Analysis of ubiquitin signaling in the human mitochondrial protein import

Abstract

Mitochondrial protein import is essential for eukaryotic organisms. Approximately 99% of mitochondrial proteins are imported from the cytoplasm, thereby ensuring proper mitochondrial function. Successful protein import is required for critical mitochondrial functions such as energy production, metabolism and immune signaling. Consequently, cells have developed a broad repertoire of mitochondrial import quality control mechanisms. Import defects are linked to several pathological conditions such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease, and cancer, underscoring mitochondrial protein import quality control a topic of high medical and cell-biological relevance. Ubiquitin, an essential eukaryotic modifier, appears to be central in the mitochondrial quality control in S. cerevisiae, but its role in human cells is poorly characterized. To address this gap of knowledge, a protein-based mitochondrial import clogging model was established in human cells, enabling protein engineering to study mitochondrial quality control. The mitochondrial quality control deals with the mitochondrial clogger by rapid degradation. The mitochondrial clogger is highly ubiquitylated, most likely leading to its degradation in a proteasome-dependent manner. In addition, proximity labeling was employed to characterize the interactome of both the mitochondrial clogger and the clogged mitochondrial surface. This provides an in-depth view on mitochondrial protein-protein interaction networks upon import stress in human cells. A cluster of proteins that regulate OXPHOS and mitochondrial gene expression was enriched in the proximity of the clogged mitochondrial surface. The interactome was unexpectedly enriched in nuclear speckle splicing factors whereas a cluster of proteins centered around the tumor suppressor BRCA1 decreased. Collectively these observations suggest that the mitochondrial surface under mitochondrial import stress defines a mitochondrial-nuclear signaling axis. The analysis further reveals the potential role of atypical ubiquitylation of the mitochondrial clogger. However, tools to study atypical ubiquitylation in vivo remain limited. Therefore, the recently developed Ubiquiton system, which enables inducible ubiquitylation in vivo, was extended to include atypical linkages K6 and K11. This provides a perspective for future studies on ubiquitylation during mitochondrial import clogging. In conclusion, this work connects two essential eukaryotic pathways, mitochondrial protein import and ubiquitin signaling and thereby contributes to a better understanding of the mitochondrial quality control which is crucial for cellular and organismic health.

Der mitochondriale Proteinimport ist essenziell für eukaryotische Organismen. Etwa 99% der mitochondrialen Proteine werden aus dem Zytoplasma importiert. Dies ist Voraussetzung für zentrale mitochondriale Prozesse wie Energieproduktion, Stoffwechsel und Immunantwort. Zellen haben deshalb ein breites Repertoire an Kontrollmechanismen für den mitochondrialen Proteinimport entwickelt. Importdefekte sind mit verschiedenen Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson und Krebs assoziiert und unterstreichen die hohe medizinische und zellbiologische Relevanz des mitochondrialen Proteinimports. Ubiquitin, ein essenzieller eukaryotischer Modifikator, spielt eine zentrale Rolle in der mitochondrialen Qualitätskontrolle in S. cerevisiae, während seine Funktion in menschlichen Zellen in diesem Kontext bislang nur unzureichend charakterisiert ist. Dafür wurde ein proteinbasiertes Modell für die Blockierung des mitochondrialen Proteinimports in humanen Zellen etabliert. Dies ermöglicht Protein-engineering, um die mitochondriale Qualitätskontrolle zu untersuchen. Der mitochondriale „Clogger“ wurde in humanen Zellen stark ubiquitiniert, was zu einem rapiden proteasomalen Abbau geführt hat. Außerdem wurde eine Methode etabliert, um das Interaktom des „Cloggers“ und der mitochondrialen Oberfläche zu charakterisieren. Dadurch wird eine detaillierte Analyse von Protein-Protein-Interaktionen der direkten Umgebung des mitochondrialen „Cloggers“ und der mitochondrialen Oberfläche unter Importstress in humanen Zellen ermöglicht. In der direkten Umgebung der verstopften Oberfläche der Mitochondrien waren regulierende Proteine angereichert, die an der Regulation der Zellatmung und der mitochondrialen Genexpression beteiligt sind. Unerwarteterweise war das Interaktom zusätzlich mit RNA-bindenden Faktoren angereichert, während eine Gruppe von Proteinen in Verbindung mit dem Tumorsuppressor BRCA1 verringert war. Dies deutet darauf hin, dass die mitochondriale Oberfläche unter Importstress eine mitochondriale-nukleäre Signalachse definiert. Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine potenzielle Rolle atypischer Ubiquitinierung des mitochondrialen „Cloggers“ hin. Da Möglichkeiten zur Untersuchung atypischer Ubiquitinierung in vivo bisher begrenzt sind, wurde das Ubiquiton-System, um die atypischen K6- und K11-Ubiquitinketten erweitert. Dadurch wird eine induzierbare Ubiquitinierung mit diesen Verknüpfungen in vivo ermöglicht und eröffnet neue Perspektiven für zukünftige Studien zur Rolle der Ubiquitinierung von mitochondrialen Importdefekten. Zusammenfassend verknüpft diese Arbeit zwei essenzielle eukaryotische Zellprozesse, die Ubiquitinierung von Proteinen mit dem Prozess des mitochondrialen Proteinimports. Dadurch trägt diese Arbeit zu einem besseren Verständnis der mitochondrialen Qualitätskontrolle bei, die von zentraler Bedeutung für die zelluläre und organismische Gesundheit ist.