Dissecting substrate recognition by GID Ubiquitin ligases

Abstract

Protein degradation is an essential process for maintaining the health of the cell, with a variety of different functions in the maintenance of homeostasis, regulation of processes in the cell, the response to environmental stresses, and quality control of the proteome. Perturbation of this system leads to a variety of diseases, including neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease or frontotemporal dementia. To degrade proteins, the cell uses two main pathways, autophagy and the ubiquitin proteasome system, the latter of which will be the focus of this study. In this pathway, ubiquitin is attached to substrate proteins by the action of E3 ligases. One such E3 ligase of rising importance is the GID/CTLH complex, which was originally found to be involved in the degradation of gluconeogenic enzymes starting with proline via its substrate receptor Gid4. In more recent years, further substrate receptor proteins have been discovered for the GID complex with Gid10 and Gid11, together with the complex’s ability to non-canonically recognize substrates via WDR26 in human cells. Thus far, Gid11 is relatively poorly understood, besides it seeming to recognize N-terminal threonine residues. One of the aims of this study is to better characterize Gid11, analyze its substrate specificities, and identify residues or regions within Gid11 important for substrate recognition. For this purpose, this study the tandem-fluorescent timer approach was used. This study highlights the importance of the third intrinsically disordered region of Gid11, as well as a variety of residues within its binding pocket. Furthermore, it shows that N-termini recognized by Gid11 are usually non-acetylated. Additionally, the Gid11-dependent turnover of two proteins without threonine N-degrons was investigated, leading to the hypothesis that Blm10 is potentially recognized via the fifth intrinsically disordered region of Gid11. A potential example of trans-ubiquitination of Cpa1 via recognition of its complex partner Cpa2 was investigated and disproven. There are several more proteins such as Hsm3 whose turnover depends on the GID complex, but which do currently not possess a known substrate receptor. Using overexpression of potential substrate receptors to compete for the binding of Gid5, it could be shown that this approach is a viable strategy to find additional, currently unknown Gid5-dependent substrate receptor proteins of the GID complex. Additional experiments were conducted to investigate the functional conservation of various GID components, both in different yeast species in case of Gid11, and in human cells in the case of core GID components, showing that most human homologs of GID components are non-functional in yeast. As a side project, the specificity of human ATE1, NTAN1, and NTAQ1 was investigated, highlighting differences between these enzymes and their human counterparts. Overall, this study provides a characterization of Gid11, its substrate specificities, and identifies several key features necessary for its function. Furthermore, it highlights potential ways to identify further, currently unknown substrate receptors of the GID complex.

Proteinabbau ist ein essenzieller Prozess zur Aufrechterhaltung der Zellgesundheit und erfüllt eine Vielzahl von Funktionen wie die Aufrechterhaltung der Homöostase, die Regulation zellulärer Prozesse, die Antwort auf Umweltstress und die Qualitätskontrolle des Proteoms. Eine Störung dieses Systems führt zu einer Vielzahl von Krankheiten, darunter neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer oder frontotemporale Demenz. Zum Proteinabbau nutzt die Zelle zwei Hauptwege: Autophagie und das Ubiquitin-Proteasom-System, wobei Letzteres im Fokus dieser Arbeit steht. In diesem Weg werden Zielproteine durch E3-Ligasen mit Ubiquitin markiert. Eine zunehmend bedeutsame E3-Ligase ist der GID/CTLH-Komplex, der ursprünglich für den Abbau von Glukoneogenese-Enzymen mit N-terminalem Prolin durch den Substratrezeptor Gid4 beschrieben wurde. In den letzten Jahren wurden mit Gid10 und Gid11 weitere Substratrezeptoren entdeckt sowie eine nicht-kanonische Substraterkennung über WDR26 in menschlichen Zellen beschrieben. Gid11 ist bislang nur unzureichend charakterisiert, abgesehen davon, dass es N-terminale Threoninreste erkennt. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, Gid11 näher zu charakterisieren, dessen Substratspezifitäten zu analysieren und wichtige Bereiche oder Aminosäuren für die Substraterkennung zu identifizieren. Hierfür wurde die Tandem-Fluoreszenz-Timer-Methode verwendet. Die Ergebnisse zeigen die Bedeutung der dritten intrinsisch ungeordneten Region von Gid11 sowie diverser Reste in der Bindungstasche. Zudem wird gezeigt, dass N-Termini, die durch Gid11 erkannt werden, in der Regel nicht acetyliert sind. Darüber hinaus wurde der Gid11-abhängige Abbau zweier Proteine ohne Threonin-N-degron untersucht, was zur Hypothese führte, dass Blm10 möglicherweise über die fünfte ungeordnete Region von Gid11 erkannt wird. Ein mögliches Beispiel für trans-Ubiquitinierung von Cpa1 über dessen Komplexpartner Cpa2 konnte widerlegt werden. Es existieren weitere Proteine, wie Hsm3, deren Abbau vom GID-Komplex abhängt, für die jedoch bisher kein Substratrezeptor bekannt ist. Durch Überexpression potenzieller Substratrezeptoren konnte gezeigt werden, dass diese Methode geeignet ist, bisher unbekannte Gid5-abhängige Substratrezeptoren des GID-Komplexes zu identifizieren. Weitere Experimente untersuchten die funktionelle Konservierung verschiedener GID-Komponenten sowohl zwischen unterschiedlichen Hefespezies im Fall von Gid11 als auch in menschlichen Zellen bei Kernkomponenten des GID-Komplexes. Dabei zeigte sich, dass die meisten humanen Homologe in Hefe nicht funktional sind. In einem Nebenprojekt wurde zudem die Spezifität von humanem ATE1, NTAN1 und NTAQ1 untersucht, wobei Unterschiede zwischen diesen Enzymen und ihren Hefehomologen festgestellt wurden. Insgesamt liefert diese Arbeit eine Charakterisierung von Gid11, seiner Substratspezifität sowie Schlüsselfaktoren, die für seine Funktion notwendig sind. Außerdem werden mögliche Ansätze zur Identifizierung weiterer, bislang unbekannter Substratrezeptoren des GID-Komplexes aufgezeigt.