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Autoren: Cramer, Jens-Michael
Titel: Einfluss verschiedener nanopartikulärer Systeme auf die zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität
Online-Publikationsdatum: 1-Mär-2013
Sprache des Dokuments: Deutsch
Zusammenfassung/Abstract: Die vorliegende Dissertation untersucht Nanopartikel und Nanokapseln aus verschiedenen Materialien mit verschiedenen Modifikationen für einen zielgerichteten Medikamententransport (Drug Targeting). Obwohl bisher zahlreiche Nanopartikel und -kapseln synthetisiert wurden, besteht nach wie vor hinsichtlich der zellulären Verträglichkeit, Biokompatibilität und Aufnahme kein allumfassendes Verständnis. Mit Hilfe der in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen und Ergebnissen soll ein Beitrag zur Schließung dieser Lücke geleistet werden.rnIm Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde der Einfluss der Herstellungsmaterialien PS, PLLA, PMMA, Biomakromoleküle (BSA, DNA), ggf. stabilisiert durch HPMA-LMA-Copolymere und neu-synthetisierte Surfmere, der Formmodifikationen Streckung und Kristallisierung, der Oberflächenmodifikationen mittels verschiedener Tenside und PEG auf die zelluläre Aufnahme und Verträglichkeit hin untersucht.rnZusammenfassend lässt sich die Aussage treffen, dass zahlreiche Materialien zur Herstellung von Trägersystemen geeignet sind und sich als biokompatibel und nicht-zytotoxisch erwiesen haben, sich jedoch stark hinsichtlich der Aufnahmeeffizienz in verschiedene Zelllinien unterscheiden. rnIm ersten Abschnitt (Kapitel 5.1) wurden in der ersten und zweiten Untersuchung auf allgemeine Parameter, die die Aufnahme von Nanopartikeln beeinflussen, eingegangen. Hier wurde der Einfluss des Alters von PLLA-Partikeln auf die zelluläre Aufnahme und Toxizität untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass mit zunehmender Materialalterung die zelluläre Aufnahme abnimmt. Eine Zytotoxizität konnte nicht gezeigt werden.rnWeiterhin wurde der Einfluss des FCS-Gehalts des Zell-Mediums auf die zelluläre Aufnahme von PMMA-Partikeln untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass mit einer steigenden FCS-Konzentration eine Abnahme der zellulären Aufnahme von PMMA-Partikeln einhergeht. Die höchste zelluläre Aufnahme konnte bei einem FCS-Gehalt des Zellmediums von 0,05% verzeichnet werden. rnIm zweiten Abschnitt (Kapitel 5.2) wurde die Stabilisierung von Nanopartikeln mittels neusynthetisierter Tenside und deren Einfluss auf die Zelle- Nanopartikel-Interaktionen untersucht. Dazu wurde zum einen die Oberflächenfunktionalisierung von Nanopartikeln mit Hilfe neu-synthetisierter „Surfmere“ und deren Einfluss auf die zelluläre Aufnahme und Toxizität untersucht. Die hergestellten Surfmere bewirken gleichzeitig eine Stabilisierung und Funktionalisierung der Nanopartikeloberfläche mit Phosphonatgruppen. Hier wurden kovalente „Surfmer“ stabilisierte Nanopartikel mit Tensid- (SDP) stabilisierten Nanopartikeln verglichen. Zudem wurden dialysierte Nanopartikel mit nicht-dialysierten verglichen. Bezüglich der zellulären Aufnahme konnte für die mittels Dialyse gereinigten Nanopartikel eine gute Aufnahme ohne Unterschiede zwischen den kovalent und nicht-kovalent Phosphonat-funktionalisierten Partikeln beobachtet werden. Die ungereinigten, SDP-stabilisierte, nicht-kovalent gebundene Nanopartikel zeigten hingegen eine bis zu 30% stärkere Aufnahme in die HeLa-Zellen und hMSCs.rnWeiterhin der Einsatz von mit HPMA-LMA-Copolymeren stabilisierte Polystyrol- und PLLA-Partikel, die den Einsatz von Tensiden während des Miniemulsionsprozesses überflüssig machen, untersucht. Auch hier konnte keine Zytotoxizität nachgewiesen werden. Die Aufnahme in HeLa-Zellen scheint mehr von der Größe der Nanopartikel als vom verwendeten Material und in hMSCs mehr von den Oberflächeneigenschaften der Nanopartikel abzuhängen.rnIm dritten Abschnitt (Kapitel 5.3) wird auf die Möglichkeit der Formmodifikation von Polystyrol-Partikeln und deren Einfluss auf die Nanopartikel-Zelle-Interaktionen eingegangen. Es geht dabei um die Aufnahme und Zytotoxizität von verstreckten (elongierten) Polystyrol-Partikeln im Vergleich zu sphärischen Nanopartikeln, sowie die Aufnahme und Zytotoxizität von kristallinen Polystyrol-Partikeln in verschiedene Zelllinien. Bei den verstreckten Partikeln nimmt die Aufnahme-Effizienz in HeLa-Zellen und hMSCs mit zunehmender Verstreckung ab. Eine Zytotoxizität konnte für keinen der erwähnten Nanopartikel nachgewiesen werden. Bei den Polystyrol-Partikeln unterschiedlicher Taktizität zeigen die kristallierten Polystyrol-Partikel eine geringfügig besser Aufnahme-Rate als die nicht-kristallierten Polystyrol-Partikel. Dabei zeigen die nach dem Herstellungsprozess mittels der Lösemittelverdampfungstechnik der wässrigen Phase entnommenen Partikel eine bessere Aufnahme als die nach der Verdampfung des Chloroforms verfügbaren Partikel. Insgesamt konnte jedoch für alle Polystyrol-Partikel trotz der unterschiedlichen Taktizitäten nach der Aufnahme in HeLa-Zellen und hMSCs mittels Durchflusszytometrie hohe Fluoreszenz-Intensitäten verzeichnet werden. Setzt man hohe Fluoreszenz-Intensitäten bei in Zellen aufgenommenen Partikeln mit guten Aufnahmeraten gleich, sind die hier dargestellten Aufnahmeraten als sehr gut zu bezeichnen. rnAuf Nanosysteme mit einer reduzierten zellulären Aufnahme wird im letzten Abschnitt (Kapitel 5.4) eingegangen. Dabei wird zum einen die unterschiedliche Oberflächenmodifikation von Polystyrol-Partikeln mit dem Co-Monomer PEG-MA und den Tensiden SDS und Lutensol AT50 untersucht. Von PEG-MA wurden zudem verschiedene Molekulargewichte (Mn=300 g•mol-1 und Mn=2080 g•mol-1) und verschiedene Konzentrationen (1,5%, 5%, 10%) eingesetzt. Ein Teil der Partikel wurde mit SDS und der andere Teil mit Lutensol AT50 hergestellt. In einem weiteren Schritt wurde das jeweilig gegenteilige Tensid (statt SDS Lutensol AT50 und umgekehrt) eingesetzt, um zu überprüfen, ob sich der zuvor beobachtete Effekt umkehren lässt. Anschließend wurde ein erst mit SDS stabilisierter Nanopartikel (BR01) mit verschiedenen Lutensol AT50-Anteilen (5%, 10%, 25%, 50%, 100%) redispergiert. Die effizienteste Aufnahme zeigte der unmodifizierte, mit SDS stabilisierte Nanopartikel BR01, die niedrigste der ebenfalls unmodifizierte, mit Lutensol AT50 stabilisierte Nanopartikel BR02. Eine steigende Konzentration des PEG-MA Mn=300 g•mol-1 hemmt die Aufnahme von mit SDS stabilisierten Partikeln konstant. Für PEG-MA Mn=2080 g•mol-1 konnte hingegen kein Einfluss nachgewiesen werden. Für die mit Lutensol AT50 stabilisierten Partikel konnte kein Einfluss von PEG-MA nachgewiesen werden. Daraus resultiert, dass der Einsatz von physikalisch adsorbiertem Lutensol AT50 die zelluläre Aufnahme effektiver hemmt als der Einsatz von kovalent gebundenem PEG-MA unterschiedlicher Kettenlänge.rnDer Einsatz von mit Biomakromolekülen hergestellten Nanokapseln, die mit zwei verschiedenen Tensiden (SDS und Lutensol AT50) stabilisiert wurden, wurde im Weiteren näher untersucht. Bei den mit SDS stabilisierten Kapseln erwiesen sich die mit ssDNA hergestellten Kapseln BN-54 und BN-55 als leicht toxisch für die HeLa-Zellen. Dagegen sind alle eingesetzten, mit Lutensol AT50 redispergierten Nanokapseln sowohl für HeLa-Zellen als auch für hMSCs zytotoxisch. Hier ist die toxische Wirkung auf das nicht-ionische Tensid Lutensol AT50 zurückzuführen. Eine zelluläre Aufnahme konnte für keine mit Biomakromolekülen hergestellten Nanokapsel nachgewiesen werden.rnDen Abschluss der Untersuchungen bildet die vergleichende Analyse der in dieser Arbeit mit dem Fluoreszenzfarbstoff PMI versehenen Partikeln hinsichtlich deren Aufnahme in HeLa-Zellen und hMSCs und deren zytotoxische Auswirkungen. In der vergleichenden Analyse werden die zuvor vorgestellten Ergebnisse für PMI-Partikeln nochmal im Kontext betrachtet. Dabei erwies sich sowohl für die HeLa-Zellen als auch für die hMSCs, dass die meisten Partikel eine geringe bis keine zelluläre Aufnahme zeigen. Eine gute Aufnahme konnte nur für wenige Nanopartikel (vor allem für die kristallinen Nanopartikel) verzeichnet werden. Eine Korrelation zwischen der Aufnahmeeffizienz und der Zytotoxizität konnte nicht nachgewiesen werden. rn
This dissertation investigates nanoparticles and nanocapsules of various materials with various modifications for targeted drug delivery. Although previously numerous nanoparticles and capsules were synthesized, with regard to the cellular tolerability and biocompatibility no comprehensive understanding exists, yet. The presented results in this dissertation will help to close this gap. rnWithin the framework of this dissertation, the influence of the manufacturing materials PS, PLLA, PMMA, biomacromolecules (BSA, DNA), optionally stabilized by HPMA-LMA copolymers and newly synthesized surfmers, the influence of shape modifications like stretching and crystallization, surface modification by means of various surfactants and PEG on cellular uptake and compatibility was tested.rnIn summary, numerous materials are suitable to produce carrier systems and have shown to be biocompatible and non-cytotoxic, but differ widely in the uptake efficiency in various cell lines.rnIn the first and second partgeneral parameters that affect the uptake of nanoparticles were adressed. The first study deals with the influence of age of PLLA particles on cellular uptake and toxicity. With increasing material aging the cellular uptake decreases. Cytotoxicity could not be shown.rnThe second study shows the influence of the FCS content in cell medium on cellular uptake of PMMA particles. In this study, it was shown that an increasing FCS concentration is accompanied by a decrease in cellular uptake of PMMA particles. The highest cellular uptake was found at a FCS concentration of 0.05%.rnThe third and fourth part were performed to investigate the stabilization of nanoparticles by the use of newly synthesized surfactants and their influence on cell-nanoparticle interactions. The influence of surface functionalization of particles using newly-synthesized Surfmers on cellular uptake and toxicity will be discussed in the third study. The prepared Surfmers cause functionalization of the nanoparticle surface with phosphonate groups. Moreover dialyzed nanoparticles were compared with non-dialyzed. After having detected a lower cytotoxicity for the surfactant SDP than for the surfactant SDS, a low toxicity with about 10% of dead cells was detected for the non-dialyzed and no cytotoxicity for the dialyzed particles. With respect to the cellular uptake of the nanoparticles purified by dialysis a good uptake without differences between the covalent and non-covalent phosphonate functionalized particles was shown. However, the unpurified, SDP stabilized, non-covalently bound nanoparticles showed up to 30% greater uptake in the HeLa cells and hMSCs.rnThe fourth part dealt with the use of polystyrene and PLLA particles stabilized with HPMA-LMA-copolymers, which make the use of surfactants during the miniemulsion process unnecessary. Here too, no cytotoxicity was detected. Uptake in HeLa cells seems to depend more on the size of the nanoparticles than on the used material, while uptake in hMSCs seems to be more dependent on the surface properties of the nanoparticles.rnThe fifth and sixth part deals with the possibility of modifying the form of polystyrene particles and their influence on the nanoparticle-cell interactions. This involves the uptake and cytotoxicity of stretched polystyrene particles and the uptake and cytotoxicity of crystalline polystyrene particles in various cell lines. For the stretched