The tumor suppressor MYPOP: Characterization of novel MYPOP antibodies and MYPOP application as inhibitor of cell proliferation

Abstract

Globally, human papillomaviruses (HPV) are the most common sexual infection (Plotzker et al., 2023), affecting over 80 out of 100 people in sexually active populations over the course of their life. Infections with high-risk HPV types imply a cancer risk due to viral oncogenes that transform infected cells. Despite the development of vaccines, HPV still account for 4.5% of the global cancer burden, such as oropharyngeal, cervical, and different types of skin cancers. Given that cancer is the second leading cause of death worldwide and HPV plays a significant role in its development, the importance of research on HPV and cancer is undeniable. Generally, cancer onset is attributed above all to genetic mutations. These mutations result in activated oncogenes or non-functional tumor suppressor proteins, enabling cells to divide uncontrollably. One of these tumor suppressor proteins is MYPOP, an interaction partner of the smaller capsid protein L2 of HPV (Wüstenhagen et al., 2018). MYPOP also binds HPV DNA, suppresses viral transcription, and thus exerts a protective effect in the human cell. Various normal cell lines have a well detectable amount of MYPOP. However, it is not detectable in immortalized or tumor cells of different cancer types. Moreover, overexpression of MYPOP in these tumor cells through transfection has been shown to provoke reduction of cell counts (Wüstenhagen et al., 2018). Due to the recent research on MYPOP, the knowledge in the literature is very limited and further research approaches are needed. For this reason, the objective of this project was to test new MYPOP antibodies and their application as markers of healthy tissue and explore ways of using MYPOP for potential targeted cancer therapy. First monoclonal MYPOP antibodies were tested on normal skin cells, immortalized cells, and cervical cancer cells. In these experiments, three antibodies were identified that reliably differentiate between normal and immortalized cells based on MYPOP expression, which implies a potential use in diagnostics. Compared to the available polyclonal MYPOP antibodies, at least equivalent reliability in Western blot (WB) analyses was observed. In the search for appropriate applications of MYPOP with the aim of reducing growth of cancer cells, directly applied purified MYPOP protein appeared to exhibit an inhibitory effect, which warrants further detailed investigation. For the first time, MYPOP was attempted to be applied as vector-based gene therapy in vitro using HPV16 pseudovirus (PsV). Initially, a successful inhibitory effect was suspected, but it turned out to be a phenomenon rather attributable to the PsV themselves. As the observed cytotoxic effect occurred only in tumor and not in healthy cells, the results still advocate for further exploration. The inclusion of recent findings of the Florin group leads to the assumption that the MYPOP protein itself poses challenges in the production of the PsV. Due to its antiviral properties, it likely interacts with capsid proteins or the DNA to be packaged and prevents efficient packaging or transcription of the expression III plasmid. This issue should be considered and addressed in the future production of MYPOP PsV. In summary, this work identifies suitable monoclonal MYPOP antibodies for future production and application in research and potential diagnostics. In addition, this project contributes to the path towards a potential therapeutic application of MYPOP in cancer therapy, testing vector- based application and highlighting issues to be considered in MYPOP-vector preparation.

