Authors:	Feiden, Sandra
Title:	Eine neue Form der Pyruvatkinase in Säugerspermien
Online publication date:	22-Jan-2007
Year of first publication:	2007
Language:	german
Abstract:	Nach Homogenisation ejakulierter Eberspermien und Zentrifugation des Homogenates blieben mehr als 60% der Aktivität des glykolytischen Enzyms Pyruvatkinase (PK) an Zellfragmenten im Sediment gebunden. Diese strukturgebundene PK wurde als PK-S bezeichnet. Das Detergenz Triton X-100 führte nicht zur Ablösung der PK-S; mit Trypsin konnten jedoch rund 80% der PK-S ohne Verlust an Aktivität von den Strukturen gelöst und durch kombinierte Kationenaustausch- und Hydrophobizitätschromatographie gereinigt werden (spezifische Aktivität: 116,7 U/mg Protein). Die lösliche PK aus Eberspermien konnte ebenfalls durch ein ähnliches Verfahren angereichert werden. Im Gel (SDS-PAGE) zeigten die Untereinheiten der PK-S mit 64.400 eine geringfügig größere relative Molekülmasse als die der PK-M1 aus Kaninchenmuskel (62.000). Die kinetischen Eigenschaften der abgelösten PK-S als auch der noch an Spermienstrukturen gebundenen PK-S und der löslichen PK aus Eberspermien waren sehr ähnlich und entsprachen der M1-Isoform der PK. Antikörper gegen Kaninchenmuskel-PK (Anti-PK-M1) reagierten auch mit der löslichen PK und der PK-S aus Eberspermien. Edman-Abbau der ersten 19 Aminosäuren zeigte, dass die tryptisch abgelöste PK-S am N-Terminus um 5 Aminosäuren gegenüber nativer PK-M1 verlängert ist, während der C- Terminus der erhaltenen PK-S-Sequenz mit einem meist nahe dem N-Terminus gelegenen Sequenzabschnitt der PK-M1 und -M2 übereinstimmt. Die N-terminale Verlängerung der nativen PK-S enthält sicherlich mehr als die nach tryptischer Lyse nachgewiesenen 5 Aminosäuren. Vergleiche der Aminosäure- und übersetzten Nukleotidsequenzen sowie die kinetischen Eigenschaften lassen vermuten, dass die PK-S, wie die PK-M1 und PK-M2, vom PKM-Gen codiert wird. Gegen die gereinigte PK-S wurden Antikörper in Kaninchen produziert. Da das Antiserum nicht ausreichend spezifisch für PK-S war, wurden aus ihm affinitätschromatographisch Antikörper (Anti-PK-S) isoliert, die hohe Affinität zu einem synthetisierten PK-S-Peptid (13 N-terminale Aminosäuren der tryptisch abgelösten PK-S) hatten. Dieses Anti-PK-S-Präparat war spezifisch für PK-S; es reagierte weder mit Kaninchenmuskel-PK noch mit löslicher PK oder anderen Proteinen aus Eberspermien. Anti-PK-S und Anti-PK-M1 wurden zur Lokalisierung von PK-S und löslicher PK in Spermien von Eber, Bulle und Mensch sowie in Schnitten von Eberhoden eingesetzt. Mit Anti-PK-S wurden der Bereich des Akrosoms und das lange flagellare Hauptstück sowie der Übergangsbereich zwischen Kopf und Mittelstück von Eberspermien fluoreszenzmarkiert, wogegen das kurze, die Mitochondrien enthaltende Mittelstück des Flagellums und der postakrosomale Kopfbereich nur mit Anti-PK-M1 markiert wurden. Immunogoldmarkierung in elektronenmikroskopischen Bildern bestätigte die Lokalisierung von PK-S im Akrosombereich. Im Hauptstück banden Anti-PK-M1 und Anti-PK-S an die fibröse Scheide. Glyzerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) konnte von mir ebenfalls im Akrosombereich, im Übergangsbereich zwischen Kopf und Mittelstück und an der fibrösen Scheide detektiert werden. Auch an Bullen- und Humanspermien konnte über Immunogoldmarkierung PK und vermutlich GAPDH an der fibrösen Scheide gezeigt werden. Im Akrosombereich dieser Spermien waren die Nachweise von PK und GAPDH jedoch nicht sicher. In Eberhodenschnitten war die PK-S erstmals, oder zumindest vermehrt, in den elongierenden Spermatiden über Fluoreszenzmarkierung nachweisbar, während andere, vermutlich somatische PK vermehrt in den früheren Stadien (Spermatogonien, aber auch in den Spermatozyten und runden Spermatiden) auftrat. Für die GAPDH zeigte sich ein ähnlicher Entwicklungsverlauf. Die Ergebnisse zeigen, dass in Eberspermien zwei Isoformen der PK auftreten: eine N-terminal verlängerte, strukturgebundene Form, die PK-S, und eine lösliche Form, die beide der PK-M1 ähneln. Der ungewöhnliche N-Terminus der PK-S dient vermutlich der spezifischen räumlichen Anordnung der PK-S im Akrosombereich und an der fibrösen Scheide, nicht aber der Modulation kinetischer Eigenschaften. Meine Untersuchungen stützen die Hypothese, dass in bestimmten Kompartimenten von Säugerspermien die Glykolyse durch Verankerung einiger ihrer Enzyme strukturell hochgeordnet ist. Dadurch wird vermutlich die Versorgung der Mitochondrien-freien Regionen mit ATP sichergestellt. Man kann diese Organisation als Anpassung des Stoffwechsels von Spermien deuten, bei denen die Mitochondrien in einem kleinen Bereich (Mittelstück) hinter dem Spermienkopf kompartimentiert sind. Im Hauptstück des Flagellums könnte die Glykolyse ATP für die Spermienmotilität liefern, im Akrosombereich für die Verhinderung einer vorzeitigen Akrosomreaktion. Somit käme der strukturierten Glykolyse eine essentielle Bedeutung für die Befruchtungsfähigkeit