Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-980
Authors: Eberle, Karolin Elisabeth
Title: Novel isolates of Cydia pomonella granulovirus (CpGV): deciphering the molecular mechanism for overcoming CpGV resistance in codling moth (Cydia pomonella)
Online publication date: 4-Oct-2010
Language: english
Abstract: During the last twenty years, Cydia pomonolla granulovirus (CpGV, Baculoviridae) has become the most important biological control agent for the codling moth (CM) in organic and integrated apple production. All registered products in Europe are based on the isolate CpGV-M, which was discovered 1964 in Mexico. A serious threat to future application of CpGV is the occurrence of CM field populations resistant to CpGV. Since 2003, populations with up to 10,000-fold reduced susceptibility were reported from orchards in Germany, France, Italy, Switzerland, Austria and the Netherlands. A putative alternative to CpGV-M are novel CpGV isolates which are able to overcome CM resistance. This thesis focuses on the identification and characterisation of resistance overcoming CpGV isolates and the analysis of their molecular difference to CpGV-M.rnSixteen CpGV isolates were tested against CM lab strains in bioassays. Hereby, five isolates were identified which were able to completely overcome resistance. The genomes of these isolates were compared to CpGV-M by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. To identify the molecular factor responsible for improved virulence of some CpGV isolates, major genomic differences were sequenced and analysed. A 0.7 kb insertion was found in CpGV-I01, -I12 and -E2, but not in other resistance overcoming isolates. Analysis of the insertions sequence revealed that it might be due to a transposition event, but not involved in overcoming resistance. rnFor unequivocal identification of CpGV isolates, a new method based on molecular analysis was established. Partial sequencing of the conserved polyhedrin/granulin ( polh/gran), late expression factor-8 (lef-8) and late expression factor-9 (lef-9) genes revealed single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNP analysis correlated with the grouping obtained by RFLP analysis. A phylogenetic classification due to different genome types A-E is proposed. Phylogenetic analysis suggested that CpGV-M was the phylogenetically youngest of the tested CpGV isolates.rnWhole genome sequencing of two resistance overcoming isolates CpGV-I12 (type D genome) and -S (type E genome) and CpGV-M (type A genome) was performed. Comparison of the three genomes revealed a high sequence identity. Several insertions and deletions ranging from 1-700 nucleotides (nt) were found. Comparison on open reading frame (ORF) level revealed that CpGV-I12 and -S shared only one protein alteration when compared to CpGV-M: a stretch of 24 nt present in ORF cp24 was not found in any of the resistance overcoming isolates. Cp24 codes for the early gene pe38. Combined with the results of phylogenetic analysis, it is proposed that these 24 nt are a recent insertion into the CpGV-M genome. The role of pe38 in overcoming resistance was investigated by knocking out pe38 of a CpGV-M based bacmid and swapping of CpGV-I12 pe38 of into the k.o. bacmid. When pe38 of CpGV-I12 was inserted into the k.o. bacmid, the infectivity could not be rescued, suggesting that the genomic portion of pe38 might play a role in its function.rnIt can be concluded that the recently observed CpGV resistance in CM is only related to type A genomes. RFLP and SNP analysis provide tools for identifying and characterising different CpGV isolates reliably, a pre-condition for a future registration of CpGV products based on novel CpGV isolates.rnrnrn
Während der letzten zwanzig Jahre ist das Cydia pomonella Granulovirus (CpGV, Baculoviridae) zum wichtigsten biologischen Pflanzenschutzmittel zur Kontrolle des Apfelwicklers (C. pomonella) im ökologischen und integrierten Apfelanbau geworden. Alle in Europa registrierten Produkte basieren dabei auf dem Isolat CpGV-M, dass 1964 in Mexico isoliert wurde. Ein Problem für die zukünftige Anwendung von CpGV ist das Auftreten CpGV-resistenter Feldpopulationen des Apfelwicklers. Seit 2003 wurden Populationen mit einer bis zu 10,000-fach reduzierten Empfindlichkeit aus Deutschland, Frankreich, Italien, der Schweitz, Österreich und den Niederlanden berichtet. Eine mögliche Alternative zu CpGV-M sind weitere CpGV-Isolate, die in der Lage sind, die CpGV-Resistenz zu brechen. Ziel dieser Arbeit war es, resistenzbrechende Isolate zu identifizieren, zu charakterisieren und ihre molekularen Unterschiede zu CpGV-M zu bestimmen.rnSechzehn CpGV Isolate wurden gegen Laborstämme des Apfelwicklers getestet. Dabei wurden fünf CpGV Isolate identifiziert, die die Resistenz komplett brechen. Mittels Restriktionsanalyse (RFLP) wurden diese Isolate mit CpGV-M verglichen. Um den Faktor für die unterschiedliche Virulenz der CpGV-Isolate zu bestimmen, wurden größere Unterschiede auf Genomebene partiell sequenziert. Eine Insertion von 0,7 kb wurde in den Genomen von CpGV-I01, -I12 und -E2 lokalisiert, aber nicht in weiteren resistenzbrechenden Isolaten. Analyse dieser Sequenz zeigte, dass sie wahrscheinlich auf ein transposables Element zurückzuführen ist.rnUm CpGV-Isolate zuverlässig zu identifizieren, wurde eine Methode auf Basis molekularer Analyse etabliert. Dafür wurden die konservierten Gene polyhedrin/granulin (polh/gran), late expression factor-8 und -9 (lef-8, lef-9) partiell amplifiziert. Mittels Sequenzierung der PCR-Produkte wurden single nucleotide polymorphisms (SNPs) lokalisiert und auf deren Basis ein phylogenetischer Stammbaum erstellt. Darauf basierend wurde eine Einteilung in verschiedene Genomtypen A-E vorgeschlagen. Auf Basis der phylogenetischen Analyse stellt CpGV-M das phylogenetisch jüngste der getesteten Isolate dar.rnZwei resistenzbrechende Isolate (CpGV-I12, Typ D Genom; CpGV-S, Typ E Genom) sowie CpGV-M (Typ A Genom) wurden komplett sequenziert. Der Vergleich der drei Genome zeigte eine hohe Sequenzidentität der Isolate. Verschiedene Insertionen und Deletionen von 1-700 Nukleotiden (nt) wurden gefunden. Vergleich auf open reading frame (ORF) Ebene zeigte, dass CpGV-S und -I12 nur einen einzigen Proteinunterschied zu CpGV-M zeigen: 24 nt im ORF24 waren nur in CpGV-M, nicht aber in den resistenzbrechenden Isolaten vorhanden. ORF24 codiert für das frühe Gen pe38. Kombiniert mit den Ergebnissen der phylogenetischen Isolate ist es wahrscheinlich, dass diese 24 nt eine Insertion in phylogenetisch jüngere Isolate sind. Die Beteiligung von pe38 an der Resistenzbrechung wurde durch knock-out von pe38 aus einem CpGV-M Bacmid und swapping von I12-pe38 in das k.o. Bacmid untersucht. Allerdings konnte durch das rescue die Infektiosität nicht mehr hergestellt werden, was wahrscheinlich daran liegt, dass noch weitere Faktoren die Funktion von pe38 an seiner ursprünglichen Position beeinflussen.rnZusammengefasst bedeutet dies, dass die aufgetretene Resistenz gegen CpGV keine Resistenz im allgemeinen, sondern gegen Typ A Genome ist. Mittels RFLP- und SNP- Analyse können CpGV-Genome zuverlässig identifiziert und charakterisiert werden, eine Grundvoraussetzung für die Zulassung von CpGV-Produkten basierend auf neuen CpGV-Isolaten.rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-980
URN: urn:nbn:de:hebis:77-24208
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 185 S.
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