Authors:	Rodríguez Alvarez, Marta
Title:	Mutagenic bypass of abasic DNA lesions during DNA and RNA synthesis in human cells
Online publication date:	8-Feb-2022
Year of first publication:	2022
Language:	english
Abstract:	DNA molecules are constantly damaged by exogenous agents and endogenous cellular processes. The balance between repair and tolerance of the resulting DNA lesions is essential for the maintenance of genome integrity. DNA damage tolerance mechanisms allow cells to continue replication and transcription in the presence of damage. Unavoidably, lesion bypass by RNA or DNA polymerases comes at the expense of fidelity. During translesion DNA synthesis (TLS), specialised DNA polymerases enable replication opposite and beyond DNA lesions. However, their elevated rates of nucleotide misincorporation turn TLS into the major source of spontaneous mutations in human cells. Erroneous bypass of DNA lesions may also occur during transcription, promoting the generation of mutant transcripts in a process termed transcriptional mutagenesis (TM). The repeated translation of the mutated mRNAs can lead to the production and accumulation of abnormal proteins with pathogenic properties. Abasic DNA lesions are extremely frequent in the genome and bear a huge miscoding potential due to their inherent lack of genetic information. Despite the abundance of this type of damage, current knowledge about its mutagenic properties is far from complete and is generally based on biochemical data obtained in cell-free systems as well as genetic evidence in prokaryotes and lower eukaryotes. This work describes an innovative system for the direct detection of mutagenic bypass events via reporter reactivation assays in human cells. We design and generate a set of mutated EGFP reporters that encode for a non-fluorescent protein. The erroneous bypass of a specific lesion placed in the mutated nucleotide leads to the synthesis of a fluorescent EGFP protein that serves to quantify the miscoding capacity of the lesion. This approach is further applied in the characterisation of the erroneous bypass of abasic DNA lesions during DNA and RNA synthesis. Once the lesion is classified as mutagenic, analysis of the transcripts via RNA sequencing allows the determination of its mutation profile. By placing repair-resistant abasic site analog tetrahydrofuran in the transcribed strand of these newly designed reporters, regain of EGFP fluorescence indicated that transcriptional mutagenesis occurs at the site of damage. The percentage of cells showing green fluorescence was a direct indication of TM events and it varied from 11% to 79% depending on the DNA repair capacity of the cell. Subsequent RNA sequencing analysis revealed that RNA pol II exclusively incorporates adenine at the lesion site. By using this novel TM assay as a tool to investigate repair, NER involvement in the repair of synthetic abasic lesions was shown for the first time in human cells. 2 To detect mutations introduced during DNA synthesis opposite AP sites, this lesion was incorporated at the mutated position in the non-transcribed strand of the reporter and opposite to a gap. After transfection into several human cells, regain of EGFP fluorescence indicated that bypass of natural abasic sites, as well as their synthetic counterpart tetrahydrofuran, occurred mostly through adenine incorporation. Surprisingly, under the same conditions, natural abasic sites exhibited a different mutation profile as compared to tetrahydrofuran. While results showed that DNA polymerases mostly inserted adenine followed by guanine, cytosine, and thymine opposite natural AP sites, the incorporation of guanine was nearly absent opposite synthetic abasic lesions. This illustrates the importance of analyzing all chemical forms of a single adduct, which might lead to different mutagenic outcomes during DNA or RNA bypass events. The miscoding property of abasic DNA lesions presents a challenge for the fidelity of replicational or transcriptional bypass processes. Most of these lesions arise from depurination reactions and cytosine deamination. Therefore, adenine leading the mutation pattern induced by these lesions implies that most AP sites are likely to be mutagenic. Thus, abasic lesions become a key source of mutagenesis in human cells, which entails important biological consequences. On one hand, it is likely that AP sites derived mutagenesis works as an important source of genetic diversity during evolution. On the other hand, mutations arising from the bypass of these lesions may play a critical role in cancer development and aggravation of degenerative diseases. In future studies, we can extend the established TM and TLS assays to investigate mutagenic bypass occurring at different DNA modifications. In addition, establishing the mutation pattern of additional DNA lesions can help to track the sources of mutations encountered in a broad range of human cellular backgrounds. Die DNA ist täglich exogene Agenzien und endogene zelluläre Prozessen ausgesetzt die Schäden im Genom verursachen können. Um die Integrität des Genoms aufrecht zu erhalten ist das Gleichgewicht zwischen Reparatur und Toleranz der resultierenden DNA-Läsionen essentiell. DNA-Schadenstoleranzmechanismen ermöglichen es den Zellen, Replikation und Transkription in Gegenwart von Schäden in der DNA-Matritze fortzusetzen, wobei eine Reduktion der Genauigkeit dabei unvermeidlich ist. Während der Transläsions-DNA-Synthese (TLS) ermöglichen spezialisierte DNA-Polymerasen die Replikation gegenüber von und über DNA-Läsionen hinweg. Die erhöhte Rate an Nukleotid-Fehleinbauten von TLS-Polymerasen eine Hauptquelle für spontane Mutationen in menschlichen Zellen. Eine fehlerhafte Umgehung von DNA-Läsionen kann auch während der Transkription auftreten. Dies fördert die Entstehung von Mutationen in RNA-Transkripten in einem Prozess der als transkriptionelle Mutagenese (TM) bezeichnet wird. Die wiederholte Translation der mangelhaften mRNAs kann zur Produktion und Akkumulation fehlerhafter Proteine mit pathogenen Eigenschaften führen. Abasische DNA-Läsionen (AP-Stellen) sind im Genom extrem häufig und bergen aufgrund ihres Mangels an genetischer Information ein enormes Potential zur Fehlkodierung. Trotz ihrer Häufigkeit ist das derzeitige Wissen über die mutagenen Eigenschaften von AP-Stellen bei weitem nicht vollständig und basiert hauptsächlich auf biochemischen Daten die in zellfreien Systemen gewonnen wurden und auf genetischen Nachweisen in Prokaryoten und niederen Eukaryoten. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Etablierung eines Verfahrens zum direkten Nachweis der fehlerhaften Umgehung von DNA-Schäden in menschlichen Zellen am Beispiel von AP-Stellen. Dieser Studie beschriebt das Design und die Optimierung eines innovativen Reporter-Reaktivierungs-Assays zur Detektion und Quantifizierung der fehlerhaften Umgehung von DNA-Läsionen. Dafür generierten wir ein Set von mutierten EGFP-Reportern, die für ein nicht-fluoreszierendes Protein kodieren. Durch das spezielle Design der Reporter führt die fehlerhafte Umgehung einer DNA-Läsion innerhalb des mutierten Nukleotids zur Expression eines fluoreszierenden EGFP-Proteins, was zur Quantifizierung der Fehlkodierung der Läsion verwendet werden kann. Nach seiner Optimierung wurde der Assay dafür verwandt die fehlerhafte Umgehung von AP-Stellen während der DNA- und RNA-Synthese zu charakterisieren. Wird die Läsion als mutagen eingestuft kann mittles RNA-Sequenzierung das Mutationsprofil der Transkripte bestimmt werden. Die Platzierung von Tetrahydrofuran, ein reparaturresistentes Analog von AP-Stellen, im transkribierten Strang dieser neu entworfenen Reporter führte zur Wiedererlangung der EGFP-Fluoreszenz was beweist, dass transkriptionelle Mutagenese an der DNA Läsion stattfand. Die Berechnung des Anteils grün fluoreszierender Zellen wies darauf hin, dass TM-Ereignisse an AP-Stellen mit einer Häufigkeit von 11% bis 79% stattfinden, in Abhängigkeit von der DNA-Reparaturkapazität der Zelle. Eine anschließende RNA-Sequenzierungsanalyse ergab, dass RNA pol II ausschließlich Adenin an der Läsionsstelle einbaute. Durch die Verwendung dieses neuartigen TM-Assays zur Untersuchung der DNA-Reparatur konnte außerdem zum ersten Mal die Beteiligung der Nukleotid-Exzisionsreparatur an der Behebung synthetischer AP-Stellen in menschlichen Zellen gezeigt werden. Um Mutationen die während der DNA-Synthese gegenüber AP-Läsion eingeführt wurden detektieren zu können, wurde eine AP-Stellen an der mutierten Position in den nicht-transkribierten Strang des Reporters und gegenüber einer Lücke eingebaut. Die Transfektion menschlicher Zellen zeigte die Wiedererlangung der EGFP-Fluoreszenz und dadurch die mutagene Umgehung von natürlichen AP-Stellen und synthetischen Tetrahydrofurans unter Einbau von Adenin. Überraschenderweise was das Mutationsprofil natürlichen AP-Stellen unter diesen Bedingungen ein anderes als das Mutationsprofil von Tetrahydrofuran. Während die Ergebnisse zeigten, dass DNA-Polymerasen gegenüber natürlichen AP-Stellen hauptsächlich Adenin, gefolgt von Guanin, Cytosin und Thymin einbauten, war der Einbau von Guanin gegenüber synthetischen natürlichen AP-Stellen fast nicht vorhanden. Dies zeigt wie wichtig es ist alle Formen eines einzelnen Addukts zu analysieren die bei DNA- oder RNA-Umgehungsereignissen zu unterschiedlichen mutagenen Ergebnissen führen können. Das Potential natürlicher AP-Stellen zur Fehlkodierung stellt eine Herausforderung für die Genauigkeit von Replikation und Transkription dar. Da die Mehrzahl der AP-Stellen durch Depurinierungsreaktionen und Cytosindesaminierung entstehen kann davon ausgegangen werden, dass die Umgehung dieser AP-Stellen unter vorrangigem Einsatz von Adenin zumeist mutagen ist. Dies macht natürlichen AP-Stellen zu einer Hauptmutationsquelle in menschlichen Zellen, was wichtige biologische Konsequenzen nach sich zieht. Einerseits ist es wahrscheinlich, dass die durch AP-Stellen eingeführten Mutationen als wichtige Quelle der genetischen Vielfalt während der Evolution fungierten. Andererseits können Mutationen, die durch die Umgehung dieser Läsionen entstehen, eine kritische Rolle bei der Krebsentwicklung und der Verschlimmerung degenerativer Krankheiten spielen. In zukünftigen Studien kann der etablierte TM- und TLS-Assay dazu verwendet werden die mutagene Umgehung verschiedenen DNA-Modifikationen zu untersuchen. Darüber hinaus kann die Bestimmung des Mutationsmusters zusätzlicher DNA-Läsionen dabei helfen, die Quellen von Mutationen zu verfolgen, die in einem breiten Spektrum menschlicher Zellen auftreten.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6588
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-55f25df2-01ea-41ba-b391-dbe965b437504
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	178 Seiten, Illustrationen
Appears in collections:	JGU-Publikationen