Authors:	Kleemann, Patrick
Title:	Mass spectrometric identification of Varicella-Zoster Virus (VZV) proteins recognized by human T cells
Online publication date:	9-Feb-2012
Year of first publication:	2012
Language:	english
Abstract:	Primary varicella-zoster virus (VZV) infection during childhood leads to varicella commonly known as chickenpox. After primary infection has occurred VZV establishes latency in the host. During subsequent lifetime the virus can cause reactivated infection clinically known as herpes zoster or shingles. In immunodeficient patients’ dissemination of the virus can lead to life-threatening disease. Withdrawal of acyclovir drug prophylaxis puts allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation (HSCT) patients at increased risk for herpes zoster as long as VZV-specific cellular immunity is impaired. Although an efficient live attenuated VZV vaccine for zoster prophylaxis exists, it is not approved in immunocompromised patients due to safety reasons. Knowledge of immunogenic VZV proteins would allow designing a noninfectious nonhazardous subunit vaccine suitable for patients with immunodeficiencies. The objective of this study was to identify T cell defined virus proteins of a VZV-infected Vero cell extract that we have recently described as a reliable antigen format for interferon-gamma (IFN-γ) enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assays (Distler et al. 2008). We first separated the VZV-infected/-uninfected Vero cell extracts by size filtration and reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The collected fractions were screened for VZV reactivity with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of VZV-seropositive healthy individuals in the sensitive IFN-γ ELISpot assay. Using this strategy, we successfully identified bioactive fractions that contained immunogenic VZV material. VZV immune reactivity was mediated by CD4+ memory T lymphocytes (T cells) of VZV-seropositive healthy individuals as demonstrated in experiments with HLA blockade antibodies and T cell subpopulations already published by Distler et al. We next analyzed the bioactive fractions with electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) techniques and identified the sequences of three VZV-derived proteins: glycoprotein E (gE); glycoprotein B (gB), and immediate early protein 62 (IE62). Complementary DNA of these identified proteins was used to generate in vitro transcribed RNA for effective expression in PBMCs by electroporation. We thereby established a reliable and convenient IFN-γ ELISPOT approach to screen PBMCs of healthy donors and HSCT patients for T cell reactivity to single full-length VZV proteins. Application in 10 VZV seropositive healthy donors demonstrated much stronger recognition of glycoproteins gE and gB compared to IE62. In addition, monitoring experiments with ex vivo PBMCs of 3 allo-HSCT patients detected strongly increased CD4+ T cell responses to gE and gB for several weeks to months after zoster onset, while IE62 reactivity remained moderate. Overall our results show for the first time that VZV glycoproteins gE and gB are major targets of the post-transplant anti-zoster CD4+ T cell response. The screening approach introduced herein may help to select VZV proteins recognized by memory CD4+ T cells for inclusion in a subunit vaccine, which can be safely used for zoster prophylaxis in immunocompromised HSCT patients. Das Varizella-Zoster-Virus (VZV) führt bei der Erstinfektion im Kindesalter zu Windpocken (Varizellen) und bleibt anschließend lebenslang im Körper erhalten. Kommt es im Laufe des Lebens zu einer Abschwächung des Immunsystems, verursacht das Virus durch erneute Infektion (Reaktivierung) die Gürtelrose (Herpes Zoster). Diese Erkrankung tritt bei 20-40% der immungeschwächten Leukämiepatienten nach allogener Blutstammzelltransplantation (HSCT, hematopoietic stem cell transplantation) auf und verursacht u.a. erhebliche Schmerzen. Breitet sich das Virus in Gehirn und Bauchhöhle aus, ist die Erkrankung lebensbedrohlich. Ein für gesunde Personen vorhandener VZV-Lebendimpfstoff zur Vermeidung des Herpes Zoster ist für Transplantationspatienten aufgrund nicht ausschließbarer Nebenwirkungen nicht zugelassen. Auch die vorbeugende Behandlung mit prinzipiell wirksamen Medikamenten bietet keinen absolut sicheren und langfristigen Schutz vor Herpes Zoster. Die Kenntnis von immunogenen VZV Proteinen würde es erlauben, einen für immunkompromittierte Patienten ungefährlichen subunit Impfstoff zu entwickeln. Es war daher das Ziel dieser Dissertation, T-zelldefinierte virale Antigene eines kommerziell erhältlichen VZV-infizierten Vero Zelllysats mit Hilfe des Interferon-γ (IFN-γ) enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) zu identifizieren (Distler et al. 2008). Zunächst trennten wir VZV-infiziertes/-uninfiziertes Zelllysat mittels Größenfiltration und reverse phase HPLC (high perfomane liquid chromatography) auf, und untersuchten die gesammelten Fraktionen mit peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von gesunden VZV-seropositiven Spendern auf IFN-γ ELISpot Reaktivität. Hierbei identifizierten wir bioaktive Fraktionen, die immunogene VZV-Proteine enthielten. Diese stimulierten primär memory CD4+ T-Zellantworten, was durch HLA-Blockade- und T-Zell Subpopulations-experimenten gezeigt werden konnte. Die bioaktiven Fraktionen analysierten wir in der Massenspektrometrie (ESI-MS) und identifizierten dabei die drei VZV Proteine Glykoprotein E, Glykoprotein B und Immediate Early Protein 62 (IE62). Komplementäre DNA dieser Proteine wurde in vitro transkribiert und die resultierende RNA effizient in PBMC elektroporiert. Hierzu etablierten wir den IFN-γ ELISpot als zuverlässiges Testsystem, um die transfizierten PBMC von 10 gesunden Spendern und von 3 Patienten nach HSCT auf T Zell Reaktivität gegen die exprimierten VZV Proteine zu prüfen. Die PBMC der gesunden seropositiven Spender zeigten die größere Reaktivität auf die beiden exprimierten Glykoproteine verglichen mit der schwächeren Reaktivität zum IE62 Protein. Dieses bestätigte sich auch mit PBMC von drei Patienten nach allo-HSCT, welche eine starke CD4+ T-Zellantwort gegen die beiden Glykoproteine und eine moderate T-Tellantwort gegen IE62 zeigten. Zusammenfassend zeigten die erstellten Daten, dass die beiden VZV Glykoproteine gE und gB Zielstrukturen einer CD4+ T Zellantwort gegen Zoster nach HSCT darstellen und somit die Basis für die zukünftige Zusammensetzung eines nicht-infektiösen Impfstoffs bilden können, der für die Wiederherstellung der Immunität gegen VZV in Patienten nach Blutstammzelltransplantation gefahrlos angewendet werden kann.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1297
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-30249
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	98 S.
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