Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-3498
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dc.contributor.authorGriffin, Louise J.
dc.date.accessioned2006-02-24T12:18:50Z
dc.date.available2006-02-24T13:18:50Z
dc.date.issued2006
dc.identifier.urihttps://openscience.ub.uni-mainz.de/handle/20.500.12030/3500-
dc.description.abstractRNAi (RNA interference) is a powerful technology for sequence-specific targeting of mRNAs. This thesis was aimed at establishing conditions for conditional RNAi-mediated silencing first in vitro and subsequently also in transgenic mice. As a target the basic helix-loop-helix transcription factor encoding gene SCL (stem cell leukaemia also known as Tal-1 or TCL5) was used. SCL is a key regulator for haematopoietic development and ectopic expression of SCL is correlated with acute T-lymphoblastic leukaemias. Loss of SCL function studies demonstrated that ab initio deletion of SCL resulted in embryonic lethality around day E9 in gestation. To be able to conditionally inactivate SCL, RNAi technology was combined with the tetracycline-dependent regulatory system. This strategy allowed to exogenously control the induction of RNAi in a reversible fashion and consequently the generation of a completely switchable RNAi knockdown. First a suitable vector allowing for co-expression of tetracycline-controlled shRNAs (small hairpin RNAs) and constitutively active EGFP (enhanced green fluorescent protein) was generated. This novel vector, pRNAi-EGFP, was then evaluated for EGFP expression and tetracycline-mediated expression of shRNAs. Four sequences targeting different regions within the SCL mRNA were tested for their efficiency to specifically knockdown SCL. These experiments were performed in M1 murine leukaemia cells and subsequently in the HEK 293 cell line, expressing an engineered HA-tagged SCL protein. The second assay provided a solid experimental method for determining the efficiency of different SCL-siRNA knockdown constructs in tissue culture. Western blotting analyses revealed a down regulation of SCL protein for all four tested SCL-specific target sequences albeit with different knockdown efficiencies (between 25% and 100%). Furthermore, stringent tetracycline-dependent switchability of shRNA expression was confirmed by co-transfecting the SCL-specific pRNAi-EGFP vector (SCL-siRNA) together with the HA-tagged SCL expression plasmid into the HEK 293TR /T-REx cell line constitutively expressing the tetracycline repressor (TetR). These series of experiments demonstrated tight regulation of siRNA expression without background activity. To be able to control the SCL knockdown in vivo and especially to circumvent any possible embryonic lethality a transgenic mouse line with general expression of a tetracycline repressor was needed. Two alternative methods were used to generate TetR mice. The first approach was to co-inject the tetracycline-regulated RNAi vector together with a commercially available and here specifically modified T-REx expression vector (SCL-siRNA T-REx FRT LoxP mouse line). The second method involved the generation of a TetR expressor mouse line, which was then used for donating TetR-positive oocytes for pronuclear injection of the RNAi vector (SCL-siRNA T-REx mouse line). As expected, and in agreement with data from conditional Cre-controlled adult SCL knockout mice, post-transcriptional silencing of SCL by RNAi caused a shift in the maturation of red blood cell populations. This was shown in the bone marrow and peripheral blood by FACS analysis with the red blood cell-specific TER119 and CD71 markers which can be used to define erythrocyte differentiation (Lodish plot technique). In conclusion this study established conditions for effective SCL RNAi-mediated silencing in vitro and in vivo providing an important tool for further investigations into the role of SCL and, more generally, of its in vivo function in haematopoiesis and leukaemia. Most importantly, the here acquired knowledge will now allow the establishment of other completely conditional and reversible knockdown phenotypes in mice.en_GB
dc.description.abstractRNAi (RNA interference) ist eine wirkungsvolle Technologie, welche die sequenzspezifische Degradation von mRNA erlaubt. Ziel dieser Doktorarbeit war es, die notwendigen experimentellen Bedingungen für die schaltbare RNAi-vermittelte Degradation spezifischer RNAs zuerst in vitro und dann in transgenen Mäusen zu etablieren. Als Zielgen zur Degradation wurde der basische Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktor SCL (Stem Cell Leukaemia, auch Tal-1 oder TCL5 genannt) verwendet. SCL ist ein Schlüsselregulator für die Bildung von Blutzellen, und ungewollte Expression von SCL wurde auch bei akuten lymphoblastischen Leukämien gefunden. Klassische knockout Versuche zeigten, dass der ab initio Verlust von SCL embryonal lethal um den Tag E9 war. Um die Funktion von SCL exogen schaltbar inaktivieren zu können, wurde in