Analytik von Phytocannabinoiden in cannabisbasierten Medikamenten, Straßencannabis und Blutproben mit Fokus auf potentielle Konsummarker Dissertation zur Erlangung des Grades „Doktor der Naturwissenschaften“ im Promotionsfach Pharmazie am Fachbereich Chemie, Pharmazie, Geographie und Geowissenschaften der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Anne Karla Scheunemann geboren in Frankfurt am Main Mainz, 2021 Dekan: Univ.-Prof. Dr. Tanja Schirmeister 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Irene Krämer 2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. Jörg Röhrich Tag der mündlichen Prüfung: Veröffentlichungen Publikationen Scheunemann A, Potential distinguishing phytocannabinoid markers for seized cannabis and cannabis-based medicines. Toxichem Krimtech. 2021;88:152–5. Scheunemann A, Elsner K, Germerott T, Groppa S, Hess C, Miederer I, Poplawski A, Röhrich J, Identification of potential distinguishing markers for the use of cannabis-based medicines or street cannabis in serum samples. Metabolites. 2021;11:316. doi:10.3390/metabo11050316. Scheunemann A, Elsner K, Germerott T, Hess C, Zörntlein S, Röhrich J. Extensive phytocannabinoid profiles of seized cannabis and cannabis-based medicines - Identification of potential distinguishing markers. Forensic Sci Int. 2021;322:110773. doi:10.1016/j.forsciint.2021.110773. Scheunemann A, Elsner K, Germerott T, Hess C, Röhrich J. Simultaneous quantification of 18 different phytocannabinoids in serum using a highly sensitive liquid chromatography- tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2021;1173:122685. doi:10.1016/j.jchromb.2021.122685. Heß C, Scheunemann A, Thomas B, Kraemer M, Bestimmung verschiedener Begleitcannabinoide in Blutproben von Cannabiskonsumenten. Kann die Einschätzung des zeitlichen Abstandes zwischen Konsum und Blutentnahme verbessert werden? Blutalkohol. 2019;56:351–65. Vorträge Scheunemann A, Elsner K, Germerott T, Hess C, Zörntlein S, Röhrich J Potential distinguishing phytocannabinoid markers for seized cannabis and cannabis-based medicines XXII. Symposium der Gesellschaft für Toxikologie und Forensische Chemie (GTFCh) „Mosbach online“, virtuelle Tagung, 15. – 17 April 2021 Posterpräsentationen Scheunemann A, Germerott T, Uebbing K, Zörntlein S, Röhrich J Cannabinoid patterns in medicinal-grade marihuana and seized cannabis plants XXI. Symposium der Gesellschaft für Toxikologie und Forensische Chemie (GTFCh), Mosbach, 11. – 13. April 2019 Wissenschaftliche Auszeichnung Young Scientist Oral Presentation Award für den Vortrag „Potential distinguishing phytocannabinoid markers for seized cannabis and cannabis-based medicines“ beim XXII. Symposium der Gesellschaft für Toxikologie und Forensische Chemie (GTFCh) „Mosbach online“ vom 15. – 17. April 2021 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................ I Tabellen- und Abbildungsverzeichnis .................................................................................... III 1 Hintergrund und Zielsetzung ........................................................................................... 1 2 Gliederung der Dissertation ............................................................................................ 3 3 Theoretische Einführung ................................................................................................. 4 3.1 Die Cannabis Pflanze ............................................................................................... 4 3.1.1 Morphologie, Verbreitung und Taxonomie ........................................................ 4 3.1.2 Inhaltsstoffe von Cannabis ................................................................................ 5 3.1.3 Biogenese von Phytocannabinoiden ............................................................... 12 3.2 Pharmakokinetik von Cannabinoiden...................................................................... 14 3.2.1 Metabolismus von THC ................................................................................... 14 3.2.2 Metabolismus weiterer Cannabinoide ............................................................. 17 3.3 Pharmakodynamik von Cannabinoiden .................................................................. 17 3.3.1 Das Endocannabinoidsystem .......................................................................... 18 3.3.2 Typische Wirkungen von Cannabis ................................................................. 19 3.3.3 Der Entourage-Effekt ...................................................................................... 19 3.4 Cannabis als Rauschdroge ..................................................................................... 20 3.5 Cannabis als Arzneimittel ....................................................................................... 21 3.5.1 Gesicherte Indikationen und weitere Anwendungsgebiete .............................. 21 3.5.2 Rechtslage ...................................................................................................... 22 3.5.3 Cannabisbasierte Arzneimittel ......................................................................... 23 3.6 Cannabis im Straßenverkehr .................................................................................. 25 3.7 Marker für verschiedene Cannabisprodukte – Aktueller Stand der Literatur ........... 26 3.8 Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) ................... 27 3.9 Extraktion von Cannabinoiden aus Stoff- und Serumproben .................................. 29 3.10 Grundlagen der Hauptkomponentenanalyse .......................................................... 29 4 Ergebnisse .................................................................................................................... 33 4.1 Simultane und hochsensible Analytik von 18 verschiedenen Phytocannabinoiden mittels LC-MS/MS ............................................................................................................. 33 4.1.1 Kurzprofil der Publikation ................................................................................ 33 4.1.2 Abgrenzung des Eigenanteils .......................................................................... 33 4.1.3 Artikel .............................................................................................................. 35 4.2 Phytocannabinoidprofile von beschlagnahmtem Cannabis und cannabisbasierten Arzneimitteln – Identifikation potentieller Unterscheidungsmerkmale ............................... 45 4.2.1 Kurzprofil der Publikation ................................................................................ 45 4.2.2 Abgrenzung des Eigenanteils .......................................................................... 45 4.2.3 Artikel .............................................................................................................. 47 4.3 Identifizierung potentieller Unterscheidungsmarker für Konsum von cannabisbasierten Arzneimitteln oder Straßencannabis in Serumproben ......................... 61 4.3.1 Kurzprofil der Publikation ................................................................................ 61 4.3.2 Abgrenzung des Eigenanteils .......................................................................... 61 4.3.3 Artikel .............................................................................................................. 63 5 Gesamtdiskussion und Ausblick ................................................................................. 100 5.1 Grundlagen und Analytik von Phytocannabinoiden ............................................... 100 5.2 Phytocannabinoidprofile und Unterscheidungsmarker in cannabisbasierten Arzneimitteln und Straßencannabis ................................................................................ 101 5.3 Phytocannabinoidprofile und Konsummarker verschiedener Cannabisprodukte in Serum ............................................................................................................................. 106 5.4 Ausblick ................................................................................................................ 110 6 Zusammenfassung ..................................................................................................... 112 7 Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 115 8 Danksagung ............................................................................................................... 127 9 Wissenschaftlicher Werdegang .................................................................................. 129 10 Versicherung an Eides statt ........................................................................................ 130 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung BfArM Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte bzw. beziehungsweise C Celsius ca. circa CBC Cannabichromen CBCA Cannabichromensäure CBCVA Cannabichromevarinsäure CBD Cannabidiol CBDA Cannabidiolsäure CBDV Cannabidivarin CBDVA Cannabidivarinsäure CBE Cannabielsoin CBG Cannabigerol CBGA Cannabigerolsäure CBGVA Cannabigerovarinsäure CBL Cannabicyclol CBLA Cannabicyclolsäure CBN Cannabinol CBNA Cannabinolsäure CBND Cannabinodiol CBR Cannabinoidrezeptor CBT Cannabitriol Delta-8-THC/ Delta-8-Tetrahydrocannabinol Δ8-THC ESI Elektrosprayionisation I Abkürzungsverzeichnis et al. et aliis (und andere) ggf. gegebenenfalls GTFCh Gesellschaft für Toxikologie und Forensische Chemie h Stunde IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry L. nach Carl von Linné lat. Latein LC-MS/MS Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (Liquid chromatography-tandem mass spectrometry) m Meter mg Milligramm min Minute mL Milliliter ng Nanogramm NRF Neues Rezeptur-Formularium PC Hauptkomponente (Principal component) PCA Hauptkomponentenanalyse (Principal component analysis) SPE Festphasenextraktion (Solid-phase extraction) THC/Delta-9-THC/ Delta-9-Tetrahydocannabinol Δ9-THC THCAA Tetrahydrocannabinolsäure A THC-COOH 11-Nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol THC-OH/ 11-Hydroxy-tetrahydrocannabinol 11-OH-THC THCV Tetrahydrocannabivarin THCVA Tetrahydrocannabivarinsäure v. Chr. vor Christus z.B. zum Beispiel II Tabellen- und Abbildungsverzeichnis Tabellen- und Abbildungsverzeichnis Tabellen: Tabelle 1: Beispieldatensatz mit mehreren Variablen zur Illustration der Hauptkomponentenanalyse (PCA) ........................................................................................ 30 Abbildungen: Abbildung 1: Chemische Strukturen von THC und THCAA. .................................................... 6 Abbildung 2: Chemische Strukturen von THCV und THCVA. .................................................. 6 Abbildung 3: Chemische Struktur von Δ8-THC. ...................................................................... 7 Abbildung 4: Chemische Strukturen von CBD und CBDA. ...................................................... 7 Abbildung 5: Chemische Strukturen von CBDV und CBDVA. ................................................. 7 Abbildung 6: Chemische Strukturen von CBN und CBNA. ...................................................... 8 Abbildung 7: Chemische Strukturen von CBG und CBGA....................................................... 8 Abbildung 8: Chemische Strukturen von CBC und CBCA. ...................................................... 9 Abbildung 9: Chemische Strukturen von CBL und CBLA. ....................................................... 9 Abbildung 10: Chemische Struktur von Cannabinodiol (CBND). ........................................... 10 Abbildung 11: Chemische Struktur von Cannabielsoin (CBE). .............................................. 10 Abbildung 12: Chemische Struktur von Cannabitriol-C5 (CBT-C5). ........................................ 10 Abbildung 13: Biogenese verschiedener saurer Cannabinoide mit Pentyl- oder Propyl- Seitenkette aus Geranylpyrophosphat und Olivetoläure bzw. Divarinsäure. ......................... 13 Abbildung 14: Chemische Strukturen von THC-OH und THC-COOH. .................................. 16 Abbildung 15: Mittlere Plasmaspiegel bei Konsum eines Joints mit 33,8 mg THC (Daten nach einer Studie von Huestis et al. [47]). ..................................................................................... 16 Abbildung 16: Chemische Strukturen der endogenen Cannabinoide Anandamid und 2- Arachidonylglycerol. .............................................................................................................. 18 III Tabellen- und Abbildungsverzeichnis Abbildung 17: Schema eines Triple-Quadrupol-Massenspektrometers mit Ionenquelle, Analysator und Detektor. ....................................................................................................... 28 Abbildung 18: Biplot von Hauptkomponente (PC) 1 und PC 2 für die PCA des Beispieldatensatzes aus Tabelle 1. ....................................................................................... 31 Abbildung 19: Loading Plots von PC 1 und PC 2. ................................................................. 32 IV Hintergrund und Zielsetzung 1 Hintergrund und Zielsetzung Cannabis sativa L. ist seit Jahrzehnten die am häufigsten konsumierte illegale Rauschdroge weltweit. Für 2018 wurde die globale Konsumprävalenz auf 192 Million geschätzt, und steigende Konsumentenzahlen werden verzeichnet [1, 2]. Hauptwirkstoffe der monospezifischen Pflanze sind das psychoaktive Delta-9-Tetrahydrocannabinol (THC) und Cannabidiol (CBD), welche in der Pflanze in Form ihrer sauren Vorstufen, der Tetrahydrocannabinolsäure (THCAA) bzw. Cannabidiolsäure (CBDA), vorliegen und unter Einwirkung von Luft, Licht oder Wärme aus diesen gebildet werden. Darüber hinaus enthält Cannabis, meist in geringeren Konzentrationen, eine Vielzahl weiterer (seltener) Cannabinoide wie Tetrahydrocannabivarin (THCV), Cannabinol (CBN) oder Cannabigerol (CBG), wobei das Gesamtcannabinoidprofil von Pflanze zu Pflanze je nach Genetik und Anbaubedingungen stark variiert [3]. Insbesondere die Teilnahme am Straßenverkehr unter Einfluss von Cannabis ist problematisch. Eine Beeinträchtigung von Aufmerksamkeit, Wahrnehmung, Impulskontrolle und psychomotorischen Funktionen führt zu einer verminderten Fahrfähigkeit, und das Unfallrisiko ist deutlich erhöht [4–7]. In Deutschland ist nach § 24a StVG Abs. 2 das Führen eines Kraftfahrzeugs unter Cannabiseinfluss mit THC Serumspiegeln ab 1 ng/mL ordnungswidrig und hat eine Geldbuße, Fahrverbot, Eintragung ins Verkehrsregister sowie Einschaltung der Führerscheinbehörde zur Folge [8]. Das therapeutische Potenzial von Cannabis ist in den vergangenen Jahrzehnten ebenfalls in den Interessenfokus der Wissenschaft gerückt und wurde bereits in einer Reihe von Studien erforscht. Als am besten untersucht gelten die Wirkstoffe THC und CBD, welche unter anderem zur Behandlung von schwerer Spastik bei Multipler Sklerose, Übelkeit und Erbrechen bei Chemotherapie, Epilepsie oder zur Schmerzbehandlung eingesetzt werden. Therapeutische Effekte und Wirkstoffspiegel anderer, häufig nur in geringen Konzentrationen in der Pflanze anwesender Cannabinoide sind dagegen bislang kaum erforscht [9, 10]. In Deutschland werden in den letzten Jahren zunehmende Verschreibungszahlen cannabisbasierter Medikamente verzeichnet [11–13]. Neben Rezeptur- und Fertigarzneimitteln wie Dronabinol, also reinem THC, und Sativex®, einer Mischung zweier auf THC bzw. CBD standardisierter Pflanzenextrakte, steht unter anderem auch Medizinalcannabis selbst als Therapieoption zur Verfügung. Letzteres ist in vielen THC- oder CBD-dominanten sowie Mischformen erhältlich [14]. Das Führen von Kraftfahrzeugen unter Medikation mit Cannabis oder cannabisbasierten Arzneimitteln ist von der oben beschriebenen gesetzlichen Regelung ausgenommen. Dennoch wird in einigen Fällen im Nachgang einer Verkehrskontrolle von den 1 