Untersuchung der Struktur und Assemblierung des Lichtsammelkomplexes II höherer Pflanzen mittels elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR) Dissertation zur Erlangung des Grades "Doktor der Naturwissenschaften" am Fachbereich Biologie der Johannes Gutenberg-Universität in Mainz Christoph Dockter geb. am 5. April 1978 in Neunkirchen/Saar Mainz 2009 Tag der mündlichen Prüfung: 26.08.2009 Dekan: 1. Berichterstatter: 2. Berichterstatter: für Anna Inhaltsverzeichnis I Allgemeine Einleitung 1 1 Die Photosynthese 1 2 Der Lichtsammelkomplex II 4 2.1 Charakterisierung des LHCII 4 2.2 Der rekombinante LHCII 9 2.3 Die Funktionen des LHCII 10 2.3.1 Phosphorylierung der N-terminalen Domäne und „state transitions“ 10 2.3.2 Die energieabhängige nicht-photochemische Löschung der 11 Anregungsenergie (qE) durch LHCII 2.4 Vergleich der Kristallstrukturen des LHCII aus Spinat und Erbse 13 3 EPR-Spektroskopie 14 4 Zielsetzung der Arbeit 18 II Kapitel 21 Kapitel I Herstellung und Charakterisierung von Cys-Mutanten des 23 rekombinanten LHCII sowie Optimierung der................................. Spinmarkierung mit Nitroxid-Markern.............................................. 1 Einleitung 23 2 Material und Methode 24 2.1 Geräte 24 2.2 Chemikalien 27 2.2.1 Lösungsmittel 27 2.2.2 Gase 27 2.2.3 Weitere Chemikalien 27 2.3 Längenstandards 28 2.3.1 DNA-Längenstandards 28 2.3.2 Protein-Längenstandards 29 2.4 Marker 29 2.4.1 EPR-Spinmarker 29 2.4.2 Fluoreszenzmarker 30 2.5 Bakterienstämme 32 2.5.1 JM101 32 2.5.2 XL1-Blue 32 2.6 Molekularbiologische Methoden zur Herstellung neuer Lhcb1-Klone 32 2.6.1 Klonierungsstrategien und Beschreibung hergestellter Mutanten 32 2.6.2 Ausgangsklone und pDS12-Vektor 34 2.6.3 Plasmid-Isolierung und DNA-Quantifizierung 35 2.6.4 Polymerase-Kettenreaktion 36 2.6.4.1 Durchführung der PCR 36 Inhaltsverzeichnis 2.6.4.1.1 Mutagenese-PCR mittels „Quikchange® II site-directed 36 mutagenesis kit“ 2.6.4.1.2 Identifikation positiver Klone mittels „dirty“-PCR 37 2.6.4.1.3 PCR zur Sequenzierung 38 2.6.4.2 PCR-Primer 39 2.6.4.2.1 Primer für die Mutagenese-PCR 39 2.6.4.2.2 Primer für „dirty“-PCR und Sequenzier-PCR 41 2.6.5 Restriktion von DNA 42 2.6.6 Agarose-Gelelektrophorese 42 2.6.6.1 Analytische Agarose-Gelelektrophorese 43 2.6.6.2 Präparative Agarose-Gelelektrophorese nach DNA-Restriktion 43 2.6.6.3 Rückgewinnung restringierter DNA aus Agarose-Gelen 43 2.6.7 Ligation 44 2.6.8 Transformation in E. coli 44 2.6.9 Dauerkulturen 45 2.6.10 Durchführung unterschiedlicher Mutagenese-Strategien 45 2.6.10.1 Punktspezifische Mutagenese mittels „Quikchange® II 45 site-directed mutagenesis kit“ 2.6.10.2 Herstellung von Lhcb1-Konstrukten durch Restriktion und 47 Ligation vorhandener Klone 2.6.10.3 Herstellung von Klonen durch Insertions-PCR 48 2.7 Präparative biochemische Methoden 48 2.7.1 Isolierung von Pigmenten 48 2.7.1.1 Anzucht von Pisum sativum 49 2.7.1.2 Isolierung von Totalpigmentextrakt aus Pisum sativum 49 2.7.1.3 Bestimmung des Chlorophyllgehaltes nach Porra et al. (1989) 50 2.7.1.4 Überprüfung der Pigmentzusammensetzung mittels analytischer HPLC 50 2.7.1.5 Butanol-Extraktion nach Martinson und Plumley (1995) 51 2.7.1.6 Aliquotieren und Aufbewahrung der Pigmente 51 2.7.2 Überexpression und Isolierung von LHCP aus E. coli als „inclusion bodies“ 52 2.7.3 Photometrische Quantifizierung der Proteinkonzentration 53 2.7.4 Markierung von LHCP 53 2.7.4.1 Markierung von LHCP mit SH-reaktiven Spinmarkern 53 2.7.4.2 Markierung von LHCP mit SH-reaktiven Fluoreszenzmarkern 55 2.7.4.3 Fällung von Protein mit Aceton und Essigsäure 55 2.7.4.4 Fällung von PROXYL-markiertem Protein mit Trichloressigsäur 56 2.7.5 Detergenzwechsel-Rekonstitution 56 2.7.6 Immobilisierung und Trimerisierung des rekombinanten LHCII 57 mittels des „His tag“/Ni2+6 -IDA-Sepharose®-Systems 2.7.7 Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation 60 2.7.8 Aufkonzentrierung von LHCII 60 2.7.9 Konzentrationsbestimmung von LHCII nach Butler & Kühlbrandt (1988) 61 Inhaltsverzeichnis 2.8 Analytische Methoden 61 2.8.1 Gelelektrophorese 62 2.8.1.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 62 nach Laemmli (1970) 2.8.1.2 Schwach-denaturierende Gelelektrophorese („grüne Gele“) 63 nach Peter & Thornber (1991) 2.8.1.2.1 Umkristallisation von Deriphat nach H. Paulsen 64 2.8.1.3 Coomassie-Brilliant-Blaufärbung 65 2.8.1.4 Densitometrische Auswertung von PA-Gelen mittels Versa Do 65 2.8.2 Spektroskopie 65 2.8.2.1 Absorptionsspektroskopie 65 2.8.2.2 Fluoreszenzspektroskopie 66 2.8.2.3 Circular-Dichroismus (CD)-Spektroskopie 67 2.8.2.4 EPR-Spektroskopie 68 2.8.2.4.1 continuous wave-EPR (CW-EPR) 68 2.8.2.4.2 Puls-EPR 68 3 Ergebnisse 70 3.1 Einleitung 70 3.2 Herstellung neuer Klone mittels punktspezifischer Mutagenese 70 3.3 Herstellung neuer Klone des Lhcb1 mittels Restriktion und Ligation 73 am Beispiel der Mutante S59Ch 3.4 Biochemische und spektroskopische Charakterisierung neuer LHCII-Klone 74 3.4.1 Herstellung der rekombinanten Apoproteine 74 3.4.2 Rekonstitution der neuen Mutanten zu funktionalen 75 Protein-Pigment-Komplexen 3.4.3 Rekonstitution und Trimerisierung neuer Mutanten mit C-terminalem 77 „His6 tag“ zu funktionalen Protein-Pigment-Komplexen 3.5 Optimierung der Spinmarkierung des rekombinanten LHCII 80 3.5.1 Vergleich der Markierungsausbeuten bei Verwendung 80 unterschiedlicher Spinmarker 3.5.2 Vergleich von TEMPO- und PROXYL-markiertem LHCII bezüglich 83 Spinmarker-Stabilität und DEER-Abständen 4 Diskussion 86 4.1 Herstellung neuer Lhcb1-Klone mittels punktspezifischer Mutagenese 86 4.2 Herstellung von Lhcb1-Klonen durch Neukombination bereits 87 existierender Klone 4.3 Beeinflussung der Struktur des rekombinanten LHCII durch SDSL 88 4.4 Optimierung des EPR-Signals durch Markierung des LHCP mit PROXYL 91 5 Schlussfolgerung 93 Inhaltsverzeichnis Kapitel II Immobilisierung des rekombinanten LHCII mittels 95 Affinitätschromatographie: Bindungsverhalten sowie .......... Experimente zur Herstellung heterogener LHCII-Trimere............. 1 Einleitung 95 2 Material und Methode 97 2.1 Molekularbiologische Herstellung von Lhcb1-Klonen mit N-terminale 97 „Strep tag“ und C-terminalem „His6 tag“ mittels Restriktion und Ligation 2.2 Präparative und analytische biochemische Methoden 100 2.2.1 Überexpression, Markierung und Rekonstitution von LHCP 100 2.2.2 Affinitätschromatographie 100 2.2.2.1 Immobilisierung des LHCII mittels „His6 tag“ 100 2.2.2.1.1 „His6 tag“/Ni2+-NTA-Sepharose® 101 2.2.2.1.2 „His6 tag“/Ni2+-IDA-Sepharose® und „His6 tag“/Ni2+-IDA-Fractogel® 102 2.2.2.1.3 Immobilisierung des LHCII mittels „His6 tag“ nach Ultrazentrifugation 104 2.2.2.1.4 Einfluss von Ni2+-Ionen in der Proteinlösung auf die 104 Immobilisierung des „His6 tag“ 2.2.2.1.5 Einfluss von Detergentien auf die Immobilisierung des „His6 tag“ 104 2.2.2.2 Immobilisierung des LHCII mittels „Strep tag“/Strep-Tactin-System 106 2.2.2.2.1 Immobilisierung und Trimerisierung von rekombinantem 108 LHCII mittels „Strep tag“ 2.2.2.2.2 Aufeinanderfolgende Immobilisierung von Klonen mit zwei 110 Affinitätsmarkern: Trimerisierung mittels C-terminalem „His6 tag“ und nachfolgende Bindung der Trimere mittels N-terminalem „Strep tag“ 2.2.2.2.3 Herstellung heterogen markierter Trimere des rekombinanten LHCII 110 3 Ergebnisse 111 3.1 Versuche zur Bindung des LHCII mittels C-terminalem „His6 tag“ 111 3.1.1 Trimerisierungs-Ausbeuten bei Verwendung unterschiedlicher 111 Säulenmaterialien 3.1.2 Einfluss verschiedener Faktoren auf die Bindung des LHCII an Ni-Säulen 113 3.1.2.1 Bindung des monomeren und trimeren LHCII nach Ultrazentrifugation 113 3.1.2.2 Einfluß von Ni2+-Ionen in der Proteinlösung auf die Bindung des 115 „His6 tag“ an Ni2+-IDA-Sepharose 3.1.2.3 Einfluß verschiedener Detergentien in der Proteinlösung auf 116 die Bindung des „His6 tag“ an Ni2+-IDA-Sepharose 3.2 Immobilisierung des rekombinanten LHCII mittels N-terminalem „Strep tag“ 120 3.2.1 Molekularbiologische Konstruktion der Lhcb1-Klone stC79Sh und st106/160h 122 3.2.2 Biochemische Charakterisierung der LHCII-Mutanten stC79Sh und 123 st106/160h: Rekonstitution sowie Trimerisierung mittels C-terminalem „His6 tag“ oder mittels N-terminalem „Strep tag“ 3.2.3 Immobilisierung des trimeren LHCII mittels „Strep tag“/Strep-Tactin-System 127 3.2.4 Herstellung heterogen markierter LHCII-Trimere: Oligomerisierung auf 129 der Ni-Säule sowie Aufreinigung mittels „Strep tag“/Strep-Tactin-System Inhaltsverzeichnis 3.2.5 Herstellung heterogen spinmarkierter LHCII-Trimere zur 133 Durchführung von DEER-Abstandsmessungen 4 Diskussion 136 4.1 Versuch der Herstellung heterogener LHCII-Trimere durch wiederholte 136 Immobilisierung mittels „His6 tag“ 4.2 Versuch der Herstellung heterogener LHCII-Trimere durch 143 Immobilisierung mittels „Strep tag“ 5 Schlussfolgerung 146 Kapitel III EPR-spektroskopische Untersuchung der Struktur 147 des LHCII in Lösung.......................................................................................... 1 Einleitung 147 2 Material und Methode 149 2.1 Präparation des spinmarkierten LHCII in stationärem Zustand 149 für CW-EPR-und Puls-EPR-Messungen 2.2 Präparation des spinmarkierten LHCII für zeitaufgelöste 149 Puls-EPR-Messungen 2.3 Simulation der theoretischen Abstandsverteilung in 151 PROXYL-markierten LHCII-Mutanten 3 Ergebnisse 153 3.1 Puls-EPR-Experimente an LHCII-Proben in stationärem Zustand 153 3.1.1 Detektion lokaler Strukturinformation durch Messung der 153 Wasserzugänglichkeit mittels ESEEM-EPR 3.1.1.1 Publikation I. Volkov et al. (2009) Pulsed EPR determination of 154 water accessibility to spin-labeled amino acid residues in LHCIIb. Biophys. J., 96, 1124-1141. 3.1.1.2 Wasserzugänglichkeit ausgewählter Aminosäuren der N-terminalen 195 Domäne im Vergleich zu membranständigen Aminosäuren des monomeren LHCII 3.1.1.3 Vergleich der N-terminalen Domäne des monomeren und 198 trimeren LHCII mittels ESEEM-EPR 3.1.2 Detektion der Proteinstruktur mittels DEER-Abstandsmessungen 200 3.1.2.1 Intramolekulare Abstandsmessungen in kristallographisch erfassten 201 Domänen des monomeren LHCII 3.1.2.2 Abstandsmessungen in kristallographisch erfassten Domänen des 204 LHCII in Abhängigkeit der Mizellen-Zusammensetzung 3.1.2.3 DEER-spektroskopische Untersuchung der Konformation des 207 N-Terminus in monomerem LHCII 3.1.2.4 DEER-spektroskopische Untersuchung der N-terminalen 211 Domäne in trimerem LHCII Inhaltsverzeichnis 3.2 Detektion von Membranproteinfaltung mittels Puls-EPR 216 3.2.1 Etablierung eines modifizierten Rekonstitutionsprotokolls für 216 zeitaufgelöste EPR-Messungen 3.2.2 Änderung der Wasserzugänglichkeit während der Faltung 218 des LHCII: zeitaufgelöste ESEEM-Spektroskopie 3.2.3 Pubklikation II. Dockter et al. Refolding of the integral membrane protein 221 light-harvesting complex II monitored by pulse EPR. [Submitted] 4 Diskussion 246 4.1 Strukturaufklärung an rekombinantem LHCII in Lösung mittels 246 Puls-EPR-Spektroskopie 4.2 Strukturdynamik der lumenalen Schleifenregion in rekombinantem LHCII 249 4.3 Lokalisierung der N-terminalen Domäne des LHCII in Detergenzlösung 254 4.4 Zeitaufgelöste Messung der LHCII-Faltung mittels Puls-EPR-Spektroskopie 256 5 Schlussfolgerungen 258 Kapitel IV Experimente zur Insertion nativer LHCII-Trimere in 259 artifizielle Vesikel aus Diblockcopolymeren................................................... 1 Einleitung 259 1.1 Amphiphile Diblockcopolymere: Aufbau und spontane Selbstorganisation 259 1.2 Insertion von Membranproteinen in artifizielle Polymersomen 261 2 Material und Methode 263 2.1 Aufreinigung des trimeren LHCII aus Erbse durch sukzessive Fällung 263 (nach Krupa et al., 1987; modifiziert nach Rühle & Paulsen, 2004) 2.2 Synthese des amphiphilen Diblockcopolymers Polybutadien-b- 264 polyethylenoxid und spontane Selbstorganisation zu Vesikeln 2.3 Ansatz zur Insertion von nativen LHCII-Trimeren in 265 PB130-b-PEO66-COOK-Vesikel 2.4 Spektroskopische Charakterisierung des LHCII nach Insertionsversuch 266 2.5 Dynamische Lichtstreuung 267 2.6 Atomare Kraftmikroskopie zur Erstellung eines Höhenprofils von 268 PB130-b-PEO66-COOK-Vesikeln 2.7 Fluoreszenz-Mikroskopie 268 2.8 Verdau von Insertionansätzen mit der Protease Thermolysin 268 3 Ergebnisse 270 3.1 Isolierung nativer LHCII-Trimere aus Erbse durch 270 sukzessive Fällung mit Salz 3.2 Photometrische Untersuchung zur Entfernung des Detergenz TX 271 aus Insertionsansätzen durch die Behandlung mit „Bio Beads“ 3.3 Spektroskopische Charakterisierung des LHCII nach Insertionsversuchen 273 3.4 Messung der Hitzestabilität des LHCII in PB-PEO-Vesikellösung 276 mittels CD-Absorption 3.5 Dynamische Lichtstreuung 277 Inhaltsverzeichnis 3.6 Erstellung eines Höhenprofils von PB130-b-PEO66-COOK- 278 Vesikeln mittels AFM 3.7 Charakterisierung der Partikel in gespreiteten Polymerschichten 282 mittels Fluoreszenz-Mikroskopie 3.8 Verdau von Insertionsansätzen mit der Protease Thermolysin 283 4 Diskussion 285 4.1 Überprüfung der Ausgangsbedingungen für Insertionsversuche 285 4.2 Entfernung der Detergenzien aus den Insertionsansätzen 285 4.3 Stabile Einlagerung des LHCII in die hydrophile PEO-Schicht von 286 Polymersomen unter Ausbildung von Protein-Aggregaten 5 Schlussfolgerung 288 III Zusammenfassung 289 IV Literaturverzeichnis 291 V Anhang 301 1 Sequenzen 301 1.1 Klon C3.2h (Kosemund, 1999) 301 1.2 Klone mit N-terminalem „Strep tag“ 302 2 Abkürzungsverzeichnis 303 3 Erklärung 307 Inhaltsverzeichnis I Allgemeine Einleitung 1 Die Photosynthese Photoautotrophe Organismen wie Pflanzen, Algen und bestimmte Bakterien sind in der Lage Sonnenlicht zu absorbieren und in energiereichen chemischen Verbindungen zu speichern. Auf diese Weise entstehen durch photosynthetisch aktive Primärproduzen- ten jährlich etwa 100 Milliarden Tonnen an trockener Biomasse (Barber, 2009), welche wiederum als Energiequelle die Lebensgrundlage der heterotrophen Organismen dar- stellt. Die Nutzung der Sonnenenergie durch Photosynthese schafft somit die Basis für das Leben auf der Erde. Allgemein kann heute die oxygene Photosynthese der Pflanzen, eukaryotischen Algen sowie Cyanobakterien, von der anoxygenen Photosynthese unterschieden wer- den, welche beispielsweise in Purpur- und grünen Schwefelbakterien stattfindet. Die Entstehung dieser lichtinduzierten Form der Energiegewinnung liegt bereits mehr als 3 Milliarden Jahre zurück. Ausgehend von einem gemeinsamen Vorläufer-Organismus entwickelten nachfolgende Generationen vermutlich zunächst die verschiedenen For- men der anoxygenen Photosynthese mit jeweils nur einem photosynthetisch aktiven Reaktionszentrum des Typ-I (Eisen-Schwefel-Typ) oder des Typ-II (Chinon-Typ) (Schubert et al., 1998). Die Oxidationskraft solcher einzelnen Photosysteme ist ausrei- chend, um beispielsweise organische Säuren oder Schwefelwasserstoff zu oxidieren, nicht aber Wasser. Erst durch die Evolution der Cyanobakterien, bzw. deren Vorfahren, und die Kopplung zweier Photosysteme des Typ-I und Typ-II wurde die photolytische Spaltung des Wassers ermöglicht und somit die oxygene Photosynthese entwickelt. Der hierbei als „Nebenprodukt“ entstehende Sauerstoff reicherte sich in der Atmosphä- re an und ermöglichte die Entwicklung einer effizienten Zellatmung, ein entscheidender Schritt zur Entstehung des höheren Lebens auf der Erde (Canfield et al., 2006). Die Hauptprozesse der oxygenen Photosynthese finden in höheren Pflanzen in den Chloroplasten der grünen Gewebe statt (Barber, 2009). Diese Zellorganellen wer- den von einer doppelten Hüllmembran umgeben. Die Matrix, das sogenannte Stroma, wird zudem von einem großflächigen Membransystem durchzogen, den Thylakoiden. Während die photosynthetische Assimilation des CO2 im Stroma stattfindet (Dunkelre- aktion), laufen die vorgeschalteten photochemischen Prozesse in der Thylakoid- membran ab (Lichtreaktion). Zur Durchführung einer effizienten photochemischen Re- aktion besitzt die Thylakoidmembran morphologisch einen charakteristischen Aufbau (Abb. 1). Die sogenannten Granathylakoide sind durch eine Stapelung gegenüberlie- gender Membranschichten charakterisiert, Stromathylakoiden durchziehen die Matrix dagegen einzeln. I Allgemeine Einleitung 2 1 Die Photosynthese Abb. 1: Heterogene Verteilung der multimeren Hauptkomplexe der Photosynthese in der Thyla- koidmembran. Photosystem (PS) II befindet sich mit Lichtsammelkomplexen (LHC; hier nur LHCII) bevorzugt innerhalb der Thylakoidgrana, PSI und ATPase dagegen nur in den äußeren Granaschichten und den Stromathylakoiden. Der Cytochrom b6/f-Komplex ist homogen über das gesamte Membransystem verteilt (verändert nach Allen & Forsberg, 2001). Auffällig ist die laterale Heterogenität der Anordnung der vier Hauptkomplexe des Pho- tosyntheseapparates, an welchen die photochemischen Primärprozesse ablaufen. Während Photosystem II (PSII) mit seinen minoren und majoren Lichtsammelkomple- xen („light harvesting complexes“, LHC) bevorzugt in den Kernbereichen der Gra- nastapel liegt, befinden sich Photosystem I (PSI) und ATPase in den Stromathylakoi- den sowie den äußeren Granaschichten. Im Gegensatz dazu ist der Cytochrom b6/f- Komplex homogen über das gesamte Membransystem verteilt (Green & Dunford, 1996). Ein Teil dieser multimeren Hauptkomplexe, nämlich die pigmentbindenden Pro- teinkomplexe des PSII und PSI, absorbieren mit hoher Effizienz eingestrahltes Son- nenlicht, die aufgenommene Energie wird in den Reaktionszentren der Photosysteme zur Ladungstrennung genutzt. Diese Überführung von Lichtenergie in elektrochemi- sches Potential findet jeweils in einem zentralen Chlorophyll (Chl)- Dimer der Reakti- onszentren des PSII (P680) und PSI (P700) statt. Nach Anregung wird ein emittiertes Elektron des PSII über verschiedene Redox-Zentren zu PSI transportiert, wo eine er- neute Anregung durch ein zweites Exciton erfolgt. Hierdurch wird ein ausreichendes Redox-Potential erreicht, um Nicotinamid-Adenindinucleotid-Phospat (NADP+) im Stroma zu reduzieren. Gleichzeitig wird die am PSII entstandene Elektronenlücke durch photolytische Spaltung von Wasser geschlossen, als Nebenprodukt entsteht I Allgemeine Einleitung 1 Die Photosynthese 3 Sauerstoff. Der aus Wasserspaltung und Redox-Prozessen hervorgehende Protonen- gradient über die Thylakoidmembran treibt zudem eine ATPase zur Produktion von Adenosin-Triphosphat (ATP) an. Die entstandenen Reduktionsäquivalente werden wie das gebildete ATP im stromal ablaufenden Calvinzyklus zur Reduktion von anorgani- schem Kohlendioxid und somit zum Aufbau der pflanzlichen Zellsubstanz genutzt (Bar- ber, 2009). Eine Schlüsselrolle in der Photosynthese-Reaktion kommt dem PSII- Superkomplex zu. Innerhalb dieses zentralen Multiproteinkomplexes erfolgt zum einen in Form der lichtinduzierten Reduktion des Plastochinon die Überführung der Licht- energie in ein elektrochemisches Potential, zum anderen findet hier die Spaltung des Wassers statt. Strukturell stellt der Superkomplex ein Dimer dar, welches aus je zwei Kernkomplexen mit jeweiligen minoren und majoren Lichtsammelkomplexen zusam- mengesetzt ist (Abb. 2; Boekema et al., 1999; Dekker & Boekema, 2005). Abb. 2: Hypothetischer Aufbau des dimeren PSII-Superkomplexes höherer Pflanzen mit ange- lagerten LHCII-Trimeren nach Schmid (2008). Gezeigt ist der Kernkomplex (D1, D2, CP43, CP47), die minoren (CP24, CP26, CP29) sowie die majoren Lichtsammelkomplexen (LHCII; s für stark gebunden, m für moderat gebunden). Die Abbildung wurde mit dem Visualisierungs- Programm Chimera (Pettersen et al., 2004) erstellt und ist zusammengesetzt aus den Kristall- daten des dimeren PSII aus Cyanobakterien (PDB-Eintrag 2AXT) und den Kristalldaten des trimeren LHCII aus höheren Pflanzen (2BHW). Die Zusammensetzung basiert auf den Ergeb- nissen von elektronenmikroskopischen Einzelpartikel-Analysen (Dekker & Boekema, 2005). I Allgemeine Einleitung 4 2 Der Lichtsammelkomplex II Die Kernkomplexe selbst bestehen aus einer Vielzahl Untereinheiten, wobei das ei- gentliche Zentrum von den Untereinheiten D1 und D2 gebildet wird. In diesem Hetero- dimer befindet sich das Reaktionszentrum P680 mit dem zentralen Chl a–Dimer, sowie die Elektronenakzeptoren Phaeophytin und Plastochinon. Auf lumenaler Membranseite ist der Kernkomplex mit dem wasserspaltenden Komplex assoziiert. Weiterhin gehören dem Kernkomplex das Cytochrom b-559 an, die Kernantennenkomplexe aus den Chlo- rophyll-Bindungsproteinen (CP) 43 und CP47 sowie eine Vielzahl kleiner Proteine, de- ren Funktion noch nicht vollständig verstanden ist. Umgeben wird der Kern von weite- ren Antennenkomplexen, die es ermöglichen, die Quantenausbeute der Photosynthese deutlich zu erhöhen. Neben den Kernantennen CP47 und CP43 wird zwischen den minoren Antennen CP24, CP26 und CP29, sowie den majoren Antennen, den Licht- sammelkomplexen II (LHCII), unterschieden. Letztere lagern sich als Trimere in der Peripherie des Superkomplexes an. Hierbei wurden in elektronenmikroskopischen Ein- zelpartikel-Analysen je dimerem Superkomplex bis zu 6 LHCII-Trimere erfasst, die je nach Bindestelle fest (LHCII-Trimer S), moderat (LHCII-Trimer M) oder locker (nicht gezeigt) assoziieren (Hankamer et al., 1997; Boekema et al., 1999; Schmid, 2008; Guskov et al., 2009). Biochemische Analysen zeigen dagegen bis zu 8 LHCII-Trimere pro dimerem Superkomplex (Peter & Thornber, 1991). Wie viele Trimere pro Super- komplex in vivo wirklich binden können und inwiefern einzelnen Trimeren hierbei be- stimmte physiologische Funktionen zukommen, ist noch ungewiss. Jedes einzelne as- soziierte LHCII-Trimer ist jedenfalls durch die hohe Zahl von 42 gebundenen Chl- Molekülen in der Lage, die Antenne des PSII deutlich zu vergrößern. Da der majore Lichtsammelkomplex höherer Pflanzen das zentrale Thema der vorliegenden Disserta- tionsschrift darstellt, soll dieser Protein-Pigment-Komplex nachfolgend gesondert vor- gestellt werden. 2 Der Lichtsammelkomplex II 2.1 Charakterisierung des LHCII Der majore Lichtsammelkomplex des PSII macht ca. 30 % des Gesamtproteins der Thylakoidmembran aus und ist damit nicht nur der häufigste Lichtsammelkomplex in der Pflanze, sondern wahrscheinlich auch das häufigste Membranprotein der Erde. Pro Jahr werden geschätzte 109 t des Apoproteins produziert und mit den Pigmenten Chl a, Chl b und den verschiedenen Xanthophyllen zu funktionalen Lichtsammlern assemb- liert (Matile et al., 1996). Als Protein-Pigment-Komplex bindet LHCII bis zu 50 % des in der Pflanze vorkommenden Chlorophylls (was einer lokalen Konzentration von 300 mM entspricht; Standfuss et al., 2005) und kann so, wie der Name schon andeutet, als ef- I Allgemeine Einleitung 2 Der Lichtsammelkomplex II 5 fektive Antenne fungieren, also Lichtenergie einfangen und zu einem Reaktionszent- rum weiterleiten. LHCII bildet zusammen mit den anderen LHC-Proteinen eine Gruppe kernco- dierter Thylakoidproteine, deren Gene Teil einer Multi-Genfamilie sind. Diese Lhc- Super-Genfamilie umfasst in Arabidopsis thaliana mindestens 30 homologe Gene (Jansson, 1999) und zählt damit zu den größten und komplexesten Genfamilien höhe- rer Pflanzen (Montane & Kloppstech, 2000), zu der unter anderem auch die „early light- inducible proteins“ (Elips) sowie das Protein PsbS gehören (Heddad & Adamska, 2002; Schmid, 2008). Da zahlreiche Produkte dieser kerncodierten Gene die Fähigkeit besit- zen neben verschiedenen Carotinoiden und Chl a auch Chl b zu binden, werden sie als Chl a/b-bindende (CAB) Proteine bezeichnet (Green et al., 1991). Der native LHCII höherer Pflanzen setzt sich aus mindestens drei verschiedenen Isoformen zusammen, den Produkten der kerncodierten Gene Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3. Der Vergleich der Aminosäuresequenz des Lhcb1 der beiden Arten Pisum sativum und Arabidopsis thali- ana zeigt eine sehr hohe Identität von 91,8 % mit lediglich 2,6 % an nicht- konservativen Austauschen, die vor allem zu Beginn der N-terminalen Domäne zu fin- den sind. Die Aminosäure-Sequenz von Lhcb1 und Lhcb2 ist in Arabidopsis thaliana zu 66,8 % identisch, der Vergleich aller drei Isoformen untereinander zeigt lediglich 56,6 % Identität. Die größten Unterschiede finden sich hierbei in den Sequenzen der N- und C- Termini sowie innerhalb der lumenalen Schleife (Standfuss & Kühlbrandt, 2004). Die Produkte aller drei Gene besitzen ähnliche Molekulargewichte zwischen 25 und 28 kDa (Jansson, 1994; Standfuss & Kühlbrandt, 2004). Hauptgenprodukte sind die Proteine Lhcb1 und Lhcb2, die zusammen 90 % der Polypeptide des LHCII ausmachen. In sei- ner nativen Form tritt der LHCII vor allem als Trimerkomplex auf. Hierbei können die drei Isomere des LHCII sowohl Homotrimere als auch Heterotrimere ausbilden (Jans- son, 1994; Jackowski et al., 2001). Die dreidimensionale Struktur des LHCII aus Erbse (Pisum sativum) konnte erstmals 1994 durch Kühlbrandt et al. mittels hochauflösender Elektronenkristallogra- phie an zweidimensionalen Kristallen mit einer Auflösung von 3,4 Å dargestellt werden. Dieses Strukturmodell umfasste die Entschlüsselung der Aminosäuren 26 bis 100 und 116 bis 224 (von insgesamt 232), was etwa 80 % der Gesamtstruktur entspricht. Damit zählt der LHCII zu den ersten Membranproteinen, deren Kristallstruktur hochaufgelöst dargestellt werden konnte (Booth & Curnow, 2006). Das Strukturmodell wurde 2004 durch Liu et al. auf die Aminosäuren 14 bis 232 (94 % der Struktur) des LHCII aus Spi- nat (Spinacia oleracea) erweitert, die Auflösung konnte auf 2,72 Å verbessert werden. Diese Röntgenstrukturanalyse stimmte größtenteils mit dem Kristallmodell von Kühlbrandt überein, bestimmte Domänen wie die lumenale Schleife (Aminosäuren 100- 116) konnten jedoch deutlich genauer dargestellt werden. Im Jahr 2005 gelang es Standfuss et al. die Auflösung der Struktur des Erbsen-LHCII auf 2,5 Å zu steigern. I Allgemeine Einleitung 6 2 Der Lichtsammelkomplex II In diesem Modell, welches als Trimer in Abb. 3 in stromaler Aufsicht (A) sowie Seiten- ansicht (B) dargestellt ist, sind 96 % der Struktur des LHCII entschlüsselt. Abb. 3: Dreidimensionale Struktur des trimeren LHCII aus Erbse nach Standfuss et al. (2005; PDB-Eintrag 2BHW) bei einer Auflösung von 2,5 Å. (A) zeigt die Aufsicht auf das Trimer von der stromalen Seite, (B) die Seitenansicht (stromale Seite oben). Die Polypeptidkette ist grau dargestellt, gebundene Pigmente und Lipide farbig hervorgehoben. Chl a ist dunkelgrün, Chl b ist hellgrün, Carotinoide sind rot dargestellt, Lipide blau. Die Abgrenzung der Thylakoid- membran ist in (B) schematisch als graue Balken dargestellt. Die Abbildung wurde mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). Die Lage der ersten neun Aminosäuren der N-terminalen Domäne bleibt bis dato kristallographisch ungeklärt. Als Grund hierfür wird zum einen der heterogene Aufbau nativer Trimere aus den Genprodukten Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3 mit jeweils variieren- I Allgemeine Einleitung 2 Der Lichtsammelkomplex II 7 der N-terminaler Peptidsequenz diskutiert (Standfuss et al., 2005), andererseits legen spektroskopische Versuche mittels elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR) der eigenen Gruppe einen gewissen Grad an N-terminaler Strukturflexibilität nahe (Jesch- ke et al., 2005). Durch die sehr kompakte Struktur des trimeren Komplexes mit über 50 gebun- denen Pigmenten kann LHCII seiner Funktion als effektiver Lichtsammler gerecht wer- den. Aufgrund der hohen Dichte an Cofaktoren ist die Erläuterung struktureller Einzel- heiten anhand Abb. 3 aber wenig übersichtlich. Zur Wahrung der Übersicht ist daher ein einzelnes Monomer des trimeren Komplexes in Abb. 4 sowohl ohne Cofaktoren (A), als auch mit den Pigmenten Chl a (B), Chl b (C) sowie mit Carotinoiden und Lipiden (D) jeweils in der Seitenansicht dargestellt. Wie Abb. 4 (A) illustriert, bildet die Polypeptidkette des LHCII insgesamt fünf α- Helices aus, die nach der neuen Nomenklatur von Standfuss et al. (2005) mit H1 bis H5 gekennzeichnet sind. Zu unterscheiden sind die drei transmembranen Helices H1, H3 und H4 von zwei kurzen amphipathischen Helices H2 und H5. Auffällig ist die Län- ge der beiden Transmembranhelices H1 und H4 (5,1 bzw. 4,3 nm), die durch ein sym- metrisch angeordnetes Salzbrücken-Paar in einer superhelikalen Struktur stabilisiert werden. Der Neigungswinkel der beiden Helices zur Membranebene beträgt jeweils 32°. Als Bindeglied fungiert eine kürzere Transmembranhelix (H3; 3,1 nm), die leicht gebogen ist und im Winkel von 9° zur Membranebene steht (Kühlbrandt et al. ,1994). Beide amphipathischen Helices sind über hydrophobe Aminosäuren in der Thylakoid- membran verankert, wobei Helix H5 in der Nähe des C-Terminus liegt. Helix H2 befin- det sich innerhalb der lumenalen Schleife und fixiert diese in der Membran (Liu et al., 2004). Der N-Terminus des LHCII ragt in das Chloroplasten-Stroma, der C-Terminus in das Lumen der Thylakoide. I Allgemeine Einleitung 8 2 Der Lichtsammelkomplex II Abb. 4: Dreidimensionale Struktur eines LHCII-Monomers aus dem Trimer nach Standfuss et al. (2005) in der Seitenansicht (PDB-Eintrag 2BHW). Die Polypeptidkette ist grau dargestellt, die Abgrenzung der Thylakoidmembran schematisch als graue Balken (stromale Seite jeweils oben). (A) zeigt die Tertiärstruktur des Proteinrückgrates der kristallographisch erfassten Ami- nosäuren 10 bis 232, N ist der N-Terminus (stromale Seite), C der C-Terminus (lumenale Sei- te). Die 5 α-Helices sind mit H1 bis H5 gekennzeichnet. (B) zeigt die Lage der 8 gebundenen Chl a-Moleküle [Chl1 (1) bis Chl8 (8)], (C) die Lage der 6 gebundenen Chl b-Moleküle [Chl9 (9) bis Chl14 (14)], (D) die Lage der Carotinoide und Lipide. Chl a ist dunkelgrün dargestellt, Chl b hellgrün, Lutein gelb (L1 und L2), Violaxanthin (V) rot, Neoxanthin orange-farben (Neo), DGDG dunkelblau (DG) und PG hellblau (P). Die Nomenklatur der α-Helices und der Cofaktoren erfolg- te nach Standfuss et al. (2005). Die Abbildung wurde mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). Insgesamt bindet jedes LHCII-Monomer bis zu 20 Cofaktoren, bestehend aus Chl-Molekülen, Carotinoiden und Lipiden, die jeweils nicht-kovalent mit dem Peptid- Rückgrat assoziiert sind. Die 14 Chl-Moleküle des monomeren LHCII werden durch Koordination des zentralen Mg2+-Atoms im Chlorin-Ring in der Regel an ein freies Elektronenpaar von Stickstoff oder Carbonyl-Sauerstoff gebunden. Die Liganden sind entweder geladene Aminosäurenreste, Carbonylgruppen des Aminosäure-Rückgrates oder auch gebundene Wassermoleküle bzw. das Lipid Dipalmitoyl- I Allgemeine Einleitung 2 Der Lichtsammelkomplex II 9 Phosphatidylglycerin (PG). Die meisten dieser Chl-Bindestellen sind in der Lhc- Superfamilie stark konserviert (Standfuss et al., 2005). Wie in (B) dargestellt, binden die 8 Chl a-Moleküle eines Monomers vorwiegend um das Helixkreuz herum, der Großteil der entsprechenden Bindestellen findet sich innerhalb des Peptid-Rückgrates von Helices H1 und H4. Die sechs Chl b-Moleküle (Abb. 4 C) des monomeren LHCII liegen, mit Ausnahme des N-terminal gebundenen Chl9, im Zwischenraum des Helixkreuzes zu Transmembranhelix H3, die jeweiligen Bindestellen sind alle im Rückgrat von H3 zu finden. Außerdem können dem LHCII die Carotinoide Lutein (Lut), Violaxanthin (Vio) und Neoxanthin (Neo) im Verhältnis 2 zu 1 zu 0,5 zugeordnet werden, wobei Violaxanthin die geringste Bindungsaffinität besitzt und bei Aufreinigung leicht dissoziert (Ruban et al., 1999; Hobe et al., 2000). Während die beiden Lutein-Bindestellen am Helixkreuz sitzen (Abb. 4 D), ragt Neoxanthin weit in die Peripherie des Komplexes. Violaxanthin bindet im Zwischenraum zweier Monomere des trimeren Komplexes. Zudem assoziieren die zwei Lipide PG und Digalaktosyldiacylglycerin (DGDG) mit dem LHCII (Standfuss et al., 2005). Während die Funktion der drei zentralen DGDG-Moleküle im Trimer noch ungewiss ist (Standfuss et al., 2005), spielt das Lipid PG eine entscheidende Rolle in der Trimerisierung des LHCII. Nußberger et al. (1993) zeigten, dass PG zwischen den Monomeren als „molekularer Klebstoff“ fungiert und essentiell für die Ausbildung und Stabilität trimerer Komplexe ist. Sowohl der proteolyti- sche Verdau der N-terminalen Domäne als auch der Verdau des Phospholipids mit einer Lipase resultierten in der Auflösung der trimeren Komplexe. Experimente von Hobe et al. (1995) konnten ein essentielles N-terminales Trimerisierungsmotiv mit der Sequenz WYGPDR definieren. Diese Sequenz beginnt mit den aromatischen Amino- säuren Trp 16 und Tyr 17 und reicht mindestens bis zur positivgeladenen Aminosäure Arg 21. Auch eine Beteiligung des C-Terminus an der Trimerstabilisierung wird ange- nommen. Der Austausch des unpolaren Trp 222 durch weniger hydrophobe Aminosäu- ren beeinträchtigt die Trimerbildung umso mehr, je polarer die eingesetzte Aminosäure ist (Kuttkat et al., 1996). Eine Interaktion dieser Aminosäure mit der transmembranen Helix H3 des gegenüberliegenden Monomers im Trimer bzw. mit den Pigmenten Chl10 und Violaxanthin gilt als wahrscheinlich (Barros & Kühlbrandt, 2009). 2.2 Der rekombinante LHCII LHCII gehört nicht nur zu den ersten kristallographisch erfassten Membranproteinen (Kühlbrandt et al., 1994), sondern war auch eines der ersten Membranproteine, dessen Gen erfolgreich isoliert (Cashmore, 1984) und in Escherichia coli (E. coli) rekombinant überexprimiert werden konnte (Paulsen et al., 1990). Zusätzlich besitzt das denaturier- te Apoprotein die Fähigkeit, in Detergenzlösung bei Anwesenheit seiner Cofaktoren mit hoher Ausbeute zu funktionalen Protein-Pigment-Komplexen rückzufalten (Plumley & Schmidt, 1987; Paulsen et al., 1990). Eine Möglichkeit der Rückfaltung besteht in ei- I Allgemeine Einleitung 10 2 Der Lichtsammelkomplex II nem raschen Wechsel des Detergenz. Hierbei wird Lithiumdodecylsulfat (LDS)- solubilisierter LHCII mit einer pigmenthaltigen n-Octyl-β-D-Glucopyranosid (OG)- Lösung verdünnt und das ionische LDS durch Fällung entfernt (Paulsen et al., 1993). Die daraufhin stattfindende Faltung des LHCII kann mittels Fluoreszenz- oder CD- Spektroskopie in vitro verfolgt werden (Booth & Paulsen, 1996; Reinsberg et al., 2000; Horn & Paulsen, 2002; Horn & Paulsen, 2004; Horn et. al., 2007). Entscheidender Vor- teil des rekombinanten LHCII gegenüber nativen Komplexen ist die Möglichkeit die Primärstruktur nach Bedarf zu modifizieren. Durch punktspezifische Mutagenese des Lhcb1-Gens ist es möglich, Aminosäuren gezielt auszutauschen oder Aufreinigungs- marker an die Termini anzufügen. Wie später erläutert werden soll, stellt die Möglich- keit der punktspezifische Mutagenese in Verbindung mit der kovalenten Spinmarkie- rung der Expressionsprodukte, das sogenannte „site-directed spin labeling“, die Grund- lage der Untersuchung des LHCII mittels EPR-Spektroskopie dar. 2.3 Die Funktionen des LHCII Dem LHCII fallen neben seiner Hauptfunktion als majorer Lichtsammler der Pflanze wichtige Funktionen in der Regulierung der Photosynthese zu. Zum einen wird durch die Interaktion stromaler Proteindomänen zweier LHCII-Trimere, die in gegenüberlie- gende Thylakoidmembranen inseriert sind, die Ausbildung der Granastapel („grana stacking“) reguliert (Day et al., 1984; Standfuss et al., 2005). Zudem wird angenom- men, dass LHCII an der nicht-photochemischen Löschung der Anregungsenergie („non photochemical quenching“, NPQ) beteiligt ist. Hierbei handelt es sich um einen essen- tiellen Schutzmechanismus, um den Kernkomplex des PSII vor Überanregung zu schützen und von der damit verbundenen Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies und der photooxidativen Zerstörung zu bewahren. NPQ kann in mehrere Komponenten aufgeteilt werden (Müller et al., 2001) von denen an dieser Stelle lediglich zwei vorge- stellt werden sollen. Die schnellste und gleichzeitig wichtigste Komponente des NPQ ist die pH- bzw. energieabhängige Löschung der Anregungsenergie, welche als „qE“ bezeichnet wird. Bei diesem Schutzmechanismus wird überschüssige Anregungsener- gie in Form von Wärme dissipiert. Weiterhin kann durch die Abwanderung des LHCII von PSII zu PSI die Antennengröße beider Photosysteme verändert und dadurch die Verteilung der Excitonenenergie auf die Photosysteme kontrolliert werden. Diese Form des NPQ wird als „qT“ bezeichnet, der Prozess der LHCII-Verlagerung als „state transi- tions“. Beide Mechanismen sollen im Folgenden näher erläutert werden. 2.3.1 Phosphorylierung der N-terminalen Domäne und „state transitions“ Höhere Pflanzen und Algen sind alternierenden Lichtverhältnissen ausgesetzt. Da die beiden Photosysteme in Reihe geschaltet sind, muss auch unter wechselnden Lichtbe- dingungen gewährleistet sein, dass die Anregungsenergie optimal auf beide Reakti- onszentren verteilt wird. Wird PSII stärker angeregt als PSI, treten die Elektronen I Allgemeine Einleitung 2 Der Lichtsammelkomplex II 11 schneller in den Plastochinon-Kreislauf ein, als sie an PSI abgegeben werden. Dieser Elektronenrückstau birgt die Gefahr der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies wie beispielsweise Singulettsauerstoff. Dieser oxidiert bevorzugt die D1-Untereinheit des PSII, die Photosynthese-Leistung der Pflanze wird deutlich gesenkt (Takahashi & Mu- rata, 2008). Diese photooxidative Zerstörung wird durch die Abwanderung des LHCII von PSII zu PSI verhindert, wo er an die Untereinheiten H, L und I binden kann (Zhang et al., 2004). Dieser als „state transitions“ bezeichnete Vorgang ist reversibel und führt zu einer Verkleinerung der PSII-Antenne bei gleichzeitiger Vergrößerung der PSI- Antenne, et vice versa. Hierdurch wird die Anregungsenergie, den äußeren Faktoren entsprechend, optimal verteilt (Allen & Forsberg, 2001; in Bezug auf „state transitions“ spricht man von „state 1“, wenn LHCII mit PSII assoziiert ist, in „state 2“ ist LHCII mit PSI assoziiert). Die Regulation dieses Prozesses geschieht über den Anstieg des Plastohydrochinonspiegels und die damit einhergehende Aktivierung einer Kinase, welche LHCII in der N-terminalen Domäne phosphoryliert. Dieser Phosphorylierung folgen das Ablösen des LHCII und die Abwanderung zu PSI. Dieser Prozess geschieht im Zeitbereich von Sekunden bis Minuten und repräsentiert damit eine Kurzzeit- Anpassung des Photosynthese-Apparates (Kargul & Barber, 2008). Wechseln die Lichtbedingungen wieder, wird LHCII durch eine Phosphatase dephosphoryliert und wandert zurück zu PSII (Allen & Forsberg, 2001; Allen, 2003; Murata, 2009). Nilsson et al. (1997) konnten anhand LHCII-sequenzhomologer synthetischer Peptide nachwei- sen, dass der Phosphorylierung des N-Terminus eine Strukturänderung der Domäne des Modellpeptids folgt. Die dort detektierte Ausbildung einer kurzen Helix in Kombina- tion mit einer β-Schleife im Bereich der Proline 15 und 19 konnte für LHCII bislang nicht nachgewiesen werden. Zer et al. (1999) und Ohad et al. (2001) zeigten zumindest eine lichtinduzierte Änderung der Zugänglichkeit des N-Terminus für die Protease Trypsin. Während im intakten LHCII-Monomer lediglich die ersten Aminosäuren des N- Terminus verdaut werden (Verringerung des Molekulargewichts auf 24 kDa, was ca. 10 Aminosäuren entspricht; Paulsen et al., 1993), führt die Belichtung des LHCII zum Ab- bau der ersten 35 Aminosäuren der N-terminalen Domäne (Zer et al., 1999). Ob im Zuge der „state transitions“ eine Konformationsänderung des LHCII eintritt und ob die- se zur Dissoziation der trimeren Komplexe führt, ist bis heute nicht geklärt. Elektro- nenmikroskopische Einzelpartikel-Analyse nativer PSI-Präparationen unter „state 2“ Bedingungen durch Jensen et al. (2007) zeigten allerdings die Interaktion des trimeren LHCII mit PSI in Arabidopsis thaliana. 2.3.2 Die energieabhängige nicht-photochemische Löschung der Anregungs- energie (qE) durch LHCII Die Komponente des NPQ mit der schnellsten Energieabgabe wird als „qE“ („energy- dependent quenching“) bezeichnet. Sie ist reversibel und wird über den lumenalen pH- Wert gesteuert, die Dissipation der Anregungsenergie erfolgt in Form von Wärme (Ba- I Allgemeine Einleitung 12 2 Der Lichtsammelkomplex II roli & Niyogi, 2000). Übersteigt die Absorption der Sonnenenergie die Kapazitäten der Pflanze zur CO2-Fixierung, wird mehr Plastochinon am PSII reduziert, als am PSI ver- braucht werden kann. Mit diesem Elektronenrückstau gehen eine Ansäuerung des Thy- lakoidlumens sowie die Gefahr der Entstehung von Singulettsauerstoff einher, welcher bevorzugt die D1-Unterheit des PSII oxidiert. Wie zuvor für den Prozess der „state transitions“ (qT) geschildert, verhindert auch der energieabhängige Schutzmechanis- mus qE des NPQ die Entstehung dieser Situation, allerdings in einer deutlich schnelle- ren Relaxationskinetik (Müller et al., 2001). LHCII scheint dabei eine tragende Rolle zu spielen (Andersson et al., 2003), der genaue Mechanismus der schnellen nicht- photochemischen Löschung sowie die genaue Rolle des LHCII sind aber bisher unklar und werden kontrovers diskutiert. Nach Pascal et al. (2005) und Ruban et al. (2007) ist in Folge des qE eine Kon- formationsänderung des LHCII vorstellbar, die mit einer Konfigurationsänderung des Pigments Neoxanthin einhergeht. Dieser hypothetischen Annahme zufolge, resultiert die Strukturänderung in einer Orientierungs- oder Distanzänderung der Pigmente des Chl a-Clusters aus Chl1, Chl2 und Chl7, was in der Energieabgabe auf Lutein L2 und Wärmedissipation resultiert. Auch das lumenal gelegene Chl b- Pärchen Chl10 und Chl13, welches durch seine ausgesprochen enge „sandwich“- Anordnung sowie durch seine Nähe zu Neoxanthin auffällt, könnte in qE eine Rolle spielen. Sowohl eine Kon- formationsänderung im Neoxanthin (Pascal et al., 2005) als auch eine Strukturände- rung der lumenalen Schleife in Abhängigkeit des lumenalen pH-Wertes (Liu et. al, 2004; Yang et al., 2008) könnten