dieser Arbeit RNAi Technologie mit dem durch Tetrazyklin schaltbaren tet on/off System kombiniert. Diese Vorgehensweise erlaubt die exogen-regulierbare und reversible Kontrolle der RNAi Induktion und ermöglicht somit die Schaltbarkeit des knockdown Phänotyps. Im Rahmen der hier vorgestellten Doktorarbeit wurde zuerst ein geeigneter Vektor hergestellt, welcher sowohl die durch Tetrazyklin kontrollierte Transkription von so genannten shRNAs (kurze, haarnadelförmige RNAs oder hairpin RNAs) erlaubt und gleichzeitig permanent EGFP (enhanced green fluorescent protein) exprimiert. Dieser neue Vektor, pRNAi-EGFP, wurde sowohl auf Expression von EGFP als auch auf kontrollierte Tetrazyklin-vermittelte Expression von shRNAs getestet. Vier verschiedene Zielsequenzen, welche die SCL mRNA erkennen, wurden auf ihre Wirksamkeit getestet, spezifisch SCL zu inaktivieren. Hierfür wurden zuerst leukämische M1 Mauszellen verwendet und dann später die HEK 293 Zelllinie eingesetzt, welche ein speziell für diesen Zweck hergestelltes, mit einer HA-Erkennungssequenz versehenes, SCL Protein exprimierte. Western blot Analysen zeigten, dass rekombinantes SCL-HA Protein durch alle vier RNAi Sequenzen herunterreguliert wurde – allerdings mit unterschiedlicher Stärke (zwischen 25% und 100% knockdown Raten). Darüber hinaus wurde die Tetrazyklin-abhängige Regulierbarkeit der Expression von shRNAs mit Hilfe von Ko-transfektionsexperimenten mit SCL-spezifischem pRNAi-EGFP Plasmid (SCL-siRNA) und dem SCL-HA Expressionsvektor in der HEK 293TR /T-REx Zelllinie bestätigt, die konstitutiv den Tetrazyklin-Repressor exprimiert (TetR). Diese Versuchsreihen bewiesen die strikte Regulierbarkeit der shRNA Expression ohne Hintergrundaktivität. Um den SCL knockdown in vivo kontrollieren zu können und um eine mögliche embryonale Letalität zu vermeiden, wird eine transgene Mauslinie benötigt in welcher der Tetrazyklin-repressor, TetR, ubiquitär exprimiert wird. Hier wurden zwei alternative Methoden verwendet, um solche TetR Mäuse zu generieren. In einer ersten Versuchsreihe wurde der Tetrazyklin-regulierbare RNAi Vektor zusammen mit dem kommerziell erwerblichen, aber hier speziell modifizierten, T-REx Expressionsvektor zur Pronukleusinjektion verwendet (SCL-siRNA T-REx FRT LoxP Mausvariante). Die zweite Methode bestand darin, dass zuerst eine konstitutiv T-REx exprimierende transgene Mauslinie etabliert wurde, welche dann als Eidonor zur Pronukleusinjektion mit dem siRNA knockdown Konstrukt verwendet wurde (SCL-siRNA T-REx Mausvariante). Wie antizipiert und in guter Übereinstimmung mit den verfügbaren Daten von Cre-induzierbaren, konditionalen SCL knockout Mäusen, resultierte die post-transkriptionelle RNAi-vermittelte Inaktivierung von SCL in einer Verschiebung der Anzahl der reifen zur Anzahl der unreifen roten Blutzellen. Dieser „shift“ konnte mit Hilfe von FACS Analysen durch spezifische Oberflächenerkennung mit den für rote Blutzellen spezifischen Markern Ter119 und CD71 sowohl im Knochenmark als auch im peripheren Blut nachgewiesen werden (Lodisch Plot Technik). In der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen zur konditionalen, mittels siRNA vermittelten, in vitro und in vivo Inaktivierung von SCL etabliert. Diese Grundlagen sind ein wichtiges Werkzeug für die darauf aufbauende Forschung zur Aufklärung der Rolle von SCL und seiner in vivo Bedeutung für die Blutzellbildung und für Leukämien im Allgemeinen. Der wichtigste Aspekt dieser Arbeit ist jedoch, dass das hier etablierte exemplarische Wissen die Herstellung von komplett konditional regulierbaren und reversiblen knockdown Phänotypen in der Maus ermöglichen wird.de_DE
dc.language.isoeng
dc.rightsInCopyrightde_DE
dc.rights.urihttps://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subject.ddc500 Naturwissenschaftende_DE
dc.subject.ddc500 Natural sciences and mathematicsen_GB
dc.titleTetracycline-inducible RNAi Knockdown of SCL (Stem Cell Leukaemia) in Miceen_GB
dc.typeDissertationde_DE
dc.identifier.urnurn:nbn:de:hebis:77-9500
dc.identifier.doihttp://doi.org/10.25358/openscience-3498-
jgu.type.dinitypedoctoralThesis
jgu.type.versionOriginal worken_GB
jgu.type.resourceText
jgu.organisation.departmentFB 10 Biologie-
jgu.organisation.year2005
jgu.organisation.number7970-
jgu.organisation.nameJohannes Gutenberg-Universität Mainz-
jgu.rights.accessrightsopenAccess-
jgu.organisation.placeMainz-
jgu.subject.ddccode500
opus.date.accessioned2006-02-24T12:18:50Z
opus.date.modified2006-02-24T12:18:50Z
opus.date.available2006-02-24T13:18:50
opus.subject.otherRNA interference, Tetracycline, inducible, mouse, transgenic, knockdown, Stem cell leukaemia, transcription factoren_GB
opus.organisation.stringFB 10: Biologie: FB 10: Biologiede_DE
opus.identifier.opusid950
opus.institute.number1000
opus.metadataonlyfalse
opus.type.contenttypeDissertationde_DE
opus.type.contenttypeDissertationen_GB
jgu.organisation.rorhttps://ror.org/023b0x485
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