Elucidation of the cell-specific regulation of the novel human tumor gene NOT

Abstract

The human NOT gene is the homologue of the l(2)not gene from Drosophil and suggested to be relevant for diverse cellular processes including tumorous growth and N-glycosylation. This PhD thesis provides the first insight into the cell-specific mechanisms controlling the expression of the NOT gene. The first part focuses on the identification and characterization of NOT splice variants. This analysis revealed the existence of 17 NOT transcripts which, depending on the alternative first exon, can be separated into two groups. The transcripts NOT-1 and NOT-4 are translated. Most of the other NOT isoforms harbor premature stop codons and are degraded by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway. The discovery of two different transcription start sites suggests the existence of two different NOT promoters that regulate the transcription of two pre-mRNAs from which all other isoforms are generated via alternative splicing. The second part describes the identification of transcription factor binding sites within a putative 1.15kb NOT promoter region. Bioinformatics tools predicted 7 potential binding sites for the transcription factor EGR-1, 22 for NFκB, 16 for CREB, and 10 for MYCN. From these putative sites one EGR-1-binding site (nts 330-312), two MYCN-binding sites (nts 184-173 and 80-69), one CREB3-binding site (nts 217-206), and six NFκB binding sites (nts 973-951, 789-776, 768-755, 638-624, 339-330, and 223-214) were confirmed in vitro using the yeast one-hybrid, EMSA, ELISA, and affinity chromatography techniques. In vivo-binding analysis using chromatin immunoprecipitation (ChIP) showed cell-specific occupancy of the EGR-1 and MYCN binding elements, whereas CREB3 and NFκB bind in all investigated cell lines. In the case of NFκB, the number of occupied sites as well as the composition and phosphorylation of the bound NFκB dimers varies between cells. The ChIP results also showed that all NFκB signals are accompanied by signals of its cofactor RPS3. In accordance with previous results obtained in our laboratory, the data presented here substantiates the DNA binding of RPS3. Furthermore, the paralogue histone acetyltransferases CBP and p300, which are described as transcriptional coactivators of NFκB and EGR-1, are bound in all investigated cell lines. The impact of the detected protein-DNA interactions on NOT expression was assessed using RNAi (for EGR-1 and NFκB), pharmacological activation or inhibition of the respective transcription factor (TNFα and Parthenolide for NFκB, BFA for CREB3), or overexpression (CREB3). Comparative studies in murine cell lines identified homologues of the human splice variants and showed that the promoter architecture is identical. Moreover, the murine NOT gene is also regulated by NFκB, CREB3, CBP, p300, and RPS3.

NOT, das humane Homologe des Drosophila Gens l(2)not, wird mit diversen zellulären Prozessen wie Tumorwachstum und der N-Glykosylierung in Verbindung gebracht. Die vorliegende Dissertation liefert die ersten Einblicke in die zellspezifischen Mechanismen, welche die Expression des NOT Gens kontrollieren. Der erste Teil der Arbeit beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung von NOT Spleißvarianten. Diese Analyse erbrachte den Nachweis von 17 NOT Transkripten, die entsprechend ihres alternativen ersten Exons in zwei Gruppen eingeteilt werden können. Die Transkripte NOT-1 und NOT-4 werden translatiert. Die meisten anderen NOT Isoformen beinhalten ein vorzeitiges Stoppcodon und werden vom Nonsense-mediated mRNA Decay (NMD) Signalweg abgebaut. Der Nachweis von zwei verschiedenen Transkriptionsstarts deutet auf die Existenz von zwei verschiedenen NOT Promotoren hin, die die Transkription zweier pre-mRNAs regulieren, aus denen alle anderen Isoformen durch alternatives Spleißen generiert werden. Der zweite Teil der Arbeit beschreibt die Identifizierung von Transkriptions-faktorbindestellen innerhalb der mutmaßlichen 1,15kb großen NOT Promoter Region. Mithilfe bioinformatischer Tools wurden 7 potenzielle Bindestellen für den Transkriptionsfaktor EGR-1, 22 für NFκB, 16 für CREB und 10 für MYCN berechnet. Von diesen wurde durch Yeast one-hybrid, EMSA, ELISA und Affinitätschromatographie eine EGR-1 Bindestelle (nts 330-312), zwei MYCN Bindestellen (nts 184-173 and 80-69), eine CREB3 Bindestelle (nts 217-206) und sechs NFκB Bindestellen (nts 973-951, 789-776, 768-755, 638-624, 339-330 und 223-214) in vitro bestätigt. Die in vivo-Bindungsstudien mittels Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) belegen eine zellspezifische Bindung von EGR-1 und MYCN, wohingegen CREB3 und NFκB in allen untersuchten Zelllinien gebunden waren. Im Fall von NFκB zeigten sich sowohl bei der Anzahl der besetzten Stellen als auch bei der Zusammensetzung und Phosphorylierung der jeweils gebundenen NFκB Dimere zellspezifische Unterschiede. Die Resultate der ChIP-Analyse zeigen zudem, dass alle NFκB Signale einhergehen mit Signalen des NFκB Kofaktors RPS3. Darüber hinaus bekräftigen die hier präsentierten Daten die in unserer Arbeitsgruppe bereits nachgewiesene RPS3 Bindung an DNA. Ebenfalls belegt wurde die in vivo-Bindung der paralogen Histon-Acetyltransferasen CBP und p300, die als transkriptionelle Koaktivatoren von NFκB und EGR-1 beschrieben sind. Die Auswirkungen der detektierten Protein-DNA Interaktionen auf die NOT Expression wurden unter Anwendung von RNAi (für EGR-1 und NFκB), pharmakologischer Aktivierung oder Inaktivierung des entsprechenden Transkriptionsfaktros (TNFα und Parthenolid für NFκB, BFA für CREB3) oder Überexpression (CREB3) ermittelt. Vergleichende Studien in murinen Zelllinien führten zur Identifizierung von homologen Spleißvarianten und veranschaulichten, dass die Promotorstruktur identisch ist. Darüber hinaus wird das murine NOT Gen ebenfalls von NFκB, CREB3, CBP, p300 und RPS3 reguliert.