Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2345
Authors: Mahendrarajah, Nisintha
Title: Regulation von Apoptose, Autophagie und DNA-Integrität in Leukämiezellen durch replikativen Stress und pharmakologische Hemmung der Histondeacetylasen
Online publication date: 22-Oct-2019
Language: german
Abstract: Die chronische myeloische Leukämie (CML) ist eine Krebserkrankung, die durch das onkogene BCR/ABL Fusionsprotein charakterisiert ist. Die zielgerichtete Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren ermöglicht in bis zu 80% der Fälle eine normale Lebenserwartung. Allerdings bleiben leukämische Stammzellen meist erhalten und können zu einer Neuerkrankung führen. Derzeit werden Histondeacetylase-Inhibitoren (HDACi) entwickelt, die als vielversprechende Krebsmedikamente in der Therapie von hämatologischen Erkrankungen eingesetzt werden. Dabei sind Kombinationstherapien mit Chemotherapeutika im Fokus, da sie effizienter als Monotherapien sind. Hydroxyurea wird aktuell als stabiles Medikament gegen Sichelzellanämie sowie gegen chronische myeloproliferative Erkrankungen eingesetzt. Aufgrund der Funktion als Ribonukleotidreduktase-Inhibitor wird Hydroxyurea in Laboren oft dazu verwendet, gezielt replikativen Stress durch Depletion von dNTPs zu induzieren. Replikativer Stress setzt in den Zellen eine komplexe Zellantwort in Gang. Dabei spielen Prozesse wie die DNA-Schadensantwort, Apoptose und Autophagie eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob der Klasse I HDACi MS 275 CML Zellen gegenüber Hydroxyurea sensitiviert. Die Daten zeigen, dass MS 275 die Expression des CDKi p21 und einen G1 Arrest der Zellen auslöst. Hydroxyurea hingegen arretiert die Zellen in der S Phase und fördert die Autophagie. Die kombinierte Gabe von MS 275 und Hydroxyurea führt zu einer signifikanten und synergistischen Zunahme der Apoptose, sowie zu einer Caspase abhängigen Proteolyse von Autophagieregulatoren. Als kritischen Faktor für eine von dem Tumorsuppressor p53-unabhängige Apoptoseinduktion wurde das pro apoptotische Protein NOXA ermittelt. Experimente mit einer genetischen Eliminierung von NOXA sowie Versuche mit NOXA-defizienten MEFs belegen eine unabdingbare Rolle von NOXA in der Aktivierung der Apoptosekaskade nach Kombinationsbehandlung in CML Zellen. Als weitere wichtige Faktoren des Apoptosewegs wurden c-ABL und p73 als vorgeschaltete Regulatoren von NOXA ausfindig gemacht. Die Untersuchung der DNA Schadensantwort ergab, dass MS 275 die von Hydroxyurea induzierte Aktivierung von Checkpoint-Kinasen, sowie insbesondere die Mengen an DNA Strangbrüchen deutlich erhöht. Die pharmakologische Hemmung von ATR und CHK1 hat eine zusätzliche Zunahme an DNA Schäden in MS-275/Hydroxyurea behandelten CML Zellen zur Folge. Die Inaktivierung der ATR-CHK1 Achse führt zu einer signifikanten Reduktion der durch MS-275/Hydroxyurea induzierten Apoptose. Diese Daten legen eine bisher unbekannte pro-apoptotische Rolle von ATR und CHK1 durch eine transkriptionelle Regulation von NOXA offen. Zudem wird dargelegt, dass Klasse I HDACs unerlässlich für die DNA-Reparatur, die Hemmung der Apoptose sowie für den Erhalt der Autophagie in CML Zellen nach replikativem Stress sind. Der aufgedeckte Mechanismus kann als generelles Konzept für die Wirkungsweise von Hydroxyurea und HDACi, insbesondere im Kontext der CML verstanden werden. Da die Behandlungsstrategie mit Hydroxyurea und HDACi vielversprechende Daten liefert, ermutigt dies zu Analysen der Kombinationstherapie in klinischen Studien.
Chronic myeloid leukemia (CML) is a hematological disorder characterized by the presence of the oncogenic fusion protein BCR/ABL. The targeted therapy with tyrosine kinase inhibitors allows in up to 80% of all CML cases an ordinary life expectancy. However, remaining leukemic stem cells can lead to new cases. At present, histone deacetylase inhibitors (HDACi) are newly developed and used as promising cancer drugs in therapy of leukemia. Combination therapies of chemotherapeutics are gaining in importance more and more, as they show higher efficacies than monotherapies. Hydroxyurea is currently the stable drug for the treatment of sickle cell anemia and chronic myeloproliferative disorders. As hydroxyurea acts as a ribonucleotide reductase inhibitor, it is commonly used in laboratories for generating replicative stress through depletion of the dNTP pool. Replicative Stress induces a complex cellular program involving DNA damage response, apoptosis and autophagy. In this thesis, I analysed if the class I HDACi MS-275 sensitizes CML cells towards hydroxyurea. Here I show that MS-275 induces the expression of the CDKi p21 and stalls the cells in G1 phase. Whereas hydroxyurea arrests the cells in S phase and triggers autophagy. The additional application of MS-275 leads to a significant and synergistic increase in apoptosis as well as to a caspase-dependent cleavage of autophagic regulators. As critical factor in inducing p53-independent apoptosis the pro-apoptotic protein NOXA was determined. Genetic elimination of NOXA as well as experiments with NOXA deficient MEFs confirmed the important role of this protein in activation of the apoptotic cascade upon MS-275/Hydroxyurea treatment in CML cells. As further critical factors in the apoptotic pathway c-ABL and p73 were found as upstream regulators of NOXA. The investigation of the DNA damage response revealed that the class I HDACi MS 275 enhances the hydroxyurea-induced activation of checkpoint kinases as well as the amount of DNA strand breaks, notably. The pharmacological inhibition of ATR and CHK1 results in a distinct accumulation of DNA damage in MS-275/Hydroxyurea-treated CML cells. The inactivation of the ATR-CHK1 axis evokes a significant reduction of the MS 275/Hydroxyurea induced apoptosis. My data reveal a previously unidentified pro-apoptotic role of ATR and CHK1 through a transcriptional control of NOXA. Furthermore, I demonstrate that class I HDACs are necessary to initiate DNA repair, to prevent apoptosis and to sustain autophagy during replicative stress in CML cells. The disclosed mechanism is to be taken as a concept for the efficacy of hydroxyurea and HDACi especially in the context of CML. As the therapeutic strategy of hydroxyurea and HDACi show promising results, this encourages one to introduce the combinatorial therapy in clinical trials.
DDC: 610 Medizin
610 Medical sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2345
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000031273
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 153 Blätter
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