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Authors: Wein, Georg
Title: Analyse der Mechanismen zur Regulation der Zellzyklus-abhängigen Stabilität der MARCKS-mRNA
Online publication date: 1-Jan-2002
Language: german
Abstract: Die Expression des PKC-Hauptsubstrates MARCKS (myristoylated alanine-rich C kinase substrate) wird in Swiss 3T3-Fibroblasten in Abhängigkeit des Zellzyklus durch Variation der mRNA-Stabilität reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der 3' nichttranslatierten Region (3'UTR) der MARCKS-mRNA an der Stabilitätskontrolle analysiert. Durch Einsatz der RNase/EMSA-Technik konnten zwei cis- Elemente der MARCKS 3'UTR identifiziert und lokalisiert werden, die mit RNA-bindenden Swiss 3T3-Proteinen (trans-Faktoren) interagieren. Diese neu identifizierten cis-Elemente sind AU-reiche Elemente (ARE) der Klasse III, da sie sehr große Sequenzhomologie zu ARE dieser Klasse aufweisen und der MARCKS 3'UTR, wie für ARE typisch, Instabilität vermitteln.Durch UV-crosslinking wurden vier Proteine mit Molekülmassen von 55, 40, 36 und 30 kDa nachgewiesen, die spezifisch an das 52nt lange Haupt-ARE (MARCKS 52nt) mit unterschiedlicher Affinität binden konnten. Mit Hilfe von rekombinant hergestellten ELAV/Hu-Proteinen und einem ELAV/Hu-spezifischen, affinitätsgereinigten Antiserum konnte eines der vier Proteine (p36) als das ELAV/Hu-Protein HuR identifiziert werden. Die Funktion der ELAV/Hu-Proteine für die Stabilitätskontrolle der MARCKS-mRNA ließ sich durch transiente und stabile Transfektion von HuR und neuronenspezifischem HuD mit dem Tetracyclin induzierbaren Expressionssystem (Tetoff) in Swiss 3T3- bzw. MEF/ 3T3-Tetoff-Zellen verdeutlichen: Durch Überexpression von HuR und HuD wurde die wachstumsinduzierte Destabilisierung der MARCKS-mRNA bei Wiedereintritt der Zellen in den Zellzyklus unterbunden.
The cell cycle dependent expression of the major PKC substrate MARCKS (myristoylated alanine-rich C kinase substrate) in Swiss 3T3 fibroblasts is controlled by the stability of its mRNA. In this work the contribution of the 3' untranslated region (3'UTR) of the MARCKS mRNA to the stability control was analysed.By performing RNase/EMSA two cis-elements of the MARCKS 3'UTR could be identified that interact with RNA-binding proteins (trans-acting factors) from Swiss 3T3 cells. Based on its sequence homology and destabilizing function, the newly identified cis-elements were grouped into class III of AU-rich elements (ARE).By performing UV-crosslink assays four trans-acting factors with molecular masses of 55, 40, 36 and 30 kDa could be identified showing high specificity, but different affinity to the major 52nt ARE (MARCKS 52nt). When producing recombinant ELAV/Hu-proteins and affinity-purifying an antiserum against these proteins p36 was identified as the ELAV/Hu-protein HuR. The function of ELAV/Hu-proteins for stability control of the MARCKS mRNA could be clearified by transient and stable transfection of HuR and the neuronal-specific HuD with the tetracycline-dependent expression system (Tetoff) in Swiss 3T3 and MEF/3T3-Tetoff cells: By overexpression of HuR and HuD the growth-induced destabilization of the MARCKS mRNA of cells reentering the cell cycle was strikingly prevented.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3947
URN: urn:nbn:de:hebis:77-3578
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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