Weltweit sind humane Papillomaviren (HPV) die häufigste sexuell übertragene Infektion (Plotzker et al., 2023), von der im Laufe des Lebens über 80 von 100 Personen in sexuell aktiven Populationen betroffen sind. Insbesondere persistente Infektionen mit Hochrisiko- HPV-Typen bergen ein Krebsrisiko durch virale Onkogene, welche maßgeblich die Transformation der infizierten Zellen bewirken. Trotz der Entwicklung von Impfungen, sind HPV noch für 4,5% der weltweiten Krebsbelastung verantwortlich, darunter oropharyngealer, Gebärmutterhals- und Hautkrebs. Dass Krebserkrankungen die zweithäufigste Todesursache weltweit darstellen und HPV einen signifikanten Anteil davon mitverursachen, verdeutlicht die Wichtigkeit der HPV- und Krebsforschung. Im Allgemeinen wird die Entstehung von Krebs vor allem auf genetische Mutationen zurückgeführt. Mutationen aktivieren Onkogene oder inhibieren Tumorsuppressor-Proteine, wodurch sich Zellen unkontrolliert teilen können. Ein solches Tumorsuppressor-Protein ist MYPOP, welches als Interaktionspartner des kleineren Kapsidproteins L2 von HPV charakterisiert und validiert wurde (Schneider, 2016; Wüstenhagen et al., 2018). MYPOP bindet außerdem HPV-DNA, unterdrückt die virale Transkription und wirkt somit protektiv. Anhand verschiedener Zelllinien konnte gezeigt werden, dass MYPOP in normalen Zellen in gut nachweisbaren Mengen vorliegt, wohingegen es in Tumorzellen verschiedener Krebsarten nicht nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus, konnte eine MYPOP Überexpression in diesen Tumorzellen mittels Transfektion eine Reduktion der Zellzahl erreichen (Wüstenhagen et al., 2018). Die Erforschung von MYPOP steckt noch in den Anfängen, weshalb bisher nur wenig Fachliteratur verfügbar ist und weitere Forschungsansätze erforderlich sind. Ziel dieser Arbeit war es deswegen, neue Antikörper und die damit verbundenen Anwendungsmöglichkeiten von MYPOP als Marker für gesundes Gewebes zu testen, sowie Applikationsarten des Proteins auf dem Weg hin zu potenzieller zielgerichteten Krebstherapie zu erproben. Hierfür wurden monoklonale MYPOP-Antikörper auf den MYPOP Nachweis in normalen Hautzellen, immortalisierten Zellen und Gebärmutterhalskrebszellen getestet. Es konnten drei Antikörper identifiziert werden, die zuverlässig und ohne zusätzliches, unspezifisches Signal, MYPOP detektieren. Sie ermöglichen hier eine Unterscheidung zwischen normalen und immortalisierten Zellen und könnten daher gegebenenfalls diagnostisch eingesetzt werden. Im Vergleich zu den bisher bereits verfügbaren polyklonalen MYPOP Antikörpern konnte eine mindestens gleichwertige Zuverlässigkeit im Western Blot (WB) beobachtet werden. Auf der Suche nach Applikationsarten von MYPOP mit dem Ziel der Wachstumsreduktion von Krebszellen, schien gereinigtes MYPOP Protein bei direkter Anwendung in der Zellkultur einen möglichen inhibitorischen Effekt vorzuweisen, welcher genauer untersucht werden müsste. I Durch die Produktion und Anwendung von HPV16 PsV wurde zum ersten Mal versucht, MYPOP vektorbasiert als Gentherapie in vitro anzuwenden. Dabei wurde zunächst ein erfolgreicher, inhibitorischer Effekt vermutet, der sich bei genauerer Betrachtung dann aber als ein vermutlich auf die Pseudoviren selbst zurückzuführendes Phänomen herausstellte. Da der beobachtete zytotoxische Effekt nur bei Tumor- und nicht bei gesunden Zellen auftrat, sprechen die Ergebnisse trotzdem dafür, diese Beobachtung weiter zu verfolgen. Mit Blick auf aktuelle Ergebnisse der Arbeitsgruppe Florin kann geschlussfolgert werden, dass das MYPOP Protein selbst die Problematik bei der Herstellung der Pseudoviren darstellt. Durch seine antiviralen Eigenschaften interagiert es wahrscheinlich mit Kapsidproteinen oder der zu verpackenden DNA und verhindert die effiziente Verpackung oder Transkription des Expressionsplasmids. Dieses Problem müsste in der zukünftigen Herstellung von MYPOP Pseudoviren berücksichtigt werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit geeignete monoklonale MYPOP Antikörper für die zukünftige Produktion und Anwendung in Forschung und möglicher Diagnostik auf. Des Weiteren leistet dieses Projekt einen Beitrag auf dem Weg hin zu einer möglichen therapeutischen Anwendung von MYPOP in der Krebstherapie, indem erstmals die vektorbasierte Transduktion als Applikationsart getestet wird und damit einhergehende Probleme der Virenpräparation dargelegt werden.