Authors:	Nilkens, Stephanie
Title:	The NreABC system of Staphylococcus carnosus combines nitrate and oxygen sensing by an NreA,NreB sensor complex
Online publication date:	16-Dec-2013
Year of first publication:	2013
Language:	english
Abstract:	Staphylococcus carnosus is a facultative anaerobic bacterium which features the cytoplasmic NreABC system. It is necessary for regulation of nitrate respiration and the nitrate reductase gene narG in response to oxygen and nitrate availability. NreB is a sensor kinase of a two-component system and represents the oxygen sensor of the system. It binds an oxygen labile [4Fe-4S]2+ cluster under anaerobic conditions. NreB autophosphorylates and phosphoryl transfer activates the response regulator NreC which induces narG expression. The third component of the Nre system is the nitrate receptor NreA. In this study the role of the nitrate receptor protein NreA in nitrate regulation and its functional and physiological effect on oxygen regulation and interaction with the NreBC two-component system were detected. In vivo, a reporter gene assay for measuring expression of the NreABC regulated nitrate reductase gene narG was used for quantitative evaluation of NreA function. Maximal narG expression in wild type S. carnosus required anaerobic conditions and the presence of nitrate. Deletion of nreA allowed expression of narG under aerobic conditions, and under anaerobic conditions nitrate was no longer required for maximal induction. This indicates that NreA is a nitrate regulated inhibitor of narG expression. Purified NreA and variant NreA(Y95A) inhibited the autophosphorylation of anaerobic NreB in part and completely, respectively. Neither NreA nor NreA(Y95A) stimulated dephosphorylation of NreB-phosphate, however. Inhibition of phosphorylation was relieved completely when NreA with bound nitrate (NreAâ ¢[NO3-]) was used. The same effects of NreA were monitored with aerobically isolated Fe-S-less NreB, which indicates that NreA does not have an influence on the iron-sulfur cluster of NreB. In summary, the data of this study show that NreA interacts with the oxygen sensor NreB and controls its phosphorylation level in a nitrate dependent manner. This modulation of NreB-function by NreA and nitrate results in nitrate/oxygen co-sensing by an NreA/NreB sensory unit. It transmits the regulatory signal from oxygen and nitrate in a joint signal to target promoters. Therefore, nitrate and oxygen regulation of nitrate dissimilation follows a new mode of regulation not present in other facultative anaerobic bacteria. Staphylococcus carnosus ist ein fakultativ anaerobes Bakterium und besitzt das zytoplasmatische NreABC-System für die Regulation der Gene der Nitratatmung. Dieses System reguliert die Expression des Nitratreduktase-Gens narG in Abhängigkeit der Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nitrat. NreB stellt die Sensorhistidinkinase des NreBC-Zweikomponenten-Systems dar und dient der Wahrnehmung von Sauerstoff. Unter anaeroben Bedingungen wird NreB durch die Bindung eines sauerstofflabilen [4Fe-4S]2+-Zentrums an der Sensordomäne aktiviert. Dies führt zur verstärkten Autophosphorylierung von NreB an der Kinasedomäne und zum Phosphoryltransfer auf den Antwortregulator NreC. Dadurch wird NreC aktiviert und induziert die Expression von narG. Die dritte Komponente des Nre-Systems ist der Nitratrezeptor NreA. In dieser Arbeit wurde die Funktion des Nitratrezeptors NreA in der Nitratregulation aufgeklärt. Die funktionellen und physiologischen Effekte von NreA und Nitrat sowie die Interaktion von NreA mit dem NreBC-Zweikomponentensystem wurden gezeigt. Für eine in vivo Untersuchung der Expression des NreABC-regulierten Nitratreduktase-Gens narG wurde ein Reportergen-System erstellt. Es diente der quantitativen Auswertung der NreA-Funktion. Maximale narG-Expression in wildtypischem S. carnosus erfordert anaerobe Bedingungen und Nitrat. Eine Deletion von nreA bewirkt eine Expression von narG unter aeroben Bedingungen und unter anaeroben Bedingungen wird Nitrat für eine maximale narG-Expression nicht mehr benötigt. Dies zeigt, dass NreA ein durch Nitrat regulierter Inhibitor der narG-Expression ist. Die in vitro Untersuchung des Effekts von gereinigtem NreA auf die Autophosphorylierung von anaerob isoliertem NreBâ ¢[4Fe-4S]2+ hat gezeigt, dass NreA die NreB-Phosphorylierung inhibiert. Dieser inhibitorische Effekt wird durch die Variante NreA(Y95A) verstärkt und die Phosphorylierung von NreB komplett inhibiert. Die Inhibition der Phosphorylierung von NreB wurde komplett aufgehoben, wenn NreA mit gebundenem Nitrat (NreAâ ¢[NO3-]) vorliegt. Es konnte zudem gezeigt werden, dass es sich bei NreA nicht um eine Phosphatase handelt, da weder NreA noch NreA(Y95A) die Dephosphorylierung von phosphoryliertem NreB stimulieren. Ebenfalls wurde gezeigt, dass NreA keinen Einfluss auf das Eisen-Schwefel-Zentrum von NreB hat, da NreA den gleichen Effekt auf aerob isoliertes NreB, welches kein [4Fe-4S]2+-Zentrum trägt, ausübt. Zusammenfassend zeigen die Daten dieser Arbeit, dass NreA mit dem Sauerstoffsensor NreB interagiert und die NreB-Phosphorylierung in Abhängigkeit von Nitrat kontrolliert. Diese Modulation der NreB-Funktion durch NreA und Nitrat ergibt eine Kombination der Nitrat/Sauerstoff-Wahrnehmung, die durch einen NreA/NreB-Sensorkomplex erfolgt. Der Sensorkomplex leitet die regulierenden Signale von Sauerstoff und Nitrat als vereintes Signal über einen Antwortregulator, NreC, zu den Zielgenen. Dies stellt eine neue Art der Regulation der Expression der dissimilatorischen Nitratreduktase dar, die in anderen fakultativ anaeroben Bakterien nicht vorhanden ist.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1795
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-35946
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	117 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen