Authors:	Wünsch, Désirée
Title:	Funktionelle Analyse der onkologisch relevanten Protease Threonin-Aspartase 1
Online publication date:	12-Aug-2015
Year of first publication:	2015
Language:	german
Abstract:	Krebs stellt eine der häufigsten Todesursachen in Europa dar. Grundlage für eine langfristige Verbesserung des Behandlungserfolgs ist ein molekulares Verständnis der Mechanismen, welche zur Krankheitsentstehung beitragen. In diesem Zusammenhang spielen Proteasen nicht nur eine wichtige Rolle, sondern stellen auch bei vielerlei Erkrankungen bereits anerkannte Zielstrukturen derzeitiger Behandlungsstrategien dar. Die Protease Threonin Aspartase 1 (Taspase1) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von Mixed Lineage Leukemia (MLL)-Fusionsproteinen und somit bei der Entstehung aggressiver Leukämien. Aktuelle Arbeiten unterstreichen zudem die onkologische Relevanz von Taspase1 auch für solide Tumore. Die Kenntnisse über die molekularen Mechanismen und Signalnetzwerke, welche für die (patho)biologischen Funktionen von Taspase1 verantwortlich sind, stellen sich allerdings noch immer als bruchstückhaft dar. Um diese bestehenden Wissenslücken zu schließen, sollten im Rahmen der Arbeit neue Strategien zur Inhibition von Taspase1 erarbeitet und bewertet werden. Zusätzlich sollten neue Einsichten in evolutionären Funktionsmechanismen sowie eine weitergehende Feinregulation von Taspase1 erlangt werden. Zum einen erlaubte die Etablierung und Anwendung eines zellbasierten Taspase1-Testsystem, chemische Verbindungen auf deren inhibitorische Aktivität zu testen. Überraschenderweise belegten solch zelluläre Analysen in Kombination mit in silico-Modellierungen eindeutig, dass ein in der Literatur postulierter Inhibitor in lebenden Tumorzellen keine spezifische Wirksamkeit gegenüber Taspase1 zeigte. Als mögliche Alternative wurden darüber hinaus Ansätze zur genetischen Inhibition evaluiert. Obwohl publizierte Studien Taspase1 als ααββ-Heterodimer beschreiben, konnte durch Überexpression katalytisch inaktiver Mutanten kein trans-dominant negativer Effekt und damit auch keine Inhibition des wildtypischen Enzyms beobachtet werden. Weiterführende zellbiologische und biochemische Analysen belegten erstmalig, dass Taspase1 in lebenden Zellen in der Tat hauptsächlich als Monomer und nicht als Dimer vorliegt. Die Identifizierung evolutionär konservierter bzw. divergenter Funktionsmechanismen lieferte bereits in der Vergangenheit wichtige Hinweise zur Inhibition verschiedenster krebsrelevanter Proteine. Da in Drosophila melanogaster die Existenz und funktionelle Konservierung eines Taspase1-Homologs postuliert wurde, wurde in einem weiteren Teil der vorliegenden Arbeit die evolutionäre Entwicklung der Drosophila Taspase1 (dTaspase1) untersucht. Obwohl Taspase1 als eine evolutionär stark konservierte Protease gilt, konnten wichtige Unterschiede zwischen beiden Orthologen festgestellt werden. Neben einem konservierten autokatalytischen Aktivierungsmechanismus besitzt dTaspase1 verglichen mit dem humanen Enzym eine flexiblere Substraterkennungs-sequenz, was zu einer Vergrößerung des Drosophila-spezifischen Degradoms führt. Diese Ergebnisse zeigen des Weiteren, dass zur Definition und Vorhersage des Degradoms nicht nur proteomische sondern auch zellbiologische und bioinformatische Untersuchungen geeignet und notwendig sind. Interessanterweise ist die differentielle Regulation der dTaspase1-Aktivität zudem auf eine veränderte intrazelluläre Lokalisation zurückzuführen. Das Fehlen von in Vertebraten hochkonservierten aktiven Kernimport- und nukleolären Lokalisationssignalen erklärt, weshalb dTaspase1 weniger effizient nukleäre Substrate prozessiert. Somit scheint die für die humane Taspase1 beschriebene Regulation von Lokalisation und Aktivität über eine Importin-α/NPM1-Achse erst im Laufe der Entwicklung der Vertebraten entstanden zu sein. Es konnte also ein bislang unbekanntes evolutionäres Prinzip identifiziert werden, über welches eine Protease einen Transport- bzw. Lokalisations-basierten Mechanismus zur Feinregulation ihrer Aktivität „von der Fliege zum Menschen“ nutzt. Eine weitere Möglichkeit zur dynamischen Funktionsmodulation bieten post-translationale Modifikationen (PTMs) der Proteinsequenz, zu welcher Phosphorylierung und Acetylierung zählen. Interessanterweise konnte für die humane Taspase1 über den Einsatz unabhängiger Methoden einschließlich massenspektrometrischer Analysen eine Acetylierung durch verschiedene Histon-Acetyltransferasen (HATs) nachgewiesen werden. Diese Modifikation erfolgt reversibel, wobei vor allem die Histon-Deacetylase HDAC1 durch Interaktion mit Taspase1 die Deacetylierung der Protease katalysiert. Während Taspase1 in ihrer aktiven Konformation acetyliert vorliegt, kommt es nach Deacetylierung zu einer Reduktion ihrer enzymatischen Aktivität. Somit scheint die Modulation der Taspase1-Aktivität nicht allein über intra-proteolytische Autoaktivierung, Transport- und Interaktionsmechanismen, sondern zudem durch post-translationale Modifikationen gesteuert zu werden. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit entscheidende neue Einblicke in die (patho)biologische Funktion und Feinregulation der Taspase1 gewonnen werden. Diese Ergebnisse stellen nicht nur einen wichtigen Schritt in Richtung eines verbesserten Verständnis der „Taspase1-Biologie“, sondern auch zur erfolgreichen Inhibition und Bewertung der krebsrelevanten Funktion dieser Protease dar. Cancer represents the second leading cause of death in Europe. Key for the long-term improvement of clinical success is an understanding of the molecular mechanisms contributing to disease development and progression. In this context, proteases not only play an important role in (patho)biological processes, but are already clinically approved targets of current treatments. The protease threonine aspartase 1 (Taspase1) plays an essential role for the activation of Mixed Lineage Leukemia (MLL) fusionproteins and thus for the development of aggressive leukemias. Also, Taspase1-induced cleavage of the MLL protein plays an important physiological role in developmental and differentiation processes. In addition, recent insights strongly promote the oncological relevance of Taspase1 also for solid tumors. Besides MLL proteins a variety of Taspase1 bona fide target proteins have been identified and are predicted in different species. However, our knowledge about the molecular mechanisms being responsible for the (patho)biological functions of Taspase1, is still incomplete. Also, no effective Taspase1 inhibitor is available to date. In order to fill this existing knowledge gap, new Taspase1 interference strategies were developed and evaluated in the context of this thesis. Additionally, new insights into evolutionary and potential fine-regulation mechanisms of Taspase1 should be gained. The establishment and application of a cell-based Taspase1 assay enabled to test the inhibitory effect of chemical compounds on Taspase1´s activity. Surprisingly, cellular assay results as well as in silico modelling clearly demonstrated that previously postulated Taspase1 inhibitors were inactive in living tumor cells. As an alternative strategy, genetic inhibition of the protease was investigated. Although previous studies proposed that Taspase1 is active as an ααββ-heterodimer, overexpression of catalytic inactive mutants did not result in a trans dominant negative effect and thus, failed to inhibited the wildtype Taspase1 enzyme. Further biological and biochemical analyses proved for the first time that active Taspase1 exists predominantly as a monomer in living cells. Surprisingly, genetically enforced dimerization lead to inhibition of the protease suggesting to exploit the concept of chemical dimerizers as a potential inhibition strategy. In the past, the identification of evolutionary conserved or diverging functional mechanisms already provided important insights leading to the inhibition of different oncological relevant proteins. Since the existence and functional conservation of a Taspase1 homolog was postulated in Drosophila melanogaster, the function and evolutionary development of Drosophila Taspase1 (dTaspase1) was further examined. Although Taspase1 has been characterized as an evolutionary highly conserved protease, important differences could be demonstrated here for both orthologs. Besides a conserved autocatalytic activation mechanism depending on the essential nucleophile threonine195, dTaspase1 exhibits a more flexible substrate recognition sequence compared to human Taspase1 which leads to an enlarged degradome in Drosophila. Furthermore, the results demonstrated that for the definition and prediction of a degradome not only proteomic, but also biological as well as bioinformatic analyses are suitable and also necessary. Interestingly, the species-specific regulation of dTaspase1´s activity could be also attributed to differences in its intracellular localization. The lack of active nuclear and nucleolar targeting signals in dTaspase1, which are highly conserved in vertebrates, provides an explanation for the rather inefficient cleavage of nuclear substrates. Thus, the regulation of localization and activity via the importin-/NPM1-axis described for human Taspase1 has evolved during vertebrate development. Collectively, this thesis describes a hitherto unknown evolutionary principle how a protease exploits a transport-based mechanism to fine-tune its degradome and proteolytic activity “from fly to man”. Besides localization, post-translational modifications (PTMs) represent another mechanism allowing a dynamic regulation of protein functions. Important PTMs include phosphorylation and acetylation, which in contrast to kinases have not yet been identified for proteases. Interestingly, independent methods, including mass spectrometry analyses, demonstrated that Taspase1 is indeed acetylated by different histone acetyl transferases (HATs). This modification of lysine residues occurs reversible and deacetylation of Taspase1 is mediated by the binding of the histone deacetylase HDAC1. Functional analyses further indicate a post-translational fine-regulation of Taspase1’s proteolytic activity which has not been described for a protease so far. Whereas Taspase1 is acetylated in its active conformation, deacetylation results in decreased enzymatic activity. Thus, Taspase1´s activity could not only be regulated by intra-proteolytic self-activation, transport and interaction mechanisms, but also by post-translational modifications. These results enlarge our general understanding of Taspase1´s function, but additionally suggest to further investigate clinically approved HDAC inhibitors to rationally regulate Taspase1´s activity. In summary, essential new insights into the (patho)biological functions and regulation of Taspase1 could be gained during this thesis. These results do not only represent an important step towards an improved understanding of “Taspase1 biology”, but also for an effective inhibition and evaluation of its oncological relevance.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1220
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-41162
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen