Controlling reaction pathways to modulate assembly processes

Abstract

Regulation of the assembly and disassembly of peptide nanostructures is essential to create complex and dynamic systems that exhibit pathway selectivity. This thesis demonstrates the design of synthetically modified peptides that are responsive to stimuli such as light, pH, or redox, thereby controlling their assembly and disassembly behavior. In addition, the concept of stimulus-controlled assembly was investigated in complex environments. In order to achieve control over the disassembly of nanostructures two short anthracene-containing peptides were designed that also feature a pH sensitive lysine. They assembled into nanosheets or nanoribbons with a distinct secondary structure. These morphologies could further be modulated by pH, leading to different amount of charges on the peptide. Upon irradiation the light-responsive anthracene units performed a bimolecular [4+4] cycloaddition, which disrupted the π-π stacking by distortion of the previously flat aromatic groups and therefore lead to disassembly of the supramolecular architecture. In contrast to monomolecular reactions such as photocleavage, the preorganization of the anthracene units within the supramolecular architecture exerted a notable influence on the kinetics of the bimolecular photodimerization. This highlights the interplay between the supramolecular structure and the molecular chemistry and showcased the controlled disassembly of diverse nanostructures. The assembly process can also be precisely controlled using light-responsive systems. In conjunction with redox-responsive cysteine, a photolytic reaction cascade was engineered, yielding a disulfide that exhibited pathway selectivity during the assembly process. This was achieved by starting from a caged isopeptide, which released the linear peptide upon photocleavage and subsequently was oxidized by the side products of the cage to a disulfide. The modulation of this process was possible through the introduction of the reducing agent DTT, which affords control over the production and lifetime of the supramolecular monomers. The disulfide displayed short, twisted fibers when directly assembled, yet revealed short and thin fibers when assembled as part of the cascade. By cycling between the redox states, a third morphology of long and thin fibers emerged, whose secondary structure could be tuned by the amount of DTT. This project demonstrated how a combination of light and redox responsiveness enables control over the assembly process with several distinct pathways giving rise to different nanostructures. A glutathione-responsive isopeptide was then used to control the assembly of nanostructures in a complex environment such as the cell. Elevated levels of glutathione within the cytosol compared to the extracellular matrix could selectively cleave the cage, initiate the reaction cascade and release the linear, assembling peptide. The formation of nanostructures and their effect on MDA-MB-231 breast cancer cells was observed through life-cell imaging and fluorescence spectroscopy, as well as the oxygen consumption of the cell. The supramolecular assembly led to a disruption of mitochondrial integrity and inhibited energy homeostasis. Notably, the observed effects were not confined to two-dimensional cell culture, they could also result in a reduction in tumor size in a three-dimensional tumor spheroid model. In summary, this thesis presented the modulation of assembly processes by controlling their reaction pathways. This was achieved by incorporating stimuli-responsive groups and tuning of supramolecular interactions. Furthermore, the interplay between molecular chemistry and the supramolecular architecture and vice versa is highlighted. These results should facilitate the discovery of next-generation biomaterials with control over the formation of complex nanostructures.

Die Regulierung der Assemblierung und Disassemblierung von Peptid-Nanostrukturen ist für die Schaffung komplexer und dynamischer Systeme, die eine Wegselektivität aufweisen, von entscheidender Bedeutung. Diese Arbeit zeigt das Design synthetisch modifizierter Peptide, die auf Stimuli wie Licht, pH-Wert oder Redox reagieren und so ihr Auf- und Abbauverhalten steuern. Darüber hinaus wurde das Konzept die durch Stimuli kontrollierte Assemblierung von Peptiden in komplexen Umgebungen untersucht. Zur Erlangung der Kontrolle über die Disassemblierung von Nanostrukturen wurden zwei kurze, anthracenhaltige Peptide entwickelt, die zudem ein pH-sensitives Lysin enthalten. Die daraus resultierenden Strukturen ordneten sich zu Nanoblättern oder Nanobändern mit einer unterschiedlicher Sekundärstruktur an. Die Morphologien konnten durch den pH-Wert moduliert werden, was zu unterschiedlichen Ladungen am Peptid führte. Bei Bestrahlung führten die lichtresponsiven Anthracen-Einheiten eine bimolekulare [4+4]-Cycloaddition durch, die die π-π-Wechselwirkungen durch Verzerrung der zuvor flachen aromatischen Gruppen störte und somit zur Auflösung der supramolekularen Architektur führte. Im Gegensatz zu monomolekularen Reaktionen, wie der Photospaltung, übte die Präorganisation der Anthracen-Einheiten innerhalb der supramolekularen Architektur einen bemerkenswerten Einfluss auf die Kinetik der bimolekularen Photodimerisierung aus. Dies unterstreicht die Wechselwirkung zwischen der supramolekularen Struktur und der molekularen Chemie und demonstriert die kontrollierte Disassemblierung verschiedener Nanostrukturen. Der Assemblierungsprozess kann ebenfalls mithilfe lichtresponsiver Systeme präzise gesteuert werden. In Verbindung mit Redox-responsivem Cystein, wurde eine photolytische Reaktionskaskade entwickelt, die ein Disulfid freisetzte, dessen Assemblierungsprozess eine Reaktionswegselektivität aufwies. Dieser Effekt wurde durch den Einsatz eines blockierten Isopeptids erzielt, welches das lineare Peptid nach der Photospaltung freisetzte und anschließend durch die Nebenprodukte der Schutzgruppe zu einem Disulfid oxidiert wurde. Die Modulation dieses Prozesses wurde durch die Einführung des Reduktionsmittels DTT erreicht, wodurch eine Kontrolle über die Produktion und Lebensdauer der supramolekularen Monomere möglich wurde. Das Disulfid wies kurze, verdrehte Fasern auf, wenn es direkt assembliert wurde, zeigte jedoch kurze und dünne Fasern, wenn es als Teil der Kaskade assembliert wurde. Durch Schalten zwischen den Redoxzuständen entstand eine dritte Morphologie aus langen und dünnen Fasern, deren Sekundärstruktur durch die Menge an DTT angepasst werden konnte. Dieses Projekt demonstrierte, dass eine Kombination aus Licht und Redoxreaktion die Kontrolle über den Assemblierungsprozess mit mehreren unterschiedlichen Pfaden ermöglicht, die zu unterschiedlichen Nanostrukturen führen. In der Folge wurde ein Glutathion-reaktives Isopeptid genutzt, um den Aufbau von Nanostrukturen in einer komplexen Umgebung wie der Zelle zu steuern. Erhöhte Glutathionwerte im Zytosol im Vergleich zur extrazellulären Matrix konnten den Käfig selektiv spalten, die Reaktionskaskade einleiten und das lineare, assemblierende Peptid freisetzen. Die Bildung von Nanostrukturen und ihre Wirkung auf MDA-MB-231-Brustkrebszellen wurden durch die Methoden der Lebendzell-Bildgebung und Fluoreszenzspektroskopie sowie durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs der Zelle beobachtet. Die supramolekulare Anordnung führte zu einer Störung der mitochondrialen Integrität und hemmte die Energiehomöostase. Bemerkenswerterweise waren die beobachteten Effekte nicht auf zweidimensionale Zellkulturen beschränkt, sondern konnten auch in einem dreidimensionalen Tumorsphäroidmodell zu einer Verringerung der Tumorgröße führen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Modulation von Assemblierungsprozessen durch die Steuerung der Reaktionswege vorgestellt. Dies wurde durch die Einbindung von auf Stimulus-responsiven Gruppen und die Anpassung der supramolekularen Wechselwirkungen erreicht. Darüber hinaus wird das Zusammenspiel zwischen der molekularen Chemie und der supramolekularen Architektur und umgekehrt hervorgehoben. Die Ergebnisse der Forschung sollten die Grundlage für die Entwicklung neuer Biomaterialien der nächsten Generation bilden, mit denen die Bildung komplexer Nanostrukturen kontrolliert werden kann.