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Autoren: Liao, Yun-Feng
Titel: Oligomerization and protein-protein interactions of the sensory histidine kinase DcuS in Escherichia coli
Online-Publikationsdatum: 19-Feb-2009
Sprache des Dokuments: Englisch
Zusammenfassung/Abstract: DcuS is a membrane-integral sensory histidine kinase involved in the DcuSR two-component regulatory system in Escherichia coli by regulating the gene expression of C4-dicarboxylate metabolism in response to external stimuli. How DcuS mediates the signal transduction across the membrane remains little understood. This study focused on the oligomerization and protein-protein interactions of DcuS by using quantitative Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) spectroscopy. A quantitative FRET analysis for fluorescence spectroscopy has been developed in this study, consisting of three steps: (1) flexible background subtraction to yield background-free spectra, (2) a FRET quantification method to determine FRET efficiency (E) and donor fraction (fD = [donor] / ([donor]+[acceptor])) from the spectra, and (3) a model to determine the degree of oligomerization (interaction stoichiometry) in the protein complexes based on E vs. fD. The accuracy and applicability of this analysis was validated by theoretical simulations and experimental systems. These three steps were integrated into a computer procedure as an automatic quantitative FRET analysis which is easy, fast, and allows high-throughout to quantify FRET accurately and robustly, even in living cells. This method was subsequently applied to investigate oligomerization and protein-protein interactions, in particular in living cells. Cyan (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP), two spectral variants of green fluorescent protein, were used as a donor-acceptor pair for in vivo measurements. Based on CFP- and YFP-fusions of non-interacting membrane proteins in the cell membrane, a minor FRET signal (E = 0.06 ± 0.01) can be regarded as an estimate of direct interaction between CFP and YFP moieties of fusion proteins co-localized in the cell membrane (false-positive). To confirm if the FRET occurrence is specific to the interaction of the investigated proteins, their FRET efficiency should be clearly above E = 0.06. The oligomeric state of DcuS was examined both in vivo (CFP/YFP) and in vitro (two different donor-acceptor pairs of organic dyes) by three independent experimental systems. The consistent occurrence of FRET in vitro and in vivo provides the evidence for the homo-dimerization of DcuS as full-length protein for the first time. Moreover, novel interactions (hetero-complexes) between DcuS and its functionally related proteins, citrate-specific sensor kinase CitA and aerobic dicarboxylate transporter DctA respectively, have been identified for the first time by intermolecular FRET in vivo. This analysis can be widely applied as a robust method to determine the interaction stoichiometry of protein complexes for other proteins of interest labeled with adequate fluorophores in vitro or in vivo.
DcuS ist eine mebranständige Sensor-Histidin-Kinase in Escherichia coli, die als Teil des DcuSR-Zwei-Komponenten-Systems den C4-Dicarboxylat-Stoffwechsel als Reaktion auf äußere Reize reguliert. Wie DcuS die Signaltransduktion über die Membran vermittelt ist nach wie vor schlecht verstanden. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Oligomerisierung von DcuS sowie dessen Wechselwirkung mit anderen Proteinen. Beide Aspekte wurden mittels quantitativer FRET-Spektroskopie (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) untersucht. Es wurde ein Verfahren zur quantitativen FRET-Analyse von Spektren entwickelt, das aus drei Schritten besteht: (1) flexible Entfernung von Untergrundsignalen, (2) eine Analyse der Spektren zur Bestimmung der FRET-Effizienz (E) und des Donor-Anteils (fD = [Donor] / ([Donor] + [Akzeptor])), und (3) ein Modell zur Bestimmung des Oligomerisierungsgrades (Wechselwirkungsstöchiometrie) der Protein-Komplexe basierend auf E vs fD. Genauigkeit und Anwendbarkeit des Verfahrens wurden durch Computer-Simulationen und Experimente überprüft. Die drei Schritte wurden in ein Computerprogramm integriert, das eine automatische, d.h. einfache und schnelle, quantitative FRET-Analyse ermöglicht, auch an lebenden Zellen. Die Methode wurde schließlich angewandt, um Oligomerisierung und Protein- Protein- Wechselwirkungen zu untersuchen, insbesondere in lebenden Zellen. Cyan (CFP) und Gelb fluoreszierendes Protein (YFP), zwei spektrale Varianten des Grün fluoreszierenden Proteins, wurden als Donor-Akzeptor-Paar für in-vivo-Messungen verwendet. Mittels CFP- und YFP-Fusionen von nicht interagierenden Membran-Proteinen konnte ein geringes FRET-Signal (E = 0,06 ± 0,01) detektiert werden, das als Maß der direkten Wechselwirkung von CFP und YFP betrachtet werden kann (falsch positiv). Zum Nachweis einer spezifischen Wechselwirkung bei CFP- / YFP-markierten Proteinen sollte sich daher eine Transfer-Effizienz deutlich über E = 0.06 ergeben. Die Oligomerisierung von DcuS wurde an drei unabhängigen experimentellen Systemen untersucht, sowohl in vivo (CFP / YFP) als auch in-vitro (zwei verschiedene Donor-Akzeptor-Paare organischer Farbstoffe). In allen Systemen konnte FRET beobachtet werden und liefert zum ersten mal einen Nachweis für die Homo-Dimerisierung von DcuS als Volllängen-Protein. Darüber hinaus konnten zum ersten mal neuartige Wechselwirkungen (Hetero-Komplexe) zwischen DcuS und funktionell verwandten Proteinen, der Citrat-spezifischen Sensor-Kinase CitA und dem aeroben Dicarboxylat-Transporter DctA, durch intermolekulare FRET in vivo nachgewiesen werden. Das hier vorgestellte Analyseverfahren kann auch bei anderen Protein-Komplexen in vitro oder in vivo zur Bestimmung der Wechselwirkungs¬stöchiometrie angewandt werden, sofern diese mit entsprechenden Fluorophoren markiert sind.
DDC-Sachgruppe: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Veröffentlichende Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Organisationseinheit: FB 10 Biologie
Veröffentlichungsort: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4295
Version: Original work
Publikationstyp: Dissertation
Nutzungsrechte: in Copyright
Informationen zu den Nutzungsrechten: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Enthalten in den Sammlungen:JGU-Publikationen

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