Authors:	Fung, Jia Jun
Advisor:	Khmelinskii, Anton
Title:	Dissecting protein quality control mechanisms of mislocalized proteins
Online publication date:	15-Feb-2023
Year of first publication:	2023
Language:	english
Abstract:	Protein homeostasis plays an important role in maintaining a healthy proteome within the cell with its quality control systems. The breakdown of protein homeostasis leads to the accumulation of mutated, misfolded, damaged, and mislocalized proteins, many of which are associated with various diseases. Mislocalized proteins are proteins that fail to reach their native compartment or assemble into their native complexes. Mislocalization can occur due to intrinsic inefficiencies of targeting, folding, trafficking, or complex assembly. Various diseases have been associated with or arise due to mislocalization of proteins, and furthermore, the extent of mislocalization increases with aging and in aneuploidy. It is therefore important to better understand the cellular mechanisms that handle mislocalized proteins. To this end, I sought to systematically identify proteins that are degraded upon mislocalization and then dissect and characterize the properties of these proteins. In order to accomplish this, I established a proteome-wide platform to study the fate of mislocalized proteins upon overexpression of individual proteins using a tandem fluorescent protein timer tag. The tag provides information on protein abundance and turnover. Using this approach, I screened 4211 proteins for their behaviour upon overexpression at different levels using low and high copy plasmids with endogenous and GAL1 promoters. My results show that ~15% of proteins are attenuated upon overexpression with a 2µ plasmid with endogenous promoters. These proteins are distinct from proteins that were attenuated in aneuploidy conditions. In addition, the main characteristics of the attenuated proteins are that they are enriched for subunits of complexes and essential genes, are highly synthesized, and have long half-lives. Aside from the 15% of attenuated proteins, I also found that another ~8% of proteins were destabilized but not attenuated upon overexpression. I showed evidence from the data and the protein properties that support my hypothesis for various methods that the cell may be using to manage and deal with protein mislocalization upon overexpression, depending on the protein’s change in protein levels and stability. I am able to show that the data also recapitulates the known degradation of cytosolic ribosomal proteins upon overexpression, however, the mitochondrial ribosomal proteins lack any attenuation. In fact, there was a depletion of mitochondrial proteins from the attenuated proteins. Only with an even stronger overexpression, I see attenuation of more mitochondrial proteins but still very minimal for the mitochondrial ribosomal proteins. I also showed that in general, the tagged mitochondrial proteins still localize correctly upon overexpression of an untagged version of the protein. The lack of attenuation of mitochondrial proteins did not change with increased growth temperature or on non-fermentable media. Focusing on the subunits of complexes, I found that not all subunits within a complex were similarly attenuated. This difference in attenuation behaviour is likely not due to synthesis rates or half-lives, but rather, presence of chaperones or direct interaction partners, assembly factors, and assembly sequence of a complex. Through overexpressing and knocking out every partner subunit within the ER membrane complex, I was able to dissect and propose an assembly model for this complex with the information on its structure. I tested several other complexes but not all were clear and easily interpretable. Based on my research, I present a large dataset of proteins that are attenuated upon overexpression which can be used to further dissect the protein quality control mechanisms that deal with mislocalized proteins. My research paves the way for further research into the proteins that are attenuated and/or destabilized upon overexpression and the likely mechanisms that are in play for each. I also present a method to dissect the assembly sequence of a complex and subunit pairs that are interdependent for stability. Die Proteinhomöostase spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines gesunden Proteoms innerhalb der Zelle mit ihren Qualitätskontrollsystemen. Eine Störung der Proteinhomöostase führt zur Anhäufung mutierter, fehlgefalteter, beschädigter und fehllokalisierter Proteine, von denen viele mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung stehen. Fehllokalisierte Proteine sind Proteine, die ihr natives Kompartiment nicht erreichen oder sich nicht zu ihren nativen Komplexen zusammenfügen. Die Fehllokalisierung kann auf intrinsische Ineffizienzen bei der Zielbestimmung, der Faltung, dem Transport oder der Komplexbildung zurückzuführen sein. Verschiedene Krankheiten sowie deren Entstehung werden mit der Fehllokalisierung von Proteinen in Verbindung gebracht. Des Weiteren nimmt das Ausmaß der Fehllokalisierung mit dem Alter sowie bei Aneuploidie zu. Daher ist es wichtig, die zellulären Mechanismen, die mit fehllokalisierten Proteinen umgehen, besser zu verstehen. Zu diesem Zweck habe ich versucht, systematisch Proteine zu identifizieren, die bei Fehllokalisierung abgebaut werden, und dann die Eigenschaften dieser Proteine zu analysieren und zu charakterisieren. Dazu habe ich eine proteomweite Plattform etabliert, um das Schicksal fehllokalisierter Proteine während der Überexpression einzelner Proteine mit Hilfe eines Tandem-Fluoreszenzprotein-Timer-Tags zu untersuchen. Der Tag liefert Informationen über die Abundanz und den Umsatz von Proteinen. Mit diesem Ansatz untersuchte ich 4211 Proteine auf ihr Verhalten bei verschiedenen Graden der Überexpression unter Verwendung von Plasmiden mit niedriger und hoher Kopienzahl und endogenen und GAL1-Promotoren. Meine Ergebnisse zeigen, dass bei der Überexpression mit einem 2µ-Plasmid und Verwendung von endogenen Promotoren ungefähr 15 % der Proteine vermindert nachweisbar sind. Diese Proteine unterscheiden sich von den Proteinen, die unter Aneuploidiebedingungen vermindertnachweisbar waren. Darüber hinaus sind die Hauptmerkmale dieser Proteine eine Anreicherung von Untereinheiten von Komplexen und essentiellen Genen, dass sie in hohem Maße synthetisiert werden und eine lange Halbwertszeit haben. Neben den 15 % der vermindert nachweisbaren Proteine habe ich auch festgestellt, dass weitere 8 % der Proteine durch Überexpression zwar destabilisiert, aber nicht vermindertnachweisbar wurden. Diese Daten, sowie die Eigenschaften der Proteine, unterstützen meine Hypothese über verschiedene mögliche Methoden, mit denen die Zelle die Fehllokalisierung von Proteinen abhängig von deren Menge und Stabilität bewältigen kann. Ich kann zeigen, dass die Daten auch den schon bekannten Abbau der zytosolischen, ribosomalen Proteine bei Überexpression aufzeigen, während bei den mitochondrialen,ribosomalen Proteinen keine Verminderung zu verzeichnen ist. Vielmehr waren unter den vermindert nachweisbaren Proteinen nur wenige mitochondriale Proteine. Erst bei einer noch stärkeren Überexpression sehe ich eine Verminderung von mehr mitochondrialen Proteinen, aber immer noch eine sehr minimale für die mitochondrialen, ribosomalen Proteine. Des Weiteren habe ich gezeigt, dass die getaggten mitochondrialen Proteine im Allgemeinen auch bei Überexpression einer nicht markierten Version des Proteins korrekt lokalisiert werden. Die fehlende Reduktion der mitochondrialen Proteine änderte sich nicht bei erhöhter Wachstumstemperatur oder auf nicht fermentierbaren Medien. Bei der Betrachtung der Untereinheiten von Komplexen stellte ich fest, dass nicht alle Untereinheiten innerhalb eines Komplexes in gleicher Weise reduziert waren. Dieser Unterschied im Verhalten ist wahrscheinlich nicht auf die Syntheseraten oder Halbwertszeiten zurückzuführen, sondern vielmehr auf das Vorhandensein von Chaperonen oder direkten Interaktionspartnern, Assembly-Faktoren und der Assembly-Sequenz eines Komplexes. Durch Überexpression und Knock-Out aller Partner-Untereinheiten des ER-Membrankomplexes konnte ich ein Modell für den Zusammenbau des Komplexes mit den Informationen über seine Struktur erstellen. Ich habe mehrere andere Komplexe getestet, aber nicht alle waren klar und leicht zu interpretieren. Auf der Grundlage meiner Forschung präsentiere ich einen großen Datensatz von Proteinen, die bei Überexpression vermindert nachweisbar werden. Dies kann zur weiteren Analyse der Qualitätskontrollmechanismen, die mit fehllokalisierten Proteinen zu tun haben, genutzt werden. Meine Forschung ebnet den Weg für die weitere Erforschung der Proteine, die bei Überexpression reduziert und/oder destabilisiert werden, sowie der wahrscheinlichen Mechanismen, die dabei im Spiel sind. Außerdem stelle ich eine Methode vor, mit der sich die Aufbaureihenfolge eines Komplexes und der Untereinheitenpaare, die für ihre Stabilität voneinander abhängig sind, aufschlüsseln lassen.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-8549
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-6cf2c1fc-2d78-47a2-b35d-91752120e47d4
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XI, 128 Seiten ; Illustrationen, Diagramme
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