The effect of knockdown and mutation of the ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 (GDAP1) on mitochondrial shape and cell metabolism

Abstract

Mutations in the gene encoding for the ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 (GDAP1) cause the hereditary polyneuropathy Charcot-Marie-Tooth disease (CMT). Structurally, the GDAP1 protein possesses a transmembrane domain anchored in the outer mitochondrial membrane (OMM) and two domains facing the cytosol that share similarities to glutathione-transferases (GST) – enzymes catalyzing the conjugation of the antioxidant glutathione to electrophilic residues. GDAP1 is highly involved in mitochondrial dynamics, ongoing processes of fusion and fission. Changes in GDAP1 expression levels can disturb this balance and shift the mitochondrial shape to either fragmented mitochondria when overexpressed or fused mitochondria when silenced. This work not only confirmed that perturbed GDAP1 expression leads to more mitochondrial elongation in GDAP1 knockdown (KD) cell lines but also in neuronal cells derived from autosomal-recessive CMT4A patients caused by a GDAP1 mutation. We observed that GDAP1 KD cells and patient-derived motoneurons exhibited a significant reduction in cytosolic fatty acids and that both in vitro models shifted their mitochondrial metabolism towards increased glutaminolysis – most likely, a compensatory effect to an impaired pyruvate conversion to acetyl-CoA, a crucial Ca2+-dependent process controlling citrate production and entry into the TCA cycle. Though GDAP1 KD cells were still less efficient for mitochondrial ATP production. By analyzing pulled down neuronal proteins by mass spectrometry, I identified the cytosolic actin-binding factor cofilin1 as a potential GDAP1-interacting protein. Cofilin1 regulates the depolymerization of actin filaments, the abundance of the intracellular signaling hubs mitochondria-ER contact sites (MERCS) and mitochondrial fragmentation mediated by the mitochondrial fission factor dynamin-related protein 1 (DRP1). Translocation of DRP1 to the OMM was indeed reduced and MERCS had an increased width in GDAP1 KD cells resulting in an impaired Ca2+ transfer upon stimulation of the inositol-1,4,5-tris-phosphate receptor (IP3R). An altered function of cofilin1 might therefore underlie the morphological and metabolic impairments observed in this work. Hence, this work shed light on metabolic alterations in GDAP1 KD but also in CMT4A patient-derived cells and contributed to further explanation of potential GDAP1 targets.

Die erblich bedingte Polyneuropathie Charcot-Marie-Tooth-Krankheit (CMT) kann durch Mutationen im Gen für das ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 (GDAP1) verursacht werden. Das GDAP1-Protein besitzt eine in der äußeren Mitochondrienmembran (OMM) verankerte Transmembrandomäne und zwei Domänen, die Ähnlichkeiten mit Glutathion-Transferasen (GST) aufweisen – Enzyme, die die Konjugation des Antioxidans Glutathion an elektrophile Reste katalysieren. GDAP1 ist in hohem Maße an der Dynamik von Fusion und Fission der Mitochondrien beteiligt. Diese zwei gegenläufigen und ausbalancierten Prozesse ermöglichen es den Mitochondrien, auf diverse Signale zu reagieren, um den Energiebedarf der Zellen zu decken. Änderungen im Expressionslevel von GDAP1 können dieses Gleichgewicht stören und die mitochondriale Morphologie erscheint entweder fragmentiert oder fusioniert, wenn die GDAP1-Expression entsprechend erhöht oder verringert ist. Die vorliegende Arbeit bestätigte nicht nur, dass ein Mangel an GDAP1 zu einer stärkeren mitochondrialen Elongation in GDAP1-Knockdown-Zelllinien (KD) führt. Diesen Effekt konnten wir auch in neuronalen Zellen nachweisen, die von CMT4A-Patienten mit autosomal-rezessiven GDAP1-Mutationen stammen. Wir beobachteten sowohl in der GDAP1 KD Zelllinie, als auch in den Patientenzellen eine signifikante Reduktion der zytosolischen Fettsäuren. Beide in vitro-Modelle verlagerten ihren mitochondrialen Metabolismus in Richtung einer erhöhten Glutaminolyse - höchstwahrscheinlich ein kompensatorischer Effekt durch eine ineffizientere Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA, ein entscheidender Ca2+-abhängiger Prozess, der die Zitratproduktion und den TCA-Zyklus beeinflusst. Dennoch wiesen die GDAP1-KD-Zellen eine weniger effiziente mitochondriale ATP-Produktion auf. Darüber hinaus ergab ein Pulldown von neuronalen Proteinen eine Interaktion mit dem zytosolischen Aktin-bindenden Protein Cofilin1. Cofilin1 reguliert die Depolymerisierung der Aktinfilamente, das Vorkommen und die Eigenschaften der intrazellulären Signalknoten Mitochondrien-ER-Kontaktstellen (MERCS) und dadurch ebenfalls die mitochondriale Fragmentierung durch das Fissionsprotein dynamin-related protein 1 (DRP1). Ich konnte in den GDAP1-KD-Zellen eine reduzierte Translokation von DRP1 an die OMM feststellen. Auch der Zwischenraum der MERCS war deutlich erhöht in den GDAP1-KD-Zellen, was zu einem gestörten Ca2+-Transfer bei Stimulation des Inositol-1,4,5-Tris-Phosphat-Rezeptors (IP3R) führte. Diese Interaktion könnte eine Hauptursache für die in dieser Arbeit beobachteten morphologischen und metabolischen Beeinträchtigungen sein. Durch die Identifikation von GDAP1-Interaktionspartnern und der metabolischen Veränderungen in GDAP1 KD und CMT-Patientenzellen trug diese Arbeit daher zu einem besseren Verständnis der Vorgänge der CMT-Erkrankung bei.