Hintergrund und Zielsetzung Führerscheinbehörden eine Medizinisch-Psychologische Untersuchung angeordnet, um die generelle Fahreignung von Cannabispatienten zu begutachten. Hier ist unter anderem zu prüfen, ob neben der Cannabistherapie ein Freizeitkonsum von (Straßen-) Cannabis erfolgt [15]. In der Vergangenheit wurden als Marker für einen solchen Freizeitkonsum bestimmte seltene Cannabinoide vorgeschlagen, wenn das abzugrenzende Cannabismedikament nur THC enthält [16–18]. Die Zuverlässigkeit dieser Marker steht jedoch in Frage, wenn die applizierten Cannabismedikamente auf Pflanzenextrakten basieren und, durch den Herstellungsprozess bedingt, ebenfalls seltene Cannabinoide enthalten können. Dies ist der Fall für die beiden am häufigsten verordneten cannabisbasierten Wirkstoffe Sativex® und Dronabinol [13]. Sativex® enthält laut Literatur einen geringen Anteil seltener Cannabinoide [19]. Das genaue Cannabinoidprofil ist allerdings nicht bekannt. Dronabinol des Herstellers Bionorica ethics wird direkt aus Medizinalhanf gewonnen und kann möglicherweise ebenfalls seltene Cannabinoide enthalten [20, 21]. Auch hier wurde das genaue Cannabinoidspektrum bislang nicht untersucht. Zwischen Phytocannabinoidprofilen von Medizinalcannabis und Straßencannabis zu differenzieren, erscheint zunächst als ein komplexes Unterfangen, da beide als Naturprodukt eine Vielzahl verschiedener (seltener) Cannabinoide enthalten. In einer Studie von Hazekamp und Fischedick wurden bereits einige signifikante Unterschiede beobachtet [22]. Jedoch wurden in der Arbeit nur zwei verschiedene Straßencannabis- und drei verschiedene Medizinalhanfsorten untersucht. Bei Sicherstellungen von Straßencannabis ist die Sorte meist nicht bekannt. Ebenso kann keine vollständige Aussage über Phytocannabinoidprofile der beschlagnahmten Proben getroffen werden, da bei Routineuntersuchungen typischerweise nur THC und CBD quantifiziert werden, und weitere Cannabinoide unerfasst bleiben. Auch bei Medizinalhanfsorten ist das Phytocannabinoidprofil oft nur in Teilen untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, Konzentrationen verschiedener (seltener) Cannabinoide sowohl in diversen Cannabissorten und cannabisbasierten Medikamenten als auch in Serumproben nach Konsum verschiedener Cannabisprodukte zu untersuchen. Der spezielle Fokus liegt hierbei auf der Identifizierung potentieller Marker zur Differenzierung von Cannabismedikamenten und Straßencannabis sowie der Prüfung der Eignung und Anwendbarkeit in der Literatur beschriebener Marker für häufig verordnete Cannabismedikamente. Weiterhin beschreibt die Arbeit zwei hochsensitive Analysemethoden zur simultanen Quantifizierung verschiedener Cannabinoide in Pflanzenextrakten bzw. Serum mittels Flüssigchromatographie-Tandem- Massenspektrometrie (LC-MS/MS). 2 Gliederung der Dissertation 2 Gliederung der Dissertation Eine theoretische Einführung in verschiedene Aspekte zu Cannabis sowie analytische und statistische Methoden wird im nachfolgenden Kapitel 3 gegeben. Hier werden Grundlagen zu Inhaltsstoffen von Cannabis, pharmakokinetische und pharmadynamische Eigenschaften, die Anwendung von Cannabis als Rausch- und Arzneimittel und seine Rolle im Straßenverkehr erläutert. Weiterhin wird ein Überblick über in der Literatur diskutierte Konsummarker zur Unterscheidung von Cannabismedikamenten und Straßencannabis gegeben. Grundlagen zu Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie, Extraktionsverfahren und Datenauswertung via Hauptkomponentenanalyse sind dort ebenfalls beschrieben. In Kapitel 4 ist der kumulative Teil der Arbeit aufgeführt. Jedem Unterkapitel sind ein Kurzprofil der jeweiligen Teilarbeit und eine Abgrenzung des Eigenanteils an der Veröffentlichung vorangestellt: Kapitel 4.1 beschreibt zunächst die Entwicklung und Validierung einer hochsensitiven LC-MS/MS Methode zur simultanen Quantifizierung 16 verschiedener Phytocannabinoide und zweier Cannabinoidmetaboliten in Serum sowie die Analyse von Serumproben von Straßencannabiskonsumenten hinsichtlich ihrer Cannabinoidgehalte. Eine LC-MS/MS Analysemethode zur Quantifizierung derselben 16 Phytocannabinoide in Pflanzenextrakten beschreibt Kapitel 4.2. Hier werden Cannabinoidprofile in Proben verschiedener Straßencannabis- und Medizinalhanfsorten, Sativex® und Dronabinol erhoben und potentielle Marker zur Differenzierung der Stoffproben identifiziert. In Kapitel 4.3 sind schließlich Ergebnisse einer klinischen Forschungsstudie dargestellt, in welcher Blutproben von Patienten unter Therapie mit Medizinalhanf oder cannabisbasierten Medikamenten hinsichtlich ihrer Phytocannabinoidprofile untersucht wurden. Mittels statistischer Verfahren werden diese Profile mit denen der Straßencannabiskonsumenten aus Kapitel 4.1 verglichen. Unterscheidungsmerkmale zwischen den Gruppen werden identifiziert und den in Kapitel 4.2 herausgearbeiteten Markern für Stoffproben sowie den in der Literatur diskutierten Konsummarkern gegenübergestellt. Schließlich werden die Marker auf Fälle aus der forensischen Routineanalytik angewendet, um Aussagen zur Einnahme von Cannabismedikamenten zu beurteilen. Kapitel 5 umfasst eine Gesamtdiskussion der Studienergebnisse in Hinblick auf die Ausgangsfragestellungen sowie einen Ausblick. Eine Zusammenfassung in Deutsch und Englisch findet sich in Kapitel 6. 3 Theoretische Einführung 3 Theoretische Einführung 3.1 Die Cannabis Pflanze 3.1.1 Morphologie, Verbreitung und Taxonomie Cannabis sativa L. ist eine einjährige, krautige Pflanze der Gattung Hanf (Cannabis), welche, genau wie die Gattung Hopfen (Humulus), der Familie der Hanfgewächse (Cannabaceae) zugeordnet wird [23]. Cannabis Pflanzen können bis zu 5 m Höhe erreichen und bilden handförmige, gefingerte Blätter mit gesägtem Blattrand aus. Die Anzahl der Teilblätter kann dabei variieren. Die Pflanze hat immer nur einen Haupttrieb und ist zweihäusig (diözisch), d.h. weibliche und männliche Blüten wachsen in der Regel auf verschiedenen Pflanzen. Männliche Blüten sind dabei eher in Rispen, weibliche Blüten eher traubenartig angeordnet. Die für die Pflanze charakteristischen Cannabinoide sind von harziger Beschaffenheit und werden in Drüsenzellen (Trichomen) gebildet und gespeichert [9, 24]. Der Pflanze dienen sie als Schutz vor Fraßfeinden und UV-Licht [25]. Besonders harzreich sind weibliche Blüten und blütenstandsnahe Blätter. Männliche Blüten, Stängel, Blätter, Wurzeln und Samen von Cannabis weisen dagegen geringere Mengen bzw. kaum Cannabinoide auf. Cannabis besitzt eine Hauptwurzel mit mehreren waagerecht abzweigenden Seitenwurzeln. Sie wurzelt bis zu 2 m tief und bevorzugt lockere, stickstoffreiche Böden mit guter Wasser- und Nährstoffversorgung. Die Blüte erfolgt bei abnehmender Tageslänge. Nach Windbestäubung bilden die weiblichen Blüten Achänen, einsamige Schließfrüchte mit harter Hülle, aus. Nach der Samenreife stirbt die Pflanze ab. Durch vegetative Vermehrung in Form von Stecklingen lässt sie sich jedoch über viele Jahre erhalten [9, 24]. Als eine der ältesten Kulturpflanzen der Menschheit wird Cannabis vermutlich bereits seit der Neusteinzeit verwendet [26]. Neben dem Einsatz zu medizinischen und Rauschzwecken werden die Pflanzenstängel zur Gewinnung von Fasern genutzt [24]. Cannabissamen dienen außerdem als Tierfutter, Nahrungsmittel oder zur Ölgewinnung. Es wird vermutet, dass die ursprüngliche Herkunft der Pflanze in Indien oder Sibirien liegt [27], von wo aus sie sich über Asien und Afrika nach Europa und schließlich global ausgebreitet hat [28]. Heute wird Cannabis in fast allen Ländern der Erde kultiviert. Schwerpunkte liegen z.B. in Marokko, Afghanistan, Indien, Albanien oder Mexiko [1]. Die Bezeichnung „Cannabis sativa“ (lat., angebauter Hanf) taucht bereits in Aufzeichnungen aus dem 16. Jahrhundert auf, beispielsweise in dem Werk „De Historia Stirpium comentarii insignes“ des Botanikers Leonhart Fuchs [29], und wurde 1753 auch von Carl von Linné beschrieben. Aufgrund des sehr unterschiedlichen Erscheinungsbildes und verschiedener Inhaltsstoffmuster in der Pflanze herrscht unter Taxonomen Uneinigkeit darüber, ob 4 Theoretische Einführung Cannabis als monospezifisch anzusehen ist oder nicht. 1783 wurde beispielsweise von Lamarck die Art Cannabis indica mit indischer Herkunft in morphologischer Abgrenzung zu C. sativa beschrieben, und Janischevsky schlug 1924 C. ruderalis als eine weitere, aus Sibirien stammende Wild-Art vor [30, 31]. Small und Cronquist kamen 1976 zu dem Schluss, dass es sich dabei um verschiedene Subspezies handelt [32]. Hillig und Mahlberg wiederum postulierten 2004 aufgrund von morphologischen und genetischen Untersuchungen die Existenz zweier grundverschiedener Genpools C. sativa und C. indica [33]. Andere Autoren haben Cannabis aufgrund von Gehalten an Delta-9-Tetrahydrocannabinol (THC) und Cannabidiol (CBD) in „Drogenhanf“ (Typ I), einen intermediären Typ (Typ II) und „Faserhanf“ (Typ III) gegliedert [34, 35]: Typ I enthält demnach > 0,3 % THC und < 0,5 % CBD mit einem THC/CBD Verhältnis > 1. Typ II enthält ähnliche Konzentrationen von THC und CBD mit > 0,3 % THC und > 0,5 % CBD. In Typ III dominiert CBD mit Konzentrationen > 0,5 %, während THC in Konzentrationen von < 0,3 % vertreten ist. In der nicht-taxonomischen Literatur wird Cannabis heutzutage als monospezifisch angesehen. Der Agrarwissenschaftler De Meijer argumentiert hierzu, dass sich Kriterien wie Cannabinoid-Verhältnisse, Herkunft der Pflanze oder Ausprägung verschiedener Allele im Gengut zur taxonomischen Unterscheidung nicht eigneten, da sie aufgrund jahrhundertelanger Kultivierung der Selektion durch den Menschen unterworfen seien. Sogar morphologisch sehr ähnliche oder genetisch verwandte Pflanzen könnten unterschiedliche Chemotypen aufweisen. Außerdem seien alle Pflanzen aus der Gattung Cannabis miteinander kreuzbar. In Bezug auf die Differenzierung von Drogen- und Faserhanf müsse man zudem beachten, dass die Einteilung auf Willkür basiere, da der Gehalt an Cannabinoiden nicht zwangsläufig mit den Fasereigenschaften der Pflanze korreliert sei. [3] 3.1.2 Inhaltsstoffe von Cannabis Das Inhaltsstoffspektrum von Cannabis ist sehr heterogen und kann je nach Genetik und Anbaubedingungen in den einzelnen Pflanzen stark variieren. Bislang wurden 554 verschiedene Komponenten in Cannabis identifiziert, von denen 113 der prominentesten Inhaltsstoffklasse, den Phytocannabinoiden, zugerechnet werden. [36, 37] Phytocannabinoide Phytocannabinoide sind terpenphenolische Verbindungen, sowie deren Derivate, die an Cannabinoid-Rezeptoren binden [38]. Sie sind, mit wenigen Ausnahmen, einzigartig für die Gattung Cannabis. In der Pflanze liegen Phytocannabinoide ursprünglich in ihrer sauren Form vor und werden erst unter Einfluss von Hitze, UV Licht oder Sauerstoff, insbesondere nach der Ernte, zur neutralen Form decarboxyliert. Durch Oxidation entstehen weitere 5 Theoretische Einführung Abbauprodukte wie beispielsweise Cannabinol (CBN) aus Tetrahydrocannabinol (THC) oder Cannabicyclol (CBL) aus Cannabichromen (CBC) [3]. In der Literatur werden 11 verschiedene chemische Typen von Phytocannabinoiden unterschieden [36]: • (-)-Delta-9-Tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) Typ: Der bekannteste Vertreter ist das psychoaktive (-)-Delta-9-trans-Tetrahydrocannabinol (THC, Abb. 1), welches 1964 erstmals von Gaoni und Mechoulam isoliert wurde [39]. Es existieren mehrere Nummerierungssysteme für Phytocannabinoide. In dieser Arbeit wird das auf der Dibenzopyran-Struktur basierende System verwendet (siehe Abb. 1), welches auch von der International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) anerkannt ist. Cannabinoide dieses Typs weisen zwei Chiralitätszentren auf (Position 6a und 10a). In der Natur kommen laut Literatur für gewöhnlich nur die (-)-trans-Isomere vor [40]. Gegenüber (+)-Delta-9-trans-Tetrahydrocannabinol ist (-)-Delta-9-trans- Tetrahydrocannabinol 10 – 100-mal stärker wirksam [41]. Weitere Vertreter des Δ9-THC- Typs sind die saure Vorstufe von THC, die Delta-9-Tetrahydrocannabinolsäure A (THCAA, Abb. 1), sowie die Propyl-Seitenketten-Analoga Delta-9-Tetrahydrocannabivarin (THCV, Abb. 2) und Tetrahydrocannabivarinsäure (THCVA, Abb. 2). Abbildung 1: Chemische Strukturen von THC und THCAA. Abbildung 2: Chemische Strukturen von THCV und THCVA. 6 Theoretische Einführung • (-)-Delta-8-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC) Typ: Cannabinoide dieses Typs weisen eine Doppelbindung an Position C8 statt an Position C9 auf. Ein Beispiel ist (-)-Delta-8-trans-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC, Abb. 3). Abbildung 3: Chemische Struktur von Δ8-THC. • Cannabidiol (CBD) Typ: Bei Cannabinoiden dieses Typs ist die Pyran-Ringstruktur im Vergleich zu Tetrahydrocannabinolen geöffnet. Bekannte Vertreter sind Cannabidiol (CBD, Abb. 4) und Cannabidiolsäure (CBDA, Abb. 4) sowie deren Propyl-Analoga Cannabidivarin (CBDV, Abb. 5) und Cannabidivarinsäure (CBDVA, Abb. 5). Abbildung 4: Chemische Strukturen von CBD und CBDA. Abbildung 5: Chemische Strukturen von CBDV und CBDVA. 7 Theoretische Einführung • Cannabinol (CBN) Typ: Cannabinoide dieses Typs entstehen durch Oxidation von Tetrahydrocannabinolen. Bekannte Vertreter sind Cannabinol (CBN, Abb. 6) und dessen saure Vorstufe Cannabinolsäure (CBNA, Abb. 6). Abbildung 6: Chemische Strukturen von CBN und CBNA. • Cannabigerol (CBG) Typ: Cannabinoide dieses Typs weisen nur eine Ringstruktur auf. Beispiele sind Cannabigerol (CBG, Abb. 7) und Cannabigerolsäure (CBGA, Abb. 7). Abbildung 7: Chemische Strukturen von CBG und CBGA. 8 Theoretische Einführung • Cannabichromen (CBC) Typ: Cannabinoide dieses Typs weisen eine Chromenol- Struktur auf. Bekannte Vertreter sind Cannabichromen (CBC, Abb. 8) und Cannabichromensäure (CBCA, Abb. 8). Abbildung 8: Chemische Strukturen von CBC und CBCA. • Cannabicyclol (CBL) Typ: Cannabinoide vom Cannabicyclol Typ entstehen unter Cyclisierung der Cannabichromen-Struktur [42]. Beispiele für diesen Typ sind Cannabicyclol (CBL, Abb. 9) und Cannabicyclolsäure (CBLA, Abb. 9). Abbildung 9: Chemische Strukturen von CBL und CBLA. 9 Theoretische Einführung • Weitere Cannabinoid-Typen: Cannabinodiol (CBND) Typ (Abb. 10): Bei diesem Typ handelt es sich um Derivate von Cannabidiol- oder Cannabidivarin-Strukturen mit aromatisiertem Ring. Abbildung 10: Chemische Struktur von Cannabinodiol (CBND). Cannabielsoin (CBE) Typ (Abb. 11): Cannabinoide dieses Typs entstehen durch Photooxidation aus Cannabidiol- oder Cannabidiolsäure-Strukturen unter Ausbildung eines Furanringes mit der Hydroxygruppe an C1 [43]. Abbildung 11: Chemische Struktur von Cannabielsoin (CBE). Cannabitriol (CBT) Typ (Abb. 12): Cannabinoide dieses Typs weisen eine oder zwei zusätzliche Hydroxy-Gruppen an Position C8 oder C10 auf. Abbildung 12: Chemische Struktur von Cannabitriol-C5 (CBT-C5). Misch-Typ mit diversen Strukturen 10 Theoretische Einführung Terpene: Terpene sind eine weitere wichtige Inhaltsstoffklasse von Cannabis und bestimmen dessen Aroma. In der Literatur wurden bislang über 200 unterschiedliche Terpenverbindungen beschrieben. Häufig vorkommende Verbindungen sind Monoterpene wie Myrcen, α-Pinen, Limonen und Linalool oder das Sesquiterpen ß-Caryophyllen. Es wird vermutet, dass Terpene nicht nur eine eigene pharmakologische Wirkung besitzen, sondern auch die Wirkung der Phytocannabinoide beeinflussen. So soll α-Pinen beispielsweise als Acetylcholinesterase-Hemmer dem Kurzzeitgedächtnis-Defizit durch THC Intoxikation entgegenwirken. [10] Weitere Inhaltsstoffe: Weitere nicht-cannabinoide Inhaltsstoffklassen von Cannabis sind [36, 42]:  Flavonoide  Steroide  Phenanthrene  Fettsäuren  Spiroindane  Stickstoffverbindungen  Xanthone  Biphenyle  Aminosäuren  Glykoproteine, Proteine und Enzyme  Zucker  Kohlenwasserstoffe  Alkohole, Ketone, Aldehyde und Säuren  Ester und Laktone  Non-cannabinoid Phenole  Pigmente, Vitamine und Spurenelemente 11 Theoretische Einführung 3.1.3 Biogenese von Phytocannabinoiden Die Biogenese von Cannabinoiden mit C5-Seitenketten erfolgt aus Cannabigerolsäure (CBGA). Diese wird unter Einwirkung der Cannabigerolsäure-Synthase aus Geranylpyrophosphat und Olivetolsäure gebildet (Abb. 13). Aus CBGA wiederum bilden sich unter Einfluss der Tetrahydrocannabinolsäure-Synthase (THCA-Synthase), Cannabidiolsäure-Synthase (CBDA-Synthase) oder Cannabichromensäure-Synthase (CBCA-Synthase) Tetrahydrocannabinolsäure (THCA), Cannabidiolsäure (CBDA) oder Cannabichromensäure (CBCA) [44]. THCA- und CBDA-Synthase sind dabei stereoselektiv und bilden ausschließlich (-)-THCA bzw (-)-CBDA. Die CBCA-Synthase hingegen bildet ein Gemisch aus (+)- und (-)-Enantiomeren im Verhältnis 5:1, wobei nicht bekannt ist, welches der beiden Enantiomere dominiert [45]. Unter nicht-enzymatischer Decarboxylierung, Isomerisierung oder weiteren Prozessen entstehen aus den sauren Vorstufen weitere Cannabinoide. Durch direkte Decarboxylierung von CBGA entsteht Cannabigerol (CBG) [44]. Die Vorläufersubstanz für Cannabinoide mit einer Propyl- statt Pentylseitenkette ist Cannabigerovarinsäure (CBGVA). Diese wird aus Divarinsäure und Geranylpyrophosphat gebildet. Analog zu CBGA wird aus CBGVA durch die oben beschriebenen Synthasen Tetrahydrocannabivarinsäure (THCVA), Cannabidivarinsäure (CBDVA) oder Cannabichromevarinsäure (CBCVA) gebildet. [44] Je nach Chemotyp können in der Pflanze beispielsweise THCA oder CBDA dominieren, während andere Cannabinoide wie THCVA nur in geringen Konzentrationen vorkommen. Auch cannabinoidfreie Chemotypen können durch entsprechende Züchtung generiert werden. [3] 12 Theoretische Einführung Abbildung 13: Biogenese verschiedener saurer Cannabinoide mit Pentyl- oder Propyl- Seitenkette aus Geranylpyrophosphat und Olivetolsäure bzw. Divarinsäure. 13 Theoretische Einführung 3.2 Pharmakokinetik von Cannabinoiden 3.2.1 Metabolismus von THC Absorption: Die häufigste Konsumart von Cannabis zu Rauschzwecken ist die inhalative Applikation, zum Beispiel in Form eines Joints. Sie ist gekennzeichnet von schneller Resorption des psychoaktiven Hauptwirkstoffs Δ9-THC ins Blut, raschem Anfluten im Gehirn und, im Vergleich zu oralem Konsum, guter Titrierbarkeit der Dosis [46]. In Studien war Δ9-THC bereits nach dem ersten Inhalationszug im Blut nachweisbar [47] und erreichte nach 3 – 10 Minuten maximale Plasmakonzentrationen, die nur geringfügig kleiner waren als nach intravenöser Applikation [47, 48]. Die Bioverfügbarkeit nach Rauchen wird auf 2 – 56 % im Vergleich zu intravenöser Applikation geschätzt [46]. Diese vergleichsweise große Spanne ergibt sich aus intra- und interindividuellen Unterschieden in Rauchdynamik und Dosisfreisetzung [49–51]: So hängt die aufgenommene Menge von THC stark von Dauer, Anzahl und Tiefe der Inhalationszüge, Verweildauer des Rauchs in der Lunge und Inhalationsvolumen ab [52–54] und variiert selbst bei automatisierter Freisetzung des Wirkstoffs [47]. Auch Erfahrung der konsumierenden Person und Erwartungshaltung bei Konsum scheinen die Bioverfügbarkeit zu beeinflussen [48, 55–57]. Pyrolyse, Verlust über den Seitenstromrauch und Verbleib von Wirkstoff im ungerauchten Ende des Joints mindern die tatsächlich applizierte Dosis von Δ9-THC [40]. Unter oraler Applikation erfolgen Resorption und Anflutung von THC, verglichen mit inhalativer Applikation, langsamer und ungleichmäßiger. THC-Höchstkonzentrationen sind geringer und werden frühestens nach ca. 1 – 2 h erreicht [40]. Auch der Eintritt pharmakodynamischer Effekte ist verzögert [58, 59]. Die orale Bioverfügbarkeit im Vergleich zu intravenöser Gabe wird auf 4 – 20 % geschätzt und unterliegt großen intra- und interindividuellen Schwankungen. Eine niedrige orale Verfügbarkeit im Vergleich zu inhalativer Applikation ist bedingt durch ggf. unvollständige Resorption und einen ausgeprägten First-Pass-Effekt, bei dem THC nach Resorption im Magen-Darm-Trakt zunächst über die Pfortader in die Leber gelangt und dort metabolisiert wird [46]. Weiterhin kann THC rektal, oromukosal, sublingual, transdermal oder intravenös verabreicht werden [40]. Distribution: Durch seine hoch lipophilen Eigenschaften verteilt sich THC im Körper in mehreren Phasen. Nach (inhalativem) Konsum flutet es unter rapidem Abfall der Blutkonzentration zunächst schnell in gut durchbluteten Geweben wie Lunge, Herz, Gehirn und Leber an, verteilt sich 14 Theoretische Einführung dann in schwächer durchblutete Gewebe und akkumuliert schließlich im Fettgewebe [40]. Erste THC Effekte traten in Studien bereits innerhalb weniger Minuten nach Konsum auf und hielten über 3 – 4 h an [60]. Im Blut liegt THC zu ca. 90 % in der Plasmafraktion, also dem zellfreien Anteil des Blutes, vor und ist dort zu 95 – 99 % an Plasma-Proteine, überwiegend Lipoproteine, gebunden. Nur ca. 10 % finden sich in Erythrozyten [46, 61–63]. Daher sind THC-Konzentrationen in Vollblut nur ca. halb so hoch wie Plasmakonzentrationen [46]. Das Verteilungsvolumen wird initial auf 2,5 – 3 Liter und im Steady State auf ca. 236 Liter geschätzt, was die gute Verteilung von THC im Gewebe verdeutlicht [40]. Über längere Zeit ist eine Rückverteilung aus dem Fettgewebedepot möglich, wo Fettsäuren stabile Konjugate mit THC bzw. seinem Metaboliten 11-OH-THC bilden [40, 64, 65]. Metabolismus: Die Metabolisierung von THC findet unter Beteiligung der Cytochrom P450 (CYP 450) Enzyme CYP2C9, CYP2C19 und CYP3A4 hauptsächlich in der Leber, jedoch ebenfalls in anderen Geweben wie Gehirn, Lunge und Dünndarm statt [66, 67]. Hauptmetabolit von THC ist das psychoaktive 11-Hydroxy-tetrahydrocannabinol (11-OH-THC oder THC-OH, Abb. 14), welches unter weiterer Oxidierung der Hydroxygruppe an Position C11 in das inaktive 11-Nor- 9-carboxy-tetrahydrocannabinol (THC-COOH, Abb. 14) umgewandelt und schließlich als THC-COOH-Glucuronid ausgeschieden wird [46]. Weitere Metaboliten sind zum Beispiel 8α- bzw. 8ß-OH-THC [46]. Nach Rauchen betrug die 11-OH-THC Plasmakonzentration in Studien nur etwa 10 % der THC-Konzentration, während nach oralem Konsum ähnliche Konzentrationen von THC und THC-OH nachgewiesen wurden [68, 69]. Die Pharmakokinetiken von Frauen und Männern unterscheiden sich nicht signifikant [68]. Auch bei seltenen und häufigen Cannabiskonsumenten wurden kaum Unterschiede nachgewiesen, was darauf schließen lässt, dass bei Toleranzentwicklung von THC weniger eine pharmakokinetische als vielmehr eine pharmakodynamische Adaption stattfindet [61]. 15 Theoretische Einführung Abbildung 14: Chemische Strukturen von THC-OH und THC-COOH. Abbildung 15 zeigt beispielhaft den mittleren Plasmakonzentrationsverlauf von THC, THC- OH und THC-COOH nach Rauchen eines Joints mit 33,8 mg THC (entsprechend 3,55 % THC) nach einer Studie von Huesties et al. [47]: THC Höchstkonzentrationen wurden noch vor Rauchende verzeichnet und fielen innerhalb von 20 – 30 Minuten rapide ab, während THC-OH und THC-COOH Höchstkonzentrationen kurz nach Rauchende bzw. nach ca. 110 Minuten auftraten. THC-OH Konzentrationen begannen nach ca. 20 Minuten abzuflachen und waren stets geringer als die von THC. THC-COOH Konzentrationen hingegen überstiegen die von THC nach ca. 30 Minuten und bildeten ein nur langsam abflachendes Plateau. Abbildung 15: Mittlere Plasmaspiegel bei Konsum eines Joints mit 33,8 mg THC (Daten nach einer Studie von Huestis et al. [47]). 16 Theoretische Einführung Elimination: Die Elimination von THC bzw. seiner Metaboliten verläuft nonlinear. Rückdiffusion aus dem Fettgewebe sowie Zirkulation im enterohepatischen Kreislauf, bei dem die Stoffe nach Aufnahme aus dem Blutkreislauf bzw. Darm zwischen Gallenblase, Darm und Leber zirkulieren, führen zu langen terminalen Plasmahalbwertszeiten von 25 – 36 h nach Einmalgabe und mehr als 4 Tagen bei chronischem Konsum von THC [40, 64, 68]. Für den Metaboliten THC-COOH wurden noch längere terminale Halbwertszeiten von 6,2 Tagen bzw. 5,2 Tagen nach gelegentlichem bzw. häufigem Konsum ermittelt [62]. THC wird zu 65 – 80 % über den Feces und zu 20 – 35 % über den Urin ausgeschieden. In Urin finden sich dabei eher saure Metaboliten, hauptsächlich THC-COOH-Glucuronid, und in Feces überwiegend THC-OH [61, 68, 70]. 3.2.2 Metabolismus weiterer Cannabinoide Der Metabolismus von CBD wird in der Literatur als ähnlich zu dem von THC beschrieben und ist ebenso individuell unterschiedlich. Dabei wird CBD vorrangig an C11, jedoch ebenfalls an der Seitenkette zur Hydroxy- bzw. Carboxyform oxidiert [49, 71]. Es unterliegt, genau wie THC, dem First-Pass-Effekt, wird aber im Gegensatz zu letzterem größtenteils unverändert im Feces ausgeschieden [46]. Die Bioverfügbarkeit von CBD beträgt beim Rauchen im Mittel 31 % verglichen mit intravenöser Gabe [72]. Die Frage, ob CBD den Metabolismus von THC bei gleichzeitiger Gabe beeinträchtigt, wird unterschiedlich beantwortet [46, 73, 74]. In einer Studie wurden bei simultaner sublingualer Verabreichung gleicher Dosen beider Stoffe für CBD niedrigere Plasma-Spitzenkonzentrationen erreicht als für THC [74]. Auch der Metabolismus von CBN ist dem von THC ähnlich. Es wird ebenfalls an C11 hydroxyliert. Die Metabolisierung erfolgt jedoch aufgrund des aromatischen Ringes langsamer und weniger ausführlich. Die mittlere Bioverfügbarkeit liegt beim Rauchen bei 41 % im Vergleich zu intravenöser Applikation. [46] Der Metabolismus von THCAA wird in der Literatur ebenfalls als ähnlich zu dem von THC beschrieben [75]: Hauptmetaboliten sind unter anderem 11-OH-THCAA, THCAA-COOH und deren Glucuronide. In einer Studie lag die orale Bioverfügbarkeit von THCAA bei durchschnittlich 41 % im Vergleich zu intravenöser Applikation und damit höher als die von THC. Halbwertszeiten beider Substanzen liegen in ähnlichen Bereichen [75]. 3.3 Pharmakodynamik von Cannabinoiden Als Cannabinoide bezeichnet man Substanzen, die an Cannabinoidrezeptoren binden [38]. Neben den bereits beschriebenen Phytocannabinoiden sowie synthetisch hergestellten Cannabinoiden existieren zudem Endocannabinoide, die vom Körper selbst produziert werden. 17 Theoretische Einführung 3.3.1 Das Endocannabinoidsystem Das Endocannabinoidsystem bezeichnet ein komplexes System im Körper, welches aus verschiedenen Cannabinoid-Rezeptoren, deren endogen produzierten Liganden und den für Endocannabinoid-Synthese und -Abbau zuständigen Enzymen besteht. Das System ist an vielen verschiedenen Regelkreisläufen in Gehirn, Haut, Verdauungstrakt, Leber, kardiovaskulärem System und anderen Bereichen beteiligt und beeinflusst dort vielfältige Prozesse wie Schmerzverarbeitung, Motorik, Nahrungsaufnahme, Entzündungsprozesse, Apoptose, Modulation von Emotionen oder Lernprozesse. [76] Endocannabinoide sind Derivate der Arachidonsäure. Das erste Endocannabinoid Arachidonylethanolamid, auch als Anandamid bezeichnet (Abb. 16), wurde 1992 isoliert. Weitere Strukturaufklärungen wie die von 2-Arachidonylglycerol (Abb. 16) oder N- Arachidonyldopamin folgten. [76] Abbildung 16: Chemische Strukturen der endogenen Cannabinoide Anandamid und 2- Arachidonylglycerol. Wirkorte der (Endo-) Cannabinoide sind Cannabinoidrezeptoren (CBR). Bisher sind zwei Rezeptoren bekannt: Der CB1-Rezeptor ist überwiegend im zentralen Nervensystem exprimiert, während der CB2-Rezeptor sich vorwiegend auf Zellen des Immunsystems befindet. Beide Rezeptoren sind Gi-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die bei Aktivierung eine Hemmung der Adenylatcyclase hervorrufen und mitogenaktivierte Proteinkinasen aktivieren. Als weitere Targets (endogener) Cannabinoide werden in der Literatur unter anderem verschiedene nichtselektive Kationenkanäle (Transient Receptor Potential Vailloid, TRPV) oder der Orphan-Rezeptor GPR55 (Rezeptor ohne bekannte Liganden oder physiologische Funktion) beschrieben. [76] Die Affinität und Wirkung von (endogenen) Cannabinoiden an den Rezeptoren ist unterschiedlich. THC beispielsweise wirkt unter anderem als Partialagonist an CB1R und CB2R [77]. Neben seiner (toxischen) psychotropen Wirkung, aus der sich beispielsweise 18 Theoretische Einführung Halluzinationen und Panikattacken ergeben können, besitzt THC unter anderem auch analgetische, krampflösende, appetitanregende und muskelrelaxierende Eigenschaften. CBD dagegen ist zwar psychoaktiv, wirkt jedoch nicht toxisch, sondern vielmehr antikonvulsiv, anxiolytisch, antiemetisch und analgetisch [10]. In Studien zeigte es unter anderem Anzeichen von inversem Agonismus an CB1R [78]. Obgleich noch wenig erforscht, besitzen auch seltene, also oft nur in geringen Konzentrationen in der Pflanze vorkommende Cannabinoide pharmakologische Wirkungen. Cannabigerol (CBG), beispielsweise, ein schwacher Partialagonist an CB1R und CB2R, ist unter anderem antimykotisch, analgetisch und besitzt, in hohen Dosen eingesetzt, zytotoxische Eigenschaften in epithelialen Karzinomen [10]. 3.3.2 Typische Wirkungen von Cannabis Typische Wirkungen von Cannabis werden in der Literatur umfangreich beschrieben [9, 40, 79]. Als Rauschmittel ist es insbesondere beliebt aufgrund seiner psychotropen Wirkung, welche über den CB1R vermittelt wird [76]. Es treten Effekte wie Euphorie, Halluzinationen, gesteigerte Kreativität, veränderte Wahrnehmung, Sedation, Entspannung und verändertes Körpergefühl auf [9, 40]. Medizinisch wird Cannabis vor allem aufgrund seiner analgetischen, appetitanregenden, antiemetischen, antikonvulsiven und muskelrelaxierenden Effekte eingesetzt. Zu den unerwünschten Wirkungen von Cannabis zählen unter anderem Dysphorie, Angst und Panikattacken, Tachykardie, verminderte Speichelproduktion, fragmentiertes Denken, Verwirrung, Übelkeit, gestörte Psychomotorik und eingeschränkte Gedächtnisfunktion [40]. Als dauerhafte Folgen des Konsums werden die Entwicklung einer Abhängigkeit und bei Rauchkonsum die Schädigung von Atemwegen und Lunge beschrieben. Zudem gibt es Hinweise, dass regelmäßiger Cannabiskonsum die Aufmerksamkeit, Denkfähigkeit und Gedächtnisleistung beeinflusst und das Risiko für Schizophrenie, Psychosen, Depressionen oder Angststörungen erhöht. Besonders gefährdet sind demnach junge Konsumenten, also Kinder und Jugendliche, bei denen die neuronale Vernetzung im Gehirn noch nicht abgeschlossen ist [9]. 3.3.3 Der Entourage-Effekt Es existieren zahlreiche Hinweise auf synergistische Effekte („Entourage-Effekte“) zwischen verschiedenen Cannabinoiden oder Terpenen und Cannabinoiden. Beispielsweise antagonisierte CBD in Studien in Anwesenheit von THC den CB1-Rezeptor und ist wahrscheinlich in der Lage, unerwünschte Wirkungen von THC wie fragmentiertes Denken, Angst oder Tachykardie abzumildern. [10] 19 Theoretische Einführung 3.4 Cannabis als Rauschdroge Cannabis ist seit Jahrzehnten die am häufigsten konsumierte illegale Droge weltweit, und wachsende Konsumtrends werden verzeichnet. Das United Nations Office on Drugs and Crime (UNDOC) schätzte die Zahl derer, die mindestens einmal Cannabis konsumiert hatten, für das Jahr 2018 auf rund 192 Million, besonders häufig darunter Kinder und junge Erwachsene zwischen 12 und 34 Jahren [1, 2, 80]. Ebenfalls wird über die letzten Jahre europaweit ein steigender Trend für den THC-Gehalt in Cannabis verzeichnet [81]. So verdoppelte sich der durchschnittliche THC-Gehalt laut Freeman et al. von 5 % in 2006 auf mehr als 10 % in 2016. Auch global wurde über die Jahre 1970 bis 2009 ein THC- Konzentrationsanstieg in Cannabiskraut von ca. 0,2 % pro Jahr verzeichnet [82]. Diese Trends sind unter anderem durch Fortschritte in Kultivierung, Züchtung und Extraktion der Pflanze und steigender Nachfrage an unbefruchteten, weiblichen Blüten mit besonders hohen Harzanteilen („Sinsemilla“) zu erklären [80, 83]. Laut dem Drogenbericht der Europäischen Beobachtungsstelle für Drogen und Drogensucht (EMCDDA) ist Cannabisharz heutzutage mit 13 – 24 % THC fast doppelt so potent wie Cannabiskraut (9 – 12 % THC). In 2017 stand mehr als die Hälfte aller registrierten Drogendelikte in der EU in Zusammenhang mit Cannabis [80]. Cannabis nimmt aufgrund seiner Bedeutung als Rausch- und Arzneimittel im Betäubungsmittelgesetz (BTMG) [84] eine Sonderstellung ein. Als Bestandteil der Anlage I ist es nicht verkehrs- und verschreibungsfähig. Anbau, Herstellung, Handel, Ein- und Ausfuhr, Abgabe, Veräußerung, in Verkehr bringen und Erwerb von Cannabis (-produkten) sind damit verboten. Ausgenommen von der Regelung sind Cannabissamen bestimmter in der EU zugelassender Sorten mit ≤ 0,2 % THC, wenn der Verkehr ausschließlich gewerblichen oder wissenschaftlichen Zwecken dient. Auch einige Delta-9- Tetrahydrocannabinole sind in Anlage I aufgeführt. Als Bestandteil der Anlage III ist Cannabis verkehrs- und verschreibungsfähig, wenn der Anbau medizinische Zwecke hat und staatlich kontrolliert wird. Delta-9-THC taucht daneben als verkehrsfähiger aber nicht verschreibungsfähiger Ausgangsstoff zur Herstellung cannabisbasierter Medikamente in Anlage II auf. [84] Gewöhnlicherweise werden bei Cannabis die getrockneten, besonders harzhaltigen Blüten und blütenstandsnahen Blätter (Marihuana) oder das gepresste Harz (Haschisch) sowie teilweise auch Haschischöl, also ein öliger Cannabisextrakt, konsumiert [85]. Die Aufnahme erfolgt hauptsächlich inhalativ durch Rauchen der reinen Substanzen oder als Gemisch mit Tabak, sowie per Vaporisation, bei welcher die Inhaltsstoffe durch einen heißen Luftstrom aus dem Material gelöst werden. Auch eine orale Aufnahme in Form von Gebäck oder Tee ist unter Konsumenten beliebt. 