Autoren:	Holland, Julia
Titel:	Development of a highly potent bispecific antibody format targeting the novel tumor-specific antigen CLDN18.2
Online-Publikationsdatum:	8-Jan-2015
Erscheinungsdatum:	2015
Sprache des Dokuments:	Englisch
Zusammenfassung/Abstract:	Due to multiple immune evasion mechanisms of cancer cells, novel therapy approaches are required to overcome the limitations of existing immunotherapies. Bispecific antibodies are potent anti-cancer drugs, which redirect effector T cells for specific tumor cell lysis, thus enabling the patient- immune system to fight cancer cells. The antibody format used in this proof of concept studyâ bispecific ideal monoclonal antibodies termed BiMABâ is a tailor-made recombinant protein, which consists of two fused scFv antibodies recognizing different antigens. Both are arranged in tandem on a single peptide chain and the individual variable binding domains are separated by special non-immunogenic linkers. The format is comprised of a scFv targeting CLDN18.2â a gastric cancer tumor associated antigen (TAA) â while the second specificity binds the CD3 epsilon (CD3ε) subunit of the T cell receptor (TCR) on T cells. For the first time, we compared in our IMAB362-based BiMAB setting, four different anti-CD3-scFvs, respectively derived from the mAbs TR66, CLB-T3, as well as the humanized and the murine variant of UCHT1. In addition, we investigated the impact of an N- versus a C-terminal location of the IMAB362-derived scFv and the anti-CD3-scFvs. Thus, nine CLDN18.2 specific BiMAB proteins were generated, of which all showed a remarkably high cytotoxicity towards CLDN18.2-positive tumor cells. Because of its promising effectiveness, 1BiMAB emerged as the BiMAB prototype. The selectivity of 1BiMAB for its TAA and CD3ε, with affinities in the nanomolar range, has been confirmed by in vitro assays. Its dual binding depends on the design of an N-terminally positioned IMAB362 scFv and the consecutive C-terminally positioned TR66 scFv. 1BiMAB provoked a concentration and target cell dependent T cell activation, proliferation, and upregulation of the cytolytic protein Granzyme B, as well as the consequent elimination of target cells. Our results demonstrate that 1BiMAB is able to activate T cells independent of elements that are usually involved in the T cell recognition program, like antigen presentation, MHC restriction, and co-stimulatory effector molecules. In the first in vivo studies using a subcutaneous xenogeneic tumor mouse model in immune incompetent NSG mice, we could prove a significant therapeutic effect of 1BiMAB with partial or complete tumor elimination. The initial in vitro RIBOMAB experiments correspondingly showed encouraging results. The electroporation of 1BiMAB IVT-RNA into target or effector cells was feasible, while the functionality of translated 1BiMAB was proven by induced T cell activation and target cell lysis. Accordingly, we could show that the in vitro RIBOMAB approach was applicable for all nine BiMABs, which proves the RIBOMAB concept. Thus, the CLDN18.2-BiMAB strategy offers great potential for the treatment of cancer. In the future, administered either as protein or as IVT-RNA, the BiMAB format will contribute towards finding solutions to raise and sustain tumor-specific cellular responses elicited by engaged and activated endogenous T cells. This will potentially enable us to overcome immune evasion mechanisms of tumor cells, consequently supporting current solid gastric cancer therapies. Aufgrund etlicher Immunevasionsmechanismen der Krebszellen werden neuartige Therapieansätze notwendig, um die Grenzen der bestehenden Immuntherapien zu überwinden. Bispezifische Antikörper sind potente Antikrebsmedikamente, die die Effektor-T-Zellen zur spezifischen Lyse von Tumorzellen anleiten, wodurch das eigene Immunsystem des Patienten die Krebszellen letztendlich bekämpft. Das Antikörper-Format welches in dieser â Proof of Conceptâ -Studie seine Anwendung findet â ein bispezifischer idealer monoklonaler Antikörper genannt BiMAB â ist ein maßgeschneidertes rekombinantes Protein, das aus zwei fusionierten scFv Antikörpern besteht, die jeweils zwei unterschiedliche Antigene erkennt. Beide werden im Tandem (nacheinander) auf einer einzigen Peptidkette angeordnet, wobei die beiden variablen Bindungsdomänen von speziellen nicht-immunogenen Linkern getrennt werden. Das Format besteht aus einem scFv welcher das Target CLDN18.2 ein tumorassoziiertes Antigen (TAA) des Magenkrebs bindet, während die zweite Spezifität sich mit CD3-Epsilon (CD3Æ ), der Untereinheit des T-Zell-Rezeptor (TCR) auf T-Zellen befasst. Zum ersten Mal vergleichen wir im Rahmen unserer IMAB362 basierten BiMAB Umgebung vier verschiedene anti-CD3-scFvs, die jeweils von dem mAbs TR66, CLB-T3 sowie der humanisierte und der murinen Variante des mABs UCHT1 abgeleitet sind. Zusätzlich untersuchen wir die Auswirkung einer N- gegenüber einer C-terminalen Stellung des vom IMAB362 abgeleiteten scFvs, beziehungsweise des abgeleiteten anti-CD3-scFvs. Somit wurden neun CLDN18.2 spezifischen BiMAB Proteine erzeugt, von denen alle eine bemerkenswert hohe Zytotoxizität gegen CLDN18.2-positive Tumorzellen zeigten. Aufgrund seiner vielversprechenden Wirksamkeit entwickelte sich 1BiMAB zum BiMAB Prototyp. Seine Selektivität mit Bindungsaffinitäten im nM-Bereich für sein TAA und CD3Æ wurde für 1BiMAB durch in-vitro-Tests bestätigt. Die gute beiderseitige Bindefähigkeit im BiMAB Design stammt von einen N-terminal positionierten IMAB362 scFv und den darauffolgenden C-terminal angeordnet TR66 scFv. 1BiMAB bewirkt eine konzentrations- und zielzellen-abhängige T-Zellen-Aktivierung, Proliferation und Hochregulierung von zytolytischen Proteinen wie Granzym B, sowie der daraus resultierenden Eliminierung von Tumor-Zielzellen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass 1BiMAB in der Lage ist, T-Zellen zu aktivieren, unabhängig von Elementen, die normalerweise im TCR-Erkennungsprogramm beteiligt sind, wie zum Beispiel die Antigen-Präsentation, die MHC-Restriktion und die kostimulatorischen Effektormoleküle. In den ersten in vivo-Studien unter Verwendung eines subkutanen xenogenen Tumormausmodells in immuninkompetenten NSG Mäuse konnten wir eine signifikante therapeutische Wirkung durch 1BiMAB mit teilweise oder vollständiger Tumoreliminierung zeigen. Die ersten RIBOMAB in-vitro-Experimente zeigten vergleichbar ermutigende Ergebnisse. Die Elektroporation der 1BiMAB IVT-RNA in die Ziel- oder in die Effektorzellen war realisierbar, während die Funktionalität der translatierten 1BiMAB IVT-RNA durch das Hervorrufen von spezifischen T-Zellaktivierung und Zielzellenlyse bewiesen wurde. Dementsprechend konnten wir zeigen, dass der in vitro RIBOMAB Ansatz für alle neun BiMABs anwendbar war, und damit das RIBOMAB Konzept stützt. Folgernd bietet die CLDN18.2-BiMAB Strategie ein großes Potenzial für die Behandlung von Krebs. In Zukunft könnte das BiMAB Format, entweder verabreicht als Protein oder als IVT-RNA, dazu beitragen, dass Lösungsansätze gefunden werden, um tumorspezifische zelluläre Immun-Antworten hervorzubringen. Dies könnte uns möglicherweise von Nutzen sein Immunevasionsmechanismen von Tumorzellen zu überwinden, und somit aktuelle solide Magenkrebstherapien unterstützen zu können.
DDC-Sachgruppe:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Veröffentlichende Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Organisationseinheit:	FB 10 Biologie
Veröffentlichungsort:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1524
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-39449
Version:	Original work
Publikationstyp:	Dissertation
Nutzungsrechte:	Urheberrechtsschutz
Informationen zu den Nutzungsrechten:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Enthalten in den Sammlungen:	JGU-Publikationen