Authors:	Nguyen, Thi-Huong
Title:	Rupture forces of split aptamers
Online publication date:	13-May-2013
Year of first publication:	2013
Language:	english
Abstract:	Rupture forces of ligand-receptor interactions, such as proteins-proteins, proteins-cells, and cells-tissues, have been successfully measured by atomic force spectroscopy (AFS). For these measurements, the ligands and receptors were chemically modified so that they can be immobilized on the tip and on a substrate, respectively. The ligand interact the receptor when the tip approaches the substrate. This interaction can be studied by measuring rupture force upon retraction. However, this technique is not feasible for measurements involving small molecules, since they form only few H-bonds with their corresponding receptors. Modifying small molecules for immobilization on surfaces may block or change binding sites. Thus, recorded rupture forces might not reflect the full scope of the involved small ligand-receptor interactions.rnIn my thesis, a novel concept that allows measuring the rupture force of small involved ligand-receptor interactions and does not require molecular modification for immobilization was introduced. The rupture force of small ligand-receptor interaction is not directly measured but it can be determined from measurements in the presence and in the absence of the ligand. As a model system, the adenosine mono phosphate (AMP) and the aptamer that binds AMP were selected. The aptamer (receptor) is a single stranded DNA that can partially self-hybridize and form binding pockets for AMP molecules (ligands). The bonds between AMP and aptamer are provided by several H-bonds and pair stacking.rnIn the novel concept, the aptamer was split into two parts (oligo a and oligo b). One part was immobilized on the tip and the other one on the substrate. Approaching the tip to the substrate, oligo a and oligo b partially hybridized and the binding pockets were formed. After adding AMP into the buffer solution, the AMP bound in the pockets and additional H-bonds were formed. Upon retraction of the tip, the rupture force of the AMP-split aptamer complex was measured. In the presence of excess AMP, the rupture force increased by about 10 pN. rnThe dissociation constant of the AMP-split aptamer complex was measured on a single molecular level (~ 4 µM) by varying the AMP concentrations and measuring the rupture force at each concentration. Furthermore, the rupture force was amplified when more pockets were added to the split aptamer. rnIn the absence of AMP, the thermal off-rate was slightly reduced compared to that in the presence of AMP, indicating that the AMP stabilized the aptamer. The rupture forces at different loading rates did not follow the logarithmic fit which was usually used to describe the dependence of rupture forces at different loading rates of oligonucleotides. Two distinguished regimes at low and high loading rates were obtained. The two regimes were explained by a model in which the oligos located at the pockets were stretched at high loading rates. rnThe contribution of a single H-bond formed between the AMP molecule and the split aptamer was measured by reducing the binding groups of the AMP. The rupture forces reduce corresponding to the reduction of the binding groups. The phosphate group played the most important role in the formation of H-bond network between the AMP molecule and the split aptamer. rn Die Kräfte für das Aufbrechen von Ligand-Rezeptor Wechselwirkungen, wie sie in Proteinen, Zellen, und lebendigen Geweben vorkommen, wurden erfolgreich mit Rasterkraft-Spektroskopie gemessen. Für diese Messungen wurden Ligand und Rezeptor so modifiziert, dass sie auf einer Spitze und dem Substrat befestigt werden konnten. Ligand und Rezeptor wechselwirken miteinander, wenn die Spitze an die Oberfläche angenähert wird. Diese Wechselwirkungen können durch Messung der Zerreisskraft beim Entfernen der Spitze untersucht werden. Leider ist dieses Verfahren ungeeignet für die Messung kleiner Moleküle, da deren Wechselwirkungen extrem schwach sind. Außerdem kann die Modifikation kleiner Moleküle zur Befestigung an Oberflächen zur Blockade oder Veränderung der Bindungsgruppen führen. Deswegen können die aufgenommenen Zerreisskräfte bei kleinen Molekülen nicht die gesamte Bandbreite der beteiligten Ligand-Rezeptor Wechselwirkungen wiedergeben.rnIn meiner Arbeit wird ein neuartiges Konzept zur Messung schwacher Ligand-Rezeptor Wechselwirkungen eingeführt das keine Modifikation der beteiligten Moleküle benötigt. Die Zerreisskraft zwischen Rezeptor und Ligand wird dabei nicht direkt gemessen sondern ergibt sich als Differenz aus Messungen in Gegenwart und in Abwesenheit des Liganden. Als Modellsystem wurde Adenosinmonophosphat (AMP) und ein Aptamer, das AMP spezifisch bindet, gewählt. Das Aptamer (Rezeptor) ist ein DNA-Einzelstrang, der teilweise selbst hybridisieren kann und dabei Bindungstaschen für AMP (Ligand) bildet. Die Bindungen zwischen dem AMP und dem Aptamer bestehen aus mehreren Wasserstoff-Brückenbindungen.rnIn meinem neuen Konzept wird das Aptamer in zwei Teile (Oligo a und Oligo b) geteilt. Ein Teil wird an der Spitze, der andere auf dem Substrat befestigt. Wenn die Spitze an das Substrat angenähert wird hybridisieren Oligo a and Oligo b teilweise und die Bindungstaschen bilden sich. Bei Zugabe von AMP zur Pufferlösung bindet das AMP in den Taschen und zusätzliche Wasserstoff-Brückenbindungen entstehen. Beim Entfernen der Spitze von der Oberfläche konnte die Zerreißkraft dieses AMP-Split-Aptamer Komplexes gemessen werden. Diese Zereisskraft erhöhte sich in der Gegenwart von AMP um ca. 10 pN.rnDie Dissoziationskonstante des AMP-Split-Aptamers wurde auf Einzel-Molekül-Ebene (~4 µM) durch Veränderung der AMP Konzentration und Messen der Zerreisskraft bei jeder Konzentration bestimmt. Außerdem wurde die Zereisskraft durch die Erhöhung der Bindungstaschen-Zahl verstärkt.rnDie Geschwindigkeitskonstante für die thermodynamische Dissoziation der zwei Oligos war in der Anwesenheit von AMP leicht verringert, was darauf hindeutet, dass AMP das Split-Aptamer mit zwei Bindungstaschen stabilisiert. Die Zerreisskräfte bei verschiedenen Belastungsgeschwindigkeiten folgten keinem logarithmischen Verhalten, das üblicherweise zur Beschreibung des Verhaltens der Zereisskraft von Oligonukleotiden bei verschiedenen Belastungsgeschwindigkeiten verwendet wird. Für hohe und niedrige Belastungsgeschwindigkeiten wurden zwei unterschiedliche Bereiche gefunden, ein Verhalten welches bisher so nicht beschrieben wurde. Ein Modell, das diese beiden Bereiche mit der Dehnung der Bindungstaschen der Oligos erklärt, wurde entwickelt.rnUm den Beitrag einer einzelnen Wasserstoffbrückenbindung zur Bildung der Doppelhelix der Nukleinsäuren zu verstehen wurde die Anzahl der Bindungsgruppen des AMP reduziert, also neue Zielmoleküle dargestellt. Die Zereisskräfte des Split- Aptamers in Anwesenheit dieser Moleküle wurden gemessen. Die Zereisskräfte skalierten linear mit der Anzahl der Bindungsgruppen. Hierbei wurde festgestellt, dass die Phosphatgruppe den größten Anteil an der Ausbildung des Wasserstoffbrücken-Netzwerks zwischen AMP Molekül und Aptamer beiträgt.rn
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2703
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-34207
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	118 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen