Interactions between extracellular vesicles, nanoparticles and cells in the presence of a protein corona

Abstract

Controlling the in vivo targeting of synthetic nanocarriers is one of the major obstacles impairing their clinical translation. This is mainly caused by the high level of complexity involved in the targeting, the dynamic change of the in vivo environment, and a lack of knowledge concerning the molecular determinants guiding this process. After injection of nanocarriers into the bloodstream a layer of biomolecules, mostly proteins, rapidly adsorb to the surface of the nanocarrier. This layer, called protein corona, adds another level of complexity as it is determined by the physico-chemical properties of the carrier and in turn influences its behavior in the in vivo environment. Thus, when designing a nanocarrier, the influence on the protein corona composition needs to be considered as well. Here, PEGylation, which increases the hydrophilicity of the carrier surface, is often used to prolong the blood circulation time. This is accompanied by the reduction of unspecific uptake into immune cells, which is in favor of targeted delivery. As a next step in the targeting process, the nanocarriers need to accumulate at the target site, for example in the tumor tissue. To achieve this a plethora of targeting ligands for many different target sites have been developed. Finally, the nanocarrier must overcome several biological barriers such as tissue barriers, the cell membrane, or intracellular barriers, which led to the development of functional moieties that facilitate barrier crossing. One approach to designing a multi-functional nanocarrier is to use a modular building principle and attach several different functional moieties to the nanocarrier surface. An alternative that does not require a rational design of the carrier surface is using biologically derived membranes as nanocarrier surface coating. Such membranes can be derived from cells but recently small vesicles, termed extracellular vesicles, became of interest as drug delivery vehicles. EVs serve as a transport system for biological cargo between distant cells. Therefore, it is hypothesized that they are naturally equipped with a variety of functionalities needed for navigating the in vivo environment. In this work, we aimed to explore different aspects of using EV mem-branes as a multi-functional surface coating for drug delivery nanocarriers. Sections 3.1 and 3.2 focus on developing a strategy to package synthetic nanocarriers into EVs without impairing their membrane integrity as it is crucial to their functionality. Here, we developed a strategy to utilize the cellular EV biogenesis pathway to directly package the NPs during the biogenesis of EVs. We hypothesize that this prevents damage to the EV membrane or the embedded proteins. While we used polystyrene NPs as model NPs for developing a general packaging protocol in Section 3.1, we used this protocol as a blueprint for packaging therapeutically relevant silica nanocapsules in Section 3.2. The purification protocol developed here is based on size exclusion chromatography, which is a commonly used gentle extra-cellular vesicle purification method. The success of our packaging strategy was confirmed by fluorescence cross-correlation spectroscopy, which identified a packaging rate of 3-7%. Section 3.3 aimed to understand the influence of the protein corona on the exocytosis of silica NPs as exocytosis is a pre-requisite for harvesting NPs packaged in extracellular vesicles. Therefore, the presence or absence of a protein corona could be one parameter for optimization of the packaging protocol. Here, we found that the presence of a plasma protein corona enhances exocytosis in an NP diameter-dependent manner. The exocytosis of larger silica NPs (100 nm) was enhanced by the presence of a corona, whereas the exocytosis of smaller silica NPs (10 nm) was not affected. Aside from gaining insight into parameters relevant to the optimization of packaging, this section also contributes important insights into the relation between protein corona formation and NP exocytosis. This aspect has not yet been addressed by NP protein corona research. In the last section, we aimed to investigate the protein corona composition of the extracellular vesicles used for packaging the NPs in sections 3.1 and 3.2. Here, we compared the protein corona of extracellular vesicles to liposomes as this is the synthetic nanocarrier type most similar to extracellular vesicles. We found that the protein corona of extracellular vesicles increased the uptake in immune cells similar to the effect observed for liposomes. In vivo, this is associated with rapid blood clearance and impairs efficient drug delivery to target cells. These findings have implications for using extracellular vesicles as surface coating and suggest that further modifications of the EV membrane might be needed. Beyond the usage of extracellular vesicles for drug delivery, these findings are valuable to understanding the basic biology of extracellular vesicles.

Nanopartikel so zu gestalten, dass sie im menschlichen Körper an ihren Wirkort gelangen, ist immer noch eine große Herausforderung in der Nanomedizin. Die Hauptgründe hierfür sind das hohe Maß an Komplexität, die dynamischen Verhältnisse im menschlichen Körper und die immer noch bestehenden Wissenslücken der molekularen Details eines gezielten Wirkstofftransports. Nachdem die therapeutischen Nanopartikel in die Blutbahn des Patienten injiziert wurden, lagern sich verschiedenste Biomoleküle, hauptsächlich Proteine, an. Diese Proteinschicht wird als Protein Corona bezeichnet und bestimmt maßgeblich die Interaktion der Nanopartikel mit der biologischen Umgebung. Da die Zusammensetzung und Wirkung der Protein Corona durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Nanopartikels bestimmt wird, muss diese beim Design der Partikeloberfläche mitbeachtet werden. Eine der meist verwandtesten Modifizierungen ist die PEGylierung, die die Hydrophobizität der Nanopartikeloberfläche verringert. Dies beeinflusst die Protein Corona, sodass sich die Blutzirkulationszeit der Nanopartikel erhöhet, indem die unspezifische Aufnahme durch verschiedene Immunzellen gehemmt wird. Insgesamt wird der gezielte Wirkstofftransport dadurch verbessert. Als weiteren Schritt müssen sich die therapeutischen Nanopartikel im Zielgewebe, wie zum Beispiel einem Tumor, anreichern. Hierzu wurden zahlreiche Liganden entwickelt, die ziel-gerichtet an bestimmte Zellen oder Gewebe binden. Als letzten Schritt müssen die Nanopartikel verschiedene biologische Barrieren überwinden, was ebenfalls zur Entwicklung funktionaler Liganden führte. Daraus ergibt sich die Möglichkeit die Nanopartikeloberfläche nach dem Baukastenprinzip mit verschiedenen funktionalen Liganden zu modifizieren. Alternativ dazu können biologische Membranen für die Funktionalisierung von Nanopartikeln verwendet werden. Hierbei muss man nicht auf rationale Designprinzipien zurückgreifen, sondern kann eine Membran verwenden, die schon über die gewünschten Eigenschaften verfügt. Hierfür eignet sich besonders die Membran von Extrazellulären Vesikeln, da diese im menschlichen dafür zuständig sind Biomoleküle zwischen weit-entfernten Zellen zu transportieren. Man spekuliert, dass diese Vesikel deshalb über alle relevanten Eigenschaften für ein Wirkstofftransportsystem verfügen. In der vorliegenden Arbeit wollen wir deshalb die Möglichkeit untersuchen die Vesikelmembran für eine funktionale Beschichtung von Nanopartikeln zu verwenden. Im ersten und zweiten Abschnitt beschäftigen wir uns damit eine Methode zu entwickeln, um die zelluläre Biogenese-Maschinerie für die Verpackung der Nanopartikel in Extrazelluläre Vesikel zu nutzen. Für die Etablierung eines vorläufigen Protokolls in Abschnitt 3.1 haben wir zunächst Polystyrol-Nanopartikel benutzt. Die dar-aus gewonnen Erkenntnisse haben wir dann in Abschnitt 3.2 für die Verpackung von kleineren, relevanteren Silika-Nanokapseln angewendet. Für die Isolierung der Vesikel haben wir Größenausschlusschromatographie angewendet, um die Vesikelmembran oder darin eingebettete Proteine nicht zu beschädigen. Den Erfolg der Verpackung von Silika-Nanokapseln konnten wir schließlich mit Hilfe von Fluoreszenz-Cross-Correlation-Spektroskopie nachweisen. In Abschnitt 3.3 haben wir den Einfluss der Protein Corona auf die Exocytose von Silika-Nanopartikeln untersucht, da die Exocytose eine Voraussetzung dafür ist, Nanopartikel aus dem Zellkulturüberstand isolieren zu können. Hierbei haben wir herausgefunden, dass die Anwesenheit einer Protein Corona für eine verstärkte Nanopartikel-Exocytose sorgt. Dieser Effekt war allerdings von dem Durchmesser der verwendeten Nanopartikel abhängig. Für große Nanopartikel (100 nm) war dieser Effekt besonders ausgeprägt, wohingegen die Exocytose von kleinen Nanopartikeln (10 nm) nicht durch die Protein Corona beeinflusst wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Protein Corona ein möglicher Parameter ist, den man für die Optimierung des Verpackungsprotokolls anpassen könnte. Darüber hinaus sind die Ergebnisse auch von Interesse für die Protein Corona-Forschung. Hier wurde bis-lang der Einfluss der Protein Corona auf die Endozytose von Nanopartikeln unter-sucht. Dass diese auch die Exocytose beeinflusst, ist eine neue Erkenntnis. Im letzten Abschnitt wurde die Zusammensetzung der Protein Corona von Extrazellulären Vesikeln untersucht und mit der von Liposomen verglichen. Liposome sind für diesen Vergleich besonders interessant, da sie diejenige Klasse synthetischer Wirkstofftransportsysteme sind, die den zellulären Vesikeln am ähnlichsten sind. Hier haben wir herausgefunden, die Protein Corona der Vesikel, sowie der Liposome, die Aufnahme in Immunzellen fördert. In vivo ist dies mit einer verkürzten Blutzirkulationszeit assoziert und reduziert den zielgerichteten Wirkstofftransport. Diese Erkenntnisse implizieren, dass weiter Modifizierungen der Extrazellulären Vesikel nötig sein könnten, um sie erfolgreich für eine funktionale Beschichtung von Nanopartikeln einsetzen zu können. Darüber hinaus tragen diese Erkenntnisse zum grundlegenden Verständnis der Biologie der Extrazellulären Vesikel bei.