von Säugerspermien zu. After centrifugation of homogenized ejaculated boar sperm only about the third of pyruvate kinase (PK) was found in the supernatant while more than 60% of the activity of this glycolytic enzyme was bound to cell fragments in the sediment. The structure-bound PK, designated as PK-S, could not be solubilized with the detergent Triton X-100, but trypsin released about 80% of PK-S from the structures with no loss of catalytic activity. PK-S thus solubilized was purified by a combination of cation exchange and hydrophobic interaction chromatography (specific activity: 116.7 U/mg protein). By similar methods the soluble PK from boar sperm could also be purified. Gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed the subunit of PK-S to have a higher relative molecular mass (64,400) than that of PK-M1 from rabbit muscle (62,000). The kinetic properties of all forms of pyruvate kinase, solubilized PK-S, PK-S still bound to cell structures as well as soluble PK, were not significantly different from each other and very similar to those of the M1-isoform of PK. Antibodies against rabbit muscle PK (anti-PK-M1) reacted with both, the soluble PK and the PK-S from boar sperm. Partial Edman degradation of the tryptically solubilized PK-S (19 amino acids) revealed that the first 5 amino acids towards the N-terminus were not present in native PK-M1 whereas following amino acids were homologous to a sequence near the N-termini of PK-M1 and -M2. The N-terminal extension of the native PK- S is certainly longer than the first 5 amino acids of the tryptically solubilized PK-S. Comparison of amino acid sequences and translated nucleotide sequences as well as the kinetic properties lead to the assumption that PK-S, like PK-M1 and PK-M2, is encoded by the PKM-gene. Antibodies against purified PK-S were raised in rabbit. As the resulting antiserum was not sufficiently specific for PK-S, those antibodies that had high affinity for a synthesized PK-S-peptide (13 N-terminal amino acids of the tryptically solubilized PK-S) were isolated from the antiserum by affinity chromatography. This antibody fraction (anti-PK-S) was specific for PK-S; it reacted neither with rabbit muscle PK nor with soluble PK or other proteins from boar sperm. Anti-PK-S and anti-PK-M1 were used to localize PK-S and to differentiate between PK-S and soluble PK in sperm from boar, bull and man as well as in sections of boar testis. With anti-PK-S fluorescence-labelling was seen in the acrosomal region and the long flagellar principal piece as well as the head-midpiece junction of boar sperm whereas the flagellar midpiece, where all sperm mitochondria are concentrated, and the postacrosomal region of the head were only labelled with anti-PK-M1. Immunogold labelling in electron micrographs confirmed the localization of PK-S in the acrosomal region. In the principal piece labelling with both, anti-PK-M1 and anti-PK-S was found at the fibrous sheath. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was also detected in the acrosomal region, at the head-midpiece junction and at the fibrous sheath. Immunogold labelling of sperm from bull and man also showed PK and presumably GAPDH at the fibrous sheath. However, in the acrosomal region of these sperm the localization of PK and GAPDH needs further study. In sections of boar testis showing spermatogenesis, PK-S was first detected in elongating spermatids as shown by fluorescence labelling, while presumably somatic PK occurred mainly in preceding germ cell stages (such as spermatogonia, but also spermatocytes and round spermatids). GAPDH showed a similar developmental course of time. The results indicate that there exist two isoforms of PK in boar sperm which both resemble to PK-M1: An N-terminally extended, structure-bound form (PK-S) and a soluble form. The unusual N-terminus of PK-S presumably serves a specific spatial arrangement of PK-S in the acrosomal area and at the fibrous sheath of sperm rather than modulation of kinetic properties of the enzyme. My findings support the hypothesis that in defined compartments of mammalian sperm glycolysis is structurally organized by anchoring some of its enzymes. This probably serves supplying the mitochondria-free regions of sperm with glycolytic ATP. Such an organization can be interpreted as an adaptation to meet the ATP demand of sperm metabolism, in which all mitochondria are confined to a small region (midpiece) behind the sperm head. In the principal piece of the flagellum, glycolysis could supply ATP for sperm motility and in the acrosomal area to control the acrosomal reaction. Thus the structural organization of glycolysis might be essential for the ability of mammalian sperm to fertilize an egg.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-921
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-12544
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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