Authors:	Trost, Tatjana
Title:	Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese
Online publication date:	15-Jul-2005
Year of first publication:	2005
Language:	german
Abstract:	Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese Die Rezeptor-Tyrosinkinase ERBB2 ist in einer Vielzahl epithelialer Tumore, wie Mamma- und Ovarialkarzinomen, überexprimiert. Diese erhöhte Expression korreliert mit aggressivem Tumorwachstum, verstärkter Metastasierung und schlechter Prognose für den Patienten. Zur genaueren Untersuchung molekularer Mechanismen, die zur Tumorentstehung infolge der ERBB2-Überexpression führen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Tet-Systems induzierbare MCF-7 Zelllinien generiert. Diese exprimieren bei Gabe von Doxyzyklin ERBB2 bzw. die zum humanen ERBB2 homologe und durch Punktmutation onkogen aktivierte Rattenvariante NeuT. Nachdem die stringente Regulierbarkeit durch Doxyzyklin für die untersuchten Zellklone gezeigt werden konnte, stellte sich bei der Charakterisierung der Zelllinien heraus, dass die Induktion von ERBB2 erstaunlicherweise nicht zur Proliferation der Zellen, sondern zum Wachstumsarrest führt. Bei der Untersuchung verschiedener Zellzyklusregulatoren konnte dieser Zellzyklusarrest dem CDK-Inhibitor P21 zugeordnet werden, dessen Expression durch ERBB2 induziert wird. In P21-Antisense-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass P21 eine Schlüsselrolle beim ERBB2-induzierten Zellzyklusarrest spielt. Neben der Induktion von P21 und der daraus resultierenden Wachstumsinhibition zeigten die Zellen starke morphologische Veränderungen und waren positiv beim Nachweis der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase. Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Induktion des Onkogens ERBB2 nicht zur Proliferation, sondern zur Aktivierung eines verfrühten Seneszenz-Programms führt, welches der Zelle Schutz gegen die Onkogeneinwirkung bietet. Bei der Untersuchung verschiedener Signaltransduktionskaskaden mit Inhibitormolekülen konnte die Aktivierung dieses Seneszenz-Programms der Stress-aktivierten Proteinkinase P38 zugeordnet werden. Zur Identifizierung von Genen, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sind, wurde die differenzielle Genexpression eines NeuT-Klons nach 8- bzw. 48-stündiger Induktion mit Doxyzyklin in einem cDNA-Array untersucht. Dabei zeigte sich eine besonders starke Induktion von Integrin 5 und Integrin 1, die zusammen den Fibronektinrezeptor bilden. Der funktionale Nachweis des Rezeptors in einem Adhäsionsassay demonstrierte ein stark erhöhtes Adhäsionsverhalten ERBB2-überexprimierender Zellen an Fibronektin. Bei der Untersuchung von Mamma-, Ovarial- und Endometriumkarzinomen konnte die Expression von ERBB2 mit der von Integrin 5 korreliert werden. Diese Ergebnisse machen Integrin 5 zu einem potenziellen neuen Tumormarker und Therapieziel in ERBB2-überexprimierenden Tumoren. Ein weiteres interessantes Gen, das sich im Array durch ERBB2 überexprimiert zeigte, war die Matrix-Metalloproteinase MMP-9. In einem Zymografieassay konnte die erhöhte Gelatinaseaktivität von MMP-9 in Dox-induzierten Zellen nachgewiesen werden. Der Einsatz verschiedener Signaltransduktionsinhibitoren ergab, dass auch die ERBB2-induzierte Expression von MMP-9 über die Aktivierung von P38 läuft. Bei der Suche nach weiteren MMPs, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sein könnten, wurde MMP-13 untersucht. Erstmals konnte gezeigt werden, dass diese Matrix-Metalloproteinase von ERBB2 induziert wird. Dieser interessante Befund wurde auch in einem anderen Zellmodell in NIH3T3 Mausfibroblasten verifiziert. Durch ihre Matrix-degradierenden Eigenschaften sind MMPs potente „Werkzeuge“ für Tumorzellen und stellen ein wichtiges Ziel zur Unterbindung der Invasion und Metastasierung dieser Zellen dar. Neben den Zellkulturarbeiten wurden im Rahmen dieser Dissertation transgene Responder-Mäuse generiert, die NeuT unter Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors exprimieren. Von vier transgenen Gründerlinien zeigten zwei eine unerwünschte, basale NeuT-Expression, für die beiden anderen Linien konnte sowohl in MEF-Assays, als auch nach Kreuzung mit rtTA- bzw. tTA-Effektor-Mäusen eine Dox-abhängige Regulation des Transgens gezeigt werden. Die Tiere dieser Linien sollen in Zukunft mit Effektor-Mäusen gepaart werden, die den rtTA bzw. tTA spezifisch in für die ERBB2- Tumorgenese relevanten Geweben, wie Ovarial- oder Lungenepithelzellen, exprimieren. So können individuelle Tumormodelle für die verschiedenen epithelialen Tumore, bei denen die Überexpression von ERBB2 von Bedeutung ist, entwickelt und untersucht werden. Conditional models to analyze the mechanisms of the ERBB2-induced tumorigenesis The receptor tyrosine kinase ERBB2 is overexpressed in a variety of human tumors including breast and ovarian carcinomas. Enhanced expression of ERBB2 correlates with aggressive tumor growth, early metastasis, and poor prognosis. To analyze the molecular mechanisms underlying the oncogenic potential of ERBB2 inducible MCF-7 cell lines were generated using the Tet-system. Following Doxicycline (Dox) application these cells express high levels of ERBB2 or the rat homolog of ERBB2 (NeuT) that harbours an activating point mutation in its transmembrane domain. Interestingly overexpression of the oncogene did not induce proliferation but growth arrest as assessed by FACS analysis. Examination of different cell cycle regulators clearly showed induction of the CDK-inhibitor P21. Application of P21-antisense oligonucleotides abolished the antiproliferative response thereby assigning P21 a key role in the ERBB2-induced growth arrest. In addition to the effects of ERBB2 on the cell cycle overexpressing cells also underwent prominent morphological changes and stained positive for the senescence-associated -galactosidase. It could be shown for the first time that overexpression of ERBB2 does not necessarily induce proliferation but instead activates a premature senescence programme as primary fail-safe mechanism that protects cells against activation of strong oncogenes. Analyzing different signal transduction cascades revealed the mitogen-activated protein kinase P38 as the crucial signalling pathway for premature senescence in these cells. To identify relevant genes for ERBB2-induced tumorigenesis gene expression of a NeuT-clone was analysed by performing cDNA-array-hybridisations comparing untreated and 8 h/ 48 h Dox-treated cells. Especially integrin 5 and integrin 1, the two subunits of the fibronectin receptor were strongly upregulated following Dox-treatment. Functional analyses of the receptor in an adhesion assay revealed an enhanced adhesion of ERBB2-overexpressing cells towards fibronectin. Furthermore a correlation between the expression of ERBB2 and integrin 5 was observed in mamma-, ovarian- and endometrium carcinoma tissue. These results depict integrin 5 as a novel tumor marker and potential therapeutic target in ERBB2-overexpressing tumors. Another interesting gene that was upregulated upon ERBB2-overexpression is matrix metallo-proteinase 9 (MMP-9). The enhanced gelatinase activity of MMP-9 could be assessed in zymographic assays with Dox-treated cells. Using small inhibitor molecules the induction of MMP-9 could also be connected to the P38 signalling pathway. In addition, ERBB2-dependent MMP-13 expression was analyzed and it could be shown for the first time that MMP-13 transcripts are induced upon oncogenic ERBB2-signalling. This interesting finding was verified by overexpressing NeuT in NIH3T3 mouse fibroblasts. Due to their matrix-degrading properties MMPs serve as potent „tools“ for tumor cells and might be an important therapeutical target blocking invasion and metastasis of those cells. Apart from in vitro analyses transgenic TetO-NeuT responder mice expressing NeuT under control of a tetracycline-responsive promotor were generated. Two out of four mouse lines positive for the transgene expressed NeuT independent from Dox administration. The two remaining responder-lines displayed stringent Dox-dependent regulation of the NeuT-transgene as determined by MEF-assays as well as in bitransgenic TetO-NeuT/(r)tTA mice. These responder mice can serve as valuable tools for establishing in vivo tumor models for different types of ERBB2-dependent malignancies (e.g. mamma-, lung-, ovarian carcinoma) when crossed with effector mice expressing (r)tTA under control of tissue-specific promotors.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3833
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-7894
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen