Beyond binding affinity – elucidating protease inhibition mechanisms from a biophysical perspective

Abstract

Proteases play essential roles in nature and are involved in protein maturation, digestion, forming extracellular matrices and their degradation, and immune escape. Inhibition of such proteases often represents a promising strategy to counter related diseases. Detailed knowledge beyond binding affinity is a prerequisite to developing more potent inhibitors. Characterizing the modes of action relies on biophysical techniques that can provide structural information on binding modes and determine binding kinetics or thermodynamics. Furthermore, they can trace conformational changes. In the course of this work, inhibitors for several disease-related proteases were characterized using a toolset of biophysical techniques. The target proteases were selected for investigation based on their distinct functions and catalysis mechanisms. In this regard, the flaviviral NS3 proteases feature an NS2B cofactor, can adopt at least two conformations, and are essential for polyprotein processing and maturation. Staphylococcus aureus sortase A is a transpeptidase that relies on a Ca2+ cofactor and is vital to forming extracellular matrices. The human matriptase displays a roughly symmetric substrate binding site and degrades extracellular matrices by activating matrix metalloproteases. Thereof, the following projects were derived: Project 1. Two strategies were examined to elucidate the mechanistic basis of entropic inhibitor optimization: The macrocyclization of Zika virus NS2B/NS3 protease inhibitors and the introduction of higher ligand symmetry of human matriptase inhibitors to enable multiple equivalent binding modes. The various opportunities to derive data from well-designed ITC experiments prompted us to develop a set of teaching experiments, demonstrating the versatility of ITC experiment execution and analysis. To guide medicinal scientists through ITC-assisted ligand development, we implemented the webserver ITCcalc. Project 2. The Dengue virus and Zika Virus NS2B/NS3 proteases display an allosteric binding site. Several biophysical methods, such as X-ray co-crystallization, MST, ITC, DSF, CD, EPR, fluorometric assays, smFRET, and 19F-NMR, were utilized to give in-depth information on conformational changes that are induced upon ligand binding.Project 3. During virus maturation, the NS2B/NS3 protease is autocatalytically cleaved at the NS2B/NS3 junction. To date, the biological significance of this highly conserved process is unknown. In this project, we investigated the mechanisms of this process to understand the regulatory functions of autocatalytic cleavage. To this end, we used fluorometric assays, CD, extensive site-directed mutagenesis, analytical SDS-PAGE, and protein MS. Project 4. Due to their antibacterial properties, metal ions are widely applied as additives in surface disinfectants, alloys of medicinal instruments, textiles, and wound dressings. SrtA constitutes an exciting anti-virulence target to counter antibiotic-resistant Staphylococcus aureus lineages. In this work, we found several metal cations to activate, inhibit, or modulate SrtA activity in FRET-based transpeptidase assays. Furthermore, their mode of action behind the activity modulation of SrtA was elucidated. Tb3+ FRET assays, ITC, DSF, MST, and X-ray crystallography were used for this purpose.

Proteasen spielen in der Natur viele wesentliche Rollen und sind an Proteinreifung, Verdauung, der Ausbildung extrazellulärer Matrices und deren Abbau sowie an der Immunflucht maßgeblich beteiligt. Die Hemmung solcher Proteasen stellt häufig eine vielversprechende Strategie zur Bekämpfung der damit verbundenen Krankheiten dar. Detaillierte Kenntnisse über die Bindungsaffinität hinaus sind eine Voraussetzung für die Entwicklung wirksamerer Inhibitoren. Die Charakterisierung der Wirkungsweisen beruht auf biophysikalischen Techniken, die strukturelle Informationen über die Bindungsmodi liefern und die Bindungskinetik oder -thermodynamik bestimmen können. Außerdem können sie Konformationsänderungen verfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Inhibitoren für mehrere krankheitsrelevante Proteasen mit Hilfe eines Instrumentariums biophysikalischer Techniken charakterisiert. Die Zielproteasen wurden auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Funktionen und Katalysemechanismen für die Untersuchung ausgewählt. Die flaviviralen NS3-Proteasen weisen einen NS2B-Kofaktor auf, können mindestens zwei Konformationen annehmen und sind für die Verarbeitung und Reifung von Polyproteinen unerlässlich. Die Sortase A von Staphylococcus aureus ist eine Transpeptidase, die auf einen Ca2+-Kofaktor angewiesen und für die Bildung extrazellulärer Matrices unerlässlich ist. Die menschliche Matriptase weist eine annähernd symmetrische Substratbindungsstelle auf und baut extrazelluläre Matrices durch Aktivierung von Matrixmetalloproteasen ab. Daraus wurden die folgenden Projekte abgeleitet: Projekt 1. Um die mechanistischen Grundlagen der entropischen Inhibitoroptimierung zu erhellen, wurden zwei Strategien untersucht: Die Makrozyklisierung von Zika-Virus NS2B/NS3- Proteaseinhibitoren und die Einführung höherer Ligandensymmetrie von humanen Matriptaseinhibitoren, um mehr äquivalente Bindemodi zu ermöglichen. Die vielfältigen Möglichkeiten, Daten aus gut konzipierten ITC-Experimenten zu gewinnen, haben uns veranlasst, eine Reihe von Lehrexperimenten zu entwickeln, die die Vielseitigkeit der Durchführung und Analyse von ITC-Experimenten demonstrieren. Um medizinische Wissenschaftler durch die ITCgestützte Ligandenentwicklung zu führen, haben wir den Webserver ITCcalc implementiert. Projekt 2. Die NS2B/NS3-Proteasen des Dengue- und Zika-Virus weisen eine allosterische Bindungsstelle auf. Verschiedene biophysikalische Methoden wie Röntgen-Co-Kristallisation, MST, ITC, DSF, CD, EPR, fluorometrische Assays, smFRET und 19F-NMR wurden eingesetzt, um detaillierte Informationen über die Konformationsänderungen zu erhalten, die durch die Ligandenbindung induziert werden.Projekt 3. Während der Virusreifung wird die NS2B/NS3-Protease autokatalytisch an der NS2B/NS3-Verbindung gespalten. Bis heute ist die biologische Bedeutung dieses hochkonservierten Prozesses unbekannt. In diesem Projekt haben wir die Mechanismen dieses Prozesses untersucht, um die regulatorischen Funktionen der autokatalytischen Spaltung zu verstehen. Zu diesem Zweck verwendeten wir fluorometrische Assays, CD, umfangreiche ortsgerichtete Mutagenese, analytische SDS-PAGE und Protein-MS. Projekt 4. Aufgrund ihrer antibakteriellen Eigenschaften werden Metallionen in großem Umfang als Zusatzstoffe in Oberflächendesinfektionsmitteln, Legierungen von medizinischen Instrumenten, Textilien und Wundverbänden eingesetzt. SrtA ist ein spannendes Anti-Virulenz- Target, um antibiotikaresistente Staphylococcus aureus-Stämme zu bekämpfen. In dieser Arbeit haben wir mehrere Metallkationen gefunden, die die Aktivität von SrtA in FRET-basierten Transpeptidase-Assays aktivieren, hemmen oder modulieren. Darüber hinaus wurde die Wirkungsweise hinter der Aktivitätsmodulation von SrtA aufgeklärt. Zu diesem Zweck wurden Tb3+-FRET-Tests, ITC, DSF, MST und Röntgenkristallographie eingesetzt.