Nanoscale libraries and novel drug modalities for targeting RNA methyltransferases

Abstract

In recent years, epitranscriptomics has emerged as a rapidly evolving field of significant relevance to biomedical research. The research primarily concerns the methylation of ribonucleic acid (RNA), a process catalyzed by RNA methyltransferases (Mtases). Members of this enzyme family have been implicated in a wide range of pathological conditions, including cancer, making them promising targets for medicinal chemistry. This dissertation focused on developing and applying innovative strategies to identify novel inhibitors of RNA Mtases. The results are divided into three distinct projects. Project 1: Direct-to-Biology (D2B). In the first project, the D2B strategy, originally described in 2021, was applied to two distinct subprojects. The first subproject aimed to identify fluorescent tracers suitable for high-throughput screening (HTS) of disease-associated RNA Mtases. Two novel fluorescent tracers were developed for a variety of RNA Mtases using a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) synthesis strategy. This approach enabled an HTS campaign against methyltransferase-like 1 (METTL1), resulting in the identification of (S)-crizotinib as a first-in-class inhibitor. In the second subproject, inhibitors of Staphylococcus aureus tRNA methyltransferase D (TrmD) were identified. The fluorescent tracer developed in the first subproject served as a starting point for a D2B-based strategy targeting S. aureus TrmD. A CuAAC-based D2B approach led to the discovery of five promising hit compounds. Moreover, a carbamate prodrug design was employed, yielding the first prodrug targeting TrmD, which effectively inhibited the growth of S. aureus. Lastly, the first crystal structure of S. aureus TrmD in complex with the active inhibitor was elucidated. Project 2: DNA-Encoded-Library (DEL) Screening. In the second project, DEL technology was employed to identify inhibitors of deoxyribonucleic acid (DNA) methyltransferase 2 (DNMT2) with novel chemotypes. This approach resulted in the identification of five selective DNMT2 binders, featuring triazin- and peptidomimetic-based core structures. Among these, only the peptidomimetic compounds demonstrated inhibitory activity, prompting subsequent X-ray crystallographic analysis. Structural characterization revealed an allosteric inhibition mechanism for the lead compound, which guided a structure-activity relationship (SAR) study conducted via solid-phase peptide synthesis. The optimized compound from this study exhibited not only enhanced binding affinity but also, as a distinguishing feature, permeability in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA). Follow-up cellular assays confirmed that the compound effectively reduced m5C levels in tRNA and exhibited synergistic effects in MOLM-13 cells when combined with doxorubicin. Project 3: Novel Modalities for Medicinal Chemistry of RNA and RNA Methyltransferases. In the third project, two novel strategies were explored to expand the repertoire of tools for targeting RNA Mtases. The first approach focused on the degradation of METTL3 using a proteolysis-targeting chimera (PROTAC) strategy, employing the known METTL3 inhibitor STM2457 as a recruiter ligand. Iterative optimization across four generations led to the development of AF 151, a potent and selective METTL3 degrader. A second, conceptually distinct strategy was conducted to enable the characterization of RNAbinding ligands and RNA modifications. This approach utilizes a mix-and-measure assay with noncovalent RNA dyes, which facilitates the quantification of various RNA modifications, including m6A, mediated by the METTL3/14 complex, among other applications.

In den vergangenen Jahren hat sich die Epitranskriptomik zu einem stark wachsenden Forschungsfeld mit hoher Relevanz für die biomedizinische Forschung entwickelt. Ein zentraler Aspekt ist die Untersuchung von RNA-Methylierungen, die durch RNA-Methyltransferasen (Mtasen) katalysiert werden. Diese Enzyme sind mit verschiedenen pathologischen Zuständen, darunter Krebs, assoziiert und stellen somit interessante Zielstrukturen für die medizinische Chemie dar. Die vorliegende Dissertation widmet sich der Entwicklung und Anwendung innovativer Strategien zur Identifizierung neuartiger RNA-Mtase-Inhibitoren. Die Arbeit gliedert sich in drei Projekte. Projekt 1: Direct-to-Biology (D2B). Im Rahmen des ersten Projekts wurde die 2021 erstmals beschriebene D2B-Strategie in zwei unterschiedlichen Teilprojekten angewendet. Das erste Teilprojekt zielte auf die Entwicklung fluoreszierender Sonden für Hochdurchsatz-Screenings (HTS) medizinisch relevanter RNA-Methyltransferasen (Mtasen) ab. Zwei neuartige Sonden wurden mittels einer Kupfer(I)-katalysierten Alkin-Azid-Cycloaddition (CuAAC)-Synthesestrategie für eine Vielzahl unterschiedlicher RNA-Methyltransferasen entwickelt. Dieser Ansatz ermöglichte ein HTS einer Wirkstoffbibliothek unter Verwendung der Methyltransferase-like 1 (METTL1) und führte zur Identifizierung von (S)-Crizotinib als erstem Inhibitor seiner Klasse. Im zweiten Teilprojekt wurden Inhibitoren gegen die tRNA-Methyltransferase D (TrmD) von Staphylococcus aureus (S. aureus) identifiziert. Eine im ersten Teilprojekt entwickelte fluoreszierende Sonde diente dabei als Ausgangspunkt für die Anwendung der D2B-Strategie gegen S. aureus TrmD. Der CuAAC-basierte Ansatz führte zur Entdeckung von fünf Inhibitoren. Ein Carbamat-Prodrug-Derivat eines dieser Inhibitoren reduzierte das Wachstum von S. aureus signifikant und stellt somit das erste antibakteriell aktive Prodrug gegen S. aureus TrmD dar. Darüber hinaus wurde die Kristallstruktur des aktiven Inhibitorkomplexes gelöst. Projekt 2: DNA-Encoded Library (DEL) Screening. Ziel war die Entwicklung neuartiger DNAMethyltransferase- 2 (DNMT2)-Inhibitoren durch ein DEL-Screening. Fünf selektive Liganden mit Triazin- bzw. peptidomimetischer Kernstruktur wurden identifiziert, wobei nur die peptidomimetischen Verbindungen inhibitorisch wirkten. Kristallstrukturanalysen belegten einen allosterischen Bindungsmodus. Eine darauf basierende Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudie (SAR) mittels Festphasen-Peptidsynthese führte zu einer Verbindung mit deutlich gesteigerter Affinität und als Alleinstellungsmerkmal Zellpermeabilität in einem Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA). In MOLM-13-Zellen reduzierte diese Verbindung das tRNA-m5C-Level und zeigte Synergie mit Doxorubicin. Projekt 3: Neue Modalitäten in der medizinischen Chemie von RNA und RNA-Mtasen. In diesem Projekt wurden zwei neue Ansätze zur Adressierung von RNA-Mtasen und RNA entwickelt. Erstens wurden Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs), aufbauend auf dem bekannten Inhibitor STM2457 zur gezielten Degradation von METTL3 konzipiert. Sukzessive Optimierung über vier PROTAC-Generationen führte zur Identifizierung von AF 151 als potentem METTL3-Degrader. Der zweite, konzeptuell andere Ansatz zielte auf die Beschleunigung der Charakterisierung von RNALiganden oder -Modifikationen ab. Hier wurde ein „mix-and-measure“-Protokoll auf Basis nichtkovalenter RNA-Farbstoffe etabliert, das unter anderem die Quantifizierung von METTL3/14- vermittelten m6A-Modifikationen ermöglicht.