Authors:	Sarah Dietzen
Title:	Funktionelle Charakterisierung IRF4-gesteuerter Transkriptionsfaktorkomplexe in Th9-Zellen
Online publication date:	18-Nov-2019
Year of first publication:	2019
Language:	german
Abstract:	IRF4 ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Differenzierung von Th9-Zellen essenziell ist und durch Bindung an den Il9-Promotor die Produktion des Th9-typischen Zytokins IL-9 aktiviert. Da IL-9 die Entstehung allergischer Erkrankungen begünstigen kann, entwickeln Irf4-defiziente Tiere im Vergleich zu Wildtyp-Tieren aufgrund einer geringeren IL-9-Expression deutlich schwächere Symptome bei allergischem Asthma. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Biotin-vermittelte Affinitätsreinigungen etabliert und angewandt, um IRF4 im Hinblick auf seine transkriptionelle Funktion zu untersuchen. Hierfür wurde eigens eine Mauslinie generiert, die ubiquitär die in vivo Biotinylierung von IRF4 ermöglicht. Der Vorteil dieser Methoden gegenüber herkömmlichen Immunpräzipitationen besteht darin, dass Streptavidin anstelle von spezifischen Antikörpern zur Isolation des biotinylierten IRF4 in Komplex mit interagierenden Proteinen oder gebundener DNA genutzt werden kann. Im Anschluss an eine Biotin-vermittelte IRF4-Interaktompräzipitation wurden die isolierten Proteine via Western Blot und Massenspektrometrie analysiert. Dabei konnten 137 IRF4-interagierende Proteine identifiziert werden, von denen ein Großteil an der transkriptionellen Regulation von Genen des Immunsystems beteiligt ist. Mithilfe einer Literatur-basierten Datenanalyse wurden IRF4-Interaktionspartner wie IKZF1/3, EZH2 und TYY2 identifiziert, die für weitere Untersuchungen zur Charakterisierung von IRF4-gesteuerten Transkriptionsfaktorkomplexen von hohem Interesse sind. Durch eine Biotin-vermittelte Chromatin-Immunpräzipitation („bioChIP“) mit anschließender Sequenzierung erfolgte eine genomweite Identifizierung von IRF4-Bindestellen in Th9-Zellen. Die Ergebnisse zeigten, dass IRF4 nicht nur am Il9-Promotor eine regulatorische Rolle spielt, sondern durch die Bindung an den Transkriptionsstartpunkt verschiedener Gene des adaptiven Immunsystems sehr wahrscheinlich auch Einfluss auf deren Expression nimmt. Auch hier rückte eine Literatur-basierte Datenanalyse mehrere Gene wie z.B. Prdm-1, Foxo1 und Gene des JAK-STAT-Signalwegs in den Fokus für weiterführende, experimentelle Untersuchungen zur IRF4-regulierten Transkription. Es zeichnet sich ein komplexes, IRF4-gesteuertes transkriptionsregulatorisches Netzwerk ab, in dem IRF4 – in Abhängigkeit seiner Interaktionspartner sowie der jeweils spezifischen DNA-Bindestellen – sowohl als Aktivator als auch Repressor agieren kann. Außerdem scheinen mehrere sich selbst regulierende Reaktionen und verstärkende Rückkopplungsschleifen zu existieren. Abschließend bleibt zu sagen, dass IRF4 nicht nur für die Differenzierung und IL-9-Produktion von Th9-Zellen eine Rolle spielt, sondern an zahlreichen Reaktionen des Immunsystems beteiligt ist. Zukünftige Studien zur Modulation der IRF4-gesteuerten Transkription ermöglichen die Entwicklung neuer Strategien, die potenziell für immuntherapeutische Maßnahmen (z.B. bei Asthma) eingesetzt werden können. IRF4 is a transcription factor essential for Th9-development and production of the Th9-cell specific cytokine IL-9 through transactivation of the Il9-promoter. IL-9 promotes the development of allergic diseases. Accordingly, it has been demonstrated that Irf4-deficient mice develop less symptoms of allergic asthma due to an impaired IL-9-production. In this project, biotin-dependent affinity maturations were optimized to characterize the transcriptional role of IRF4. To do so, a mouse model was established that allows the in vivo biotinylation of IRF4. One major advantage of this method over conventional immunoprecipitations is the use of streptavidin instead of specific antibodies to isolate the biotinylated transcription factor together with interacting proteins or bound DNA. Following a biotin-dependent IRF4-pulldown, the isolated proteins were analyzed via Western Blot and mass spectrometry. Thereby, 137 proteins could be identified, the majority of which function in the transcriptional regulation of genes playing a role in immunity. Through a literature-base data analysis IRF4-interaction partners such as IKZF1/3, EZH2 and TYY2 could be determined, which are of great interest to further characterize IRF4-dependent transcription factor complexes. A biotin-dependent Chromatin-Immunoprecipitation (“bioChIP”) and subsequent sequencing led to the genome wide identification of IRF4-bound genes in Th9-cells. Analysis of these data showed that IRF4 not only plays a regulatory role at the Il9-promoter but might also impact the expression of various other genes participating in the adaptive immune system by binding the respective transcription start site (TSS). Again, a literature-based data evaluation highlighted genes like Prdm-1, Foxo1 and genes of the JAK-STAT-signaling pathway for further investigation of IRF4-dependent transcription. Combined, these results suggest a complex IRF4-regulated transcriptional network in which IRF4 – depending on its interaction partners as well as its DNA-binding site – can act as both transcriptional activator and repressor. Furthermore, several self-regulating reactions and positive feedback loops seem to exist. To conclude, IRF4 does not only play an important role in the differentiation and the IL-9-production of Th9-cells but is also involved in multiple immune reactions. Future studies concerning the modulation of the IRF4-dependent transcriptional network will allow for the development of new strategies that potentially utilize immunotherapeutic approaches (e.g. in allergic asthma).
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2371
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000031645
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	VI, 114 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen