Authors:	Schott, Lina Katharina
Title:	Etablierung eines zellbasierten Reporter-Modells zur Untersuchung regulatorischer Mechanismen der Genexpression von Prothrombin
Online publication date:	9-Feb-2022
Year of first publication:	2022
Language:	german
Abstract:	Thrombin ist als Schlüsselprotein der Hämostase für die Generierung eines Thrombus zur Blutstillung und zur Wiederherstellung der Gefäßintegrität bei Gefäßverletzung von zentraler Bedeutung. Hierbei spielt nicht nur seine proteolytische Aktivität eine Rolle, die zur Aktivierung von Fibrinogen zu Fibrin ausschlaggebend ist. Desweiteren ist Thrombin durch Aktivierung von PAR-Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche zur Thrombozytenaktivierung fähig, welches zur Ausschüttung verschiedener für den Ablauf der Koagulation wichtigen Mediatoren führt (11). Neben seiner zentralen Rolle in der Hämostase spielt Thrombin außerdem wichtige Rollen in weiteren (patho)physiologischen Zuständen, darunter zählen die embryonale Entwicklung (194, 195, 269) und die Angiogenese (61, 62), aber auch inflammatorische Prozesse (71, 88) sowie die Tumorbiologie (52, 123). Obwohl die Funktion des Thrombins im Rahmen der Gerinnung, aber auch seiner weiteren Funktionen immer besser verstanden wird, ist bisher wenig bekannt über die Mechanismen, die der Regulation seiner Genexpression unterliegen und durch welche Faktoren diese beeinflusst wird. Mit der Etablierung eines hepatozytären Zellkulturmodells auf Basis der D-Insight Mauslinie wurde in der vorliegenden Arbeit hierfür ein praktikables Instrument etabliert. Mit diesem kann die F2 Expression und Prothrombin Sekretion der Hepatozyten in Echtzeit mittels der Lumineszenzreporter FLuc und RLuc nachverfolgt werden. Das Modell steht auch künftig für die weitere Nachverfolgung der F2 Genexpression und der weitergehenden Untersuchung stimulierender Substanzen zur Verfügung. Es konnte mithilfe dieses Modells eine von der Zellkonfluenz und der Inkubationsdauer unterschiedlich regulierte Genexpression gezeigt werden. Dieses legt die Existenz genregulierender Mechanismen nahe. Bei Betrachtung der Prothrombinsekretion ins Medium konnten zudem stets konstante Prothrombin Konzentrationen gezeigt werden, die einer stark variierenden F2 Genexpression unterlag. Dies könnte darauf hindeuten, dass eine hohe Prothrombinkonzentration im Medium einen negativen Feedbackmechanismus auf die F2 Expression bewirkt. Weiter wurde das F2 Expressionslevel mithilfe von Co-Kulturen (mit MEFs bzw. HeLas) untersucht. Hierbei konnte eine variierende F2 Genexpression in Reaktion auf diese unterschiedlichen Umgebungseinflüsse gezeigt werden. So wurde die F2 Expression in Co-Kulturen mit (ebenfalls physiologischerweise in der Leber ansässigen) Fibroblasten (MEFs) tendenziell induziert, während sie in der Co-Kultur mit malignen Tumorzellen (HeLas), signifikant induziert wurde. Hier könnten sowohl direkte interzelluläre Interaktionen (Zell-Zell-Interaktionen), als auch indirekte Interaktionen der Zellen durch ins Medium sezernierte Substanzen eine Rolle spielen. Da HeLa Zellen neben anderen proinflammatorischen Zytokinen und tumorassoziierten Proteinen auch Tissue Factor exprimieren, kann hier vermutet werden, dass eine Thrombinaktivierung stattfindet. Das aktivierte Thrombin könnte hier für die Induktion der F2 Genexpression verantwortlich sein. In diesem Zusammenhang wäre auch eine Induktion der F2 Expression durch erniedrigte Prothrombinkonzentrationen denkbar, die nach der stattgehabten Thrombin Generierung verbleiben. Weiter konnten unter direkter Stimulation der Zellen mit aktiviertem Thrombin sowie dem Thrombin-Inhibitor Argatroban die zuvor erhobenen Hinweise auf einen Trend zur Heraufregulation der Expression unter dem Einfluss aktivierten Thrombins bestätigt werden. Meine Ergebnisse liefern somit erste Anhaltspunkte für autoregulatorische Mechanismen, die der F2 Genexpression zugrunde liegen. Zudem ist davon auszugehen, dass eine Anpassung an pathologische Zustände potentiell durch weitere fremdregulatorische Mechanismen stimuliert werden. Eine direkte Applikation des sowohl inflammatorisch als auch tumorassoziierten Proteins MMP-1 führte ebenfalls zu einer Induktion der F2 Expression. Der Effekt könnte unter anderem durch eine katalytische Aktivierung von PAR-1 und einer nachfolgenden p38 MAP Kinase-Aktivierung erfolgen, die konsekutiv zu einer Induktion der F2 Expression führt. Eine Applikation des gerinnungshemmenden Therapeutikums Phenprocoumon zeigte keine Regulierung der F2 Expression, obschon seine klinische Anwendung dennoch sowohl bei hämostatischen als auch tumor-assoziierten Pathologien induziert sein kann. Letztlich können mithilfe des in dieser Arbeit etablierten D-Insight Zellkulturmodells in künftigen Forschungsprojekten nicht nur weitergehende direkte Zell-Zell-Interaktionen, sondern auch weitere indirekt auf die Zellen einwirkende Substanzen untersucht werden. Hierbei können insbesondere die Hinweise auf einen autoregulatorischen Mechanismus weiter spezifiziert und weitere mögliche Einflussfaktoren der F2 Genexpression in fortgeführten Screenings in großem Umfang identifiziert werden, mit letztlich potentiell therapeutischen Implikationen.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences 610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6738
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-9db8f02a-5624-4dcd-9bb6-c1da4e3c92685
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	V, 77 Seiten, Diagramme, Illustrationen
Appears in collections:	JGU-Publikationen