20 Theoretische Einführung 3.5 Cannabis als Arzneimittel Neben seiner Anwendung als Rauschmittel hat Cannabis eine Jahrtausende alte Historie als Therapeutikum. Erste Aufzeichnungen über den medizinischen Gebrauch der Pflanze werden auf ca. 2700 v. Chr. datiert und stammen aus einem chinesischen Arzneibuch des Kaisers Shen-Nung. Dort wurde Cannabis unter anderem eine lindernde Wirkung bei Obstipation, Malaria und Rheuma zugeschrieben [23]. Auch in vielen anderen Kulturen wie Japan, Tibet oder Ägypten ist die medizinische Verwendung der Pflanze schriftlich dokumentiert [28]. In Europa erlangte Cannabis besonders in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts zunehmende Popularität und wurde zum Beispiel in Form von Tinkturen zur Symptomlinderung und Behandlung von Schmerzen, Krämpfen, Depressionen, Übelkeit oder Schlafstörungen eingesetzt. Schwankende Qualität von Cannabis-Arzneimitteln und die Entwicklung synthetischer, spezifischer wirkender Arzneimittel wie Acetylsalicylsäure oder Barbituraten führten Anfang des 20. Jahrhunderts jedoch dazu, dass Cannabis immer seltener verwendet wurde. Aufgrund seiner Rauschwirkung wurde es schließlich 1961 in der UN-Konvention gegen narkotische Suchtmittel als Betäubungsmittel strenger staatlicher Kontrolle unterstellt und seine Anwendung mit wenigen Ausnahmen verboten [9, 28]. Mit der Entdeckung des Endocannabinoidsystems und der Isolierung verschiedener Cannabinoide, darunter 1964 THC, ist das Interesse an der therapeutischen Verwendung von Cannabis in den letzten Jahrzehnten erneut gestiegen. 3.5.1 Gesicherte Indikationen und weitere Anwendungsgebiete In der Vergangenheit haben Studien vor allem das pharmakologische und therapeutische Potential von THC und CBD untersucht. Laut Literatur [86] gelten positive Effekte der Substanzen als gesichert bei:  chronischen Schmerzen  Anorexie und Essstörungen  Spastik bei Multipler Sklerose  Epilepsie Weiterhin werden unter anderem neuroprotektive, antiinflammatorische und immunmodulierende, antikanzerogene, anxiolytische und antipsychotische Effekte von Cannabis sowie ein Nutzen bei Glaukomen oder Schlafstörungen diskutiert [87–94]. Allerdings steht die Forschung hier noch am Anfang, und es sind weitere Studien nötig, um diese Effekte wissenschaftlich zu belegen. Auch in Bezug auf die therapeutischen Effekte anderer (seltener) Cannabinoide und deren Synergie untereinander oder in Kombination mit Terpenen besteht weiterer Forschungsbedarf. 21 Theoretische Einführung 3.5.2 Rechtslage Ein bedeutendes Ereignis der jüngeren Geschichte der cannabisbasierten Therapie in Deutschland war die Verabschiedung des Gesetzes zur Änderung betäubungsmittelrechtlicher und anderer Vorschriften (BT-DS 18/8965) in 2017 [95]. Vor der Gesetzesänderung war es schwerkranken und austherapierten Patienten in Ausnahmefällen gestattet, Cannabis in Medizinalqualität in der Apotheke zu erwerben. Die Kosten von ca. 450 – 540 € pro Monat bzw. 15 – 18 € pro Gramm Cannabis waren jedoch nicht durch gesetzliche Krankenkassen erstattungsfähig und mussten privat getragen werden. Anträge der Patienten auf eine Erlaubnis zum Eigenanbau von Cannabis wurden vom Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) abgelehnt. Nach Klagen betroffener Patienten gegen diese Entscheidung wurde das BfArM im Juli 2014 vom Verwaltungsgericht Köln dazu verurteilt, neu über die Anträge einiger Patienten zu entscheiden, da durch ein Versagen der Erlaubnis die Grundrechte der Patienten verletzt würden [96–98]. Als Konsequenz aus diesem Urteil wurde im Januar 2017 das Gesetz zur Änderung betäubungsmittelrechtlicher und anderer Vorschriften [95] verabschiedet. Das Gesetz besagt, dass nicht-arzneimittelrechtlich zugelassene Cannabisblüten und -extrakte in Medizinalqualität verschreibungsfähig sind und in der Regel durch gesetzliche Krankenkassen erstattet werden müssen. Weiterhin sieht es vor, dass cannabisbasierte Fertigarzneimittel auch bei Verschreibung außerhalb ihrer zugelassenen Indikation (Off- Label-Use) erstattungsfähig sind. Cannabisblüten oder –extrakte sowie die Wirkstoffe Dronabinol (reines (-)-Delta-9-trans-Tetrahydrocannabinol) und Nabilon (ein Δ9-THC Analogon) können schwerkranken Versicherten demnach verordnet werden, wenn keine andere geeignete Therapieoption verfügbar ist, und die Therapie mit Cannabis-Arzneimitteln den Krankheitsverlauf oder schwere Symptome positiv beeinflussen könnte [95]. Dabei sind die möglichen Indikationen für eine solche Therapie nicht konkretisiert, sodass es der Einschätzung des jeweiligen behandelnden Arztes obliegt, ob ein Therapieversuch sinnvoll erscheint. Die Betäubungsmittelverschreibungsverordnung sieht eine Höchstmenge von 100 mg getrockneten Medizinalcannabisblüten pro Monat vor [99]. 22 Theoretische Einführung 3.5.3 Cannabisbasierte Arzneimittel Folgende cannabisbasierte Arzneimittel stehen aktuell in Deutschland für eine Therapie zur Verfügung: - Δ9-THC/ Dronabinol: Bei Dronabinol handelt es sich um reines (-)-Delta-9-trans- Tetrahydrocannabinol (THC). In Deutschland ist es als Rezeptursubstanz verfügbar, die zur Herstellung verschiedener Zubereitungen eingesetzt wird. Dazu gehören: o Dronabinol-Kapseln mit 2,5, 5 oder 10 mg Dronabinol (Neues Rezeptur- Formularium (NRF) 22.7) [100] o Ölige Dronabinol-Tropfen 25 mg/mL (NRF 22.8) [101] o Ölige Cannabisölharz-Lösung 25 mg/mL Dronabinol (NRF 22.11) [102] o Ethanolische Dronabinol-Lösung 10 mg/mL zur Inhalation (NRF 22.16) [103] Hauptsächlich wird Dronabinol bei Anorexie und Kachexie, z.B. bei AIDS Patienten, bei Übelkeit und Erbrechen infolge von Chemotherapie oder als Muskelrelaxans und Analgetikum bei Multipler Sklerose oder neuropathischem Schmerz eingesetzt [102]. Der Hersteller THC-Pharm gewinnt den Wirkstoff partialsynthetisch, während die Firma Bionorica ethics Dronabinol direkt aus österreichischem Medizinalhanf extrahiert [20, 21]. In den USA ist Dronabinol als Fertigarzneimittel in Form von Marinol® Kapseln oder als Syndros® Lösung zur oralen Einnahme im Handel. - Nabiximols (Sativex® Spray): Sativex® ist ein oromukosal appliziertes Spray. Es enthält ein Gemisch aus zwei auf THC bzw. CBD standardisierten ethanolischen Cannabis Pflanzenextrakten („Tetranabinex®“ und „Nabidiolex®“) im Verhältnis von 1,1 zu 1 [19]. Die zur Herstellung verwendeten Cannabispflanzen stammen aus einem kontrollierten Umfeld und werden vegetativ über Stecklinge vermehrt [104]. Sativex® ist indiziert als Add-on Therapeutikum bei mittelschwerer bis schwerer Spastik durch Multiple Sklerose, wenn andere Therapien nicht angemessen ansprechen [105]. - Nabilon (Canemes® Kapseln): Nabilon ist ein synthetisches THC-Analogon. Die Wirkung von 1 mg Nabilon entspricht dabei der Wirkung von 7 – 8 mg THC. Canemes® Kapseln sind zugelassen für die Behandlung von Übelkeit und Erbrechen bei Chemotherapie für Erwachsene, wenn andere antiemetische Therapien nicht adäquat ansprechen. [106] - Medizinalcannabisblüten (Blütenstände weiblicher Pflanzen): Medizinalcannabispflanzen werden in einem kontrollierten Umfeld kultiviert. Während Pflanzen zur Gewinnung von Reinsubstanzen wie Dronabinol häufig aus dem kostengünstigeren Feldanbau stammen, werden Pflanzen zur Gewinnung von Medizinalcannabisblüten gewöhnlicherweise in geschlossenen Räumen oder Gewächshäusern angebaut. Um das Inhaltsstoffspektrum der Pflanzen möglichst 23 Theoretische Einführung konstant zu halten, sind Wasser- und Nährstoffzufuhr sowie Temperatur- und Lichtverhältnisse dort genau geregelt. Die Vermehrung von Medizinalcannabispflanzen findet meist vegetativ über Kultivierung von Stecklingen einer Mutterpflanze statt, um die Genetik der Pflanze möglichst konstant zu halten [107, 108]. Derzeit sind verschiedene THC- oder CBD-dominante Cannabisblüten mit bis zu 25,7 % THC (Sorte Peace Naturals 24/1) oder bis zu 17 % CBD (Sorte Cannabis Flos 1/17 IMC) verfügbar. Daneben sind Mischvarietäten mit moderaten Konzentrationen an THC und CBD, wie z.B. Cannabis Flos 7/9 IMC mit 7 % THC und 9 % CBD erhältlich. Medizinalcannabisblüten können von Patienten bei einer Apotheke als ganze Blüten oder in Einzeldosen abgeteilt bezogen werden. Die meisten Blüten werden aus Kanada oder den Niederlanden importiert, jedoch mittlerweile auch in Deutschland angebaut [14]. Das Neue Rezeptur-Formularium (NRF) sieht eine Einnahme als Teezubereitung (NRF 22.14., als Einzeldosen verpackt in NRF 22.15. [109, 110]) oder zur Inhalation nach Verdampfung (NRF 22.12., als Einzeldosen in NRF 22.13. [111, 112]) vor. - Medizinalcannabisextrakte: Es handelt sich um ölige Vollspektrum-Extrakte zur oralen Anwendung, die THC und CBD in verschiedenen Verhältnissen sowie weitere Cannabinoide, Terpene und Flavonoide enthalten. Die Extrakte werden in der Regel vorbehandelt, sodass die sauren Cannabinoidvorstufen zu ihren neutralen Formen decarboxylieren. [113] - Cannabidiol (CBD): Reines CBD ist in der Europäischen Union als Fertigarzneimittel Epidyolex® seit 2019 zugelassen. Dabei handelt es sich um eine ethanolische Lösung zum Einnehmen, die 100 mg CBD pro 1 mL Lösung enthält. Epidyolex® ist zugelassen als Adjuvant zusammen mit Clobazam bei Krampfanfällen im Zusammenhang mit verschiedenen Epilepsieformen (Lenox-Gastaut-Syndrom oder Dravet-Syndrom) bei Patienten ab 2 Jahren [114]. Neben dem Fertigarzneimittel ist im NRF eine Rezeptur für ölige Cannabidiol-Lösung zum Einnehmen in der Konzentration von 50, 100, 200 oder 400 mg/mL beschrieben. Als mögliche Indikationen werden Epilepsie, Schwindel, Angstzustände, Erbrechen, Schizophrenie, bestimmte Nervenentzündungen sowie neurodegenerative oder Krebs-Erkrankungen genannt [115]. Die Zahl von Verschreibungen cannabisbasierter Arzneimittel ist in den letzten Jahren stetig gestiegen [11–13]. Für das Jahr 2020 lag sie bei rund 340.000 Verordnungen. Am häufigsten wurden dabei cannabinoidhaltige Stoffe oder Fertigarzneimittel in Zubereitungen (also überwiegend Dronabinol-Rezepturen), Medizinalcannabisblüten und Sativex® verordnet [13]. 24 Theoretische Einführung 3.6 Cannabis im Straßenverkehr Kognition, Kurzzeitgedächtnis, psychomotorische Funktionen und Impulskontrolle sind durch die Intoxikation mit THC beeinträchtigt, und es kommt zu einer verminderten Aufmerksamkeits- und Reaktionsfähigkeit [5–7]. Auch wenn bisher keine klaren Dosis- Wirkungsbeziehungen definiert werden konnten, waren die Beeinträchtigungen in Studien stets umso gravierender, je mehr THC konsumiert wurde [116]. Das Unfallrisiko nach engfristigem Konsum ist laut Literatur mindestens verdoppelt [4, 117]. Damit stellt die Teilnahme am Straßenverkehr unter Einfluss von THC ein bedeutendes Sicherheitsrisiko dar und ist, je nach Tatbestand, ordnungswidrig oder eine Straftat. Das Führen eines Kraftfahrzeugs mit THC Serum Spiegeln ab 1,0 ng/mL ist nach § 24a Absatz 2 des Straßenverkehrsgesetzes (STVG) ordnungswidrig und wird mit einer Geldbuße, Punkten im Fahreignungsregister des Kraftfahrt-Bundesamtes und Fahrverbot geahndet [8, 118]. Dabei ist der Grenzwert von 1,0 ng/mL kein Wert, ab dem per se eine eingeschränkte Leistungsfähigkeit zu erwarten ist, sondern vielmehr eine analytische Quantifizierungsgrenze, die auf einer Empfehlung der Grenzwertkommission vom 20.11.2002 beruht [119]. Werden zusätzlich zum Nachweis von THC Fahrfehler oder (cannabisbedingte) Ausfallerscheinungen festgestellt, die darauf hinweisen, dass das Fahrzeug nicht sicher geführt wurde, liegt eine Straftat nach § 316 oder § 315c des Strafgesetzbuches (StGB) vor [120, 121]. Je nach Ausmaß der Gefährdung wird die Straftat mit Führerscheinentzug und einer Geldstrafe oder Haftstrafe von bis zu einem Jahr bzw. bis zu 5 Jahren geahndet. Der bestimmungsgemäße Gebrauch von Arzneimitteln ist von der in Absatz 2 des § 24a StVG beschriebenen Regelung ausgenommen. Eine Teilnahme am Straßenverkehr unter Therapie mit cannabisbasierten Arzneimitteln (inklusive Medizinalcannabis) ist somit nicht ordnungswidrig, solange keine Ausfallerscheinungen vorliegen. Patienten unter Cannabismedikation müssen dazu vor Fahrantritt sorgfältig prüfen, ob sie in der Lage sind, das Fahrzeug sicher zu führen [15]. Trotz dieser Ausnahme ordnen Führerscheinbehörden nach Verkehrskontrollen von Cannabispatienten mit positivem THC-Nachweis teilweise Medizinisch-Psychologische Untersuchungen an, um die generelle Fahreignung zu begutachten. Diese ist nach Punkt 9.2 und 9.3 der Anlage 4 der Fahrerlaubnisverordnung (FeV) [122] bei regelmäßigem (und teilweise auch gelegentlichem) Konsum von Cannabis eigentlich ausgeschlossen. Eine Medizinisch-Psychologische Untersuchung wird herangezogen, um anhand von Kriterien wie Behandlungscompliance, psychophysischer Leistungsfähigkeit, Toleranz und Risiko von zusätzlichem Freizeitkonsum bzw. Cannabis-Missbrauch zu prüfen, ob der Patient dennoch eine generelle Fahreignung aufweist [15]. Eine Herausforderung besteht hierbei darin, die 25 Theoretische Einführung Einnahme cannabisbasierter Medikamente und (zusätzlichen) Freizeitkonsum von Cannabis zu unterscheiden, da in beiden Fällen THC aufgenommen wird. 3.7 Marker für verschiedene Cannabisprodukte – Aktueller Stand der Literatur In der Literatur existieren bereits einige Vorschläge für (Konsum-) Marker verschiedener Cannabisprodukte: • Oraler/ oromukosaler Konsum: Nadulski et al. und Karschner et al. haben erhöhte Konzentrationen des THC-Metaboliten THC-OH mit THC-OH/THC Quotienten > 1 nach oralem bzw. oromukosalem Konsum von THC im Unterschied zu inhalativem Konsum beobachtet. Dies wird dadurch erklärt, dass THC bei oralem oder oromukosalem Konsum dem First-Pass-Effekt unterliegt und im Vergleich zu inhalativem (Rauch-) Konsum mehr THC-OH gebildet wird. [69, 123] • Sativex®: Als Charakteristikum bzw. Konsummarker für Sativex® wird in der Literatur ein spezifisches CBD/THC Verhältnis beschrieben, da die beiden Stoffe, anders als z.B. in gängigen Straßencannabissorten, in Sativex® im Verhältnis von ca. 1:1 vorliegen [124]. In Studien lagen CBD/THC Verhältnisse nach Sativex®-Konsum in Plasma zwischen 0,6 und 1,1 und in Speichel zwischen 0,8 und 1,3 [74, 125]. • Straßencannabiskonsum: In der Literatur wird der Nachweis von Cannabinoiden wie Delta-9-Tetrahydrocannabinolsäure A (THCAA), Tetrahydrocannabivarinsäure (THCVA) oder Tetrahydrocannabivarin (THCV) in biologischen Proben als Marker für den Konsum von illegalen Cannabisprodukten vorgeschlagen, beispielsweise in Abgrenzung zur Einnahme reiner Delta-9-THC basierter Arzneimitteln wie Marinol® [16–18]. • Medizinalcannabis: Hinweise darauf, dass sich bestimmte Medizinal- und Straßencannabissorten signifikant unterscheiden könnten, gibt eine Studie von Hazekamp und Fischedick [22]. Dort wurden bei einem Vergleich von Cannabinoid- und Terpenprofilen verschiedener Medizinal- und Straßencannabissorten signifikante Unterschiede zwischen der Medizinalcannabissorte Bedrocan® und anderen Medizinal- und Straßencannabisvarietäten festgestellt. Bedrocan® wies dabei höhere THC-Gehalte und ein anderes Terpenprofil auf als die Vergleichssorten. [22] 26 Theoretische Einführung 3.8 Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC- MS/MS) Cannabinoidprofile von Stoff- und Serumproben wurden in dieser Arbeit durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS) untersucht. Hierbei handelt es sich um eine hochsensitive Methode, mittels derer Analyten in einem Substanzgemisch aufgetrennt und anhand ihres spezifischen Masse/Ladungsverhältnisses quantifiziert werden können. Das Verfahren ist in zahlreicher Literatur ausführlich beschrieben [126–128]. An dieser Stelle sollen die wichtigsten Zusammenhänge kurz erläutert werden. Das Trennprinzip der Flüssigchromatographie basiert auf unterschiedlichen molekularen Eigenschaften verschiedener Analyten. Diese werden als Gemisch in einem flüssigen Eluentenstrom (mobile Phase) durch eine stationäre (feste) Phase geleitet, die häufig aus einer Säule mit gepacktem, modifiziertem oder nicht modifiziertem Silikagel besteht und eine hohe Oberfläche aufweist. Die Auftrennung erfolgt dadurch, dass die Analyten eine unterschiedliche Affinität zur stationären Phase aufweisen und von der mobilen Phase entsprechend verschieden schnell weitergeleitet werden. Wenig oder nicht affine Analyten verlassen die stationäre Phase dabei früher als solche, die lange an der stationären Phase haften. Zur Auftrennung der lipophilen Cannabinoide wurde in dieser Arbeit eine stationäre Phase mit modifiziertem Silikagel genutzt, welches an seiner Oberfläche mit apolaren C18- Ketten versehen ist (Reversed-phase chromatography). Die Detektion und Quantifizierung der einzelnen Analyten im Eluentenstrom erfolgte in dieser Arbeit durch Tandem-Massenspektrometrie. Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren, das die Auftrennung, Identifizierung und Quantifizierung von Analyten anhand ihres Masse-zu- Ladung-Verhältnisses ermöglicht. Ein Massenspektrometer besteht klassischerweise aus einer Ionenquelle, einem Analysator und einem Detektor. In der Ionenquelle wird die mobile Phase nach Passage der Säule zunächst in die Gasphase überführt, und die Analyten werden ionisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu die Elektrosprayionisation (ESI) eingesetzt, bei der der flüssige Eluentenstrom über eine temperierte Kapillare zerstäubt wird, an deren Spitze ein hohes elektrisches Potential angelegt ist. Aus der Zerstäubung entsteht ein feines Aerosol mit geladenen Tröpfchen, die über einen Trägergasstrom, meist Stickstoff, durch verschiedene Fokussierungsvorrichtungen weitergeleitet und verkleinert werden, bis nur noch überwiegend einfach geladene, ionisierte Analyten im Gas vorliegen. Das Ionengemisch wird dann in den Analysator weitergeleitet, welcher die Ionen im Hochvakuum nach ihrem Masse-zu-Ladung- Verhältnis trennt. Beim Verfahren der Tandem-Massenspektrometrie besteht der Analysator 27 Theoretische Einführung aus mehreren hintereinandergeschalteten Quadrupolen. Ein Quadrupol wiederum besteht aus vier parallelen Stabelektroden, welche zusammen ein elektrisches Feld erzeugen, durch das die Ionen hindurch fliegen. Je nach Schaltung der Elektroden kann das elektrische Feld Ionen auch so beschleunigen, dass nur solche mit einem bestimmten Masse-zu-Ladung- Verhältnis den Quadrupol durchlaufen, während andere abgelenkt werden. Weiterhin kann ein Quadrupol auch als Kollisionszelle fungieren, in dem Ionen durch Kollision mit Stoßgas (meist Stickstoff) fragmentieren. Bei der klassischen Tandem-Massenspektrometrie werden drei Quadrupole hintereinandergeschaltet. Im ersten Quadrupol werden (Precursor-) Ionen mit einer bestimmten Masse selektiert und anschließend im zweiten Quadrupol, der als Kollisionszelle dient, zu Produkt-Ionen fragmentiert. Im dritten Quadrupol erfolgt schließlich die Selektion bestimmter Fragmente anhand ihres Masse/Ladungsverhältnisses (Abb. 17). Da Moleküle je nach Aufbau und Kollisionsenergie mit dem Stoßgas sehr charakteristisch fragmentieren, können sie mit diesem Verfahren sehr spezifisch identifiziert werden. Nach Passage des Analysators werden die Ionen (-fragmente) in einen Detektor weitergeleitet, welcher sie erfasst und in elektrische Signale umwandelt. Abbildung 17: Schema eines Triple-Quadrupol-Massenspektrometers mit Ionenquelle, Analysator und Detektor. Im ersten Quadrupol wird ein (Precursor-) Ion selektiert und in der Kollisionszelle (zweiter Quadrupol) fragmentiert. Im dritten Quadrupol werden bestimmte Fragmente (Produkt-Ionen) selektiert und gelangen in den Detektor. 28 Theoretische Einführung 3.9 Extraktion von Cannabinoiden aus Stoff- und Serumproben In der Literatur existieren verschiedene Ansätze zur Extraktion von Cannabinoiden aus Pflanzenmaterial [129]. Für das klassische Mazerationsverfahren, bei dem sich die Cannabinoide durch längeren Kontakt des Pflanzenmaterials mit einem Lösemittel aus der Pflanzenmatrix lösen, werden überwiegend alkoholische Lösemittel wie Methanol oder Ethanol sowie eine Mischung aus Methanol und Chloroform im Verhältnis 9:1 vorgeschlagen [129–131]. Die beste Stabilität von neutralen und sauren Cannabinoiden ergab sich in Studien für alkoholische Lösemittel wie Methanol und Ethanol [132, 133]. In der vorliegenden Arbeit wurden Phytocannabinoide mittels Mazeration mit Methanol aus Proben von Medizinalcannabis extrahiert. Analog zur Extraktion von beschlagnahmten Straßencannabisproben durch das Landeskriminalamt Mainz wurde die Extraktion der Medizinalcannabisproben unter Wärme (70 °C) im Ultraschallbad durchgeführt, um die Extraktionsausbeute zu erhöhen. Für die Extraktion von Phytocannabinoiden und Cannabinoidmetaboliten aus Serummatrix wurde in dieser Arbeit das Verfahren der Festphasenextraktion (Solid-phase extraction, SPE) verwendet. In diesem Verfahren wird die flüssige (Serum-) Probe in eine SPE Kartusche gegeben, welche mit einer festen Phase (Sorbens) gefüllt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde modifiziertes C18-Silikagel als Sorbens verwendet. Ähnlich zur Säulenchromatographie, basiert die SPE darauf, dass die zu isolierenden Analyten an der festen Phase haften, während weitere Bestandteile der Probe durch die Säule laufen [134]. Anschließend werden die Analyten durch ein Lösemittel von der Säule gewaschen, zu welchem sie eine höhere Affinität besitzen, als zur festen Phase. Gegebenenfalls können Waschschritte zwischengeschaltet werden, um einen reineren Extrakt zu erhalten. Neben der Extraktion von Analyten aus einer flüssigen Matrix bietet das Verfahren der SPE die Möglichkeit, Extrakte aufzukonzentrieren und Störsubstanzen für den weiteren Analyseprozess zu entfernen [134]. 3.10 Grundlagen der Hauptkomponentenanalyse Cannabinoidkonzentrationen von Stoff- und Blutproben wurden in dieser Arbeit mittels Hauptkomponentenanalyse (Principal component analysis, PCA) verglichen. Prinzipien und Anwendung der PCA sind in der Literatur ausführlich beschrieben [135]. An dieser Stelle sollen die Grundzüge des Verfahrens kurz erläutert werden: Die PCA ist ein mathematisches Instrument zur Dimensionsreduktion und zur Identifizierung von Zusammenhängen und Strukturen in multidimensionalen Datensätzen. Dazu werden aus den ursprünglichen Merkmalen (Variablen) eines Datensatzes neue Variablen, sogenannte 29 Theoretische Einführung Hauptkomponenten (Principal components, PCs), gebildet. Hierbei handelt es sich um Linearkombinationen (Vektoren) der ursprünglichen Variablen, entlang derer die Varianz zwischen den Objekten des Datensatzes maximal ist. Der Anteil der beschriebenen Varianz nimmt mit zunehmendem Rang der Hauptkomponente (PC) ab, sodass die erste PC den größten Anteil der Varianz beschreibt [136]. Korrelationen zwischen ursprünglichen Variablen und PCs werden als Ladungen (Loadings) in Diagrammen (Loading Plots) beschrieben [137]. Hohe Loadingwerte zeigen dabei an, dass die PC besonders stark von der entsprechenden Originalvariable geprägt ist. Im nächsten Schritt werden für jedes Objekt des Datensatzes die ursprünglichen Merkmalsausprägungen auf die PCs projiziert und so zu Faktorenwerten (Scores) transformiert. Diese Scores können nun in einem Streudiagramm (PCA Scatter Plot) gegen die PCs aufgetragen werden. Ein Biplot visualisiert zusätzlich zu Scores und PCs die ursprünglichen Variablen des Datensatzes als Vektoren durch den Ursprung [136]. Die PCA ermöglicht somit die Darstellung hochdimensionaler Datensätze in einfachen 2- oder 3-dimensionalen Koordinatensystemen. Ebenso lassen sich mittels PCA Strukturen und Zusammenhänge zwischen den Objekten eines Datensatzes verdeutlichen, die aus Rohdaten durch eine Vielzahl an Variablen möglicherweise schwer ersichtlich sind: Weisen Objekte in Bezug auf eine bestimmte Variable zum Beispiel ähnlich hohe Werte auf, so werden diese Werte auch auf den entsprechenden PCs im PCA Plot abgebildet. Objekte mit ähnlichen Eigenschaften für mehrere Variablen werden im entsprechenden PCA Plot in sogenannten Clustern gehäuft dargestellt. Objekte mit unterschiedlichen Eigenschaften hingegen streuen und werden weiter entfernt voneinander abgebildet. Ein Beispieldatensatz in Tabelle 1 soll die Funktion und Interpretation der PCA verdeutlichen: Der Datensatz erscheint mit einer Vielzahl an Variablen recht unübersichtlich. Strukturen und Zusammenhänge zwischen den Objekten lassen sich allein auf Basis der Rohdaten nur schwer entnehmen. Objekt Variable A B C D E 1 9 8 1 2 3 2 7 9 2 1 3 3 0 7 3 7 7 4 8 1 9 4 2 5 2 8 4 6 8 Tabelle 1: Beispieldatensatz mit mehreren Variablen zur Illustration der Hauptkomponentenanalyse (PCA). 30 Theoretische Einführung Eine PCA ermöglicht die Darstellung der Daten aus Tabelle 1 in einem übersichtlichen, zweidimensionalen Koordinatensystem. Dazu wurde der Beispieldatensatz mittels der PAST software (Version 4.02) für wissenschaftliche Datenanalyse [138] analysiert. Abb. 18 zeigt den resultierenden Biplot: Abbildung 18: Biplot von Hauptkomponente (PC) 1 und PC 2 für die PCA des Beispieldatensatzes aus Tabelle 1. PC 1 und PC 2 bilden zusammen rund 97 % der Gesamtvarianz ab. Die Einflüsse der ursprünglichen Variablen A – E auf die PCs sind als Vektoren dargestellt. Cluster der Objekte 1 und 2 sowie 3 und 5 deuten auf ähnliche Eigenschaften in Bezug auf die hier dargestellten PCs hin. Objekt 1 und 2 sowie 3 und 5 bilden im Biplot Cluster und weisen somit in Bezug auf PC 1 und PC 2 ähnliche Eigenschaften auf: Objekt 1 und 2 liegen im negativen Bereich der x- und y-Achse. Hier sind vor allem Variable A und B ausgeprägt. Bei Objekt 3 und 5, im positiven Bereich der x-Achse abgebildet, dominieren hingegen Variable B, D und E. Objekt 4 liegt, ähnlich wie Objekt 1 und 2, im negativen Bereich der x-Achse und weist ebenfalls einen hohen Wert für Variable A auf. Im Gegensatz zu allen anderen Objekten besitzt Objekt 4 jedoch einen hohen Wert für Variable C und wird, separiert von den restlichen Datenpunkten, im positiven Wertebereich der y-Achse dargestellt. Die Einflüsse der ursprünglichen Variablen A – E auf die jeweilige PC werden im Biplot in Abb. 18 als Vektoren durch den Ursprung verdeutlicht: Die x-Achse (PC 1) stellt im negativen Bereich vor allem hohe Ausprägungen von Variable A, und im positiven Bereich hohe Werte für die Variablen B, D und E dar. PC 2 bildet insbesondere hohe Ausprägungen für Variable C im positiven y-Achsenbereich und für Variable B im negativen Bereich ab. Für eine bessere Übersicht sind die Einflüsse der ursprünglichen Variablen in Abb. 19 zusätzlich als 31 Theoretische Einführung Balken in einem Loading Plot dargestellt. PC 1 und 2 erklären mit insgesamt rund 97 % den Großteil der Varianz im Datensatz. Ähnliche oder unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf diese PCs haben somit eine hohe Aussagekraft für die Gesamtstruktur des Datensatzes. Abbildung 19: Loading Plots von PC 1 und PC 2. Die Balkendiagramme verdeutlichen den Einfluss der ursprünglichen Variablen auf die PCs: Während PC 1 im positiven Bereich vor allem von Variable D und E und im negativen Bereich von A beeinflusst wird, wird PC 2 besonders von Variablen B und C dominiert. 32 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Simultane und hochsensible Analytik von 18 verschiedenen Phytocannabinoiden mittels LC-MS/MS Der Inhalt dieses Kapitels wurde als „Research Article“ veröffentlicht in: Scheunemann A, Elsner K, Germerott T, Hess C, Röhrich J. Simultaneous quantification of 18 different phytocannabinoids in serum using a highly sensitive liquid chromatography- tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2021;1173:122685. doi:10.1016/j.jchromb.2021.122685. 4.1.1 Kurzprofil der Publikation In der Arbeit wurde eine spezifische und hoch sensitive LC-MS/MS Analysemethode zur Quantifizierung 16 verschiedener Phytocannabinoide und zweier Cannabinoidmetaboliten in Serum entwickelt und validiert. Die Analyten umfassten Δ9-Tetrahydocannabinol (THC), Cannabidiol (CBD), Cannabigerol (CBG), Cannabinol (CBN), Cannabichromen (CBC), Cannabicyclol (CBL), Tetrahydrocannabivarin (THCV), Cannabidivarin (CBDV) und die sauren Vorstufen Tetrahydrocannabinolsäure A (THCAA), Cannabidiolsäure (CBDA), Cannabigerolsäure (CBGA), Cannabinolsäure (CBNA), Cannabichromensäure (CBCA), Cannabicyclolsäure (CBLA), Tetrahydrocannabivarinsäure (THCVA) und Cannabidivarinsäure (CBDVA), sowie zusätzlich die beiden THC-Metaboliten 11-Hydroxy- tetrahydrocannabinol (THC-OH) und 11-Nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol (THC-COOH). Die Methode wurde erfolgreich auf 55 Proben aus forensischen Realfällen aus dem Institut für Rechtsmedizin Mainz angewendet, und zum ersten Mal wurden Serumkonzentrationen von CBNA, CBCA, CBLA und CBDVA untersucht. Die Analysemethode ermöglicht die Erhebung umfassender Serum Cannabinoidprofile, welche für die Beantwortung verschiedener (forensischer) Fragestellungen relevant sind, wie beispielsweise der Identifizierung möglicher Marker zur Unterscheidung von Einnahme cannabisbasierter Medikamente und (Freizeit-) Konsum von Marihuana. Auch in Studien zu pharmakokinetischen und therapeutischen Eigenschaften seltener Cannabinoide kann die Methode angewendet werden. 4.1.2 Abgrenzung des Eigenanteils Literaturrecherche, Laborarbeiten, Entwicklung und Validierung der Analysemethode sowie die Erhebung und Auswertung der Messdaten wurden von mir durchgeführt. Die Methode zur Festphasenextraktion der Serumproben wurde dabei aus einer Veröffentlichung von Herrn PD Dr. Jörg Röhrich et al. entnommen. Das Konzept der Studie wurde von mir in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Katrin Elsner und Herrn Röhrich erarbeitet. Das Manuskript 33 Ergebnisse wurde vollständig von mir erstellt. Kommentierung und Unterbreitung von Überarbeitungsvorschlägen erfolgten durch die Koautoren. Die Umsetzung der Überarbeitungsvorschläge erfolgte vollständig durch mich. Die Arbeit wurde durch Herrn Röhrich und Frau Elsner betreut. 34 Ergebnisse 4.1.3 Artikel 35 Ergebnisse 36 Ergebnisse 37 Ergebnisse 38 Ergebnisse 39 Ergebnisse 40 Ergebnisse 41 Ergebnisse 42 Ergebnisse 43 Ergebnisse 44 Ergebnisse 4.2 Phytocannabinoidprofile von beschlagnahmtem Cannabis und cannabisbasierten Arzneimitteln – Identifikation potentieller Unterscheidungsmerkmale Der Inhalt dieses Kapitels wurde als „Research Article“ veröffentlicht in: Scheunemann A, Elsner K, Germerott T, Hess C, Zörntlein S, Röhrich J. Extensive phytocannabinoid profiles of seized cannabis and cannabis-based medicines - Identification of potential distinguishing markers. Forensic Sci Int. 2021;322:110773. doi:10.1016/j.forsciint.2021.110773. 