Autoren:	Weis, Sylvia
Titel:	Einfluss des Calcium-sensitiven Rezeptors auf die Expression von miRNA im Hinblick auf eine Knochenmetastasierung des Nierenzellkarzinoms Influence of the calcium-sensing receptor (CaSR) on miRNA expression in regard to bone metastasis of renal cell carcinoma
Online-Publikationsdatum:	5-Okt-2022
Erscheinungsdatum:	2022
Sprache des Dokuments:	Deutsch
Zusammenfassung/Abstract:	Kommt es beim Nierenzellkarzinom zur Ausbildung von Fernmetastasen, sinkt die Prognose und Überlebensrate rapide ab. Auch heute bieten die Therapieoptionen in diesem Stadium lediglich eine Verlängerung des progressionsfreien Überlebens um wenige Monate. Ein bevorzugtes Organ für die Metastasierung des NZK sind die Knochen, in die der Tumor in 30 % der Fälle streut. Diskutiert werden als Ursache hierfür das günstige Mikromilieu der Knochenmatrix sowie die hohe extrazelluläre Calcium-Konzentration in Verbindung mit dem Calcium-sensitiven Rezeptor (CaSR). Die intensive Erforschung der genauen zellulären Mechanismen der knochenspezifischen Metastasierung stellt im Hinblick auf die Entwicklung neuer Therapien weiterhin eine große Herausforderung dar. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des CaSR auf die Expression von miRNA im Hinblick auf eine knochenspezifische Metastasierung des Nierenzellkarzinoms untersucht. Dazu wurden als Modell 786-O Zellen, die mit dem CaSR transfiziert waren, eingesetzt und diese mit WT-Zellen verglichen. Mittels einer miRNA-Expressionsanalyse konnten zahlreiche signifikant veränderte miRNA im Vergleich von CaSR-Zellklonen und WT-Zellen jeweils ohne und nach Calcium-Behandlung identifiziert werden. Davon waren aufgrund von Literaturdaten die miRNA 23a, die miRNA 374b, die miRNA 181c, die miRNA 320c und die miRNA 424 im Hinblick auf die Fragestellung besonders interessant. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse konnten zu den ausgewählten miRNA mittels qRT-PCR überwiegend validiert werden. Die miRNA 374b und 320c zeigten in CaSR-Zellklonen einen Expressionsabfall im Vergleich zu WT-Zellen. Auch bei den Expressionslevel der miRNA 181c und 424 zeigte sich dieser Effekt in zwei der verwendeten CaSR-Zellklonen. Die miRNA 23a wies in CaSR-Zellklonen eine deutliche Expressionssteigerung nach Calcium-Behandlung auf und wurde in Calcium-behandelten CaSR-Zellklonen deutlich stärker als in Calcium-behandelten WT-Zellen exprimiert. Nach einer Hemmung des CaSR mit NPS2143 zeigte sich, dass der miRNA 23a-Expressionsanstieg nach Calcium-Behandlung um mehr als die Hälfte zurückging. Dies legte die Annahme nahe, dass die Expression der miRNA 23a durch den CaSR reguliert wird und dessen Aktivierung durch Calcium einen miRNA 23a-Expressionsanstieg bewirkt. Frühere Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigten bereits, dass mit einer CaSR-Expressionssteigerung verstärkte metastatische Eigenschaften wie die Zellproliferation, die Migration und Adhäsion einhergehen. Die Proliferation der Zellen war dabei nach Calcium-Behandlung im Vergleich zu WT-Zellen deutlich gesteigert. Nach den hier beschriebenen Ergebnissen bezüglich der miRNA 23a stellte sich nun die Frage, ob solche Eigenschaften durch die vom CaSR regulierte miRNA 23a ausgelöst werden. Deshalb wurde die miRNA 23a inhibiert und die Auswirkung dieser Hemmung auf die Prozesse Proliferation und Zellviabilität untersucht. Im Fall, dass die CaSR-bedingte erhöhte Proliferation durch miRNA 23a vermittelt wird, sollte unter miRNA 23a-Hemmung ein Proliferationsanstieg nach Calcium-Behandlung ausbleiben. Tatsächlich zeigte sich, dass die Proliferation der CaSR-Zellklone nach Calcium-Behandlung bei Hemmung der miRNA leicht verringert war. Auch die Viabilität der Zellen nahm bei miRNA 23a-Hemmung im Vergleich zur Negativkontrolle leicht ab. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die miRNA 23a durch den CaSR reguliert wird und eine Rolle in zellulären Signalwegen spielt, die zu verstärkten metastatischen Eigenschaften führt, wie z.B. der Zellproliferation oder der Viabilität. Aus diesem Grund leisten die Erkenntnisse über den CaSR und die miRNA 23a einen Beitrag zur Aufklärung der intrazellulären Signalwege in knochenmetastasierenden NZK-Zellen und könnten damit für die Entwicklung weiterer zielgerichteter Therapeutika und als prognostische Marker von großer Bedeutung sein. Once renal cell carcinoma (RCC) develops distant metastases, the prognosis and survival rate of the patient deteriorates enormously. Even today, treatment options at this stage only offer an extension of progression-free survival by a few months. A preferred organ for RCC metastasis is bone, where the tumor spreads in 30% of patients. The favorable microenvironment of the bone matrix and the high extracellular calcium concentration in conjunction with the calcium-sensing receptor (CaSR) seem to play a crucial role in this. Intensive research to reveal the exact cellular mechanisms of bone-specific metastasis remains a major challenge with regard to the development of new targeted therapies. In the present work, the influence of CaSR on the expression of miRNA was investigated with regard to bone-specific metastasis of clear renal cell carcinoma (ccRCC). For this purpose, a miRNA-array was performed using the ccRCC cell line 786-O, which was transfected with CaSR. Numerous significantly altered miRNAs were identified when CaSR cell clones were compared with wild-type (WT) cells, without and after activation of CaSR by calcium. Of these, miRNA 23a, miRNA 374b, miRNA 181c, miRNA 320c, and miRNA 424 were of particular interest based on data in the literature and with respect to the research question. The results of expression analysis could be validated to the selected miRNAs by qRT-PCR. miRNA 374b, miRNA 320c, miRNA 181c, and miRNA 424 showed a decrease in expression in calcium-treated CaSR cell clones versus calcium-treated WT cells. In contrast, there was a significant increase in expression of miRNA 23a in CaSR cell clones after calcium treatment, and miRNA 23a was expressed at significantly higher levels in calcium-treated CaSR cell clones than in calcium-treated WT cells. After inhibition of CaSR with its specific inhibitor, NPS2143, the miRNA 23a expression increase was observed to decrease by more than half after calcium treatment. This suggests that miRNA 23a expression is regulated by CaSR and its activation by calcium causes an increase in miRNA 23a expression. Previous results of our research group have shown that enhanced metastatic properties such as cell proliferation, migration, and adhesion potential are associated with CaSR overexpression. In this regard, cell proliferation was significantly increased after calcium treatment compared to WT cells. Following the results described concerning the relation between CaSR and miRNA 23a, the question arose whether such properties are induced by miRNA 23a. Further investigations were therefore performed by inhibiting miRNA 23a and analyzing the effect of this inhibition on proliferation and cell viability. In the case that increased proliferation is mediated by miRNA 23a, the proliferation increase after calcium treatment should be absent under miRNA 23a inhibition. Indeed, it was found that the proliferation and viability of CaSR cell clones was slightly decreased after calcium treatment when miRNA was inhibited. These results suggest that miRNA 23a is regulated by CaSR and plays a role in intracellular signaling pathways leading to enhanced metastatic properties, such as cell proliferation or viability. These findings on CaSR and miRNA 23a contribute to the elucidation of the mechanisms involved in bone metastasis and may therefore be of great importance to the development of targeted therapeutics and as prognostic markers.
DDC-Sachgruppe:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Veröffentlichende Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Organisationseinheit:	FB 04 Medizin FB 10 Biologie
Veröffentlichungsort:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-7616
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-3905ba1c-4663-479f-848c-25482c379d541
Version:	Original work
Publikationstyp:	Dissertation
Nutzungsrechte:	Urheberrechtsschutz
Informationen zu den Nutzungsrechten:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Umfang:	III, 114 Seiten, Illustrationen, Diagramme
Enthalten in den Sammlungen:	JGU-Publikationen