particles the uptake efficiency in HeLa cells and hMSCs increases with the stretching factor. Cytotoxicity was not detected for any of the mentioned nanoparticles. For polystyrene particles of different tacticity, syndiotactic polystyrene particles have a slightly better uptake rate than atactic polystyrene particles. Particles manufactured with the extracted solvent evaporation technique of the aqueous phase show a better internalisation than particles from the chloroform phase. However, for all polystyrene particles, despite the different tacticity, high fluorescence intensities were recorded by flow cytometry after uptake in HeLa cells and hMSCs. By equating high fluorescence intensities recorded in cells with good uptake rates, the uptake rates shown here can be described as very good.rnNanosystems with a reduced cellular uptake are discussed in the final two parts. The different surface modification of polystyrene particles with the co-monomer PEG-MA and the surfactants SDS and Lutensol AT50 is examined. Additionally, different molecular weights (Mn = 300 g • mol-1 and Mn = 2080 g • mol-1) and various concentrations (1.5%, 5%, 10%) of PEG-MA were used. One part of the particles was prepared with SDS and the other part with Lutensol AT50. In a further step, the respective opposite surfactant (SDS instead of Lutensol AT50 and vice versa) was used to look whether the previously observed effect can be reversed. Subsequently nanoparticles stabilized with SDS (BR01) were redispersed with various Lutensol AT50 concentrations (5%, 10%, 25%, 50%, 100%). The unmodified, with SDS stabilized nanoparticle BR01 showed the most efficient uptake, while the lowest uptake was observed for the also unmodified, with Lutensol AT50 stabilized nanoparticle BR02. An increasing concentration of PEG-MA Mn = 300 g • mol-1 inhibits the uptake of particles stabilized with SDS constantly. For PEG-MA Mn = 2080 g • mol-1, however, no influence could be detected. For the particles stabilized with Lutensol AT50 no influence of PEG-MA could be detected. This shows that the use of Lutensol AT50 inhibits the cellular uptake more effectively than the use of PEG-MA with different chain lengths.rnNanocapsules produced with the use of biomacromolecules which were stabilized with two different surfactants (SDS and Lutensol AT50) were screened in more detail below. For the capsules stabilized with SDS, the capsules BN 54 and BN 55, produced with ssDNA, proved to be slightly toxic for HeLa cells. In contrast, all employed nanocapsules, redispersed with Lutensol AT50 are cytotoxic for both HeLa cells and hMSCs. Here the toxic effect is due to the non-ionic surfactant Lutensol AT50.No cellular uptake could be detected for any nanocapsules manufactured with biomacromolecules.rnThe last part compares different particles bearing the fluorescent dye PMI regarding their uptake in HeLa cells and hMSCs and their cytotoxic effects. In this comparative analysis the previously presented results for PMI particles are again put into context. Thereby, it has been shown, that most particles show little or no cellular uptake for both HeLa cells and hMSCs. A good uptake was recorded only for a few nanoparticles (especially for the crystalline nanoparticles). A correlation between the uptake efficiency and the cytotoxicity could not be proven. rn
DDC-Sachgruppe: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Veröffentlichende Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Organisationseinheit: Externe Einrichtungen
Veröffentlichungsort: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4401
Version: Original work
Publikationstyp: Dissertation
Nutzungsrechte: in Copyright
Informationen zu den Nutzungsrechten: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Umfang: 156 S.
Enthalten in den Sammlungen:JGU-Publikationen

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