Authors:	Jaenecke, Isabel
Title:	Lysosomaler Transport kationischer Aminosäuren durch Mitglieder der SLC7-Familie
Online publication date:	14-Jan-2013
Year of first publication:	2013
Language:	german
Abstract:	Lysosomaler Transport kationischer Aminosäuren (KAS) stellt einen Rettungsweg in der Cystinose-Therapie dar. Ein solches Transportsystem wurde in humanen Hautfibroblasten beschrieben und mit System c benannt. Des Weiteren stellt lysosomales Arginin eine Substratquelle für die endotheliale NO-Synthase (eNOS) dar. Das von der eNOS gebildete NO ist ein wichtiges vasoprotektiv wirkendes Signalmolekül. Ziel war es daher, herauszufinden, ob Mitglieder der SLC7-Unterfamilie hCAT möglicherweise System c repräsentieren.rnIn dieser Arbeit konnte ich die lysosomale Lokalisation verschiedener endogener, sowie als EGFP-Fusionsproteine überexprimierter CAT-Isoformen nachweisen. Mittels Fluoreszenz-mikroskopie wurde festgestellt, dass die in U373MG-Zellen überexprimierten Fusionsproteine hCAT-1.EGFP sowie SLC7A14.EGFP mit dem lysosomalen Fluoreszenz-Farbstoff LysoTracker co-lokalisieren. Eine Lokalisation in Mitochondrien oder dem endoplasmatischem Retikulum konnte mit entsprechenden Fluoreszenz-Farbstoffen ausgeschlossen werden. Zusätzlich reicherten sich die überexprimierten Proteine hCAT-1.EGFP, hCAT-2B.EGFP und SLC7A14.EGFP in der lysosomalen Fraktion C aus U373MG-Zellen zusammen mit den lysosomalen Markern LAMP-1 und Cathepsin D an. Gleiches galt für den endogenen hCAT-1 in der lysosomalen Fraktion C aus EA.hy926- und U373MG-Zellen sowie für den SLC7A14 in den humanen Hautfibroblasten FCys5. Mit dem im Rahmen dieser Arbeit generierte Antikörper gegen natives SLC7A14 konnte erstmals die endogene Expression und Lokalisation von SLC7A14 in verschiedenen Zelltypen analysiert werden.rnObwohl eine Herunterregulation des hCAT-1 in EA.hy926-Endothelzellen nicht zu einer Reduktion der Versorgung der eNOS mit lysosomalem Arginin führte, ist eine Funktion von hCAT-1 im Lysosom wahrscheinlich. Sowohl die [3H]Arginin- als auch die [3H]Lysin-Aufnahme der Fraktion C aus U373MG-hCAT-1.EGFP war signifikant höher als in die Fraktion C aus EGFP-Kontrollzellen. Dies konnte ebenfalls für den hCAT-2B.EGFP gezeigt werden. Zusätzlich zeigten lysosomale Proben aus U373MG-hCAT-2B.EGFP-Zellen in der SSM-basierten Elektrophysiologie eine elektrogene Transportaktivität für Arginin. Das Protein SLC7A14.EGFP zeigte in keiner der beiden durchgeführten Transportstudien eine Aktivität. Dies war unerwartet, da die aus der Diplomarbeit stammende und im Rahmen dieser Dissertation erweiterte Charakterisierung der hCAT-2/A14_BK-Chimäre, die die „funktionelle Domäne“ des SLC7A14 im Rückgrat des hCAT-2 trug, zuvor den Verdacht erhärtet hatte, dass SLC7A14 ein lysosomal lokalisierter Transporter für KAS sein könnte. Diese Studien zeigten allerding erstmals, dass die „funktionelle Domäne“ der hCATs die pH-Abhängigkeit vermittelt und eine Rolle in der Substraterkennung spielt.rnZukünftig soll weiter versucht werden auch endogen eine Transportaktivität der hCATs für KAS im Lysosom nachzuweisen und das Substrat für das intrazellulär lokalisierte Waisen-Protein SLC7A14 zu finden. Eine mögliche Rolle könnte SLC7A14 als Transporter für Neurotransmitter spielen, da eine sehr prominente Expression im ZNS festgestellt wurde.rn Lysosomal transport of cationic amino acids (CAS) constitutes a salvage pathway in the therapy of cystinosis. Such a transport system has been described in human skin fibroblasts and named system c. Furthermore lysosomal arginine plays a role in substrate supply of the endothelial NO synthase (eNOS). NO generated by cytosolic eNOS is an important vasoprotective signaling molecule. Objective of this work was to find out, if members of the SLC7 subfamily of human cationic amino acid transporters (hCATs) might represent system c.rnIn this study I could demonstrate the lysosomal localization of several endogenous and as EGFP fusion proteins overexpressed hCAT isoforms. Fluorescence microscopy revealed, that the fusion proteins hCAT-1.EGFP and SLC7A14.EGFP co-localized with the lysosomal fluorescent dye LysoTracker when overexpressed in U373MG cells. Localization in mitochondria or the endoplasmic reticulum could be excluded using appropriate fluorescent dyes. In addition the overexpressed proteins hCAT-1.EGFP, hCAT-2B.EGFP und SLC7A14.EGFP enriched in the lysosomal fraction C derived from U373MG cells, together with the lysosomal markers LAMP-1 und Cathepsin D an. The same was true for endogenous hCAT-1 in the lysosomal fraction C derived from EA.hy926 and native U373MG cells and for SLC7A14 in human skin fibroblasts. The antibody against native SLC7A14, which has been generated during this work, has enabled us to study endogenous expression and localization of SLC7A14 in several cell types for the first time.rnAlthough down regulation of hCAT-1 in EA.hy926 endothelial cells did not lead to a reduction of the lysosomal arginine supply of eNOS, a function of hCAT-1 in the lysosome is most likely. Uptake of [3H]arginine as well as [3H]lysine of fraction C derived from U373MG-hCAT-1.EGFP was significantly higher than of fraction C derived from EGFP control cells. Similar results were obtained for hCAT-2B.EGFP. Additionally, lysosomal membranes derived from U373MG-hCAT-2B.EGFP cells exhibited electrogenic transport activity for arginine using SSM-based electrophysiology. SLC7A14.EGFP did not show any transport activity in both experimental setups. This was unexpected, because the chimeric protein hCAT-2/A14_BK, which has been created during my diploma thesis and its characterization has been broadened during my dissertation did transport arginine with similar but not identical properties as hCAT-2A. The chimera carries the “functional domain” of SLC7A14 in the backbone of hCAT-2 and thus substantiated the suspicion that SLC7A14 is a lysosomal localized CAS transporter. However, these studies revealed, that the „functional domain“ of hCATs mediates pH dependence, additionally to substrate affinity and trans-stimulation properties and is involved in substrate recognition.rnProspective studies should now focus on the detection of endogenous transport activity of hCATs in the lysosome and on the identification of the substrate for SLC7A14. A role of SLC7A14 as transporter for neurotransmitter is possible, because a prominent mRNA expression of this SLC7 member has been detected in the central nervous system.rn
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4362
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-33223
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	159 S.
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