Authors:	Bektas, Inga
Title:	Das wasserlösliche Chlorophyll-Protein (WSCP): biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur biologischen Funktion
Online publication date:	31-May-2010
Year of first publication:	2010
Language:	german
Abstract:	Das WSCP (water-soluble chlorophyll protein) der Brassicaceen ist das einzig bekannte Chlorophyll-bindende Protein, welches keine Carotinoide bindet. Es ist ein wasserlösliches, ca. 80 kDa großes Homotetramer mit 1-4 gebundenen Chlorophyllen. Das Protein ist äußerst stabil und vermag die gebundenen Chlorophylle vor Photooxidation zu schützen. Seine Funktion in der Pflanze ist bis heute ein Rätsel und sollte in dieser Arbeit zusammen mit seinen biochemischen Eigenschaften weiter aufgeklärt werden. Es wurden Versuche durchgeführt mit nativem und rekombinantem WSCP aus Blumenkohl (BoWSCP bzw. BoWSCPhis) und aus Arabidopsis thaliana (AtWSCP bzw. AtWSCPhis). Die Expressionsausbeute von BoWSCPhis konnte verbessert werden und zusätzlich wurde die Rekonstitutionsmethode für das rekombinante WSCP optimiert, sodass das pigmentierte Protein mit hoher Ausbeute und großer Reinheit gewonnen werden konnte. Zudem wurde ein neuer WSCP-Klon hergestellt, mBoWSCPhis, der in seiner Sequenz dem maturen nativen BoWSCP entspricht und weitaus weniger Aggregationsprobleme zeigte als BoWSCPhis. Weiterführende Versuche zur Stabilität und dem Oligomerisierungsgrad von WSCP haben die neue Erkenntnis erbracht, dass die Phytolschwänze der von WSCP gebundenen Chlorophylle zwar essentiell sind für die Stabilität von WSCP-Oligomeren, nicht aber für die Oligomerisierung selbst, wie es in der Literatur bislang postuliert wurde. Zusätzlich zu ihrer außerordentlichen Hitzestabilität erwiesen sich die Chl-WSCP-Komplexe als stabil in einem breiten pH-Spektrum. AtWSCPhis besaß eine vergleichbare Stabilität, und auch das Oligomerisierungsverhalten zeigte Ähnlichkeiten zu BoWSCPhis. Im Rahmen einer Forschungskooperation mit dem Institut für Optik und Atomare Physik der TU Berlin wurden zeitaufgelöste Absorptionsspektren sowie Tieftemperatur-Fluoreszenzspektren an Chl-WSCP-Komplexen gemessen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die WSCP-gebundenen Chlorophylle excitonisch gekoppelt sind und wiesen zudem auf unterschiedliche Chl-Bindungsmodi hin. Aufgrund seines einfachen Aufbaus und seines geringen Chlorophyllgehalts hat sich WSCP bei diesen Versuchen als sehr geeignetes Modellsystem erwiesen, um Messungen zur Chlorophyllbindung mit Vorhersagen aus theoretischen Modellen zu vergleichen. Bei den Experimenten zur biologischen Funktion wurden einerseits Arabidopsis thaliana WSCP-„knock-out“-Pflanzen unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert, andererseits wurden Experimente mit rekombinantem WSCP durchgeführt, um eine mögliche Interaktion mit anderen Proteinen zu detektieren. Die vegetativen Stadien der Mutante zeigten keinen Phänotyp; das native Arabidopsis-WSCP konnte später bei der Wildtyp-Pflanze ausschließlich in jungen Schoten lokalisiert werden, was eine Erklärung hierfür lieferte. Rekombinantes WSCP konnte Chlorophylle aus nativem LHCII entfernen, eine Interaktion mit Chlorophyllase konnte jedoch nicht nachgewiesen werden; daher konnte auch die Hypothese, WSCP sei ein Chl-Carrier beim Chl-Abbau, nicht untermauert werden. Bei den durchgeführten Enzym-Assays wurde eine geringfügige Inhibition der Cysteinprotease Papain beobachtet, aber keine Inhibition der Serinprotease Trypsin, obwohl Blumenkohl-WSCP N-proximal das Motiv der Künitz-Proteaseinhibitoren besitzt. Die Frage nach der biologischen Funktion von WSCP bleibt also weiterhin offen. The water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of the Brassicaceae family is the only known chlorophyll-binding protein that does not bind carotenoids. It is a homotetramer of approximately 80 kDa containing 1-4 bound chlorophylls. The protein is extremely stable and protects the bound chlorophylls from photooxidization. This work concentrated on investigating the biological function of WSCP as well as its biochemical properties. Experiments were performed with native and recombinant WSCP from cauliflower (BoWSCP and BoWSCPhis) and from Arabidopsis thaliana (AtWSCP and AtWSCPhis). The yield of BoWSCPhis expression was improved and additionally, the reconstitution method for recombinant WSCP was optimized, so that the pigmented protein was obtained in large amounts and with high purity. Also, a new WSCP clone, named mBoWSCPhis, was constructed with its sequence corresponding to that of mature native BoWSCP. This protein showed far less aggregation than BoWSCPhis. As opposed to an earlier report, WSCP tetramerization does not depend on the presence of phytol chains in the chlorophylls, although these are essential for the stability of WSCP oligomers. The Chl-WSCP complexes are not only exceptionally heat-stable but also withstand a wide range of pH values. AtWSCPhis proved comparably stable and also showed a similar oligomerization behavior as BoWSCPhis. In the course of a research cooperation with the Optical Institute of the TU Berlin, time resolved absorption spectra as well as low-temperature fluorescence spectra of Chl-WSCP complexes were measured. The results clearly showed that the WSCP-bound chlorophylls are excitonically coupled and also indicated that there are different modes of chl-bindung in WSCP. Due to its simple structure and low chlorophyll content, WSCP proved a very suitable model system for comparing measurements of chlorophyll binding to predictions based on theoretical models. For studying the biological function of the protein, Arabidopsis thaliana WSCP “knock-out“ mutants were characterized under different growth and stress conditions, and also experiments with the recombinant protein were performed in order to detect possible interactions with other proteins. The vegetative stages of the mutant showed no phenotype. Consistently, in wild-type Arabidopsis no WSCP was detected in leaves but it was in young siliques. In experiments in vitro, recombinant WSCP was able to remove chlorophylls from native LHCII, but an interaction with chlorophyllase was not detected. Therefore, the hypothesis that WSCP acts as a Chl-carrier during Chl-breakdown could not be supported. Cauliflower WSCP slightly inhibited the cysteine-protease papain but did not inhibit the serine-protease trypsin in spite of its N-proximal Künitz-type protease inhibitor motif. The biological function of WSCP therefore remains an open and interesting question.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2283
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-22846
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	192 S.
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