Erkennungssequenzen und strukturelle Elemente als Determinanten der regulierten Spaltung von Membranproteinen

Abstract

Eine funktionell und strukturell diverse Gruppe von Transmembranproteinen wie beispielsweise Mediatoren und deren Rezeptoren können proteolytisch gespalten werden. Dieser Prozess wird als Shedding bezeichnet. Kürzlich konnte die proteolytische Aktivität identifiziert werden, die für die Prozessierung von proTNFa verantwortlich ist. Sie wurde TACE (TNF Alpha Converting Enzyme) genannt. In Experimenten mit TACE-/- Fibroblasten konnte ich herausfinden, dass das durch PMA induzierte Shedding des IL-6Rs stark reduziert war. Eine basale hydroxamatsensitive Freisetzung des IL-6Rs konnte allerdings noch detektiert werden. Um Unterschiede im Shedding von IL-6R und proTNFa zu untersuchen, generierte ich chimäre Proteine aus diesen beiden Proteinen, bei denen die Spaltstellenregionen gegeneinander vertauscht worden waren. TNFa Chimären zeigten nur sehr geringes Shedding. Im Gegensatz dazu wurden IL-6R Chimären, die die proTNFa Spaltstelle enthielten spontan gespalten. Die PMA-Induzierbarkeit war verloren gegangen. Daraufhin wurden verschiedene Chimären des unspaltbaren Proteins gp130 und der Spaltstellenpeptide aus TNFa, TGFa und IL-6R generiert. Hierbei wurde ein kurzes membranproximales Peptid aus gp130 gegen die Spaltstellen ausgetauscht. Diese Peptide übertrugen sowohl spontane ale auch PMA-induzierte Spaltbarkeit auf gp130. Um die minimalen Bedingungen für Shedding zu untersuchen, setzte ich verkürzte IL-6R Spaltstellenpeptide in gp130 ein. Die resultierenden Chimären waren empfänglich für reguliertes Shedding. Überaschenderweise konnten auch spaltbare Chimären durch das Ersetzen der membrannahem Region von gp130 durch die entsprechende Region aus dem ebenfalls nicht spaltbaren LIFR generiert werden.

A functionally and structurally diverse group of transmembrane proteins including transmembrane forms of mediators or receptors can be proteolytically cleaved to form soluble growth factors or receptors. Recently, the proteolytic activity responsible for proTNFa processing has been identified and named TACE. In experiments with TACE-/- fibroblasts I found that PMA-induced shedding of the IL-6R is strongly reduced. A basal hydroxamate sensitive release of IL-6R, however, could still be detected. To characterize differences between shedding of IL-6R and proTNFa I generated chimeric IL-6R and proTNFa proteins wherein the endogenous cleavage sites (CS) had been replaced by the corresponding region of proTNFa and IL-6R, respectively. Interestingly, proTNFa chimeric proteins showed only minimal shedding. In contrast, IL-6R chimeras containing the proTNFa CS were shed spontaneously, processing was not further induced by PMA. Then several chimeric proteins of uncleavable gp130 and the proteins TNFa, TGFa, and IL-6R, which are known to be subject to shedding, were generated. By exchanging small peptide sequences of gp130 for cleavage site peptides of TNFa, TGFa, and IL-6R I showed that these short sequences conferred susceptibility to spontaneous and PMA induced shedding of gp130. In order to investigate minimal requirements for shedding, truncated cleavage site peptides of IL-6R were inserted into gp130. The resulting chimeras were susceptible to shedding. Surprisingly, I could also generate cleavable chimeras by exchanging the juxtamembrane sequence of gp130 for the corresponding region LIFR, a protein that similarly to gp130 is not subject to regulated or spontaneous shedding.