die Distanz der Pigmente verändern und zu effektiver Wärmedissipation führen (Beddard & Porter, 1976). Liu et al. (2004) favorisieren die direkte Einbeziehung des LHCII in den soge- nannten Xanthophyllzyklus. Von dieser Schutzstrategie ist bekannt, dass sie durch den Abfall des lumenalen pH-Wertes unter Starklichtbedingungen aktiviert wird und zudem vollkommen reversibel ist. Hierbei wird eine lumenal lokalisierte Deepoxidase aktiviert, wodurch das Xanthophyll Violaxanthin über Antheraxanthin zu Zeaxanthin umgesetzt wird. Da Zeaxanthin mit 11 Doppelbindungen ein stärker delokalisiertes π- Elektronensystem als Violaxanthin besitzt, ist es in der Lage, die Anregungsenergie der benachbarten Chlorophylle direkt zu übernehmen und in Form von Wärme abzugeben (Jahns et al., 2009). Da bei entsprechendem Überschuss Zeaxanthin mit LHCII assozi- iert und wahrscheinlich in die Bindetasche des Violaxanthins bindet, vermuten Liu et al. (2004) den Austausch der Xanthophylle bei Lichtstress. Dieser Austausch soll gleich- zeitig mit einer allosterischen Konformationsänderung der lumenalen Schleife bzw. der Helix H5 einhergehen, ausgelöst durch die Ansäuerung des Lumens. Die Änderung der Strukturen bewirkt, dass die gebundenen Chl14 (lumenale Schleife) oder Chl8 (Helix H5) so positioniert werden, dass ein Energietransfer auf Xanthophyll stattfindet und Wärme dissipiert werden kann. I Allgemeine Einleitung 2 Der Lichtsammelkomplex II 13 Standfuss et al. (2005) präsentieren dagegen einen Löschmechanismus, der vollkommen ohne Konformationänderung des LHCII auskommt. Ihrer Hypothese zufol- ge besitzt das unter Starklicht-Bedingungen gebildete Zeaxanthin die höhere Affinität zu der Violaxanthin-Bindestelle des LHCII. Wird bei einer Absenkung des lumenalen pH-Wertes Zeaxanthin gebildet, wird dieses bevorzugt an LHCII gebunden, kann die Anregungsenergie der benachbarten Chlorophylle direkt übernehmen und in Form von Wärme abgeben. Auch eine direkte Interaktion des LHCII mit dem Membranprotein PsbS wird diskutiert (Barros & Kühlbrandt, 2009). Dieses nah verwandte Lhc-Protein ist ebenfalls in der Lage, Zeaxanthin zu binden, zudem ist die Sensitivität des Proteins für eine Änderung des pH-Wertes bekannt (Bergantino et al., 2003). Bei Abnahme des pH- Wertes dissoziiert der dimere PsbS-Komplex und interagiert in monomerer Form be- vorzugt mit minoren und majoren LHC-Komplexen (Teardo et al., 2007). Durch Wech- selwirkung mit dem in die Peripherie ragenden Neoxanthin des LHCII könnte so die überschüssige Anregungsenergie von LHCII auf PsbS übertragen und effektiv als Wärme abgegeben werden (Barros et al., 2009). 2.4 Vergleich der Kristallstrukturen des LHCII aus Spinat und Erbse Die dreidimensionale Struktur eines Proteins ist allgemein für dessen Funktion aus- schlaggebend. Daher gehen, wie zuvor erläutert, verschiedene Arbeitsgruppen von Strukturänderungen des LHCII in Abhängigkeit seiner physiologischen Funktionen aus. Dies beinhaltet verschiedene Hypothesen zur energieabhängigen nicht- photochemischen Löschung und ebenso zur Veränderungen der N-terminalen Domäne durch Phosphorylierung im Zuge der „state transitions“. Insbesondere Strukturände- rungen des membranständigen LHCII-Kernbereichs werden kontrovers diskutiert und konnten bisher nicht nachgewiesen werden. Der direkte Vergleich der beiden hochauf- gelösten Kristallmodelle von Liu et al. (2004) aus Spinat und von Standfuss et al. (2005) aus Erbse zeigt im Kernbereich des LHCII keinerlei signifikanten Strukturände- rungen. Dies betrifft sowohl die Anordnung des Peptidrückgrates als auch die Lage der Pigmente und das, obwohl beide Proteinproben aus wenig verwandten Arten stammen und andere Kristallformen besitzen, welche zusätzlich bei unterschiedlichen pH-Werten präpariert wurden (Barros et al., 2009). Sowohl die geringe „root mean square (rms) deviation“ zwischen den Atomen des Peptidrückgrates beider Präparationen (max. 0,4 Å), als auch der kristallographische Temperaturfaktor (B-Faktor), welcher Aufschluss über die interne Flexibilität eines Proteins gibt, sprechen für die Hypothese eines rigi- den LHCII-Kernbereichs. Andererseits zeigt der Vergleich beider Strukturen signifikan- te Unterschiede in der Distanz der Formylgruppe des Chl13 zum Tetrapyrrol des Chl10 im zuvor angesprochenen Chl b-Dimer Chl 10/13 (Pascal et al., 2005) sowie in der Position des membranexponierten Iononringes des Neoxanthin (Ruban et al., 2007). Außerdem besitzen verschiedene oberflächenexponierte Schleifenregionen wie N- terminale Domäne sowie stromale und lumenale Schleife lediglich moderate B- I Allgemeine Einleitung 14 3 EPR-Spektroskopie Faktoren, was für einen höheren Grad an Flexibilität spricht (Barros & Kühlbrandt, 2009). An diesem Punkt wird ein entscheidender Nachteil der Kristallographie deutlich. Flexible Strukturen innerhalb eines Proteins können nur detektiert werden, wenn zwei unterschiedlich funktionale, stationäre Zustände des Proteins als kristalline Probe er- zeugt und kristallographisch festgehalten werden können. Proteindynamik, etwa die Änderung der Struktur in Abhängigkeit äußerer Faktoren oder auch während der Fal- tung eines Proteins, kann dagegen nicht detektiert werden. Dies ist zwar mittels hoch- auflösender Kernspinresonanz (NMR)- Spektroskopie möglich, diese Methode scheitert aber oftmals an der Größe der zu untersuchenden Membranproteine. Eine alternative Methode hierzu stellt die eng verwandte EPR-Spektroskopie dar, die im Folgenden genauer vorgestellt werden soll. 3 EPR-Spektroskopie Die elektronenparamagnetische Resonanz (EPR), auch bekannt als Elektronenspin Resonanz (ESR), beschreibt den Prozess der resonanten Absorption von Mikrowellen- strahlung durch paramagnetische (ungepaarte) Elektronen in Anwesenheit eines äuße- ren Magnetfeldes. Diese Form der Absorptionsspektroskopie wurde 1944 von Zavoisky auf Grundlage der Radartechnik entwickelt und findet als spektroskopische Methode breite Anwendung in chemischen, physikalischen, medizinischen und biologischen Disziplinen zur Strukturaufklärung von Feststoffen oder Molekülen in Lösung sowie in der Aufklärung dynamischer Prozesse. Grundlage der EPR-Spektroskopie ist die Elekt- ron-Zeeman-Interaktion. Bringt man paramagnetische Elektronen mit einem Spin S (und eigenem permanenten magnetischen Moment) in ein externes Magnetfeld, so kommt es zur Aufspaltung der Energiezustände, die Spins richten sich parallel oder antiparallel aus. Diese Aufspaltung in zwei unterschiedlichen Energielevels wird als Elektron-Zeeman-Interaktion bezeichnet und ist proportional zur Stärke des äußeren Magnetfeldes B0 (Abb. 5). Die Energiedifferenz zwischen beiden Zuständen ist: ∆E = E(mS = +½) - E(mS = -½) = h * ν = ge * βe * B0 wobei ge = 2.0023 dem g-Faktor des freien Elektron entspricht (dimensionslos), βe = 9,27400899 *10-24 J/T dem Bohr’schen Magneton entspricht (Betrag des magnetischen Moments des Elektrons) und B0 dem äußeren Magnetfeld entspricht. I Allgemeine Einleitung 3 EPR-Spektroskopie 15 Abb. 5: Darstellung des Elektron-Zeeman-Effekts mit der Aufspaltung eines S= ½- Systems eines freien, ungepaarten Elektrons in einem externen Magnetfeld B0. Durch die Absorption von Mikrowellen der Frequenz ν, deren Energie exakt der Energielücke zwischen beiden Zuständen entspricht, erfolgt der Übergang des Spins vom parallelen (ms= - ½) zum antiparallelen Zustand (ms= + ½). Werden diese Elektronen mit elektromagnetischen Wellen einer Frequenz bestrahlt (Abb. 5), deren Energie exakt der Energielücke zwischen beiden Zuständen entspricht, so ist der Übergang des Spins vom parallelen zum antiparallelen Zustand möglich und die Resonanz-Bedingung ist erfüllt. Im Folgenden kann das angeregte Elektron durch Relaxation wieder in den energieärmeren, parallelen Zustand zurückfallen. Unterschie- den wird hierbei zwischen der Spin-Gitter-Relaxation („Τ1-Relaxation“ oder longitudina- le Relaxation), beispielsweise verursacht durch Librationsbewegung, und der Spin- Spin-Relaxation („Τ2-Relaxation“ oder transversale Relaxation), beispielsweise durch dipolare Wechselwirkung mit H2O oder durch die Interaktion mit anderen Elektro- nenspins. Beide Prozesse finden gleichzeitig statt, die Dauer wird durch die Dynamik der Umgebung definiert. Der Spin ist danach erneut anregbar, was in Abhängigkeit zur Dauer der Relaxation in einem entsprechenden Absorptionsverhalten resultiert. Im Allgemeinen liegt in EPR-Experimenten die Frequenz der elektromagneti- schen Strahlung im Mikrowellenbereich. Je nach eingestrahlter Mikrowellenfrequenz werden verschiedene Frequenzbereiche unterschieden, welche besonders häufig An- wendung finden und klassischerweise als „S-Band“ (2-4 GHz), „X-Band“ (8-12 GHz), „Q-Band“ (33-50 GHz) und „W-Band“ (80-110 GHz) bezeichnet werden. Hierbei gilt zu beachten, dass bei Anstieg der Frequenz die Stärke des Magnetfeldes zunehmen muss. Gleichzeitig wird hierbei die Empfindlichkeit des Systems erhöht, wodurch die erforderliche Spinkonzentration sinkt. Wie aus obiger Gleichung hervorgeht, kann die Resonanz-Bedingung sowohl durch Änderung der eingestrahlten Frequenz ν als auch durch Änderung des angeleg- I Allgemeine Einleitung 16 3 EPR-Spektroskopie ten Magnetfeldes B0 erfüllt werden, was man sich in verschiedenen EPR-Techniken zunutze macht. In der sogenannten „continuous wave“ (CW)- EPR werden Spinproben kontinuierlich mit Mikrowellen einer konstanten Frequenz bestrahlt, gleichzeitig wird das externe Magnetfeld linear verändert bis die Resonanzbedingung erfüllt ist. Dies hat den Vorteil eines recht einfachen experimentellen Aufbaus mit vergleichweise gerin- gem technischen und finanziellen Aufwand. Nachteilig ist, dass im CW-Experiment alle Wechselwirkungen, also Τ1- und Τ2-Relaxation, gleichzeitig beobachtet werden, wo- durch ermittelte Messdaten oftmals unübersichtlich werden. Im Gegensatz dazu wer- den in Puls-EPR-Experimenten bei konstantem externen Magnetfeld ein großer Be- reich der Resonanzfrequenzen durch einen kurzen Mikrowellen-Puls großer Bandbreite (mehrere GHz) angeregt. Dies hat den Vorteil, dass einzelne Wechselwirkungen der Spins gezielt angeschaut werden können, es kann also zwischen der Spin-Gitter- und der Spin-Spin-Relaxation unterschieden werden. Andererseits ist hier der experimen- telle Aufwand deutlich höher (Jeschke, 2006). Anwendung findet die EPR-Spektroskopie unter anderem in der Strukturaufklä- rung von Makromolekülen. Dies ist sowohl in