zelloberflächen-Signalübertragung. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung, Aktivierung, Polarisierung und funktionellen Aktivität von Leukozyten. Daher führt eine beeinträchtigte Aktivität der β2-Integrine zu einer gestörten Immunantwort. Das Adhäsionsmolekül Mac-1 wird von Makrophagen, aktivierten Lymphozyten und lymphoiden natürlichen Killerzellen sowie von Granulozyten, Monozyten, einschließlich konventioneller DCs vom Typ 2, exprimiert und scheint das vielseitigste Beta2-Integrin zu sein. Die ersten in der Literatur beschriebenen Entdeckungen zur Bedeutung von Mac-1 betreffen verschiedene Funktionen von Leukozyten, einschließlich dem Rollen, der festen Adhäsion und der Transmigration in entzündetes Gewebe. CD11b/CD18 ist auch für immunologische Prozesse wie die neutrophile Phagozytose und die ROS-Produktion wichtig. Angesichts der großen Zahl potenzieller Liganden von Mac-1 ist davon auszugehen, dass viele seiner Funktionen noch unbekannt sind und sind daher Gegenstand laufender Studien. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von Mac-1 auf dendritischen Zellen (DC) für deren T-Zell-Aktivierungseigenschaften analysiert. Die Phänotypisierung von DC auf der Grundlage von CD11c und der Oberflächenexpression der Aktivierungsmarker MHCII und CD86 ergab keine signifikanten Genotyp-bedingten Unterschiede. Das Fehlen von Mac-1 auf der DC-Zelloberfläche schränkte jedoch die T-Zell-stimulierende Kapazität von DC aus Milz und frisch isoliertem Knochenmark ein. Das konzipierte die Frage nach einer direkten Beteiligung von Mac-1 an der DC-T-Zell-Signalübertragung auf und veranlasste zu Überlegungen über die Bedeutung von Mac-1 im DC-Bildungs- und Reifungsprozess. Diese Studie unterstreicht auch die Bedeutung von Mac-1 für die GM-CSF-getriebene Differenzierung der hämatopoetischen Zellen in BMDC. In Abwesenheit von Mac-1 wurde die Differenzierung von BMDCs unter GM-CSF-Behandlung verlangsamt und die Ausbreitung von Granulozyten in der Kultur wurde begünstigt. Diese Ergebnisse deuten auf Mac-1-Mangel-bedingte Veränderungen in der GM-CSF-gesteuerten Hämatopoese hin. Die Analyse der T-Zell-Stimulationskapazität von BMDC zeigte jedoch überraschenderweise, dass die Fähigkeit der CD11b−/−-BMDC-Kultur, CD8+ T-Zellen zu stimulieren, nicht beeinträchtigt ist. Dies kann zu dem Schluss führen, dass Mac-1 für die DC-Differenzierung in vivo wichtiger als in vitro ist. Die LPS-Stimulation erhöhte leicht die T-Zell-Aktivierungseigenschaften der BMDC-Kulturen unabhängig vom Genotyp. Die spektrophotometrische Analyse zeigte jedoch starke Unterschiede in der zellulären Zusammensetzung von CD11b−/−- im Vergleich zu WT-BMDC. So enthielten LPS-stimulierte CD11b−/−-BMDC-Kulturen im Vergleich zu WT-Kulturen einen deutlich geringeren Anteil an DCs, aber DC-PMN-Hybride entstanden in hohem Maße. Die Zellphänotypisierung der LPS-stimulierten BMDC zeigte eine veränderte TLR-Liganden-Signalübertragung in CD11b−/−-BMDC. Es stellte sich die Frage nach der Beteiligung von Mac-1 an der PMN-T-Zell-Signalübertragung. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von Krankheitserregern die CD8+ T-Zell-stimulierenden Eigenschaften der PMN von Mac-1 abhängen, da CD11b−/−-PMNs keine CD8+ T-Zell-stimulierende Fähigkeit ausüben, während WT PMNs im Vergleich zu WT BMDCs eine mittlere Fähigkeit aufweisen. Die Behandlung von WT-PMN mit Mac-1-Liganden beeinträchtigte ihre CD8+ T-Zell-stimulierende Aktivität. Die Hemmung der CD8+ T-Zell-Proliferationskapazität von WT-PMN durch Fibrinogen, Thrombospondin und Vitronectin konnte durch LPS-Stimulation wiederhergestellt werden. Die TLR4-Induktion vermittelte die Umwandlung von CD11b−/−-PMN in DC-PMN-Hybride, die dadurch APC-Fähigkeit erlangen und die Proliferation von CD8+ T-Zellen in ähnlichem Maße wie die WT-PMN und die WT-BMDC induzieren. Darüber hinaus wurde die Rolle von Mac-1 für die funktionellen Eigenschaften von Maus-PMNs bei invasiver Aspergillose in vivo untersucht, die eine primäre Immunantwort gegen Aspergillus fumigatus ausüben. Eine gestörte β2-Integrin-Aktivität ist als Ursache für ein Immunschwächesyndrom bekannt, das als Leukozytenadhäsionsmangel Typ 1 (LAD-1) bezeichnet wird. LAD-1-Patienten, die an einer Dysfunktion der β2-Integrine (LFA-1, Mac-1, CD11c/CD18 und CD11d/CD18) aufgrund der Beeinträchtigung ihrer gemeinsamen β-Untereinheit CD18 leiden, sind häufig mit wiederkehrenden Lungeninfektionen wie Aspergillose konfrontiert. Es ist jedoch wenig darüber bekannt, inwieweit Mac-1 für eine wirksame Abwehr von Aspergillus fumigatus erforderlich ist. In dieser Studie wurde eine signifikante Erhöhung des Infektionsniveaus bei CD11b−/− Mäusen und eine wesentliche Bedeutung von Mac-1 für die zytotoxischen Funktionen der PMN gegen Aspergillus fumigatus nachgewiesen. Darüber hinaus wird in dieser Studie berichtet, dass bei CD11b−/−-Mäusen die Migration von CD11b−/− PMNs in die Lunge während einer Aspergillus fumigatus-Infektion nicht verlangsamt ist, sondern eine erhöhte Lungeninfiltration von PMNs auftritt. Die Phagozytose von A. fumigatus Konidien durch PMN bei Mac-1-Mangel war ebenfalls beeinträchtigt, was den signifikanten Anstieg des Infektionsgrades trotz einer erhöhten Lungen-PMN-Infiltration bei CD11b−/−-Mäusen erklären könnte. Letzteres könnte ein kompensatorischer Effekt sein. Interessanterweise waren CD11b−/−-PMNs in der BAL durch eine mäßige Expression des Maus-DC-Markers CD11c gekennzeichnet, was darauf hindeutet, dass die Bildung von DC-PMN-Hybriden nicht nur durch das LPS sondern auch durch andere mikrobielle Komponenten ausgelöst werden kann.

Beta2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules formed from a beta chain (CD18) and one of four alpha chains (CD11a, CD11b, CD11c, CD11d) – LFA-1, Mac-1, p150,95 and CD11d/CD18. These heterodimers are crucial for efficient binding of cells to the extracellular matrix and in cell surface signalling. They play important roles in the differentiation, activation, polarization and functional activity of leukocytes. Therefore, impaired activity of β2 integrins leads to impaired immune responses. The adhesion molecule Mac-1 is expressed by macrophages, activated lymphocytes and lymphoid natural killer cells as well as granulocytes, monocytes, including conventional DCs type 2 and appears to be the most versatile beta2 integrin. The first observations on its functions described various functions, including rolling, tight adhesion, and transmigration of leucocytes into inflamed tissue. CD11b/CD18 is also essential for immunological processes such as neutrophil phagocytosis and ROS production as well as T cell activation. Given the large number of potential ligands of Mac-1, it is assumed that many of its functions are still unknown and are a subject of ongoing studies. In the present work, the importance of Mac-1 on dendritic cells (DC) for their T cell activation properties was analysed. DC phenotyping based on CD11c and activation markers MHCII and CD86 surface expression did not demonstrate significant genotype-related differences. However, the absence of Mac-1 on the DC cell surface limited the T cell stimulating capacity of spleen- and freshly isolated bone marrow DC. This raised the question of direct Mac-1 involvement in DC-T cell signalling and prompted consideration of the importance of Mac-1 in the DC formation and maturation process. This study highlights also the importance of Mac-1 for GM-CSF driven BMDC differentiation in CD11b−/− hematopoietic cells. In the absence of Mac-1, BMDC differentiation under GM-CSF treatment was slowed down and the expansion of granulocytes in the culture was favoured. These results indicate Mac-1 deficiency-related alterations in GM-CSF driven haematopoiesis. However, analysis of the T cell stimulation capacity of BMDC surprisingly showed unimpaired ability of CD11b−/− BMDC culture to stimulate CD8+ T cells. This could lead to the conclusion that Mac-1 is more important for DC differentiation in vivo than in vitro. LPS stimulation slightly increased the T cell activation properties of the BMDC cultures regardless of the genotype. Although spectrophotometric analysis showed strong differences in cellular composition of CD11b−/− compared with WT BMDC. In this regard, LPS-stimulated CD11b−/− BMDC cultures contained a significantly lower percentage of DCs compared to WT cultures, but DC-PMN-Hybrids emerged at a high level. Cell phenotyping of the LPS-stimulated BMDC demonstrated altered TLR ligand signalling in CD11b−/− BMDC. It soon conceived the question about Mac-1 involvement in PMN-T cell signalling. In the present work it was demonstrated that in the absence of pathogens, the CD8+ T cell stimulating properties of the PMN depended on Mac-1 since CD11b−/− PMNs did not exert CD8+ T cell stimulatory ability, with WT PMNs bearing an intermediate capacity compared to WT BMDCs. Treatment of WT PMN with Mac-1 ligands impaired their CD8+ T cell stimulatory activity. The inhibition of CD8+ T cell proliferation capacity of WT PMN by fibrinogen, thrombospondin and vitronectin could be restored with LPS stimulation. TLR4 induction mediated the conversion of CD11b−/− PMN into the DC-PMN-Hybrids, which thereby acquire APC ability and induce proliferation of CD8+ T cells to a similar extent as the WT PMN and the WT BMDC. Furthermore, the role of Mac-1 for the functional properties of mouse PMNs in invasive aspergillosis in vivo, which exert primary immune responses against Aspergillus fumigatus, was investigated. Dysfunctional β2 integrin activity is known o cause an immune deficiency syndrome called leukocyte adhesion deficiency type 1 (LAD-1). LAD-1 patients that suffer from dysfunction of β2 integrins (LFA-1, Mac-1, CD11c/CD18 and CD11d/CD18) due to the impairment of their common CD18 β subunit are often confronted with recurrent lung infections such as aspergillosis. However, little is known to what extent Mac-1 is required for effective Aspergillus fumigatus defense. This study demonstrated a significant increase in the level of infection in CD11b−/− mice and an essential relevance of Mac-1 in PMN cytotoxic functions against Aspergillus fumigatus. Further, this study reports that in case of CD11b−/− mice migration of CD11b−/− PMNs to the lungs was not slowed during Aspergillus fumigatus infection, but increased lung PMN infiltration was observed. Impaired phagocytosis of A. fumigatus conidia by PMN in case of MAC-1 deficiency was also demonstrated, which may explain the significant increase in the degree of infection despite an increased lung PMN infiltration in CD11b−/− mice. Actually, the latter may constitute a compensatory effect. Interestingly, CD11b−/− PMNs in the BAL were characterized by moderate expression of the mouse DC marker CD11c, suggesting that the formation of DC-PMN hybrids can be triggered not only by the LPS but also by other microbial components .