4.2.1 Kurzprofil der Publikation In der Arbeit wurde eine LC-MS/MS Analysemethode zur Quantifizierung von 16 verschiedenen Phytocannabinoiden in Cannabis Pflanzenextraktmatrix entwickelt und validiert. Das Analytspektrum umfasste Tetrahydocannabinol (THC), Cannabidiol (CBD), Cannabigerol (CBG), Cannabinol (CBN), Cannabichromen (CBC), Cannabicyclol (CBL), Tetrahydrocannabivarin (THCV), Cannabidivarin (CBDV) sowie deren sauren Vorstufen Tetrahydrocannabinolsäure A (THCAA), Cannabidiolsäure (CBDA), Cannabigerolsäure (CBGA), Cannabinolsäure (CBNA), Cannabichromensäure (CBCA), Cannabicyclolsäure (CBLA), Tetrahydrocannabivarinsäure (THCVA) und Cannabidivarinsäure (CBDVA). Mit dieser Methode wurden Extrakte von beschlagnahmtem Straßencannabis aus dem Landeskriminalamt Mainz, Extrakte verschiedener Medizinalcannabissorten sowie das cannabisbasierte Fertigarzneimittel Sativex® und die Rezeptursubstanz Dronabinol zweier verschiedener Hersteller untersucht. Die resultierenden Phytocannabinoidprofile wurden hinsichtlich potentieller Unterscheidungsmerkmale verglichen. Cannabinoidprofile von Straßen- und Medizinalcannabis wurden mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) verglichen. Sowohl für verschiedene Medizinalcannabissorten als auch Sativex® und Dronabinol wurden potentielle Marker zur Unterscheidung von Straßencannabis identifiziert. Die Marker umfassten beispielsweise erhöhte Konzentrationen von THC und THCV, ein charakteristisches Verhältnis von THC zu CBD unter Anwesenheit von CBC, oder die fast vollständige Abwesenheit seltener Cannabinoide. 4.2.2 Abgrenzung des Eigenanteils Literaturrecherche, Laborarbeiten, Entwicklung und Validierung der Analysemethode, Aufbereitung und Vermessung der Proben, Auswertung und Interpretation der Messdaten sowie Durchführung und Interpretation der Hauptkomponentenanalyse wurden vollständig von mir durchgeführt. Das Konzept der Studie wurde von mir in Zusammenarbeit mit Herrn PD Dr. Jörg Röhrich und Frau Dr. Katrin Elsner erstellt. Die Extrakte beschlagnahmter 45 Ergebnisse Straßencannabisproben wurden von Herrn Dr. Siegfried Zörntlein und dem Landeskriminalamt Mainz zur Verfügung gestellt. Das Manuskript wurde von mir erstellt und überarbeitet. Kommentierung und Unterbreitung von Vorschlägen zur Überarbeitung erfolgten durch die Koautoren. Die Arbeit wurde durch Herrn Röhrich und Frau Elsner betreut. 46 Ergebnisse 4.2.3 Artikel 47 Ergebnisse 47 Ergebnisse 48 Ergebnisse 49 Ergebnisse 50 Ergebnisse 51 Ergebnisse 52 Ergebnisse 53 Ergebnisse 54 Ergebnisse 55 Ergebnisse 56 Ergebnisse 57 Ergebnisse Ergänzende Informationen Supplementary Table S1: LC-MS/MS specifications Product Collision Product Collision Precursor Compound ion 1 energy 1 ion 2 energy 2 Polarity Retention ion (m/z) time (min) (m/z) (eV) (m/z) (eV) CBDVA 329.2 311.2 18 217.1 22 Negative 1.85 THC-COOH-d9 352.3 308.3 22 254.3 30 Negative 2.08 CBDV 285.2 217.1 18 107 34 Negative 2.17 CBDA 357.2 339.2 22 245.2 30 Negative 3.15 CBGA 359.2 341.2 18 315.2 22 Negative 3.55 CBG-d9 326.3 202.2 10 123 40 Positive 3.84 CBG 317.3 193.1 10 123 40 Positive 3.91 CBD-d3 318.3 196.1 22 123 40 Positive 4.02 CBD 315.2 193.1 22 123 40 Positive 4.05 THCV 287.2 123 40 231.1 22 Positive 4.07 THCVA 329.2 285.2 22 217.1 30 Negative 5.15 CBN-d3 312.2 282.1 40 222.1 52 Negative 5.5 CBN 309.2 279.1 40 222.1 52 Negative 5.52 CBNA 353.2 309.2 26 279.1 38 Negative 5.81 THC-d3 318.3 196.1 22 123 40 Positive 6.04 THC 315.2 193.1 22 123 40 Positive 6.04 CBL 315.2 235.2 18 165.1 22 Positive 6.52 CBC-d9 324.3 202.2 14 268.2 14 Positive 6.64 CBC-d9 322.3 200.2 22 212.2 35 Negative 6.64 CBC 315.2 193.1 14 259.2 14 Positive 6.7 THCAA 357.2 313.2 30 245.2 34 Negative 6.72 CBCA 357.2 313.2 22 191.1 26 Negative 7.06 CBLA 357.2 313.2 26 191.1 26 Negative 7.24 Product ion 1 = target ion, product ion 2 = qualifier ion 58 Ergebnisse Supplementary Table S2: Calibration levels 1-8 in methanol Calibration level 1 2 3 4 5 6 7 8 CBCA, THC, 10 25 50 100 200 300 400 500 ng/mL THCAA CBG, CBGA, CBLA, 1 2.5 5 10 20 30 40 50 ng/mL CBNA, THCVA THCV 0.5 1.25 2.5 5 0 15 20 25 ng/mL CBDA 0.4 1 2 4 8 12 16 20 ng/mL CBL 0.2 0.5 1 2 4 6 8 10 ng/mL CBDVA 0.1 0.25 0.5 1 2 3 4 5 ng/mL CBDV 1.25 2.5 5 10 15 20 25 ng/mL CBD 0.5 1 2 4 6 8 10 ng/mL CBN 0.25 0.5 1 2 3 4 5 ng/mL CBC 0.5 1 2 3 4 5 ng/mL Supplementary Table S3: Method validation data Analyte LOD [ng/mL] LOQ [ng/mL] Bias [%] Intraday precision [%] Interday precision [%] low high low high low high THC 0.014 10 6.1 2.1 2.8 2.4 3.9 2.8 THCAA 0.01 10 5.2 4.3 9.4 3.9 11.9 4.2 CBD 0.2 0.5 5.0 6.0 2.2 3.0 6.8 3.5 CBDA 0.04 0.4 -1.3 -1.2 11.2 6.1 14.4 7.5 CBN 0.25 0.25 2.2 4.3 4.8 4.7 5.5 5.0 CBNA 0.005 1.0 4.4 3.8 7.0 4.8 8.2 5.0 CBG 1.0 1.0 0.5 0.9 3.0 2.5 3.1 3.6 CBGA 0.1 1.0 0.02 -4.2 11.6 4.0 12.9 7.4 CBC 0.5 0.5 5.0 -0.4 10.0 3.2 10.0 4.7 CBCA 0.1 10 11.8 11.1 8.2 6.2 9.7 6.5 CBL 0.2 0.2 7.4 6.1 4.6 2.3 5.3 2.9 CBLA 0.0125 1.0 -3.2 12.8 5.6 4.7 6.4 10.8 THCV 0.25 0.5 -2.1 -1.4 4.7 6.6 4.9 7.0 THCVA 0.005 1.0 11.3 5.3 12.4 4.3 16.1 7.3 CBDV 0.5 1.25 4.2 3.5 4.5 5.4 5.7 5.7 CBDVA 0.02 0.1 -3.3 8.0 14.5 12.1 14.5 13.8 59 Ergebnisse 60 Ergebnisse 4.3 Identifizierung potentieller Unterscheidungsmarker für Konsum von cannabisbasierten Arzneimitteln oder Straßencannabis in Serumproben Der Inhalt dieses Kapitels wurde als „Research Article“ veröffentlicht in: Scheunemann A, Elsner K, Germerott T, Groppa S, Hess C, Miederer I, Poplawski A, Röhrich J, Identification of potential distinguishing markers for the use of cannabis-based medicines or street cannabis in serum samples. Metabolites. 2021;11:316. doi:10.3390/metabo11050316. 4.3.1 Kurzprofil der Publikation In einer klinischen Forschungsstudie wurden in verschiedenen Studienzentren in Mainz und Wiesbaden Serumproben von Patienten unter Therapie mit verschiedenen cannabisbasierten Medikamenten oder Medizinalcannabis gesammelt und mittels der in Kapitel 4.1 beschriebenen LC-MS/MS Analysemethode auf 18 verschiedene Phytocannabinoide und Cannabinoidmetaboliten untersucht. Die resultierenden Phytocannabinoidprofile wurden mittels verschiedener statistischer Verfahren mit Serumcannabinoidprofilen von Straßencannabiskonsumenten verglichen. Dabei wurden potentielle Marker für die Einnahme verschiedener cannabisbasierter Medikamente in Abgrenzung zu Konsum von Straßencannabis identifiziert. Diese potentiellen Konsummarker wurden auf verschiedene Serumproben aus forensischen Realfällen angewendet, bei denen der Konsum cannabisbasierter Medikamente eingeräumt wurde. 4.3.2 Abgrenzung des Eigenanteils Das grundlegende Konzept der Studie wurde von mir in Zusammenarbeit mit Herrn PD Dr. Jörg Röhrich und Frau Dr. Katrin Elsner entworfen. Literaturrecherche, Ausarbeitung des Versuchsdesigns und Entwurf der Studienfragebögen und -materialien, Erstellung des Studienprotokolls, Beantragung eines positiven Votums durch die Ethikkommissionen Rheinland Pfalz und Hessen sowie Koordination der Studie wurden von mir vorgenommen. Die Blutproben wurden durch verschiedene Studienzentren in Mainz und Wiesbaden zur Verfügung gestellt. Die Akquise der Studienzentren erfolgte größtenteils durch mich. Laborarbeiten, Aufarbeitung und Analyse der Serumproben mittels LC-MS/MS sowie Auswertung, statistische Analyse und Interpretation der Ergebnisse wurden vollständig von mir vorgenommen. Die Auswahl der statistischen Verfahren erfolgte durch mich in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Alicia Poplawski und Frau PD Dr. Isabelle Miederer. Das Manuskript wurde von mir erstellt und überarbeitet. Kommentierung des Manuskripts und 61 Ergebnisse Unterbreitung von Vorschlägen zur Überarbeitung erfolgten durch die Koautoren. Die Arbeit wurde durch Herrn Röhrich und Frau Elsner betreut. 62 Ergebnisse 4.3.3 Artikel 63 Ergebnisse 64 Ergebnisse 65 Ergebnisse 66 Ergebnisse 67 Ergebnisse 68 Ergebnisse 69 Ergebnisse 70 Ergebnisse 71 Ergebnisse 72 Ergebnisse 73 Ergebnisse 74 Ergebnisse 75 Ergebnisse 76 Ergebnisse 77 Ergebnisse 78 Ergebnisse 79 Ergebnisse 80 Ergebnisse 81 Ergebnisse 82 Ergebnisse 83 Ergebnisse 84 Ergebnisse 85 Ergebnisse 86 Ergebnisse 87 Ergebnisse 88 Ergebnisse 89 Ergebnisse 90 Ergebnisse 91 Ergebnisse 92 Ergebnisse 93 Ergebnisse 94 Ergebnisse 95 Ergebnisse 96 Ergebnisse 97 Ergebnisse 98 Ergebnisse 99 Gesamtdiskussion und Ausblick 5 Gesamtdiskussion und Ausblick 5.1 Grundlagen und Analytik von Phytocannabinoiden Das öffentliche und wissenschaftliche Interesse an der medizinischen Verwendung von Cannabis ist in den letzten Jahren deutlich gestiegen. In Deutschland werden stetig wachsende Verschreibungszahlen cannabisbasierter Medikamente verzeichnet, seit cannabisbasierte Arzneimittel außerhalb ihrer zugelassenen Indikation (Off-Label-Use) sowie Medizinalcannabisblüten und -extrakte durch das Gesetz zur Änderung betäubungsmittelrechtlicher und anderer Vorschriften in 2017 verordnungsfähig wurden [11– 13, 95]. Aus der medizinischen Anwendung ergeben sich viele Fragestellungen, die bislang nicht oder nur unzureichend beantwortet wurden. Beispielsweise existieren, abseits von Tetrahydrocannabinol (THC) und Cannabidiol (CBD), nur wenige Daten zu Vorkommen, therapeutischer Wirkung und Pharmakokinetik anderer (seltener) Phytocannabinoide. Aus forensischer und auch medizinischer Sicht stellt sich außerdem die Frage, ob die Einnahme cannabisbasierter Medikamente (inklusive Medizinalcannabis) und (Freizeit-) Konsum von Straßencannabis differenziert werden können. Um diese Fragestellungen zu untersuchen, sind detaillierte Kenntnisse zum Gehalt von Phytocannabinoiden in cannabisbasierten Arzneimitteln, Straßencannabis und biologischen Proben nach Konsum essentiell. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, umfassende Phytocannabinoidprofile verschiedener Cannabisprodukte und Serumproben nach Konsum dieser Produkte zu erstellen. Im Fokus dieser Arbeit lag die Identifizierung potentieller Marker zur Unterscheidung cannabisbasierter Arzneimittel und Straßencannabis. Weitere Anwendungsbereiche der Forschungsergebnisse werden an entsprechender Stelle ebenfalls diskutiert. Zur Erstellung detaillierter Phytocannabinoidprofile bedarf es sensitiver Analysemethoden, die ein großes Spektrum an Cannabinoiden abdecken und diese möglichst simultan quantifizieren, um die Analyse effizient zu gestalten. In der vorliegenden Arbeit wurden zu diesem Zweck zwei (hochsensitive) LC-MS/MS Analysemethoden zur Untersuchung von Cannabis Pflanzenextraktmatrix und Serummatrix entwickelt und validiert. Ihr Analytspektrum umfasst jeweils THC, CBD, Cannabigerol (CBG), Cannabinol (CBN), Cannabichromen (CBC), Cannabicyclol (CBL), Tetrahydrocannabivarin (THCV), Cannabidivarin (CBDV) und die sauren Vorstufen Tetrahydrocannabinolsäure A (THCAA), Cannabidiolsäure (CBDA), Cannabigerolsäure (CBGA), Cannabinolsäure (CBNA), Cannabichromensäure (CBCA), Cannabicyclolsäure (CBLA), Tetrahydrocannabivarinsäure (THCVA) und Cannabidivarinsäure (CBDVA), sowie für Serum zusätzlich die beiden THC- Metaboliten 11-Hydroxy-tetrahydrocannabinol (THC-OH) und 11-Nor-9-carboxy- 100 Gesamtdiskussion und Ausblick tetrahydrocannabinol (THC-COOH). Mit diesen 16 Phytocannabinoiden und zwei Cannabinoidmetaboliten umfassen die Methoden nach aktuellen Übersichtsarbeiten [139– 142] mehr Analyten als die meisten bisher beschriebenen LC-MS/MS Methoden, vor allem in Bezug auf saure Cannabinoide. Zudem wird der Literatur zufolge für Serum erstmals auch die Quantifizierung von CBNA, CBCA, CBLA und CBDVA ermöglicht. Mit Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ab 0,0004 ng/mL und 0,004 ng/mL in Serum und 0,005 ng/mL und 0,1 ng/mL in Pflanzenextrakten sind die Methoden außerdem äußerst sensitiv. Im Vergleich dazu liegen beispielsweise für eine bereits beschriebene Serum Methode mit ähnlichem Analytspektrum die minimalen Nachweis- und Bestimmungsgrenzen mit 0,2 ng/mL und 0,4 ng/mL erheblich höher [143]. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden haben ein breites Anwendungsspektrum und können neben der Untersuchung forensischer Fragestellungen zum Beispiel zur Aufklärung therapeutischer Cannabinoid-Blutspiegel oder im Rahmen einer Qualitätskontrolle von Medizinalcannabis eingesetzt werden. 5.2 Phytocannabinoidprofile und Unterscheidungsmarker in cannabisbasierten Arzneimitteln und Straßencannabis Kenntnisse über Phytocannabinoidprofile in Straßencannabis und medizinischen Cannabisprodukten sind relevant für die Unterscheidung einzelner Cannabissorten, beispielsweise im Rahmen einer Sicherstellung von unbekanntem Cannabismaterial, und liefern Hinweise auf potentielle Konsummarker in Blutproben. In Anbetracht von unterschiedlichen Wirkungen einzelner Cannabinoide im Körper und Synergieeffekten bei ihrer Kombination (Entourageeffekt), ist die Aufklärung von Gehalten seltener Cannabinoide in Medizinalhanf und cannabisbasierten Medikamenten außerdem ein wichtiges Element bei der Erforschung ihres therapeutischen Potenzials. Kenntnisse hierüber könnten in der Zukunft helfen, das für den Patienten am besten geeignete Cannabismedikament oder die am besten geeignete Medizinalhanfsorte auszuwählen. Ziel dieser Arbeit war es, eine solche Übersicht über Phytocannabinoidprofile in verschiedenen Produkten zu geben. Dafür wurden in Kapitel 4.2 dieser Arbeit sowohl beschlagnahmte Straßencannabisproben aus dem Landeskriminalamt Mainz als auch verschiedene Medizinalhanfsorten, das cannabisbasierte Arzneimittel Sativex® sowie die Rezeptursubstanz Dronabinol zweier verschiedener Hersteller mit unterschiedlichem Herstellungsverfahren untersucht. Straßencannabis und Medizinalhanf wurden weiterhin gesondert via Hauptkomponentenanalyse verglichen. Angesichts potentiell unterschiedlicher Lagerungsbedingungen vor der Untersuchung, insbesondere bei den Straßencannabisproben, wurden neutrale und saure Form des jeweiligen Cannabinoides für eine bessere Vergleichbarkeit zu Gesamt-Cannabinoidkonzentrationen (im Folgenden 101 Gesamtdiskussion und Ausblick „Cannabinoidgesamt“) zusammengefasst. Die Berechnung dazu wird in Kapitel 4.2 ausführlich erläutert. Die wichtigsten Ergebnisse der Analyse sollen hier, im Kontext mit dem aktuellen Forschungsstand, noch einmal diskutiert werden. Straßencannabis Wie erwartet, lagen die Cannabinoide in den Extrakten von beschlagnahmten Straßencannabisproben vor allem in ihrer Säureform vor, welche erst durch Umwelteffekte wie beispielsweise Hitze, UV Licht oder Luft zu den neutralen Formen decarboxyliert werden [3]. THCgesamt-Konzentrationen reichten im Straßencannabis Kollektiv von 0,8 – 18,8 % und entsprachen mit einem Durchschnitt von 10 % dem aktuellen Trend, nach dem Straßencannabis im Mittel 9 – 12 % THC enthält [80]. Fast alle der 27 untersuchten Extrakte enthielten < 1 % CBDgesamt. Lediglich in zwei Proben wurden CBDgesamt-Gehalte von 4 – 5 % festgestellt. Auch dies entspricht den aktuellen Beobachtungen, nach denen klassischerweise THC-dominante Cannabissorten mit wenig CBD konsumiert werden, jedoch auch CBD-reiche Sorten aufgrund potentieller positiver Effekte von CBD auf die Gesundheit an Popularität gewinnen [80]. In Bezug auf seltene Cannabinoide waren im Studienkollektiv vor allem CBG (CBGgesamt maximal 1,71 %) und CBC (CBCgesamt maximal 2,9 %) vertreten, während CBNgesamt, THCVgesamt und CBLgesamt-Konzentrationen stets bei < 1 % lagen. Mit maximal 0,044 % wies CBDVgesamt die geringsten Konzentrationen auf. Die Literatur liefert nur wenige Informationen zu Gehalten seltener Cannabinoide, da bei Sicherstellungen häufig nur THC und CBD quantifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit stehen jedoch größtenteils mit den bisher beschriebenen Erkenntnissen in Einklang. So wurden in Studien für CBN und THCV stets Gehalte < 1 % und CBG-Konzentrationen von maximal 1,25 % beschrieben [22, 144–146]. Einzig CBC-Konzentrationen lagen in der Literatur mit durchschnittlichen Werten von 0,18 – 0,28 % niedriger. Jedoch wurden bei besonders harzreichen, weiblichen Blüten (Sinsemilla) mit hohen THC-Gehalten von 11,8 % auch höhere CBC-Konzentrationen von bis zu 1,41 % nachgewiesen [144]. Da die CBC- reichen Proben aus dem Studienkollektiv dieser Arbeit analog dazu auch hohe THC- Konzentrationen von bis zu 18,8 % aufwiesen, könnte es sich hier ebenfalls um Sinsemilla Proben handeln. CBL- und CBDV-Gehalte wurden in der Literatur bisher wenig bis gar nicht untersucht. Medizinalcannabis Cannabinoid Zusammensetzungen in Deutschland erhältlicher Medizinalcannabissorten sind sehr heterogen. THC-reiche Sorten weisen THC-Konzentrationen von bis zu 25,7 % bei einem geringen CBD-Anteil < 1 % (Sorte: Peace Naturals 24/1) auf, während CBD- dominante Sorten bis zu 17 % CBD und 1 % THC (Sorte Cannabis Flos 1/17 IMC) enthalten. Weitere Varietäten enthalten moderate Konzentrationen beider Cannabinoide, wie 102 Gesamtdiskussion und Ausblick beispielsweise die Sorte Cannabis Flos 7/9 IMC mit 7 % THC und 9 % CBD [14]. Gehalte seltener neutraler Cannabinoide in Medizinalcannabis sind in der Literatur wenig und nur für einzelne Sorten beschrieben. Konzentrationen lagen in der Regel bei maximal 1 – 2 % [14, 22, 147]. Vereinzelt wurde auch saure Cannabinoide quantifiziert. Für THC-reiche Sorten lag dabei der Anteil von THCAA bei 22 – 25 %, während CBDA und CBGA in geringeren Quantitäten von 0,1 % bzw. 0,5 – 3,2 % präsent waren [14]. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene THC- und CBD-dominante, sowie Mischvarietäten untersucht, um das breite Spektrum an erhältlichen Medizinalhanfsorten zu repräsentieren. Die Einteilung in verschiedene Gruppen hinsichtlich ihres THC- und CBD- Gehaltes ermöglichte eine differenzierte Betrachtung der heterogenen Cannabinoidprofile: - Gruppe 1 mit den Sorten Bedrocan®, Pedanios 22/1 und Red No. 2 mit THCgesamt- Gehalten von 22,0 – 24,2 % und 0,04 – 0,07 % CBDgesamt repräsentierte sehr THC- reiche Sorten. - In Gruppe 2 waren mit Bedica® und Orange No. 1 Varietäten mit moderaten Konzentrationen von 17,2 % und 14,9 % THCgesamt und geringen CBDgesamt-Gehalten von 0,04 % und 0,03 % vertreten. - Bediol®, Green No. 3 und Penelope wurden Gruppe 3 zugewiesen und repräsentierten mit THCgesamt- und CBDgesamt-Konzentrationen von 5,7 – 12,1 % und 7,7 – 13,2 % Mischvarietäten mit moderaten Anteilen beider Cannabinoide. - Mit Bedrolite® in Gruppe 4 wurde zusätzlich eine CBD-dominante Sorte (6,1 % CBDgesamt) mit sehr geringem THC-Anteil (0,2 %) untersucht. Eine wichtige Erkenntnis der Arbeit ist, dass Varietäten mit ähnlichen THC- und CBD- Konzentrationen auch insgesamt ähnliche Phytocannabinoidprofile aufwiesen. Dies konnte in einem Vergleich aller Gruppen via Hauptkomponentenanalyse (PCA) dadurch gezeigt werden, dass die einzelnen Sorten entsprechend ihrer Gruppen clusterten (Vergleich Kapitel 4.2). Die Verteilung seltener Cannabinoide innerhalb dieser Gruppen wurde von der Arbeit ausführlich untersucht. Dabei wurden entgegengesetzte Trends für das Vorkommen von CBDV und THCV, Propyl-Analoga von CBD und THC, festgestellt: CBDVgesamt war mit einer maximalen Konzentration von 0,3 % in Bedrolite® vor allem in CBD-reichen Sorten vertreten. THCVgesamt dominierte mit Maximalkonzentrationen von 0,3 % in Red No. 2 dagegen in THC- reichen Varietäten. Für CBGgesamt und das THC-Oxidationsprodukt CBNgesamt wurde ein ähnlicher Trend festgestellt, wie für THCV. Ihre Gehalte lagen mit maximal 3,9 % und 0,3 % in THC-dominanten Varietäten der Gruppe 1 am höchsten. CBC und CBL dagegen waren mit Gehalten von 1,0 – 2,2 % (CBCgesamt) und 0,02 – 0,05 % (CBLgesamt) über alle vier Gruppen hinweg in ähnlichen Konzentrationen vorhanden. Der Anteil saurer Cannabinoide betrug in Medizinalhanf, ähnlich wie bei Straßencannabis, im Verhältnis zur neutralen Form 103 Gesamtdiskussion und Ausblick im Mittel mindestens das Zehnfache. THCAA- und CBDA-Anteile von 23,0 – 25,6 % bzw. 0,03 – 0,08 % sowie CBGA-Konzentrationen von bis zu 4,1 % waren in THC-dominanten Varietäten ähnlich wie in der Literatur beschrieben [14]. Auch die Konzentrationen der meisten neutralen Cannabinoide standen im Einklang mit bisherigen Ergebnissen, sofern die entsprechende Sorte in der Literatur beschrieben war. Die in der vorliegenden Arbeit erstellten Cannabinoidprofile verschiedener Medizinalhanfsorten sind nicht nur für die Identifizierung potenzieller Unterscheidungsmarker im Vergleich zu Straßencannabis von Nutzen. Auch im Hinblick auf therapeutische Potenziale seltener Cannabinoide sind Erkenntnisse zu deren Konzentrationen in verschiedenen Medizinalcannabisvarietäten von Relevanz. So könnten die Ergebnisse in Zukunft zum Beispiel dabei helfen, die am besten geeignete Medizinalhanfsorte für den jeweiligen Patienten auszuwählen. Sativex® Das oromukosal applizierte Fertigarzneimittel Sativex® wird aus auf THC und CBD standardisierten Cannabis Pflanzenextrakten hergestellt und enthält laut Literatur ebenfalls seltene Cannabinoide [19]. Ein genaues Phytocannabinoidprofil wurde jedoch bisher nicht beschrieben. Hier liefert diese Arbeit neue Ergebnisse: Neben den erwarteten, ähnlichen Konzentrationen von THC und CBD (jeweils ca. 3 %) wurde CBC mit einer Konzentration von 0,2 % als weiterer Inhaltsstoff identifiziert. Andere seltene Cannabinoide wurden ebenfalls nachgewiesen, jedoch in deutlich geringeren Konzentrationen von 0,000005 % (THCVA) bis 0,08 % (CBG). Dronabinol Dronabinol wird, je nach Hersteller, durch unterschiedliche Methoden gewonnen. Während die Firma THC Pharm die Rezeptursubstanz partialsynthetisch herstellt, gewinnt Bionorica ethics Dronabinol direkt aus Medizinalcannabis [20, 21]. In der vorliegenden Arbeit wurde Dronabinol erstmals auch auf andere seltene Cannabinoide untersucht. Dabei wurden, je nach Herstellungsverfahren, Unterschiede im Cannabinoidprofil festgestellt: Beide Proben enthielten neben THC auch geringe Mengen von CBD, CBN und THCV, wobei es sich im Falle von Dronabinol der Firma THC Pharm wahrscheinlich um Abbauprodukte von THC oder Syntheserückstände handelt. In Dronabinol von Bionorica ethics wurden darüber hinaus jedoch noch weitere Cannabinoide wie THCAA oder CBC in geringen Konzentrationen von bis zu 0,03 % nachgewiesen. Dies ist vermutlich auf das Herstellungsverfahren der Direktextraktion zurückzuführen, bei dem, neben THC, noch weitere Cannabinoide in den Extrakt gelangen. 104 Gesamtdiskussion und Ausblick Unterscheidungsmarker für Medizinalcannabis und cannabisbasierte Arzneimittel im Vergleich zu Straßencannabis In der Literatur finden sich nur wenige Hinweise auf Marker für Medizinalcannabis oder cannabisbasierte Arzneimittel. Eine Studie von Hazekamp und Fischedick identifizierte bei einem Vergleich der Medizinalhanfsorte Bedrocan® mit den zwei Straßencannabisvarietäten White Widow und Amnesia via Hauptkomponentenanalyse unter anderem THC als mögliches Unterscheidungsmerkmal [22]. Allerdings wurden in der Studie sowohl Cannabinoide als auch Terpene untersucht. Ob Unterscheidungsmöglichkeiten auch durch alleinige Betrachtung von Cannabinoidspektren bestehen, wurde in der Literatur bisher nicht beschrieben. Ebenso fehlen Daten zum Vergleich weiterer Medizinalhanfvarietäten und Straßencannabissorten. Die vorliegende Arbeit liefert hier neue Ergebnisse: So könnten die sehr THC-reichen Medizinalcannabissorten Bedrocan®, Pedaions 22/1 und Red No. 2 durch ihren hohen Gehalt an THCAA und THCVA, und damit höhere THCgesamt- und THCVgesamt- Konzentrationen, unterschieden werden. Allerdings sollte bei dem Vergleich berücksichtigt werden, dass über die Zeit auch für Straßencannabis steigende THC-Gehalte verzeichnet werden [81]. Bei Pedanios 22/1 und Red No. 2 könnten erhöhte CBGgesamt- und CBNgesamt- Konzentrationen ebenfalls als Marker dienen. In CBD-reichen Sorten Bediol®, Green No. 3, Penelope und Bedrolite® wurden vor allem erhöhte Gehalte an CBDA, CBDVA und CBDV als potentielle Unterscheidungsmarker zu (überwiegend THC-reichem) Straßencannabis identifiziert. Dabei wurden in Bedrolite® die höchsten CBDV- und CBDVA-Konzentrationen im gesamten Studienkollektiv nachgewiesen, während bei den ersten drei genannten Sorten CBDA dominierte. Auch CBCA-Konzentrationen lagen hier höher als bei Straßencannabis. Inwieweit CBD-dominanter Medizinalhanf von CBD-reichem Straßencannabis mit nur geringen THC-Gehalten differenzierbar ist, könnte in weiteren Studien untersucht werden. Für die Medizinalhanfsorten Bedica® und Orange No. 1 mit moderaten THC-Gehalten konnten keine Marker identifiziert werden. Sie lagen im PCA Vergleich innerhalb des 95%- Konfidenzintervalls des Straßencannabis Kollektivs. Beim Vergleich von Medizinal- und Straßencannabis sollten auch Fluktuationen in Cannabinoidgehalten über verschiedene Chargen beachtet werden. Da in der vorliegenden Arbeit jeweils nur eine Charge untersucht wurde, fungieren die hier aufgezeigten Cannabinoidprofile vor allem als erste Orientierungspunkte. Fluktuationen in den Profilen können Gegenstand weiterer Studien sein. Für den Konsum von Sativex® wurden ähnliche THC- und CBD-Konzentrationen als potentielle Marker von dieser Arbeit bestätigt. Außerdem wurden moderate Konzentrationen an CBC, dem neben THC und CBD am häufigsten vorkommenden Cannabinoid, sowie die 105 Gesamtdiskussion und Ausblick Abwesenheit größerer Mengen saurer Cannabinoide ebenfalls als mögliche Charakteristika identifiziert. Weiterhin liefert die Arbeit die Erkenntnis, dass in Dronabinol außer THC auch Spuren anderer, seltener Cannabinoide enthalten sind. Dies trifft besonders für Dronabinol des Herstellers Bionorica ethics zu. Somit ist nicht auszuschließen, dass biologische Proben nach Einnahme von Dronabinol, je nach Dosis, geringe Konzentrationen weiterer Cannabinoide aufweisen. Dennoch kommt die Arbeit zu dem Schluss, dass diese potentiellen Vorkommen deutlich geringer ausfallen sollten als nach Konsum von Cannabis. 5.3 Phytocannabinoidprofile und Konsummarker verschiedener Cannabisprodukte in Serum Ebenso wie in Cannabisprodukten selbst, sind Erkenntnisse zu Phytocannabinoidprofilen in biologischen Proben nach Konsum verschiedener Cannabisprodukte in vielerlei Hinsicht relevant. Sie lassen beispielsweise Schlüsse darüber zu, welche Konzentrationen seltener Cannabinoide nach Applikation von Medizinalhanf im Körper erreicht werden, und ob diese im therapeutischen Bereich liegen, sofern zu diesem entsprechende Daten vorliegen. Insbesondere können solche Phytocannabinoidprofile Hinweise dazu liefern, ob sich der Konsum verschiedener Cannabisprodukte, vor allem der von Cannabismedikamenten und Straßencannabis, in biologischen Proben unterscheiden lässt. Eine Beantwortung dieser Fragestellung ist nicht nur von Bedeutung für die Compliancekontrolle bei Patienten unter cannabisbasierter Therapie, sondern auch im Hinblick auf das Verkehrsrecht. Cannabismedikamente sind dort von der Regelung des § 24a des StVG ausgenommen. Eine Teilnahme am Straßenverkehr unter Cannabistherapie ist, im Gegensatz zu Freizeitkonsum von Cannabis, damit nicht ordnungswidrig, sofern der Patient vor Fahrantritt sicherstellt, dass er in der Lage ist, sein Fahrzeug sicher zu führen. Die Möglichkeit, Freizeitkonsum von Straßencannabis von cannabisbasierter Therapie zu unterscheiden, würde Cannabispatienten im Falle einer Verkehrskontrolle entlasten und dabei helfen, Aussagen zur Einnahme von Cannabismedikamenten zu überprüfen. Vor allem mit Fokus auf potentielle Konsummarker wurden in der vorliegenden Arbeit Phytocannabinoidprofile in Serumproben von Straßencannabis-Konsumenten untersucht. Zusätzlich wurden in einer klinischen Forschungsstudie Serumproben von Patienten unter cannabisbasierter Therapie mit Sativex®, Dronabinol, verschiedenen Medizinalhanfsorten, Dr. Nice CBD Kapseln oder Kombinationen davon hinsichtlich ihrer Phytocannabinoidprofile analysiert. Auch demographische Daten der Patienten, Einnahmeschemata sowie die Zeitabstände zwischen Applikation und Blutentnahme wurden erhoben. Die Cannabinoidprofile wurden anschließend mithilfe statistischer Methoden verglichen, und 106 Gesamtdiskussion und Ausblick potentielle Konsummarker wurden für verschiedene Cannabismedikamente im Vergleich zu Straßencannabis identifiziert. Die Anwendbarkeit der Marker wurde an forensischen Realfällen getestet. Phytocannabinoidprofile Detaillierte Phytocannabinoidprofile von Cannabispatienten und Straßencannabis Konsumenten sind in Kapitel 4.3 beschrieben. Die wichtigsten Erkenntnisse sollen an dieser Stelle noch einmal zusammengefasst werden: - Für verschiedene cannabisbasierte Medikamente wurde gezeigt, dass sich Phytocannabinoidprofile in Stoffproben auch in den entsprechenden Serumproben nach Konsum abbilden. - Sativex®: Serumproben von Sativex®-Patienten wiesen, neben THC, THC- Metaboliten und CBD, im Einklang mit Sativex®-Stoffproben ebenfalls CBC auf. Weiterhin wurden sehr geringe Konzentrationen von THCAA, CBN und THCVA nachgewiesen. - Medizinalhanf: Serumproben nach Applikation von THC-reichem Medizinalhanf wiesen, analog zu Stoffproben, neben THC und dessen Metaboliten zahlreiche weitere Cannabinoide auf und zeigten die höchsten THCAA-, CBN- und THCVA- Konzentrationen im gesamten Kollektiv. CBD-Konzentrationen, hingegen, waren erwartungsgemäß sehr niedrig. Im Vergleich dazu konnte gezeigt werden, dass eine Serumprobe nach Applikation einer CBD-reichen Sorte deutlich höhere CBD- Konzentrationen enthielt. - Dronabinol: Analog zu Stoffproben von Dronabinol wurden in Serumproben von Dronabinol-Patienten vor allem THC und dessen Metaboliten detektiert. Teilweise wurden auch Spuren anderer seltener Cannabinoide wie THCAA, CBN oder THCVA nachgewiesen, jedoch meist unterhalb der Bestimmungsgrenze. - Straßencannabis: Serumproben von Straßencannabis-Konsumenten wiesen häufig eine Vielzahl seltener Cannabinoide auf, darunter auch saure Cannabinoide, die in anderen Kollektiven in eher geringen Konzentrationen detektiert wurden. Die in dieser Arbeit aufgeführten Phytocannabinoidprofile sind nicht nur für die Identifizierung potenzieller Unterscheidungsmarker relevant. Auch liefern sie im Hinblick auf Serumspiegel seltener Cannabinoide im Zusammenhang mit der Zeit zwischen Konsum und Blutentnahme sowie demographischen Daten der Patienten erste Hinweise zu Pharmakokinetiken, die für viele Cannabinoide noch nicht erforscht sind. Weiterhin ergänzt die Arbeit die relativ spärliche Datenlage zu der Frage, welche THC- Serumspiegel nach Applikation größerer THC Mengen (in der Studie bis zu 66 mg als 107 Gesamtdiskussion und Ausblick Einzeldosis) erreicht werden. In bisherigen Studien zur Pharmakokinetik von THC wurden dagegen häufig geringere Einzeldosen von ca. 35 mg THC untersucht [5, 47]. Potenzielle Konsummarker In der Literatur finden sich verschiedene Vorschläge für Konsummarker von Cannabisprodukten: - Zur Unterscheidung von Straßencannabis-Konsum und Einnahme von Medikamenten, welche nur THC enthalten, wurden THCAA, THCVA und THCV als Marker diskutiert [16–18]. - Als Marker für oralen oder oromukosalen Konsum von THC wurden erhöhte THC- COOH/THC und THC-OH/THC Verhältnisse im Vergleich zu Rauchen beschrieben [69, 125]. - Als Marker für Sativex®-Konsum wurde ein spezifisches CBD/THC Verhältnis zwischen 0,6 und 1,1 nach Applikation beschrieben [74, 124]. Diese Arbeit hat die Anwendbarkeit der beschriebenen Marker auf das Studienkollektiv geprüft und weitere potenzielle Marker identifiziert: Oraler/Oromukosaler Konsum von THC (Sativex®, Dronabinol) versus Rauchen: Charakteristische THC-OH/THC Verhältnisse wurden in der vorliegenden Arbeit bestätigt. Diese waren im Kollektiv der Sativex®- und Dronabinol-Patienten stets > 1, sofern THC- Konzentrationen oberhalb der Bestimmungsgrenze lagen. Im Kollektiv der Straßencannabis- Konsumenten, welche THC charakteristischerweise inhalativ aufnehmen, war das THC- OH/THC Verhältnis dagegen fast immer < 1. Auch erhöhte THC-COOH/THC wurden im Sativex®- und Dronabinol-Kollektiv im Vergleich zum Medizinal- oder Straßencannabis- Kollektiv registriert. Für beide Marker wurde mittels statistischer Analysen (Kruskal-Wallis Test und Berechnung der Effektstärke) ein starker Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt. Sativex®: Charakteristische CBD/THC Verhältnisse wurden von dieser Arbeit ebenfalls bestätigt. So lagen diese Verhältnisse in der Studie zwischen 0,6 und 1,5 im Sativex®- Kollektiv und im Medizinal- und Straßencannabis-Kollektiv, bis auf eine Ausnahme, bei maximal 0,5. Als weiterer potentieller Marker wurde ein erhöhtes CBC/THC Verhältnis bei Konsum von Sativex® identifiziert. Entsprechende Werte in den anderen Subkollektiven lagen meist niedriger. Spuren von THCAA oder THCVA in den Serumproben lassen darauf schließen, dass, je nach Sensitivität der Analysemethode, ein Nachweis dieser Cannabinoide zumindest in geringen Mengen auch bei Sativex®-Konsumenten denkbar ist. THCV wurde nicht detektiert. Seine Anwesenheit sowie die Präsenz anderer seltener Cannabinoide wie CBG, CBNA oder CBGA und generell höhere Konzentrationen seltener 108 Gesamtdiskussion und Ausblick Cannabinoide lassen den Schluss zu, dass (zusätzlich) Cannabis oder ein anderes cannabinoidhaltiges Produkt konsumiert wurde. Damit sind die von ElSohly et al., Raikos et al. und Radünz et al. vorgeschlagenen Marker THCV, THCAA und THCVA für die Differenzierung von Sativex®-Konsum (eingeschränkt) anwendbar. Dronabinol: Diese Arbeit hat gezeigt, dass, abhängig von der Analysemethode, nach Dronabinol-Konsum in Einzelfällen durchaus geringe Konzentrationen einiger seltener Cannabinoide wie THCAA und THCVA in Serumproben nachgewiesen werden können. Größere Mengen sprechen aber eher für einen (zusätzlichen) Konsum von Cannabis oder cannabinoidhaltiger Produkte. THCV wurde, genau wie im Sativex®-Konsumenten Kollektiv, nicht detektiert. Der von ElSohly et al. vorgeschlagene Marker scheint daher als Charakteristikum für Straßencannabis-Konsum geeignet. Selbiges gilt für höhere Konzentrationen von THCVA und THCAA. Medizinalcannabis versus Straßencannabis: Den Konsum von Medizinal- und Straßencannabis anhand von Cannabinoidprofilen in Blutproben der Konsumierenden zu differenzieren, stellt die anspruchsvollste Fragestellung dieser Arbeit dar: Bei Medizinal- und Straßencannabis handelt es sich um Pflanzen derselben Gattung, die, je nach genetischer Verwandtschaft, dieselben Inhaltsstoffe in ähnlichen Konzentrationen aufweisen können. Eindeutige Konsummarker für THC-reiches Medizinal- oder Straßencannabis konnten in dieser Arbeit nicht erfasst werden. Dafür ergeben sich mehrere mögliche Erklärungen: Zum einen könnten die in der Studie konsumierten Medizinal- und Straßencannabissorten tatsächlich sehr eng miteinander verwandt sein und praktisch identische Cannabinoidmuster aufweisen. Ebenso ist denkbar, dass Unterschiede zwischen den Pflanzen bestehen, diese nach Konsum jedoch durch Metabolisierungseffekte kaschiert wurden. Weiterhin könnte die Stichprobengröße der Studie zu gering gewesen sein, um signifikante Unterschiede zwischen THC-reichen Pflanzen zu beobachten. Daneben könnte die alleinige Betrachtung von Cannabinoiden möglicherweise nicht ausreichen, um die (geringen) Unterschiede zwischen den Pflanzen zu erfassen. Wie im folgenden Kapitel 5.4 ausführlicher diskutiert, könnte die Analyse auf andere Stoffgruppen, beispielsweise Terpene, ausgeweitet werden, um ein noch umfassenderes Inhaltsstoffprofil zu erhalten. Der Konsum CBD-reicher Cannabissorten konnte in der Studie anhand des CBD/THC Verhältnisses im Serum erfolgreich vom Konsum THC-reicher Varietäten differenziert werden. Da Straßencannabis in den meisten Fällen hohe THC-Anteile und nur wenig CBD aufweist, bietet dieser Marker zumindest für die Abgrenzung CBD-reicher Medizinalhanfsorten wie Bedrolite® oder Bediol® eine Perspektive. Alle Marker wurden in der Arbeit durch statistische Analysen der entsprechenden Gruppen als signifikante Unterschiede mit überwiegend hohen Effektstärken bestätigt. In jedem Fall 109 Gesamtdiskussion und Ausblick sollte bei der Anwendung dieser Marker berücksichtigt werden, dass die Anwesenheit bestimmter (seltener) Cannabinoide zwar für den Konsum von Cannabis oder cannabinoidhaltiger Produkte spricht, ihre Abwesenheit den Konsum jedoch nicht ausschließt. Anwendung der Marker auf forensische Realfälle In dieser Arbeit wurde die Anwendbarkeit der oben diskutierten Konsummarker auf forensische Realfälle überprüft. Dabei wurden Serumproben von Personen untersucht, die laut eigener Aussage Sativex®, Dronabinol und in einem Fall ein „THC-Medikament“ eingenommen hatten. Die Analyse ihrer Cannabinoidprofile und deren Vergleich mit dem oben beschriebenen Studienkollektiv via PCA ergaben dabei, dass im PCA Plot fast alle Proben eher im Bereich der Straßencannabis-Konsumenten clusterten, was auf einen (zusätzlichen) Konsum cannabinoidreicher Produkte wie Cannabis hindeutet. Die Probe einer Person, welche laut eigener Angabe Dronabinol eingenommen hatte, wurde im Plot jedoch entsprechend der Aussage im Bereich der Studienproben von Dronabinol-Patienten abgebildet und wies ähnliche Merkmale in ihrem Cannabinoidprofil auf. Hier konnte die Aussage bestätigt oder zumindest nicht widerlegt werden. Insgesamt zeigt diese Arbeit eine relativ simple Methode auf, um Cannabinoidkonzentrationen von Serumproben in ihrer Gesamtheit zu betrachten und auszuwerten. Dazu beschreibt sie typische Profile nach Konsum cannabisbasierter Medikamente oder Straßencannabis, mit denen zu prüfende Proben verglichen werden können. Bei diesem Vergleich muss berücksichtigt werden, dass es sich um ein relativ kleines Vergleichskollektiv handelt, welches individuelle Unterschiede im Metabolismus von Cannabinoiden gegebenenfalls nicht abbildet. Informationen über den Konsum von Cannabisprodukten in der Studie basierten außerdem nur auf eigenen Angaben der Teilnehmer. Dennoch können Aussagen bezüglich eines Dronabinol- oder Sativex®- Konsums durch den Vergleich mit dem Studienkollektiv eingeordnet und ein möglicher (Bei-) Konsum von Cannabis oder cannabinoidreichen Produkten detektiert werden. 5.4 Ausblick Das Gebiet der Cannabinoidanalyse bietet viel Potenzial für weitere Forschung. So könnte beispielsweise das Analytspektrum der in dieser Arbeit vorgestellten Analysemethoden für Pflanzenextrakt- und Serummatrix durch weitere Cannabinoide und, im Falle von Serumproben, Cannabinoidmetaboliten ergänzt werden, um noch detailliertere Erkenntnisse zu Phytocannabinoidprofilen verschiedener Cannabisprodukte zu erhalten. Auch eine Ausweitung des Analytspektrums auf verschiedene Terpene ist sinnvoll, welche neben Cannabinoiden eine weitere wichtige und therapeutisch wirksame Inhaltsstoffgruppe von 110 Gesamtdiskussion und Ausblick Cannabis sativa darstellen [10]. In einigen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass sich verschiedene Cannabisvarietäten in ihren Terpenprofilen unterscheiden [22, 146, 147]. Eine Erweiterung potentieller Cannabiskonsummarker durch Terpene ist also denkbar. Neben der Identifizierung von Konsummarkern könnten, mithilfe von Cannabinoidanalysen, auch Pharmakokinetiken abseits von THC sowie Synergieeffekte verschiedener Cannabinoide hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirkung untersucht werden. Aus dem in Kapitel 4.2 präsentierten Forschungsansatz zur Analyse verschiedener Cannabisprodukte ergeben sich ebenfalls weitere Fragen. Insbesondere könnten Schwankungen in Cannabinoidkonzentrationen verschiedener Medizinalcannabis Chargen untersucht werden, um die langfristige Eignung der in dieser Arbeit identifizierten Marker zu beurteilen. Auch die aktuellen Trends für Cannabinoidprofile von Straßencannabis, also eine stetige Zunahme des durchschnittlichen THC-Gehaltes und zunehmende Popularität von CBD-reichen Produkten, sollten beobachtet und bei der Anwendung der Konsummarker mit einbezogen werden. Ebenso ist die Ausweitung der Studie auf weitere Medizinalhanfsorten sinnvoll. Auch die in Kapitel 4.3 beschriebene Studie zu Cannabinoidprofilen in Serumproben bietet eine vielversprechende Grundlage für weitere Forschung. So könnte die Studie, gegebenenfalls in einem kontrollierten Umfeld, in größerem Umfang und über einen längeren Zeitraum wiederholt werden, um mit einer höheren Fallzahl noch belastbarere Ergebnisse zu generieren. Dabei könnten auch Cannabinoidprofile nach Konsum weiterer Medizinalhanfsorten oder -extrakte erforscht werden. Unter anderem wäre interessant, inwieweit sich CBD/THC Verhältnisse nach Sativex®-Konsum und nach Konsum CBD- und THC-reicher Cannabissorten unterscheiden. Die Untersuchung von anderen Matrices wie beispielsweise Urin oder Haaren ist ebenfalls denkbar. 111 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Ziel dieser Arbeit war es, umfassende Phytocannabinoidprofile in verschiedenen cannabisbasierten Medikamenten und Straßencannabis sowie in Serumproben nach Konsum solcher Produkte aufzuklären. Aus dem Vergleich dieser Profile wurden potenzielle Unterscheidungsmarker identifiziert. Dazu wurde im ersten Schritt eine hochsensitive Flüssigchromatographie-Tandem- Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Analysemethode für Pflanzenextraktmatrix und Serummatrix entwickelt und validiert. Die Methode ermöglicht die simultane Quantifizierung der 16 Phytocannabinoide Tetrahydocannabinol (THC), Cannabidiol (CBD), Cannabigerol (CBG), Cannabinol (CBN), Cannabichromen (CBC), Cannabicyclol (CBL), Tetrahydrocannabivarin (THCV), Cannabidivarin (CBDV) und ihrer sauren Vorstufen Tetrahydrocannabinolsäure A (THCAA), Cannabidiolsäure (CBDA), Cannabigerolsäure (CBGA), Cannabinolsäure (CBNA), Cannabichromensäure (CBCA), Cannabicyclolsäure (CBLA), Tetrahydrocannabivarinsäure (THCVA) und Cannabidivarinsäure (CBDVA). Für Serummatrix umfasst die Methode zusätzlich 11-Hydroxy-tetrahydrocannabinol (THC-OH) und 11-Nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol (THC-COOH). Mit der Methode wurden Extrakte von beschlagnahmtem Straßencannabis und verschiedenen THC- bzw. CBD-dominanten Medizinalcannabissorten sowie Sativex® und Dronabinol zweier verschiedener Hersteller untersucht. Aus dem Vergleich der jeweiligen Phytocannabinoidprofile wurden potenzielle Marker wie z.B. erhöhte Konzentrationen von THC und THCV bzw. CBD und CBDV bei bestimmten Medizinalhanfsorten, ein charakteristisches CBD/THC Verhältnis unter Anwesenheit von CBC für Sativex®, sowie die fast vollständige Abwesenheit seltener Cannabinoide für Dronabinol identifiziert. In einer weiteren Studie wurden Serumproben von Straßencannabis-Konsumenten und Patienten unter cannabisbasierter Therapie hinsichtlich ihrer Cannabinoidprofile analysiert und mit statistischen Methoden verglichen. Die in Stoffproben festgestellten Marker wurden dabei teilweise auch in Serumproben registriert. So wurden nach Konsum von Sativex® neben THC-OH/THC Verhältnissen > 1 auch charakteristische CBD/THC Verhältnisse und erhöhte Vorkommen von CBC im Vergleich zu Straßen- oder Medizinalcannabis- Konsumenten nachgewiesen. Proben nach Dronabinol-Konsum wiesen ebenfalls THC- OH/THC Verhältnisse > 1 auf. Andere (seltene) Cannabinoide waren im Gegensatz zu den Cannabiskollektiven, wenn überhaupt, nur in Spuren vorhanden. Der Konsum THC-reicher Medizinalhanfsorten war in der Studie nicht von Straßencannabis-Konsum zu unterscheiden. Jedoch konnte der Konsum einer CBD-dominanten Medizinalhanfsorte durch erhöhte CBD/THC Verhältnisse differenziert werden. Um die Anwendbarkeit der Marker zu prüfen, 112 Zusammenfassung wurden Serumproben aus forensischen Realfällen analysiert und mit den Studienkollektiven verglichen. 113 Summary 6 Summary The aim of this work was to elucidate extensive phytocannabinoid profiles both in cannabis- based medicines and street cannabis as well as serum samples after consumption of these products. Potential differentiating markers were identified from comparison of the respective profiles. For this purpose, a highly-sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC- MS/MS) analysis method was developed for plant extract matrix and serum matrix. The method enables the simultaneous quantification of the 16 phytocannabinoids delta-9- tetrahydrocannabinol (THC), cannabidiol (CBD), cannabigerol (CBG), cannabinol (CBN), cannabichromene (CBC), cannabicyclol (CBL), tetrahydrocannabivarin (THCV) and cannabidivarin (CBDV) and their acidic precursors tetrahydocannabinolic acid A (THCAA), cannabidiolic acid (CBDA), cannabigerolic acid (CBGA), cannabinolic acid (CBNA), cannabichromenic acid (CBCA), cannabicyclolic acid (CBLA), tetrahydrocannabivarinic acid (THCVA) and cannabidivarinic acid (CBDVA). For serum, 11-hydroxy-tetrahydrocannabinol (THC-OH) and 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol (THC-COOH) were quantified as well. With this method, extracts of seized street cannabis and different THC- or CBD-dominant medical cannabis strains as well as Sativex® and Dronabinol from two different manufacturers were analyzed. From the comparison of the resulting phytocannabinoid profiles, potential distinguishing markers were identified, such as elevated concentrations of THC and THCV or CBD and CBDV respectively for different medical cannabis strains, a characteristic CBD/THC ratio and presence of CBC for Sativex® and the almost exclusive presence of THC for Dronabinol, with traces of other minor cannabinoids only. In a second study, serum samples of street cannabis users and patients under cannabis- based therapy were analyzed regarding their phytocannabinoid profiles and compared via statistical methods. Some of the markers identified in cannabis products were observed in serum samples after use of these products as well. Besides THC-OH/THC ratios > 1, serum samples after Sativex® use also exhibited characteristic CBD/THC ratios and increased concentrations of CBC, compared to samples of street- or medical cannabis users. Samples of Dronabinol users exhibited THC-OH/THC ratios > 1 as well. Minor cannabinoids, if detected at all, were found in traces only, in contrast to samples of cannabis users. Use of THC-rich medical cannabis could not be distinguished from street cannabis use in the study. However, use of a CBD-dominant medical cannabis variety could be differentiated by increased CBD/THC ratios. To test applicability of the identified markers, cannabinoid profiles of forensic case serum samples were analyzed and compared to the study collective. 114 Literaturverzeichnis 7 Literaturverzeichnis 1. United Nations Office on Drugs and Crime (UNODC). World drug report 2019. Vienna: United Nations; 2019. 2. United Nations Office on Drugs and Crime (UNODC). World drug report 2020. Vienna: United Nations; 2020. 3. Meijer E de. The Chemical Phenotypes (Chemotypes) of Cannabis. In: Pertwee R, editor. Handbook of Cannabis: Oxford University Press; 2014. p. 89–110. doi:10.1093/acprof:oso/9780199662685.003.0005. 4. 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Erstgutachter: Prof. Dr. Irene Krämer Zweitgutachter: PD Dr. Jörg Röhrich Hiermit versichere ich gemäß §10 Abs. 3d der Promotionsordnung vom 24.07.2007: Ich habe die jetzt als Dissertation vorliegende Arbeit selbst angefertigt und alle benutzten Hilfsmittel (Literatur, Apparaturen, Material) in der Arbeit angegeben. Ich habe oder hatte die jetzt als Dissertation vorgelegte Arbeit nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder andere wissenschaftliche Prüfung eingereicht. Ich hatte weder die jetzt als Dissertation vorgelegte Arbeit noch Teile davon bei einer anderen Fakultät bzw. bei einem anderen Fachbereich als Dissertation eingereicht. 130