Authors:	Großerüschkamp, Marc
Title:	Time-resolved surface enhanced resonance Raman spectro-electrochemistry of heme proteins
Online publication date:	18-Jan-2011
Year of first publication:	2011
Language:	english
Abstract:	The membrane protein Cytochrome c Oxidase (CcO) is one of the most important functional bio-molecules. It appears in almost every eukaryotic cell and many bacteria. Although the different species differ in the number of subunits, the functional differences are merely marginal. CcO is the terminal link in the electron transfer pathway of the mitochondrial respiratory chain. Electrons transferred to the catalytic center of the enzyme conduce to the reduction of molecular oxygen to water. Oxygen reduction is coupled to the pumping of protons into the inter-membrane space and hence generates a difference in electrochemical potential of protons across the inner mitochondrial membrane. This potential difference drives the synthesis of adenosine triphosphate (ATP), which is the universal energy carrier within all biological cells. rnrnThe goal of the present work is to contribute to a better understanding of the functional mechanism of CcO by using time-resolved surface enhanced resonance Raman spectroscopy (TR-SERRS). Despite intensive research effort within the last decades, the functional mechanism of CcO is still subject to controversial discussions. It was the primary goal of this dissertation to initiate electron transfer to the redox centers CuA, heme a, heme a3 and CuB electrochemically and to observe the corresponding redox transitions in-situ with a focus on the two heme structures by using SERRS. A measuring cell was developed, which allowed combination of electrochemical excitation with Raman spectroscopy for the purpose of performing the accordant measurements. Cytochrome c was used as a benchmark system to test the new measuring cell and to prove the feasibility of appropriate Raman measurements. In contrast to CcO the heme protein cc contains only a single heme structure. Nevertheless, characteristic Raman bands of the hemes can be observed for both proteins.rnrnIn order to investigate CcO it was immobilized on top of a silver substrate and embedded into an artificial membrane. The catalytic activity of CcO and therefore the complete functional capability of the enzyme within the biomimetic membrane architecture was verified using cyclic voltammetry. Raman spectroscopy was performed using a special nano-structured silver surface, which was developed within the scope of the present work. This new substrate combined two fundamental properties. It facilitated the formation of a protein tethered bilayer lipid membrane (ptBLM) and it allowed obtaining Raman spectra with sufficient high signal-to-noise ratios.rnSpectro-electrochemical investigations showed that at open circuit potential the enzyme exists in a mixed-valence state, with heme a and and heme a3 in the reduced and oxidized state, respectively. This was considered as an intermediate state between the non-activated and the fully activated state of CcO. Time-resolved SERRS measurements revealed that a hampered electron transfer to the redox center heme a3 characterizes this intermediate state.rn Das Membranprotein Cytochrom c Oxidase (CcO) ist eines der wichtigsten funktionellen biologischen Moleküle. In leicht abgewandelter Form kommt es fast allen Eukaryoten und in einigen Bakterien vor. Als Teil der mitochondrialen Atmungskette ist die CcO das letzte Glied einer Elektronentransferkette. Die and das katalytische Zentrum des Enzyms übertragenen Elektronen dienen der Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Das an diesen Prozess gekoppelte Pumpen von Protonen in den Intermembranraum erzeugt einen Protonengradienten relativ zur Matrix, welcher die Synthese von Adenosintriphosphat (ATP) antreibt. Dabei ist ATP der universelle Energieträger in allen biologischen Zellen.rnrnZiel der vorliegenden Arbeit ist, mittels oberflächenverstärkter resonanter Raman Spektroskopie (SERRS), zum besseren Verständnis der Funktionsweise der CcO beizutragen. Trotz des intensiven Forschungsaufwands in den letzten Jahrzehnten, ist diese noch immer Gegenstand kontroverser Diskussionen. rnVordergründiges Ziel meiner Dissertation war es, den Elektronentransfer zu den vier Redox-Zentren CuA, Häm a, Häm a3 und CuB elektrochemisch zu initiieren und diesen, insbesondere in Bezug auf die beiden Häm Strukturen, sowohl qualitativ als auch quantitativ mit Hilfe von SERRS zu charakterisieren. rnrnZunächst wurde eine Messzelle entworfen, die es ermöglichte die entsprechenden Messungen durch Kombination der elektrochemischen Anregung mit Raman Spektroskopie durchzuführen. Das Hämprotein Cytochrom c, welches nur ein einziges Redox-Zentrum besitz, wurde benutzt um die Messzelle erfolgreich zu testen sowie die Durchführbarkeit der Raman Messungen zu belegen. rnrnUm das Protein CcO zu untersuchen wurde dieses auf einem Silbersubstrat immobilisiert und anschließend in eine künstliche Membran, eingebettet. Die katalytische Aktivität des Enzyms und damit die volle Funktionsfähigkeit in der biomimetischen Membranarchitektur, konnte mit Hilfe zyklischer Voltammetrie nachgewiesen werden. Für die Raman Spektroskopie kam eine eigens für diese Untersuchung entwickelte nano-strukturierte Silberoberfläche zum Einsatz, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erarbeitet wurde. Diese vereinheitlicht zwei wesentliche Eigenschaften. Sie erlaubt die Formierung der proteinverankerten Doppelschicht- Lipidmembran (ptBLM) und ermöglicht den Oberflächenverstärkungseffekt zu nutzen um Ramanspektren mit ausreichendem Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen.rnrnDie spektro-elektrochemischen Untersuchungen zeigten, dass das nicht vollständig aktivierte Enzym in einem gemischten Valenzzustand vorkommt, der durch ein vollständig reduziertes Häm a und ein vollständig oxidiertes Häm a3 gekennzeichnet ist. Weiterhin konnte der Redox-Zustand des katalytischen Häm a3 durch Variation des angelegten elektrischen Potentials gezielt verändert werden. Zeitaufgelöste SERRS Messungen ergaben, dass der nicht vollständig aktivierte Zustand der CcO nicht nur durch geringe katalytische Aktivität, sondern auch durch eine verlangsamte Elektronentransferrate gekennzeichnet ist.rn
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2320
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-25602
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	156 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen