Analyse zellulärer Apoptose und DNA-Schäden im Tumor nach intravaskulärer Applikation von Zinkoxid-Nanopartikeln im CAM Assay
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Tumorerkrankungen zählen weltweit zu den häufigsten Todesursachen, und es besteht ein großer Bedarf, Tumortherapien effizienter, verträglicher und zielgerichteter zu machen. Zinkoxid Nanopartikel (ZnO-NP) könnten aufgrund ihrer besonderen physikalischen und chemischen Eigenschaften eine innovative Möglichkeit zur selektiven Tumortherapie darstellen. Im Rahmen dieses Promotionsvorhabens sollte daher ihre in vitro gezeigte toxische Wirkung auf Tumorzellen mit nachfolgender zellulärer Apoptose in einem in vivo Modell, dem CAM-Assay, verifiziert werden. Hierzu wurden in ovo humane Tumorzellen auf der extraembryonalen, reich vaskularisierten Chorionallantoismembran (CAM) zu einem Tumor herangezüchtet, der dann Anschluss an das Gefäßsystem des Hühnerembryos erlangte. Mittels Western Blot wurden dann das phosphorylierte Histon (γH2AX) als Hinweis auf DNA-Schäden und die Cleaved Caspase-9 (ClC-9) als Hinweis auf Apoptosen nach intravaskulärer Applikation von ZnO-NP im Tumor untersucht. Insgesamt wurden aus drei voneinander unabhängigen Durchgängen des CAM-Assays 56 Tumorlysate gewonnen, in denen die Proteinexpression von γH2AX und ClC-9 nach intravaskulärer Gabe von ZnO-NP oder sterilem destillierten Wasser (Aqua dest.) als Kontrolle untersucht wurde. Dabei spielte die Etablierung eines geeigneten Puffersystems zur Gewebelyse und nachgeschalteter Immundetektion eine wichtige Rolle. Zur Gewebelyse erwies sich der RIPA-Puffer v.a. aufgrund der schlechten Löslichkeit von γH2AX in RIPA-Puffer als unbrauchbar. Ein Einfach-Lysepuffer zeigte eine deutlich überlegene Löslichkeit für das γH2AX und reproduzierbare Ergebnisse in der Immundetektion von γH2AX und ClC 9. In allen untersuchten Tumorproben gelang der Nachweis des DNA Schadensmarkers γH2AX und des Apoptosemarkers ClC-9, jedoch ließen sich beim Vergleich zwischen der Applikation von sterilem Aqua dest. und der Gabe von 270 µg ZnO NP pro Ei keine signifikanten Unterschiede bezüglich der DNA Schäden oder der zellulären Apoptosen im Tumor nachweisen. Unter den gegebenen experimentellen Bedingungen ließen sich somit keine toxischen Effekte durch ZnO-NP in den Tumoren auf der CAM nachweisen. Die Ursachen für die Diskrepanz zwischen in vitro- und in vivo-Daten muss nun in nachfolgenden Untersuchungen aufgeklärt werden.