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Autoren: Kersten, Christian
Titel: Selectivity determining features in N-myristoyltransferases – a model system for drug targets with conserved binding sites
Online-Publikationsdatum: 10-Aug-2017
Sprache des Dokuments: Englisch
Zusammenfassung/Abstract: In rational drug design projects one major goal is to obtain high affinity ligands for a target, while maintaining selectivity over potential off-targets and thereby reducing unwanted side effects. However, this proves to be challenging when facing highly conserved binding sites. In this project, the focus was laid on a model system of two well investigated essential eukaryotic enzymes, which catalyze the transfer of myristate to a various number of substrates – the N-myristoyltransferases (NMT) of Leishmania major (LmNMT) and the human homologue HsNMT1. The enzymes share an overall sequence identity of over 40 % and an identical first protein-ligand interaction shell. Many non-selective NMT-inhibitors were found previously, but only a few selective ones are known. Further, the molecular basis for selective inhibition was unclear. A combination of molecular dynamic simulations (MDs), isothermal titration calorimetry (ITC), fluorescence-based enzyme inhibition assay and X-ray crystallography was used to analyze protein dynamics, water network formation and their changes upon ligand binding. Two different selectivity determining features were identified and validated by site-directed mutagenesis – the impairment of protein flexibility upon ligand binding close to the catalytically active C-terminus and a highly stable water molecule, only present in the binding site of HsNMT1. Based on these findings, a virtual screening was conducted and three novel and selective LmNMT inhibitors were revealed.
Ein Hauptziel in Projekten des rationalen Wirkstoffdesigns ist es, Liganden zu identifizieren, welche eine hohe Affinität zu einer Zielstruktur aufweisen und gleichzeitig Selektivität gegenüber potentiellen "off-targets" zeigen, um unerwünschte Nebenwirkungen zu reduzieren. Dies stellt im Falle hochkonservierter Bindetaschen jedoch eine Herausforderung dar. Der Fokus dieser Arbeit wurde auf ein Modellsystem zweier gut untersuchter, essentieller eukaryotischer Enzyme gelegt, welche den Transfer von Myristat auf verschiedene Substrate katalysieren – die N-Myristoyltransferasen (NMT) von Leishmania major (LmNMT) und das humane Homologon HsNMT1. Beide Enzyme weisen eine Sequenzidentität von über 40 % und identische direkte Protein-Ligand-Interaktionen auf. Bislang wurden viele unselektive, aber nur wenige selektive NMT-Inhibitoren identifiziert. Die molekulare Begründung im Falle einer selektiven NMT Inhibition blieb jedoch unklar. In dieser Arbeit wurde eine Kombination aus Moleküldynamik-Simulationen (MDs), isothermer Titrationskalorimetrie (ITC), einem fluoreszenzbasierten Assay und Kristallstrukturanalyse eingesetzt, um die Proteindynamik, Netzwerkbildung von Wassermolekülen und deren Veränderungen nach Ligandenbindung zu analysieren. Zwei unterschiedliche selektivtätsbestimmende Eigenschaften konnten identifiziert und mittels zielgerichteter Mutagenese validiert werden – die Einschränkung der Proteinflexibilität nahe des katalytisch aktiven C-Terminus nach Ligandenbindung einerseits, sowie ein hoch-stabil gebundenes Wassermolekül in der Bindetasche von HsNMT1 andereseits. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein virtuelles Screening (VS) durchgeführt, welches zur Entdeckung von drei neuartigen und selektiven LmNMT Inhibitoren führte.
DDC-Sachgruppe: 540 Chemie
540 Chemistry and allied sciences
Veröffentlichende Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Organisationseinheit: FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Veröffentlichungsort: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2524
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000014502
Version: Original work
Publikationstyp: Dissertation
Nutzungsrechte: Urheberrechtsschutz
Informationen zu den Nutzungsrechten: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Umfang: xix, 146 Seiten
Enthalten in den Sammlungen:JGU-Publikationen

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