Authors:	Seiwert, Dennis
Title:	Membran-inserierter pflanzlicher Lichtsammelkomplex LHCII : strukturelle Untersuchungen
Online publication date:	28-Aug-2018
Year of first publication:	2018
Language:	german
Abstract:	Biologische Membranen bestehen in der Regel hauptsächlich aus Phospholipiden. Die pflanzliche Thylakoidmembran ist dagegen zu ~80% aus Lipiden mit ungeladenen Zuckerkopfgruppen (Galaktolipide) zusammengesetzt; den übrigen Teil machen negativ geladene Lipide aus. Der Großteil der Galaktolipide besteht aus MGDG, das aufgrund seiner kegelförmigen Gestalt selbst keine lamellaren Membranstrukturen bilden, jedoch durch Interaktionen mit LHCII-Proteinen in die Thylakoidmembran integriert werden kann. Um die Bedeutung dieser Wechselwirkung für die Struktur des LHCII zu verstehen, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Methode entwickelt, das Protein in oberflächengestützte Membranen (SLBs) zu integrieren. Anschließend konnten mithilfe der atomaren Kraftmikroskopie (AFM) einzelne Komplexe aus den SLBs herausgezogen und damit die LHCII- Polypeptidstruktur schrittweise mechanisch denaturiert werden. Der LHCII wies dabei kein klar strukturiertes Entfaltungsmuster auf, da jede der zahlreichen Pigmentbindestellen vermutlich einen eigenen Beitrag zur Gesamtstabilität der Proteinstruktur leistet. Die Entfaltung in Abhängigkeit verschiedener Thylakoidlipidumgebungen zeigte keinen signifikanten Einfluss von negativer Ladung (Phospholipid PG) oder möglichen Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Galaktolipid DGDG auf die Stabilität der LHCII-Struktur. Dagegen erhöhte die Anwesenheit von MGDG deutlich die mechanische Stabilität des LHCII sowohl in Transmembrandomänen wie auch in einigen Schleifendomänen. Somit erfolgt diese Stabilisierung eher durch die Strukturkomplementarität zwischen kegelförmigem MGDG und uhrglasförmigem LHCII als durch ortsspezifische Wechselwirkungen. Fluoreszenzbasierte Diffusionsmessungen (FRAP und FCS) in den SLBs sollten ermöglichen, die Art der LHCII-MGDG-Wechselwirkung zu verstehen. Eine „Raft“-Bildung mit MGDG-Lipiden (direkte Lipid- Protein-Assoziation) sollte zu einer Verlangsamung der LHCII-Diffusion führen. Die Komplexe konnten in SLBs zwar frei diffundieren, jedoch sind keine quantitativen Beurteilungen zur Mobilität des Proteins gelungen, da die Formierung von SLBs aus Galaktolipidvesikeln zu großen Lücken im Membransystem führte und damit die Streuung von Messwerten erhöhte. Eine zusätzliche Varianz der Messungen kam aufgrund von Ausstülpungen der flachen Membranoberfläche zu gestapelten Bereichen, jedoch nur in Anwesenheit von LHCII-Proteinen, zustande. Dieses Phänomen konnte genutzt werden, um mittels topographischer (AFM) und fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen Erkenntnisse zur Bedeutung der physikochemischen Eigenschaften von Thylakoidlipiden für die Granastruktur in Chloroplasten zu gewinnen. Bei der Membranadhäsion spielten offenbar nur Wechselwirkungen zwischen LHCII-Trimeren in gegenüberliegenden Membranschichten eine entscheidende Rolle (Velcro-Modell), die durch Salzbrücken zusätzlich verstärkt wurden. Zusätzlich begünstigte MGDG das Ausstülpen der Membran. Dies ist vermutlich damit zu erklären, dass die konvexe Geometrie von MGDG-Lipiden eine Krümmung der Lipiddoppelschicht erleichtert. Dank der Etablierung von AFM konnte mit dieser Arbeit der Weg für weiterführende Untersuchungen zur Faltung und Strukturstabilisierung des LHCII, z.B. in Abhängigkeit der Bindung bestimmter Pigmente, geebnet werden. Biological membranes are predominantly composed of phospholipids. However, the thylakoid membrane of plants contains ~80% uncharged lipids with sugar head groups (galactolipids); the remainder consists of negatively charged lipids. The major galactolipid is MGDG, which is not able to form a lamellar membrane structure due to its cone shape. However, MGDG can be incorporated into the thylakoid membrane thanks to interactions with LHCII proteins. In this work, a method was developed for reconstituting LHCII into lipid bilayers on solid surfaces (SLBs) in order to investigate the impact of LHCII-MGDG interactions on the structure of LHCII. In the next step, the LHCII polypeptide was unfolded stepwise by mechanical denaturation, as individual proteins were pulled out of the SLBs via atomic force microscopy (AFM). The LHCII protein showed no distinct unfolding pattern, presumably because each of its numerous pigment binding sites contributes to the overall stability of the protein structure. Unfolding from membranes containing different thylakoid lipids revealed no significant effect on the structural stability of LHCII of negative charge (phospholipid PG) or potential hydrogen bonds with galactolipid DGDG. By contrast, the presence of MGDG substantially enhanced the mechanical stability in transmembrane domains as well as several loop domains of LHCII. Hence, the stabilization is provided by the complementary structures of conical MGDG and hourglass-shaped LHCII rather than by site specific interactions. Fluorescence-based diffusion measurements (FRAP and FCS) within the SLBs should allow for deciphering the nature of LHCII-MGDG interactions. Presumably, a raft-like assembly of MGDG molecules (direct association between protein and lipid) would slow down the diffusion of LHCII proteins. Even though the complexes exhibited free diffusion in SLBs, quantitative estimations regarding the mobility of LHCII could not be achieved since SLB formation starting out from galactolipid vesicles produced huge gaps within the membrane system; this in turn increased scattering of the measured data. An additional variance of the data was caused by stacked regions protruding from the flat membrane surface, which only appeared in the presence of LHCII proteins. The latter phenomenon could be used to gain insights into the impact of physicochemical properties of the thylakoid lipids on the grana structure in chloroplasts, while applying topographical (AFM) and fluorescence microscopy imaging. Apparently, membrane adhesion was mainly established by interactions between LHCII trimers of opposing membrane sheets (Velcro model) which were further enhanced by salt bridges. Moreover, MGDG facilitated the formation of membrane protrusions. This feature may be assigned to the convex geometry of MGDG lipids easing curvature stress of the lipid bilayer. As part of this work, establishing AFM has paved the way for further studies, e.g. in dependence of binding certain pigments, on the folding and structural stabilization of LHCII.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4187
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000022499
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	iii, 136 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen