Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-3742
Authors: Kiweler, Nicole
Title: Impact of class I HDACs and their inhibitors on renal and colorectal tumor cell fate decisions
Online publication date: 23-Aug-2019
Language: english
Abstract: Advanced, metastasized renal and colorectal carcinomas are difficult to treat and frequently incurable diseases. Therefore, a key focus of modern cancer research is the identification of improved chemotherapeutic treatment options. Overexpression of histone deacetylases (HDACs) is a frequent characteristic of malignant neoplasms and often correlates with disadvantageous disease progression and therapy outcome. In recent years, inhibitors of histone deacetylases (HDACi) were introduced as a new class of small-molecule anticancer therapeutics. Since HDACs deacetylate numerous histones and non-histone proteins, the inhibition of these enzymes has implications for a large number of cellular processes. As a result of the pleiotropic actions of HDACs, the precise impact of HDACi on cellular signaling pathways remains poorly understood. This work investigated the effects of HDACs and HDACi on key cellular signaling pathways in kidney and colon tumor cell lines on a global and functional scale. Having found that HDACi induce morphological alterations in renal cell carcinoma (RCC) cells that resemble the characteristics of a mesenchymal phenotype, this work investigated individual and proteomics-based analyses of epithelial-mesenchymal transition (EMT) signaling pathways. Proteomics and GO-term enrichment analyses revealed disturbed EMT signaling and an associated loss of cell cycle control. Detailed analysis of EMT transcription factor expression by qPCR, epithelial and mesenchymal marker protein expression by Western blot, migratory potential, and β-catenin localization by immunofluorescence confirmed these findings. Furthermore, HDACi significantly induced cell death that due to caspase-mediated apoptosis. These findings were confirmed in primary renal cells. RNAi-based knockdown experiments unveiled HDAC1 and HDAC2 as mechanistic targets of HDACi. In colorectal cancer (CRC) cells, the specific modification of HDAC2 by sumoylation affects p53- and nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells (NF-κB)-dependent gene expression. The work presented demonstrates that a loss of HDAC2 sumoylation enhances CRC sensitivity towards the antimetabolite 5-fluorouracil (5-FU) as well as the DNA-crosslinker nimustine (ACNU). HDAC2 sumoylation did thereby not affect p53 activation and ATM- and ATR-dependent DNA damage signaling. In contrast, DNA damage-induced accumulation of γH2AX and γH2AX foci formation depended on HDAC2 sumoylation. Mass spectrometric analysis of global protein expression, knockdown experiments, and analyses of DNA damage repair by immunofluorescence identified the specific loss of the chromatin remodeling complex-associated DNA-helicases Brahma-related gene 1 (BRG1) and SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A containing DEAD/H box 1 (SMARCAD1) as potential cause for the observed sensitization effects. Curiously, the main cytotoxic effects of 5-FU were rather based on its RNA damage than on its DNA damage. Thus, this work reveals a multitude of novel effects of commonly used chemotherapeutics.
Fortgeschrittene, metastasierende renale und kolorektale Karzinome sind schwer behandelbare und häufig unheilbare Erkrankungen. Ein Hauptaugenmerk gegenwärtiger Krebsforschung liegt daher auf der Identifikation verbesserter chemotherapeutischer Behandlungsoptionen. Die Überexpression von Histondeacetylasen (HDACs) ist ein häufiges Merkmal maligner Neoplasien und korreliert oftmals mit einem unvorteilhaften Krankheitsverlauf und Therapieausgang. Im Laufe der letzten Jahre wurden Inhibitoren von Histondeactelyasen (HDACi) als neue Klasse niedermolekularer Chemotherapeutika vorgestellt. Da HDACs eine Vielzahl an Histonen und Nicht-Histonproteinen deacetylieren, hat die Inhibierung dieser Enzyme Auswirkungen auf zahlreiche zelluläre Prozesse. Aufgrund dieses pleiotropen Einflusses von HDACs sind die konkreten Wirkungsweisen von HDACi auf zelluläre Signalwege jedoch weiterhin kaum verstanden. Diese Arbeit untersuchte den Einfluss von HDACs und HDACi auf zentrale, zelluläre Signalwege in renalen und kolorektalen Tumorzelllinien auf globaler und funktionaler Ebene. Nachdem gefunden wurde, dass HDACi in renalen Karzinomzellen (RCC) morphologische Veränderungen auslösen, die denen eines mesenchymalen Phänotypus ähneln, untersucht diese Arbeit individuelle und Proteom-basierte Analysen von Signalwegen der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT). Diese zeigten eine Störung von EMT-Signalwegen sowie einen damit assoziierten Verlust der Zellzykluskontrolle. Detaillierte Analysen der Expression von EMT Transkriptionsfaktoren durch qPCR, der Expression epithelialer und mesenchymaler Markerproteine durch Western Blot, des Migrationspotentials und der β-Catenin-Lokalisation durch Immunfluoreszenz bestätigten diese Befunde. Weiterhin induzierten HDACi signifikant Zelltod durch Caspase-vermittelte Apoptose. Diese Ergebnisse wurden bestätigt in primären renalen Zellen. RNAi-basierte Knockdown-Experimente identifizierten HDAC1 und HDAC2 als mechanistischen Zielstrukturen der HDACi. In kolorektalen Tumorzellen (CRC) beeinflusst die Modifizierung von HDAC2 durch Sumoylierung die p53- und NF-κB-abhängige Genexpression. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass ein Verlust der HDAC2-Sumoylierung die Sensitivität von CRC gegenüber dem Antimetaboliten 5-Fluorouracil (5-FU) sowie dem DNA-Vernetzer Nimustin (ACNU) steigert. Die HDAC2-Sumoylierung beeinflusste dabei weder die p53-Aktivierung noch die ATM- und ATR-abhängige DNA-Schadenssignalisierung. Dagegen waren die schadensinduzierte Anreicherung von γH2AX und die γH2AX-Focibildung von der HDAC2-Sumoylierung abhängig. Die massenspektrometrische Untersuchung der globalen Proteinexpression, Knockdown-Experimente und Analysen der DNA-Schadensreparatur durch Immunfluoreszenz identifizierten den Expressionsverlust der DNA-Helikasen BRG1 und SMARCAD1 als potentielle Ursache der beobachteten Sensitivierungseffekte. Eigenartigerweise basierten die zytotoxischen Effekte von 5-FU eher auf dessen RNA-Schaden als auf dessen DNA-Schaden. Diese Arbeit offenbart daher eine Vielzahl neuer Effekte häufig verwendeter Chemotherapeutika.
DDC: 500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3742
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000030680
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: XIV, 197 Blätter
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