Authors:	Placentino, Maria
Title:	Characterization of parental and zygotic contributions to siRNA mediated silencing in C. elegans
Online publication date:	25-Jun-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	The Piwi pathway is a germline-specific defence mechanism that animals have evolved to silence transposable elements, in order to preserve genome integrity and ensure survival of a species. In C. elegans, the Piwi protein PRG-1 forms a complex together with its 21U RNA co-factor, in order to recognize and silence a target RNA. Upon target recognition, an RNA-dependent RNA polymerase is recruited to the target RNA to use it as a template and synthetize secondary siRNAs. These so-called 22G RNAs are then loaded onto secondary Argonaute proteins, such as WAGO-1 and HRDE-1, to amplify the silencing reaction. In some cases, the silencing mediated by HRDE-1 can become independent from PRG-1 and is accompanied by the deposition of heterochromatic marks at the targeted locus. This form of silencing is extremely stable and can be transmitted for several generations; it depends on HRDE-1 as well as mutator proteins, and it is called RNAe. RNAe establishes in a stochastic manner, but the mechanisms behind this decision are not known. We therefore investigated how PRG-1 mediated silencing is connected to RNAe. In chapter 2, we show that maternally provided 21U RNAs are essential for establishing de novo 22G RNAs production. The parental contribution of both 21U RNAs and RNAe silencing memory is necessary to instruct the silencing machinery in the next generation, to ensure appropriate gene silencing as well as gene expression; this is an essential requirement to guarantee gonad development and fertility. In chapter 3, we use a transgenic 21U RNA target and define that maternal 21U RNAs are not only necessary, but also sufficient to initiate de novo silencing. Moreover, in some cases, maternal 21U RNAs can trigger RNAe. This silencing can also affect endogenous targets, thereby causing variability in the transcriptome among different individuals. In chapter 4, we describe the characterization of a novel factor, which we named PID-2. PID-2 is required to establish de novo target silencing initiated by maternal 21U RNAs, in particular to boost the production of secondary 22G RNAs and to establish RNAe. PID-2 is also involved in Tc1 silencing, acting just downstream of PRG-1. PID-2 interacts with two novel Tudor proteins, PID-4 and PID-5, and together they are required for maintenance of an immortal germline over generations. These factors are linking PRG-1 mediated silencing to RNAe, therefore we started to unravel the requirements for establishing this very stable form of silencing. Der Piwi-Pathway ist ein keimbahnspezifischer Abwehrmechanismus, den Tiere entwickelt haben, um mobile Elemente der Erbinformation stillzulegen. Dies dient der Erhaltung der Genomintegrität und sichert die Fruchtbarkeit und somit das Überleben einer Art. In C. elegans bildet das Piwi-Protein PRG-1 zusammen mit seinem 21U RNA-Cofaktor einen Komplex, um RNAs zu erkennen und stillzulegen. Dabei wird eine RNA-abhängige RNA-Polymerase an die RNA rekrutiert um sekundäre siRNAs zu synthetisieren. Diese sogenannten 22G RNAs dienen als Cofaktoren für sekundäre Argonaute-Proteine wie WAGO-1 und HRDE-1, welche die Silencing-Reaktion verstärken. In einigen Fällen kann das von HRDE-1 vermittelte Silencing unabhängig von PRG-1 werden und wird von folglich von repressiven Histonmodifikationen an den Zielgenen begleitet. Diese Form des Silencing ist extrem stabil und kann über mehrere Generationen übertragen werden; sie hängt sowohl von HRDE-1 als auch von Mutatorproteinen ab und heißt RNAe. RNAe etabliert sich stochastisch, jedoch sind die Mechanismen hinter diesem Prozess nicht bekannt. Wir haben daher untersucht, wie PRG-1 vermitteltes Silencing mit RNAe zusammenhängt. In Kapitel 2 zeigen wir, dass mütterlich vererbte 21U RNAs für die Etablierung der de novo 22G RNA Produktion unerlässlich sind. Sowohl der elterliche Beitrag von 21U RNAs als auch das RNAe Silencing Gedächtnis sind notwendig, um die Silencing-Maschinerie in der nächsten Generation anzuleiten und damit ein angemessenes Gen-Silencing zu erhalten. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung, um die Entwicklung der Gonaden und die Fruchtbarkeit zu gewährleisten. In Kapitel 3 verwenden wir ein Transgen, das von einer 21U RNA erkannt wird. Damit können wir nachweisen, dass mütterliche 21U RNAs nicht nur notwendig, sondern auch ausreichend sind um de novo Silencing einzuleiten. Darüber hinaus können in einigen Fällen mütterliche 21U RNAs RNAe auslösen. Diese Stillegung kann sich auch auf endogene Zielgene auswirken, was zu einer Variabilität des Transkriptoms zwischen verschiedenen Individuen führt. In Kapitel 4 beschreiben wir die Charakterisierung eines bisher unbekannten Proteins, das wir PID-2 genannt haben. PID-2 ist erforderlich, um de novo Target Silencing zu etablieren, das von mütterlichen 21U RNAs initiiert wird. In diesem Prozess ist PID-2 erforderlich um die Produktion von sekundären 22G RNAs zu steigern und RNAe zu etablieren. PID-2 ist auch am Tc1-Silencing beteiligt und agiert dabei nach PRG-1. PID-2 interagiert mit zwei neuartigen Tudor-Proteinen, PID-4 und PID-5, und zusammen werden sie für die transgenerationale Erhaltung einer unsterblichen Keimbahn benötigt. Die beschriebenen Faktoren verbinden das PRG-1 vermittelte Silencing mit RNAe und geben erste Aufschlüsse über die Anforderungen für die Etablierung dieser sehr stabilen Form des Silencing.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	Externe Einrichtungen
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1998
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000028428
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	212 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen