Authors:	Nowak, Christoph
Title:	Spektroelektrochemische Untersuchungen mittels oberflächenverstärkter Infrarotabsorptionsspektroskopie (SEIRAS) an Multi-Redox-Center-Proteinen in einer biomimetischen Membranumgebung
Online publication date:	29-Jul-2010
Year of first publication:	2010
Language:	german
Abstract:	Die optische Eigenschaften sowie der Oberflächenverstärkungseffekt von rauen Metalloberflächen sowie Nanopartikeln wurden intensiv für den infraroten Bereich des Spektrums in der Literatur diskutiert. Für die Präparation solcher Oberflächen gibt es prinzipiell zwei verschiedene Strategien, zum einen können die Nanopartikel zuerst ex-situ synthetisiert werden, der zweite Ansatz beruht darauf, dass die Nanopartikel in-situ hergestellt und aufgewachsen werden. Hierbei wurden beide Ansätze ausgetestet, dabei stellte sich heraus, dass man nur mittels der in-situ Synthese der Goldnanopartikel in der Lage ist nanostrukturierte Oberflächen zu erhalten, welche elektronisch leitfähig sind, nicht zu rau sind, um eine Membranbildung zu ermöglichen und gleichzeitig einen optimalen Oberflächenverstärkungseffekt zeigen. Obwohl keine ideale Form der Nanopartikel mittels der in-situ Synthese erhalten werden können, verhalten sich diese dennoch entsprechend der Theorie des Oberflächenverstärkungseffekts. Optimierungen der Form und Grösse der Nanopartikel führten in dieser Arbeit zu einer Optimierung des Verstärkungseffekts. Solche optimierten Oberflächen konnten einfach reproduziert werden und zeichnen sich durch eine hohe Stabilität aus. Der so erhaltene Oberflächenverstärkungseffekt beträgt absolut 128 verglichen mit dem belegten ATR-Kristall ohne Nanopartikel oder etwa 6 mal, verglichen mit der Oberfläche, die bis jetzt auch in unserer Gruppe verwendet wurde. Daher können nun Spektren erhalten werden, welche ein deutlich besseres Signal zu Rauschverhältnis (SNR) aufweisen, was die Auswertung und Bearbeitung der erhaltenen Spektren deutlich vereinfacht und verkürzt.rnNach der Optimierung der verwendeten Metalloberfläche und der verwendeten Messparameter am Beispiel von Cytochrom C wurde nun an der Oberflächenbelegung der deutlich größeren Cytochrom c Oxidase gearbeitet. Hierfür wurde der DTNTA-Linker ex-situ synthetisiert. Anschließend wurden gemischte Monolagen (self assembeld monolayers) aus DTNTA und DTP hergestellt. Die NTA-Funktionalität ist für die Anbindung der CcO mit der his-tag Technologie verantwortlich. Die Kriterien für eine optimale Linkerkonzentration waren die elektrischen Parameter der Schicht vor und nach Rekonstitution in eine Lipidmembran, sowie Elektronentransferraten bestimmt durch elektrochemische Messungen. Erst mit diesem optimierten System, welches zuverlässig und reproduzierbar funktioniert, konnten weitere Messungen an der CcO begonnen werden. Aus elektrochemischen Messungen war bekannt, dass die CcO durch direkten Elektronentransfer unter Sauerstoffsättigung in einen aktivierten Zustand überführt werden kann. Dieser aktivierte Zustand zeichnet sich durch eine Verschiebung der Redoxpotentiale um etwa 400mV gegenüber dem aus Gleichgewichts-Titrationen bekannten Redoxpotential aus. Durch SEIRAS konnte festgestellt werden, dass die Reduktion bzw. Oxidation aller Redoxzentren tatsächlich bei den in der Cyclovoltammetrie gemessenen Potentialen erfolgt. Außerdem ergaben die SEIRA-Spektren, dass durch direkten Elektronentransfer gravierende Konformationsänderungen innerhalb des Proteins stattfinden. rnBisher war man davon ausgegangen, aufgrund des Elektronentransfers mittels Mediatoren, dass nur minimale Konformationsänderungen beteiligt sind. Vor allem konnte erstmaligrnder aktivierte und nicht aktivierte Zustand der Cytochrom c Oxidase spektroskopisch nachweisen werden.rn The optical properties as well as the surface enhancement effect of rough metal surfaces and nanoparticles in the infrared were intensively discussed in the literature. There are two different strategies for preparing those nanostructured surfaces. First one can synthesize nanoparticles ex-situ and immobilize them on a surface in a second step. The second strategy bases on the fact, that it is possible to synthesize those particles in-situ with a parallel immobilization on an existing metal surface. Both techniques were tested in this thesis. It could be shown that electronically conductive surfaces with a high surface enhancement effect could only be prepared by the in-situ synthesis of those surfaces. Furthermore it was possible to form well and densely packed membranes which are required for immobilizing and stabilizing Cytochrome c Oxidase (CcO). Optimizing of the shape and dimension of the particles increased the surface enhancement effect of the discussed surface. The optimized enhancement effect is absolute 128 compared to the same, but bare ATR-crystal. Compared with the commonly used Osawa surface we have a six times higher surface enhancement effect. This new developed surface enabled us to take infrared spectra with an improved signal to noise ratio (SNR).rnAfter optimizing the new surface the surface concentration of CcO was optimized by varying the surface concentration of chelator molecules. Therefore we proceeded to replace the in situ by an ex situ synthesis to form the chelator, dithiobis(nitriloacetic acid butylamidyl propionate (DTNTA). To yield the optimal surface concentration of CcO the DTNTA was mixed with dithiopropionic acid (DTP). Packing density of the proteins turned out to be a crucial parameter. The NTA group of the DTNTA molecule is responsible for the immobilization of his-taged CcO molecules. Criteria for the optimal linker-concentration were the electrochemical parameters, which could be measured by cyclicvolammometry and impedance spectroscopy.rnWith this highly optimized system infrared measurements on CcO could be conducted. From electrochemical measurements it is known that the CcO can be transfered under aerobic conditions in a so called activated state. This state is characterized by an typical shift of the redox-potential of each redox-center by about 400 mV compared to titrations of the CcO in equilibrium. With surface enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) it could be shown that the reduction and oxidation of all redoxcenters at the electrochemical measured potentials takes place. Furthermore the IR-spectra show that huge conformational changes in the protein backbone take place during the electron transfer.rnSo far one assumed only little conformational changes during the electron transfer. This assumption based on mediator based measurements of the CcO. In the present work the activated and non activated form of the CcO have been shown spectroscopically.rn
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4645
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-23375
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	279 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen