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Authors: Wystub, Sylvia
Title: Expressions- und Funktionsanalysen von Neuroglobin und Cytoglobin
Online publication date: 5-Nov-2007
Language: german
Abstract: Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten durchgeführt. Beide Globine wurden erst kürzlich entdeckt, und ihre Funktionen konnten trotz vorliegender Daten zur Struktur und biochemischen Eigenschaften dieser Proteine bisher nicht eindeutig geklärt werden. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre und subzelluläre Lokalisation von Neuroglobin und Cytoglobin in murinen Gewebeschnitten untersucht. Die Expression von Ngb in neuronalen und endokrinen Geweben hängt offensichtlich mit den hohen metabolischen Aktivitäten dieser Organe zusammen. Insbesondere im Gehirn konnten regionale Unterschiede in der Ngb-Expression beobachtet werden. Dabei korrelierte eine besonders starke Neuroglobin-Expression mit Gehirnbereichen, die bekanntermaßen die höchsten Grundaktivitäten aufweisen. In Anbetracht dessen liegt die Funktion des Neuroglobins möglicherweise im basalen O2-Metabolismus dieser Gewebe, wobei Ngb als O2-Lieferant und kurzfristiger O2-Speicher den vergleichsweise hohen Sauerstoffbedarf vor Ort sicherstellen könnte. Weitere Funktionen in der Entgiftung von ROS bzw. RNS oder die kürzlich publizierte mögliche Rolle des Ngb bei der Verhinderung der Mitochondrien-vermittelten Apoptose durch eine Reduktion des freigesetzten Cytochrom c wären darüber hinaus denkbar. Die Cygb-Expression im Gehirn beschränkte sich auf relativ wenige Neurone in verschiedenen Gehirnbereichen und zeigte dort vorwiegend eine Co-Lokalisation mit der neuronalen NO-Synthase. Dieser Befund legt eine Funktion des Cytoglobins im NO-Metabolismus nahe. Quantitative RT-PCR-Experimente zur mRNA-Expression von Ngb und Cygb in alternden Säugern am Bsp. der Hamsterspezies Phodopus sungorus zeigten keine signifikanten Änderungen der mRNA-Mengen beider Globine in alten im Vergleich zu jungen Tieren. Dies widerspricht publizierten Daten, in denen bei der Maus anhand von Western Blot-Analysen eine Abnahme der Neuroglobin-Menge im Alter gezeigt wurde. Möglicherweise handelt es sich hierbei um speziesspezifische Differenzen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte vergleichende Sequenzanalyse der humanen und murinen NGB/Ngb-Genregion liefert zum einen Hinweise auf die mögliche Regulation der Ngb-Expression und zum anderen eine wichtige Grundlage für die funktionellen Analysen dieses Gens. Es konnte ein minimaler Promotorbereich definiert werden, der zusammen mit einigen konservierten regulatorischen Elementen als Basis für experimentelle Untersuchungen der Promotoraktivität in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen dienen wird. Bioinformatische Analysen führten zur Identifizierung des sog. „neuron restrictive silencer element“ (NRSE) im Ngb-Promotor, welches vermutlich für die vorwiegend neuronale Expression des Proteins verantwortlich ist. Die kontrovers diskutierte O2-abhängige Regulation der Ngb-Expression konnte hingegen anhand der durchgeführten komparativen Sequenzanalysen nicht bestätigt werden. Es wurden keine zwischen Mensch und Maus konservierten Bindestellen für den Transkriptionsfaktor HIF-1 identifiziert, der die Expression zahlreicher hypoxieregulierter Gene, z.B. Epo und VEGF, vermittelt. Zusammen mit den in vivo-Daten spricht dies eher gegen eine Regulation der Ngb-Expression bei verminderter Verfügbarkeit von Sauerstoff. Die Komplexität der Funktionen von Ngb und Cygb im O2-Stoffwechsel der Vertebraten macht den Einsatz muriner Modellsysteme unerlässlich, die eine sukzessive Aufklärung der Funktionen beider Proteine erlauben. Die vorliegende Arbeit liefert auch dazu einen wichtigen Beitrag. Die hergestellten „gene-targeting“-Vektorkonstrukte liefern in Verbindung mit den etablierten Nachweisverfahren zur Genotypisierung von embryonalen Stammzellen die Grundlage zur erfolgreichen Generierung von Ngb-knock out sowie Ngb- und Cygb-überexprimierenden transgenen Tieren. Diese werden für die endgültige Entschlüsselung funktionell relevanter Fragestellungen von enormer Bedeutung sein.
In the context of this thesis the expression and function of the respiratory proteins Neuroglobin (Ngb) and Cytoglobin (Cygb) in vertebrates were investigated. Both globins were recently discovered and their functions are, despite available data on the structure and biochemical characteristics of these proteins, not yet clear. In the first part of this work the cellular and subcellular localization of Neuroglobin and Cytoglobin in mouse tissue sections were examined. The expression of Neuroglobin in neuronal and endocrine tissues is obviously connected with the high metabolic activities of these organs. In particular regional differences to the Ngb expression in the brain could be observed. A strong Neuroglobin expression correlated thereby with brain regions with the highest basic metabolic rates. This points to towards a possible role of Neuroglobin close to the basal O2 metabolism of this tissues, whereby Ngb could guarantee the comparatively high oxygen demand as local O2 supplier or short term O2 storage. Further functions in the detoxification of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) or the recently published putative role in the prevention of mitochondria mediated apoptosis by reduction of relased cytochrom c are also conceivable. The Cygb expression in the brain was limited to distinct neurons in different brain areas, where predominantly a colocalization with the neural NO Synthase could be shown. These findings suggest a function of Cytoglobin in the NO metabolism. Quantitative Realtime PCR analyses of Ngb and Cygb expression in senescent mammals at the example of the hamster species Phodopus sungorus did not show significant changes in the mRNA amount of both globins among young and old animals. This is contradictory to published data, where a reduction of the Neuroglobin expression was shown in aged mice. This discrepancies might be due to species specific differences. Furthermore a comparative sequence analysis of the human and mouse NGB/Ngb gene region has been carried out, which is required for the understanding of the regulatory mechanism of the Ngb gene expression and on the other hand an important prerequisite for the functional analysis of this gene. A minimal promotor region could be defined, which will together with other conserved regulatory elements provide the basis for experimental investigations for the promotor activity against external stimuli. Bioinformatical analysis led to the identification of the so called "neuron restrictive silencer element" (NRSE) in the Ngb promotor region, which is probably responsible for the predominant neuronal expression of this protein. Comparative sequence analysis did not confirm the controversially discussed O2 dependent regulation of the Ngb gene expression. Conserved binding sites for the transcription factor HIF-1, which madiate the expression of numerous hypoxia responsible genes, e.g. Epo and VEGF, could not be identified in the mouse and human gene sequences. Together with further in vivo data this speaks against a regulation of the Ngb gene expression in response to decreased availability of oxygen. The complexity of the functions of Ngb and Cygb in the O2 metabolism of the vertebrates makes the application of murine model systems essential, which enable a gradual clearing up of the functions of both proteins. This work supplies an important contribution to this. The designed gene-targeting vector constructs build together with the established procedures for genotyping of embryonic stem cells the basis for a successful generation of Ngb knock out as well as Ngb and Cygb overexpressing transgenic animals.These will be of enormous importance for the final decoding of functional relevant questions.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1672
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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