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http://doi.org/10.25358/openscience-3246Full metadata record
| DC Field | Value | Language |
|---|---|---|
| dc.contributor.author | Auschrat, Barbara | |
| dc.date.accessioned | 2009-01-14T15:41:34Z | |
| dc.date.available | 2009-01-14T16:41:34Z | |
| dc.date.issued | 2009 | |
| dc.identifier.uri | https://openscience.ub.uni-mainz.de/handle/20.500.12030/3248 | - |
| dc.description.abstract | Als BH3-only Protein gehört Bid zu den proapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2 Familie, die während der Apoptose die Freisetzung Caspase-aktivierender Proteine aus den Mitochondrien kontrollieren. Bid zählt zu den potentesten BH3-only Proteinen und wird von vielen transformierten und nichttransformierten Zellen konstitutiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, Bid durch RNA-Interferenz stabil zu depletieren, um Bid-abhängige Apoptosewege in HeLa Zervixkarzinomzellen zu identifizieren, die von intrinsischen Stressstimuli sowie von konventionellen und neuartigen Chemotherapeutika induziert werden. Da Bid im Todesrezeptor-vermittelten Signalweg der Apoptose durch Caspase-8 gespalten und aktiviert wird, waren die Bid-depletierten Zellen signifikant vor der Fas/CD95-, TRAIL- oder TNF-α-induzierten Apoptose geschützt und zeigten nach Exposition mit allen drei Todesrezeptorliganden eine drastisch reduzierte Effektorcaspase-Aktivität und eine höhere Proliferationsrate als die Kontrollzellen. Eine ektopische Bidexpression in Bid knock down (kd) Zellen hob die Protektion vor der Fas- und TRAIL-induzierten Apoptose auf. Der Proteasominhibitor Epoxomicin, der Proteinkinase- Inhibitor Staurosporin oder die ER Stress-induzierenden Agenzien Tunicamycin, Thapsigargin und Brefeldin A lösten hingegen einen Bid-unabhängigen Zelltod aus. Allerdings konnten subletale Tunicamycin- oder Thapsigarginkonzentrationen HeLa Zellen für die TRAIL-induzierte Apoptose sensitivieren. Da der Synergieeffekt auf einer ER Stress-vermittelten Amplifizierung des Todesrezeptorwegs beruhte, zu der eine Tunicamycin-induzierte Steigerung der Expression des Todesrezeptors DR5 signifikant beitrug, erfolgte diese Sensitivierung nur in Bid-profizienten Zellen. Bid war in HeLa Zellen außerdem an der apoptotischen Signalkaskade beteiligt, die von den DNA-schädigenden Agenzien Etoposid, Doxorubicin und Oxaliplatin (Oxa) ausgelöst wird. Nach Behandlung mit Oxa zeigten die Bid kd Zellen eine verzögerte Caspase-2, -3, -8 und -9 Aktivierung, einen geringeren Verlust des mitochondrialen Membranpotentials sowie eine reduzierte Apoptose- und eine höhere Proliferationsrate als Bid-profiziente Zellen. Neben Bid war ein weiteres BH3-only Protein, Puma, an der Oxa-induzierten Effektorcaspase-Aktivierung beteiligt, da eine Puma-spezifische siRNA unabhängig vom Bidstatus der Zellen antiapoptotisch wirkte. Im letzten Teil der Arbeit wurde untersucht, welche Proteasen für die durch gentoxische Agenzien induzierte Spaltung und Aktivierung von Bid verantwortlich sind. Obwohl Caspasen für die Exekutionphase der Oxa-induzierten Apoptose notwendig waren, trugen sie weder zur initialen Bidaktivierung noch zur mitochondrialen Depolarisierung bei, da sie erst postmitochondrial aktiviert wurden. Konventionelle Calpaine hingegen wurden nach DNA-Schädigung bereits stromaufwärts der Mitochondrien aktiviert und der Calpaininhibitor Calpeptin reduzierte nicht nur die Bid- und Caspasespaltung, sondern auch die mitochondriale Depolarisierung signifikant. Diese Protektion durch Calpeptin fiel in Bid-depletierten Zellen signifikant geringer als in Bid-profizienten Kontrollzellen aus. Auch war in Oxa-behandelten Bid kd Zellen, die eine durch Caspase-2, -3 und -8 nicht spaltbare Bidmutante exprimierten, trunkiertes Bid nachweisbar, dessen Generierung durch Calpain-, aber nicht durch Caspaseinhibierung verhindert werden konnte. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf eine Calpain-abhängige Bidaktivierung stromaufwärts der Mitochondrien hin und zeigen, dass die BH3-only Proteine Bid und Puma wichtige Vermittler der Oxa-induzierten Apoptose in HeLa Zellen darstellen. | de_DE |
| dc.description.abstract | The BH3-only protein Bid belongs to the proapoptotic members of the Bcl-2 family of proteins which control the release of caspase-activating factors from mitochondria. As Bid can efficiently neutralize many antiapoptotic Bcl-2 proteins and directly activate the multidomain proapoptotic proteins Bak and Bax it is one of the most potent BH3-only proteins and is constitutively expressed in many transformed and non-transformed cells. Whereas the caspase-8-dependent cleavage and activation of Bid following death receptor stimulation has been thoroughly investigated its contribution to stress-induced cell death is less characterized. This study was therefore conducted to identify and characterize Bid-dependent apoptotic pathways triggered by intrinsic stress stimuli and chemotherapeutic drugs in HeLa cervical cancer cells. HeLa cells stably expressing a Bid-specific small hairpin RNA displayed significantly less effector caspase activation and cell death and significantly increased clonogenic survival in response to anti-Fas/CD95, TRAIL or TNF-α treatment. Sensitivity to death receptor-mediated apoptosis was restored when recombinant Bid was ectopically reexpressed in HeLa Bid knock down (kd) cells. Bid-depleted cells were equally sensitive to cell death induced by the proteasome inhibitor epoxomicin, the protein kinase inhibitor staurosporine, and the ER stressors tunicamycin, thapsigargin, and brefeldin A. However, Bid kd cells were dramatically protected from apoptosis when subtoxic concentrations of tunicamycin or thapsigargin were combined with subtoxic TRAIL concentrations. Treatment with tunicamycin potently upregulated the agonistic TRAIL-receptor death receptor 5 (DR5) at the mRNA and protein level without affecting expression levels of death receptor 4. Small interfering RNA (siRNA)-mediated depletion of DR5 expression significantly reduced the synergistic effect between tunicamycin and TRAIL demonstrating that signalling through DR5 and further downstream through Bid was required for the synergy. Interestingly, knock down of Bid also impaired apoptosis induced by the DNA damaging drugs etoposide, doxorubicin, and oxaliplatin (Oxa). After exposure to Oxa mitochondrial depolarization and activation of caspase-2,-3,-8 and -9 were significantly reduced whereas colony formation was increased in Bid-depleted cells. Pretreatment with the pan-caspase inhibitor zVAD-fmk prevented the activation of caspase-2, -3, -8 and -9 in response to Oxa but did not block mitochondrial depolarization suggesting that caspases are not involved in Bid activation upstream of mitochondria. Instead, Oxa triggered an early activation of calpains in Bid kd and control cells. Use of the calpain inhibitor calpeptin significantly reduced Bid cleavage, activation of caspase-2, -3, -8 and -9 and mitochondrial depolarization in Oxa-treated control cells. Calpeptin was significantly less protective in Bid-depleted cells. Inducible expression of a caspase-2, -3 and -8 noncleavable Bid mutant (D59A) failed to mediate TRAIL-induced apoptosis but reactivated cell death in Bid kd cells in response to Oxa. Additionally, D59A-Bid was cleaved following exposure to Oxa. Whereas pretreatment with zVAD-fmk did not prevent the generation of truncated Bid calpeptin significantly reduced the Oxa-induced Bid cleavage. Irrespective of the Bid expression levels treatment with Oxa induced the expression of another BH3-only protein, PUMA, and siRNA-mediated depletion of PUMA mRNA significantly decreased apoptosis in both the control and the Bid kd cells. The data demonstrate that Bid and Puma cooperate to mediate Oxa-induced apoptosis in HeLa cells and that calpain-dependent cleavage is responsible for the activation of Bid upstream of mitochondria. | en_GB |
| dc.language.iso | ger | |
| dc.rights | InCopyright | de_DE |
| dc.rights.uri | https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/ | |
| dc.subject.ddc | 570 Biowissenschaften | de_DE |
| dc.subject.ddc | 570 Life sciences | en_GB |
| dc.title | Untersuchungen zur Rolle des BH3-only-Proteins Bid bei der Stress-induzierten Apoptose in Karzinomzelllinien | de_DE |
| dc.type | Dissertation | de_DE |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:hebis:77-18617 | |
| dc.identifier.doi | http://doi.org/10.25358/openscience-3246 | - |
| jgu.type.dinitype | doctoralThesis | |
| jgu.type.version | Original work | en_GB |
| jgu.type.resource | Text | |
| jgu.organisation.department | FB 10 Biologie | - |
| jgu.organisation.year | 2008 | |
| jgu.organisation.number | 7970 | - |
| jgu.organisation.name | Johannes Gutenberg-Universität Mainz | - |
| jgu.rights.accessrights | openAccess | - |
| jgu.organisation.place | Mainz | - |
| jgu.subject.ddccode | 570 | |
| opus.date.accessioned | 2009-01-14T15:41:34Z | |
| opus.date.modified | 2009-01-14T15:41:34Z | |
| opus.date.available | 2009-01-14T16:41:34 | |
| opus.organisation.string | FB 10: Biologie: FB 10: Biologie | de_DE |
| opus.identifier.opusid | 1861 | |
| opus.institute.number | 1000 | |
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| opus.type.contenttype | Dissertation | de_DE |
| opus.type.contenttype | Dissertation | en_GB |
| jgu.organisation.ror | https://ror.org/023b0x485 | |
| Appears in collections: | JGU-Publikationen | |