Feststoffen als auch in Lösung möglich, was, wie in Kapitel (Kap.) III einleitend genauer erläutert werden soll, zahlreiche Vortei- le gegenüber anderen Methoden der Strukturaufklärung bringt. Grundlegende Voraus- setzung zur Durchführung von EPR-Experimenten ist das Vorhandensein ungepaarter Elektronen wie beispielsweise in freien Radikalen oder Übergangsmetallen. Diese Vor- aussetzung ist für den Großteil an Proteinen nicht gegeben, eine Ausnahme bilden beispielsweise Enzymkomplexe mit Übergangsmetallen im katalytischen Zentrum. Ab- hilfe des Problems schafft die Mitte der 70er Jahren erstmals vorgestellte Methode zur Markierung rekombinanter Proteine mit paramagnetischen Spinmarkern (Berliner, 1976; Altenbach et al., 1989). Durch die Entwicklung dieser sogenannten punktspezifi- schen Spinmarkierung („site-directed spin labeling“, SDSL) wurde dieser Nachteil durch die Möglichkeit einer selektiven Markierung ausgewählter Proteinbereiche zum Vorteil gewandelt. Durch eine schrittweise Vermessung eines komplexen Makromole- küls ergibt so letztendlich aus vielen Einzeldaten ein interpretierbares Gesamtbild. Die Weiterentwicklung von Mutagenese-Techniken in Kombination mit unterschiedlichen Markersystemen resultierte in effizienten Markierungsstrategien. Hierbei hat sich ins- besondere die kovalente Bindung von Maleimid- oder Iodacetamid-Gruppen tragenden Nitroxid-Markern an selektiv eingeführte Cysteine (Cys) bewährt. Diese Methode konn- te auch für den rekombinanten LHCII etabliert werden (Bender, 2004), verschiedene EPR-spektroskopische Versuchsreihen resultierten bereits in einer Vielzahl an Er- kenntnissen bezüglich der Struktur des LHCII in Lösung (Bender, 2004; Seimetz, 2004; Dockter, 2005; Jeschke et al., 2005; Hebel, 2007; Dietz, 2008; Müller, 2008). Wie zuvor erwähnt, lässt sich die EPR-Spektroskopie grundsätzlich in CW- und Puls-EPR differenzieren. Das Potential ersterer Methode liegt unter anderem in der Aufklärung lokaler Strukturen einzeln spinmarkierter Proteindomänen. Hier seien bei- I Allgemeine Einleitung 3 EPR-Spektroskopie 17 spielsweise Methoden zur Bestimmung der Lösungsmittelzugänglichkeit und der Mobi- lität ausgewählter Domänen von Membranproteinen zu nennen, welche anhand der Membranproteine Rhodopsin und Bacteriorhodopsin verifiziert werden konnten (Farah- bakhsh et al., 1993; Steinhoff et al., 1994). Auch Puls-EPR Experimente können Aus- kunft über die lokale Umgebung der Spinmarker geben. Hervorzuheben sei hier die „electron spin echo envelope modulation“ (ESEEM)- EPR, die es erlaubt den Abstand des Spinmarkers zu umliegenden Deuterium-Kernen im Umkreis von 3 bis 6 Å sehr genau vorherzusagen (Schweiger & Jeschke, 2001). Beide Methoden und ihre Anwen- dung zur lokalen Strukturbestimmung in Membranproteinen sollen in Kap. III genauer dargestellt werden. Mit Hilfe einer anderen Puls-EPR-Technik, der sogenannten „doub- le electron-electron resonance“ (DEER)- Spektroskopie (Pannier et al., 2000) lassen sich Abstände zwischen zwei Spinmarkern bestimmen. Die kovalente Einbringung zweier Spinmarker erlaubt die Messung von Abständen im Bereich von 1,5 bis 6 nm, unter idealen Bedingungen können sogar Distanzen von 8 nm detektiert werden (Jeschke & Polyhach, 2007). Diese leistungsstarke Methode ermöglicht Strukturbe- stimmung in unterschiedlich komplexen Materialien wie beispielsweise copolymeren Strukturen, Nanocompositen oder auch Membranproteinen (Jeschke et al., 2005; Jeschke & Polyhach, 2007; Mao et al., 2008; Altenbach et al., 2008). Voraussetzung ist jeweils die Einbringung von zwei ungepaarten Elektronen. Das Prinzip der Methode ist in Abb. 6 vereinfacht anhand eines doppelt spinmarkierten LHCII-Monomers (markiert an stromaler und lumenaler Schleife) illustriert. Abb. 6: Darstellung des Prinzips der DEER-EPR-Technik zur Messung der Distanz zwischen zwei Spinmarkern in LHCII (graues Peptidrückgrat; PDB-Eintrag 2BHW). Die ungepaarten Spins (rote Pfeile) der kovalent gebundenen PROXYL-Spinmarker (schwarz) richten sich im Magnetfeld parallel aus. Durch Anregung des Systems mit einem definierten Mikrowellenpuls (h ν) kommt es zur Umkehr eines Spins (rechte Teilabbildung, oberer roter Pfeil). Die Änderung der magnetischen Umgebung des Spins hat direkten Einfluss auf den zweiten Spin. Diese Di- pol-Dipol-Kopplung ist abhängig von der Distanz beider Spins zueinander, was die Ermittlung des Abstands möglich macht. Die Abbildung wurde mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). I Allgemeine Einleitung 18 4 Zielsetzung der Arbeit Innerhalb eines externen Magnetfeldes richten sich beide Spins (rote Pfeile) parallel aus (linke Bildhälfte). Die Anregung eines der beiden Spins mittels eines definierten Mikrowellenpulses (h ν) resultiert in dessen Spinumkehr, was eine Änderung der mag- netischen Umgebung des Spins beinhaltet. Dieses magnetische Feld hat direkten Ein- fluss auf den zweiten Spin, die Wechselwirkung zwischen den beiden magnetischen Dipolen (Dipol-Dipol-Kopplung) ist hierbei abhängig von der Entfernung der beiden Spins zueinander und resultiert in einem typischen Absorptionsverhalten. Auf diese Weise kann die Distanz zwischen beiden Spins durch Fourier-Transformation der Ori- ginaldaten mit anschließender Tikhonov-Regularisierung sehr genau bestimmt werden. Auf Membranproteine angewendet ermöglicht diese Methode in Kombination mit SDSL die Erstellung sehr genauer „Abstandskarten“ und damit die Vorhersage der Protein- struktur und die Bestimmung von Proteindynamik. DEER-Experimente durch Jeschke et al. (2005) lieferten bereits eine Vielzahl an Erkenntnissen bezüglich der Struktur des LHCII in Lösung und verifizierten die Strukturflexibilität des nicht kristallisierbaren Ab- schnitts der N-terminalen Domäne mit zwei unterschiedlichen Aufenthaltswahrschein- lichkeiten über und seitlich des Komplexkernes. Da diese EPR-Technik und ihre An- wendung zur Aufklärung der Struktur des LHCII in Lösung den Kern dieser Dissertati- onsschrift darstellen, soll an dieser Stelle auf die weiteren Kapitel und die dort zu fin- denden Einführungen in einzelne Experimente verwiesen werden. Eine detaillierte Dar- stellung der DEER-Technik ist darüber hinaus der Publikation Jeschke & Polyhach (2007) zu entnehmen. 4 Zielsetzung der Arbeit Die Hauptziele, die in diesem Projekt verfolgt wurden, waren zum einen die Entwick- lung von EPR-messtechnischen Methoden zur Charakterisierung von Strukturen und Strukturveränderungen in Membranproteinen. Die Verifizierung der Techniken sollte in Versuchsreihen mit spinmarkiertem LHCII erfolgen und mit den bekannten Daten der hochaufgelösten Kristallstruktur verglichen werden. Zum anderen sollten es die verifi- zierten EPR-Techniken ermöglichen, die Struktur des monomeren und trimeren LHCII in Lösung zu studieren, kristallographisch nicht erfasste und potentiell flexible Domä- nen des LHCII zu erforschen sowie den Ablauf der Proteinfaltung während der sponta- nen LHCII-Selbstorganisation in vitro zu charakterisieren. Um eine angemessene Anzahl an spinmarkierten LHCII-Proben effizient her- stellen zu können, sollte in einem ersten Schritt die Methode der punktspezifischen Spinmarkierung des rekombinanten LHCII verbessert werden. Ziel war es eine moder- ne Methode der punktspezifischen Mutagenese mit etablierten Methoden der Gruppe (Bender, 2004) zu vergleichen und auf ihren Nutzen zur effizienten Herstellung von Cys-Einzel- und Doppelmutanten des LHCII zu testen. Weiterhin war von Interesse zu I Allgemeine Einleitung 4 Zielsetzung der Arbeit 19 testen, ob einer Markierung des LHCII mit dem Spinmarker TEMPO (Bender, 2004) nicht die Markierung mit dem chemisch stabileren Spinmarker PROXYL vorzuziehen ist (Kapitel I). In einem zweiten Schritt sollten die Probleme der biochemischen Präparation heterogen spinmarkierter Trimere des LHCII (Seimetz, 2004; Dockter, 2005) erneut aufgegriffen und detailliert untersucht werden. Hierfür waren insbesondere Experimen- te zur grundsätzlichen Verbesserung der Immobilisierung trimerer Komplexe des LHCII mittels des C-terminalen „His6 tag“ auf unterschiedlichen Ni2+-Affinitätssäulen unum- gänglich, aber auch der Versuch der Etablierung einer alternativer Präparationstechnik mittels schrittweiser Immobilisierung über unterschiedliche Bindemotive war von Inte- resse (Kapitel II). Spinmarkierte Proben des LHCII in Detergenzlösung sollten letztlich mit ver- schiedenen EPR-Monitoren spektroskopisch analysiert werden. Hierbei stand zum ei- nen die Etablierung verschiedener Puls-EPR-Methoden zur Detektion lokaler Struktu- ren in Membranproteinen im Vordergrund. Durch Vergleich solcher gepulsten Messun- gen mit etablierten CW-EPR-Techniken an kristallographisch aufgelösten Domänen des LHCII sollten die neuen Methoden zunächst verifiziert werden, um dann im folgen- den Schritt die kristallographisch nicht erfasste N-terminale Domäne sowie die Protein- dynamik des LHCII während der Assemblierung studieren zu können. Zum anderen sollte, dem gleichen Schema folgend, der kristallographisch erfasste Kernbereich des LHCII mittels DEER-EPR durch Erstellung einer „Abstandskarte“ für LHCII in Lösung bestätigt werden. Hierauf aufbauende Messungen der Diplomanden A. Müller und C. Dietz sollten sich vor allem auf die Strukturaufklärung der N-terminalen Domäne in mo- nomerem und trimerem LHCII sowie auf der Untersuchung der Konformation der lume- nalen Schleife des LHCII konzentrieren. In einem finalen Experiment war schließlich geplant, die Faltung des LHCII in vitro durch Detektion der zeitaufgelösten Änderung von Abständen zwischen selektiv markierten Domänen mittels DEER-EPR zu verfolgen und mit zeitaufgelösten Experimenten zur Pigment-Bindung zu vergleichen (Kapitel III). In einem Nebenexperiment sollte zudem getestet werden, ob es möglich ist native LHCII-Trimere nach Standard-Methode in artifizielle Blockcopolymer-Vesikel zu inserieren und ob sich dies positiv auf die Stabilität der Protein-Pigment-Komplexe auswirkt (Kapitel IV). I Allgemeine Einleitung 20 4 Zielsetzung der Arbeit II Kapitel Kapitel I S. 23 Herstellung und Charakterisierung von Cys-Mutanten des rekombinanten LHCII sowie Optimierung der Spinmarkierung mit Nitroxid-Markern. Kapitel II S. 95 Immobilisierung des rekombinanten LHCII mittels Affinitätschromatographie: Bindungsverhalten sowie Experimente zur Herstellung heterogener LHCII- Trimere. Kapitel III S. 147 EPR-spektroskopische Untersuchung der Struktur des LHCII in Lösung. Kapitel IV S. 259 Experimente zur Insertion nativer LHCII-Trimere in artifizielle Vesikel aus Diblockcopolymeren. 22 Kapitel I Herstellung und Charakterisierung von Cys-Mutanten des rekombinanten LHCII sowie Optimierung der Spin- markierung mit Nitroxid-Markern. 1 Einleitung Eine grundlegende Voraussetzung zur Vermessung des LHCII mittels EPR- Spektroskopie ist die Einführung ungepaarter Elektronen. Eine bewährte Möglichkeit ist die kovalente Bindung von paramagnetischen Nitroxid-Markern an die Aminosäure Cys, welche zuvor molekularbiologisch an die gewünschte Position eingefügt wurde (SDSL; Altenbach et al., 1989). Die punktspezifische Mutagenese des Lhcb1-Gens ist seit Anfang der 90er Jahre etabliert (Paulsen & Kuttkat, 1993). Die damals verwendete Technik nach Kunkel et al. (1987) wurde 2001 in der Arbeit von C. Huschenbett durch die effektivere Methode nach Chen & Przybyla (1994) ersetzt und resultierte in mehre- ren Cys-Einzelmutanten des rekombinanten LHCII. Nach gleicher Methode, sowie durch Neukombination vorhandener Mutanten mittels Restriktion und Ligation, wurden durch Bender (2004) weitere Cys-Mutanten des LHCII produziert. Aufbauend auf einem Markierungsprotokoll für Iodacetamidgruppen-tragende Marker (Huschenbett, 2001), konnten diese Cys-Mutanten mit dem Nitroxid TEMPO punktspezifisch spinmarkiert werden (Bender, 2004). EPR-spektroskopische Untersu- chungen des TEMPO-markierten LHCII resultierten in zahlreichen Erkenntnissen be- züglich der Struktur des LHCII in Lösung (Bender, 2004; Seimetz, 2004; Dockter, 2005; Jeschke et al., 2005). Versuche zur Stabilität des Pyridin-Derivats TEMPO zeigten aber, dass dieser Spinmarker durch Reduktionsmittel wie Tris-(2- carboxyethyl)phosphin, 1,4-Dithiotreitol (DTT) oder β-Mercaptoethanol (β-Me) leicht zum diamagnetischen Hydroxylamin reduziert werden kann (Burmeister Getz et al., 1999). Die Folge war oftmals eine Verringerung des EPR-Signals in spinmarkierten LHCII-Proben (Dockter, 2005). Ziele dieses Projektes waren neben der Weiterentwicklung von EPR- messtechnischen Methoden die Aufklärung der LHCII-Struktur in Lösung mittels unter- schiedlicher EPR-Monitore. In Anbetracht der großen Anzahl der hierfür benötigten spinmarkierten LHCII-Mutanten, war es von Interesse die etablierte Technik zur punkt- spezifischen Spinmarkierung des LHCII auf ihre Effizienz zu prüfen. Daher sollte zum einen eine moderne Mutagenese-Methode mit der etablierten Technik von Chen & Przybyla (1994) verglichen werden und zum anderen die Markierung des LHCII mit dem chemisch stabileren Spinmarker PROXYL (Kroll, 1999) getestet und auf Vorteile gegenüber einer Markierung mit TEMPO untersucht werden. Kapitel I 24 2 Material und Methode 2 Material und Methode Die im folgenden Abschnitt beschriebenen Materialen und Methoden sind als allgemein zu betrachten und auf die gesamte Dissertation anwendbar. Zur Wahrung der Über- sichtlichkeit sind spezifische Versuchsbeschreibungen in den entsprechenden Kapiteln aufgeführt. 2.1 Geräte Absorptions-Spektrometer UV-2101 PC Shimadzu Corporation, Japan V-550 Jasco Labor- und Datentechnik GmbH, Groß-Umstadt Mikrotiterplattenphotometer Molecular Devices, USA „SPEKTRA-Max-PLUS” Eppendorf Biophotometer Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf Autoklav Varioklav Typ 500 H+P Labortechnik GmbH, München CD-Spektropolarimeter J-810-S Jasco Labor- und Datentechnik Pelletier-Element: Modell CDF-426S/426L GmbH, Groß-Umstadt Software: Spectra Manager, Version 1.6 Drehrad Kulturenrad Typ Rotator Bachofer GmbH, Reutlingen EPR-Spektroskopie Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten Spektrometer: Elexsys EX 580 (Mainz/Zürich) Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten Resonator (Zürich): dielektrischer Puls-ENDOR-Resonator Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten (EN4118X-MD-4) Resonator (Mainz): Flexline split-ring Resonator Molecular Specialties, USA (ER4118X_MS3) Kapitel I 2 Material und Methode 25 Temperierung: Oxford Instruments, UK Oxford CF935 Cryostat Oxford ITC4 temperature controller Software: DeerAnalysis2006: www.mpip-mainz.mpg.de/~jeschke/distance.html Fluoreszenz-Spektrometer Fluoromax-2 ISA SPEX/ Jobin Yvon, Grasbrunn Kühlung: Ministat Compatible Control Huber Kältemaschinenbau Software: Datamax Software Version 2.24 Gelelektrophorese Gelgießsystem Midget-Systems, Pharmacia LKB, Schweden Spannungsquelle Bio-Rad Power-Pac 3000, USA Kühlung: Haake G, Haake D1, Modell Fisons Firma Haake Messtechnik GmbH, Karlsruhe Geltrockner: 2003 Slab Gel Dryer LKB Bromma Geldokumentation VersaDoc™ Imaging System 3000 (Versa Doc) Bio-Rad, München Software: Quantity One HPLC, analytisch Jasco Labor- und Datentechnik GmbH, Groß-Umstadt Gradientenmischer: LG-1580-04 Quaternay Gradient Unit Pumpe: Pu-1580 Intelligent Pump Detektor: Diode Array Detector MD-1515 Säule: Chromolith SpeedROD RP-18e Software: Jasco-PDA, BROWIN, Version 1.5 Inkubationsschüttler Certomat H/B, Braun Biotech International, Melsungen Kamera Canon Powershot A710IS Canon Deutschland GmbH, Krefeld Magnetrührer Heidolph MR 3001 K8 Heidolph Elektro, Kelheim IKAMAG KMO2 basic IKA, Labortechnik Staufen Kapitel I 26 2 Material und Methode Mixer Heavy Duty Blendor Blender Waring, USA PCR-Cycler Primus 25 Legal PCR System Modell 5524 MWG-Biotech, Ebersberg Whatman Biometra T Gradient Biometra, Göttingen pH-Meter INOLab pH Level 2 WTW GmbH, Weilheim Reinstwasseranlage Optilab-Standard MembraPure, Lörzweiler Rotationsverdampfer Heidolph VV 2000 Heidolph Elektro, Kelheim Scanner Epson Perfection V700Photo Epson Deutschland GmbH, Meerbusch Sterilbank Laminar Flow SLEE Semiconductor Technik GmbH, Mainz Ultraschallbad SONOREX Super Bandelin, Berlin Vortexer IKA MS2 Minishaker IKA, Labortechnik Staufen Waagen BP 2100S Sartorius AG, Göttingen AnalytiK A200S Sartorius AG, Göttingen Wärmeschrank Memmert Memmert, Schwalbach Wasserkocher HB4 basic IKA, Labortechnik Staufen Wasserbad Thermomix MM H/B, Braun Biotech International, Melsungen Kapitel I 2 Material und Methode 27 Zellaufschluss-Presse French Pressure Cell Press SLM Aminco, SLM Instruments, Inc. Zentrifugen Beckmann: Beckmann Instruments, München Optima XL-100K (Rotoren SW 40Ti, SW 41Ti, SW 60Ti, SW61Ti) Optima XL-90K (Rotoren SW 40Ti, SW 41Ti, SW 60Ti, SW61Ti) Optima XL-80K (Rotoren SW 40Ti, SW 41Ti, SW 60Ti, SW61Ti) Avanti J-26XP J2HS (Rotoren JLA-10500, JA-20) Hettich: Hettich Zentrifugen, Tuttlingen Mikro 22 (Rotor 1195-L) Mikro 22R (Rotor 1195) Rotina 38R (Rotoren 1792 und 1789-L) Mikroliter 2020 2.2 Chemikalien 2.2.1 Lösungsmittel Die in dieser Arbeit verwendeten Lösungsmittel stammen von den Firmen Merck (Darmstadt), Riedel de Häen (Hannover) und Carl Roth (Karlsruhe). Aceton wurde einmal bei Normaldruck destilliert, um die Reinheit zu erhöhen. Benutztes Aceton wur- de zum Teil rezyklisiert und nach zweimaliger Destillation erneut eingesetzt. Diethy- lether wurde unter Zugabe von KOH zwei Stunden unter Rückfluss zur Beseitigung von Peroxiden aufgekocht und anschließend destilliert. 2.2.2 Gase Stickstoff 5.0 wurde von der Firma AirLiquide (Düsseldorf) bezogen und sowohl zum Eintrocknen von Pigmenten als auch zum Umspülen der Detektoren des CD- Spektrometers verwendet. 2.2.3 Weitere Chemikalien Alle anderen Chemikalien wurden bei folgenden Herstellern in p.A. Qualität bezogen: Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Alfa Aesar, USA Avanti Polar-Lipids, USA Biomol, Hamburg Bio-Rad, USA Boehringer, Mannheim Macherey-Nagel, Düren Kapitel I 28 2 Material und Methode MobiTec, Göttingen New England BioLabs Inc., Schwalbach PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Serva, Heidelberg Sigma-Aldrich, Deisenhofen 2.3 Längenstandards 2.3.1 DNA-Längenstandards Als DNA-Längenstandards wurden 100 Basenpaar (bp)- und 1 Kilo-Basenpaar (kb)- DNA-Leitern von New England Biolabs (NEB, Bad Schwalbach) und die 1 kb- DNA- Leiter von Fermentas verwendet, welche in Abb. 1.2.1 mit Größenangaben abgebildet sind. Die angegebenen DNA-Massen beziehen sich jeweils auf eine aufgetragene DNA-Masse von 0,5 µg. Abb. 1.2.1: DNA-Längenstandards von NEB und Fermentas. 2.3.2 Protein-Längenstandards SDS7-Marker wurde von Sigma-Aldrich (Deisenhofen) bezogen und vor Gebrauch 2 min bei 100 °C denaturiert. Die Zusammensetzung des Proteinmix ist in Tab. 1.2.1 mit Angabe der molekularen Proteinmasse dargestellt. Kapitel I 2 Material und Methode 29 Tab. 1.2.1: Proteinmix in SDS7-Marker mit Angabe der molekularen Proteinmasse. Molekulare Masse Protein 67,0 kDa (Kilo-Dalton) Albumin, Rind 45,0 kDa Albumin, Ei 36,0 kDa Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Kaninchen 29,0 kDa Carboanhydrase, Rind 24,0 kDa Trypsinogen, Rind Pankreas 20,1 kDa Trypsin-Inhibitor, Soja-Bohne 14,2 kDa α-Lactalbumin, Rind Milch 2.4 Marker 2.4.1 EPR-Spinmarker A) 4-(2-Iodacetamido)-TEMPO, free radical 4-(2-Iodoacetamido)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy, free radical TEMPO-IA Beschreibung: Quelle: Aldrich Formel: C11H20IN2O2 Molekulargewicht: 339,19 g/mol Löslich in: Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), Wasser, Ethanol lichtempfindlich Abb. 1.2.2: Strukturformel von TEMPO-IA Kapitel I 30 2 Material und Methode B) 3-(2-Iodoacetamido)-PROXYL, free radical 3-(2-Iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, free radical PROXYL-IA Beschreibung: Quelle: Aldrich Formel: C10H18IN2O2 Molekulargewicht: 325,17 g/mol Löslich in: DMSO, DMF, Wasser, Ethanol lichtempfindlich Abb. 1.2.3: Strukturformel von PROXYL-IA 2.4.2 Fluoreszenzmarker A) BODIPY® 507/545 IA [N-(4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3,4-diaza-s-indacene-2-yl)- iodoacetamide] BODIPY-IA Beschreibung: Quelle: Invitrogen Formel: C15H17BF2IN3O Molekulargewicht: 431,03 g/mol max. Absorption (Methanol): 508 nm max. Emission (Methanol): 543 nm mol. Extinktionskoeffizient: 69000 [cm-1 x M-1] lichtempfindlich Kapitel I 2 Material und Methode 31 Abb. 1.2.4: Strukturformel von BODIPY-IA B) DY731-Maleimide DY731-Mal DY731 Beschreibung: Quelle: DYOMICS (USA) Formel: C44H53N4O10S2Na Molekulargewicht: 885,04 g/mol max. Absorption (Ethanol): 736 nm max. Emission (Ethanol): 759 nm molarer Extinktionskoeffizient: 225000 [cm-1 x M-1] Löslich in: Wasser, Methanol, DMF, DMSO lichtempfindlich Abb. 1.2.5: Strukturformel von DY731-Mal Kapitel I 32 2 Material und Methode 2.5 Bakterienstämme 2.5.1 JM101 Chemokompetente Bakterienzellen des E. coli- Expressionsstammes JM101 wurden von NEB (Bad Schwalbach) bezogen. Die Herstellung chemisch kompetenter Zellen und der Test der Transformationseffizienz erfolgten nach Standard-Protokoll wie be- schrieben in Müller (2008). 2.5.2 XL1-Blue Superkompetente Bakterienzellen des E. coli- Stammes XL1-Blue wurden von der Fir- ma Stratagene (La Jolla, USA) bezogen. Es wurden chemokompetente Zellen verwen- det, die Bestandteil des „Quikchange® II site-directed mutagenesis kit“ (Stratagene) waren. Die Zellen wurden bei -80 °C gelagert und waren nach Auftauen auf Eis gebrauchsfertig. 2.6 Molekularbiologische Methoden zur Herstellung neuer Lhcb1- Klone 2.6.1 Klonierungsstrategien und Beschreibung hergestellter Mutanten In der vorliegenden Dissertation, sowie in den Diplomarbeiten Hebel (2007), Plunger (2007), Dietz (2008) und Müller (2008), wurden eine Vielzahl neuer Klone des Lhcb1 hergestellt, welche in Tab. 1.2.2 zusammengefasst sind. Zur Herstellung wurden ver- schiedene Mutagenese-Strategien angewendet, insbesondere die punktspezifische Mutagenese (PSM) mittels „Quikchange® II site-directed mutagenesis kit“ der Firma Stratagene (2.6.10.1). Hierbei wurde vorzugsweise die Aminosäuren Serin (Ser) oder Valin (Val) gegen Cys ausgetauscht. Umgekehrt wurde durch Müller (2008) die Mutan- te C79Sh durch Austausch des nativen Cys 79 gegen Ser produziert. Dieser Cys-freie Klon diente als Matrize zur Herstellung von Cys-Einzel- und Cys-Doppelmutanten des LHCII mit C-terminalem „His6 tag“ (Hexahistidyl-Rest). Zuvor entstanden Klone mit C- terminalem „His6 tag“ [S59Ch (Kap. I), V196Ch (Hebel, 2007)] bzw. Klone mit N- terminalem „Strep tag II®“ (kurz „Strep tag“) sowie C-terminalem „His6 tag“ (stC79Sh, st106/160h; Kap. II) durch Restriktion und Ligation (R+L; 2.6.10.2) bereits vorhandener Klone. Als dritte Mutagenese-Methode wurde die Insertions-PCR mit phosphorylierten Überhangprimern (I-PCR, 2.6.10.3) zur Herstellung eines Klons mit C-terminalem „His12 tag“ [S3Chh (Plunger)] gewählt. Die Benennung der Klone ist folgendermaßen zu verstehen. In Mutante S59C wurde das Ser an Position 59 durch Cys ersetzt, im entsprechenden Ausgangsklon C79S war das einzige native Cys an Position 79 bereits durch Ser ersetzt worden (Hu- schenbett, 2001). Somit sitzt das einzig vorhandene Cys des Klons S59C an Position 59. Die Cys-Doppelmutante S59C/V90C entspricht S59C und besitzt zusätzlich an Po- Kapitel I 2 Material und Methode 33 sition 90 ein zweites Cys (im Austausch gegen Val). Die Mutante S59Ch entspricht ebenfalls der Mutante S59C, trägt aber zusätzlich einen C-terminalen „His6 tag“. Die doppelt affinitätsmarkierten Klone stC79Sh und st106/160h tragen neben dem C- terminalen „His6 tag“ noch einen N-terminalen „Strep tag“ (Kap. II). Alle von Müller (2008) hergestellten „P“-Klone besitzen den Aminosäurenaustausch Threonin (Thr) 5 zu Glutaminsäure (Glu). Tab. 1.2.2: Übersicht aller während der Dissertation hergestellten Lhcb1-Klone (auch der Dip- lomanden Hebel, 2007; Plunger, 2007; Dietz, 2008; Müller, 2008) mit Angabe des Herstellers, einer Kurzbeschreibung des Klons und der Mutagenese-Strategie mit Ausgangsklon. PSM steht für punktspezifische Mutagenese, R+L für Restriktion und Ligation, I-PCR für Insertions-PCR, S für Serin, V für Valin, C für Cystein, T für Threonin, A für Alanin, K für Lysin, F für Phenylalanin, E für Glutaminsäure, P für Phosphorylierungs-Imitation, h und hc sowie h6 für C-terminalen „His6 tag“, hh für C-terminalen „His12 tag“, Strep und S2 für N-terminalen „Strep tag“, Be für Bender, Die für Dietz, Dil für Dilly-Hartwig, Doc für Dockter, Hu für Huschenbett, Ko für Kose- mund, La für Lauterbach und Mü für Müller. Zahlen bezeichnen Aminosäurepositionen im Apoprotein. Ausnahme bilden die von Kosemund (1999) bzw. Dilly-Hartwig (1995) hergestellten Klone C3.2h und D7f.3, hier beziehen sich Buchstaben und Zahlen der Klone auf Herstellerna- men und Klonierungsschritte. Strategie, Ausgangsklon Hersteller Klon Beschreibung (Hersteller) Dockter S59C S59C, C79S PSM, C79S (Hu) S59Ch S59C, C79S, h6 R+L, S59C (Doc), C3.2h (Ko) V90C C79S, V90C PSM, C79S (Hu) S123C C79S, S123C PSM, C79S (Hu) V196C C79S, V196C PSM, C79S (Hu) S59C/V90C S59C, C79S, V90C PSM, V90C (Doc) V90C/S123C C79S, V90C, S123C PSM, V90C (Doc) V90C/V196C C79S, V90C, V196C PSM, V90C (Doc) S123C/V196C C79S, S123C, V196C PSM, V196C (Doc) stC79Sh Strep, C79S, h6 R+L, D7f.3-S2 (La),C79Sh (Mü) st106/160h Strep, C79S, S106C, S160C, h6 R+L, D7f.3-S2 (La), S106/160Ch (Be) Plunger S3Chh S3C, C79S, h12 I-PCR, S3Ch (Hu) Hebel V196Ch C79S, V196C, h6 R+L, S3Ch (Hu), V196C (Doc) Müller C79Sh C79S, h6 PSM, C3.2h (Ko) P3 S3C, T5E, C79S, h6 PSM, S3Ch (Hu) P14 T5E, S14C, C79S, h6 PSM, S14Ch (Mü) P29 T5E, S29C, C79S, h6 PSM, S29Ch (Mü) P3/14 S3C, T5E, S14C, C79S, h6 PSM, S3C/S14Ch (Mü) P3/29 S3C, T5E, S29C, C79S, h6 PSM, S3C/S29Ch (Mü) P3/59 S3C, T5E, S59C, C79S, h6 PSM, S3C/S59Ch (Mü) P14/29 T5E, S14C, S29C, C79S, h6 PSM, S14C/S29Ch (Mü) P29/59 T5E, S29S, S59C, C79S, h6 PSM, S29C/S59Ch (Mü) A4Ch A4C, C79S, h6 PSM, C79Sh (Mü) K7Ch K7C, C79S, h6 PSM, C79Sh (Mü) V9Ch V9C, C79S, h6 PSM, C79Sh (Mü) Kapitel I 34 2 Material und Methode A10Ch A10C, C79S, h6 PSM, C79Sh (Mü) S11Ch S11C, C79C, h6 PSM, C79Sh (Mü) S12Ch S12C, C79S, h6 PSM, C79Sh (Mü) S14Ch S14C, C79S, h6 PSM, C79Sh (Mü) V22Ch V22C, C79S, h6 PSM, C79Sh (Mü) S29Ch S29C, C79C, h6 PSM, C79Sh (Mü) S34Ch S34C, C79S, h6 PSM, C79Sh (Mü) F40Ch F40C, C79S, h6 PSM, C79Sh (Mü) A49Ch A49C, C79S, h6 PSM, C79Sh (Mü) S3C/S14Ch S3C, S14C, C79S, h6 PSM, S3Ch (Hu) S3C/S29Ch S3C, S29C, C79S, h6 PSM, S3Ch (Hu) S3C/S59Ch S3C, S59C, C79S, h6 PSM, S3Ch (Hu) S14C/S29Ch S14C, S29C, C79S, h6 PSM, S29Ch (Mü) S29C/S59Ch S29C, S59C, C79S, h6 PSM, S59Ch (Doc) Dietz V90Ch C79S, V90C, h6 PSM, C79Sh (Mü) S106Chc C79S, S106C, h6 PSM, C79Sh (Mü) S123Ch C79S, S123C, h6 PSM, C79Sh (Mü) V90C/S106Ch C79S, V90C, S106C, h6 PSM, V90Ch (Die) V90C/S123Ch C79S, V90C, S123C, h6 PSM, S123Ch (Die) 2.6.2 Ausgangsklone und pDS12-Vektor Die zur Herstellung neuer Lhcb1-Klone verwendeten Ausgangsklone sind jeweils in Tab. 1.2.2 aufgelistet. Allen Ausgangs- und neu produzierten Klonen ist gemein, dass sie Abkömmlinge des maturen Lhcb1-Gens (lhcb1*2, AB80; Cashmore, 1984) aus Erb- se (Pisum sativum) sind und in die multiple Klonierungsstelle des Expressionsvektors pDS12-RBSII (Bujard et al., 1987) inseriert vorliegen. Die Größe des Konstrukts pDS12-RBS II und Lhcb1 beträgt 4241 Nukleotide (Nt), das Plasmid ist in Abb. 1.2.6 dargestellt und beschrieben. Abb. 1.2.6: Schematische Darstellung des Expres- sionsvektors pDS12-RBSII. Col E1 origin bezeich- net den Replikationsursprung, Ampr das β- Lactamase-Gen für die Ampicillinresistenz, Lac I das Lac-Repressor-Gen, P den T5-Promotor P N25 , O den E. coli- Lac-Operator, RBS die Ribosomen- Bindestelle, MCS die „multiple cloning site“ (multip- le Klonierungsstelle), t0 und t1 die Terminatoren und cat das Gen für Chloramphenicol- Acetyltransferase für Chloramphenicol-Resistenz. Abbildung verändert nach Heinemann (1999). Kapitel I 2 Material und Methode 35 2.6.3 Plasmid-Isolierung und DNA-Quantifizierung Im Zuge der Herstellung verschiedener Lhcb1-Klone wurden zunächst Plasmid- Isolierungen der entsprechenden Ausgangsklone (Tab. 1.2.2) durchgeführt. Hierzu wurden Bakterienzellen des Stammes E. coli JM101 aus -80 °C- Dauerkulturen über Nacht auf Luria-Bertani (LB)-Ampicillin (Amp)-Platten (16 h, 37 °C) vereinzelt, eine ein- zelne Kolonie gepickt und über Nacht in 15 ml Amp-haltigem (100 mg/l) LB- Flüssigmedium angezogen. Die gewünschte Plasmid-DNA wurde aus der Kultur mit Hilfe des „peqGOLD plasmid miniprep kit I“ (PEQLAB Biotechnologie, Erlangen) nach Anweisung des Herstellers auf Silica-Säulen gebunden, mehrmals gewaschen und mit 70 µl warmem (50 °C), sterilem Aqua dest. in zwei Durchgängen (je 50 und 20 µl) elu- iert. Die Quantifizierung der gelösten Plasmid-DNA erfolgte auf einem analytischen Agarose-Gel (2.6.6.1) oder photometrisch durch Messung der UV-Absorption der aro- matischen Ringe der Nukleobasen bei 260 nm im Biophotometer. Zur Abschätzung der Reinheit der DNA-Lösung, bezogen auf RNA- und Protein-Kontamination, wurden zu- dem die Absorptionsmaxima bei 280 nm sowie, als Referenzwert, die Absorption bei 320 nm bestimmt. Die Konzentration der DNA-Lösung wurde wie folgt errechnet: c (DNA) [ng/µl] = (E260 – E320) x 50 ng/µl Über den erhaltenen Quotienten E260/E280 wurde die Reinheit der Nukleinsäure-Lösung abgeschätzt. Eine reine DNA-Lösung besitzt einen Wert von 1,8 , eine reine RNA- Lösung einen Wert von 2,0. Bei einer Verunreinigung der Lösung mit Proteinen liegt der Wert deutlich niedriger. Material: LB-Amp Platten: 1 % Trypton 0,5 % Hefeextrakt 1 % NaCl (pH 7,5) 1,5 % Agar 100 µg/ml Amp LB-Flüssigmedium: 1 % Trypton 0,5 % Hefeextrakt 1 % NaCl (pH 7,5) 100 µg/ml Amp „peqGOLD plasmid miniprep kit I“ (PEQLAB Biotechnologie, Erlangen) steriles Aqua dest. Kapitel I 36 2 Material und Methode 2.6.4 Polymerase-Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion („polymerase chain reaction“, PCR) wurde 1987 von Mullis & Faloona zur Amplifikation von DNA in vitro entwickelt. Nach Hitze- Denaturierung des zu vervielfältigen Doppelstranges bei 95 °C erfolgt im zweiten Schritt das Anlagern der DNA-Primer („Annealing“) bei Temperaturen zwischen 50 und 70 °C, abhängig der entsprechenden Primer-Schmelztemperatur und der gewünschten Stringenz. Im dritten Schritt, der sogenannten Elongation, synthetisieren spezielle DNA-Polymerasen meist bei 72 °C ausgehend von den Primern in 5’-3’- Richtung ei- nen neuen DNA-Einzelstrang, welcher komplementär zur Matrize ist. So entstehen aus einem Matrizen-Doppelstrang zwei neue Doppelstränge, aus jeweils einem Matrizen- und einen neu synthetisierten Strang. Die Verwendung thermostabiler DNA- Polymerasen erlaubt die Wiederholung dieses Zyklus ohne eine Beeinträchtigung der Enzyme durch Denaturierung. In 16-35 Zyklen wird die Matrizen-DNA innerhalb kurzer Zeit und unter geringem Aufwand exponentiell vervielfältigt und kann, meist nach Auf- reinigung, weiterverwendet werden. Neben der Mutagenese-PCR zur Herstellung neu- er Mutanten wurden zur Charakterisierung der Klone eine „dirty“-PCR oder eine Se- quenzier-PCR durchgeführt. 2.6.4.1 Durchführung der PCR 2.6.4.1.1 Mutagenese-PCR mittels „Quikchange® II site-directed mutagenesis kit“ In der Mutagenese-PCR dienten die aus E. coli JM101 Zellen isolierten pDS12-RBSII- Vektoren verschiedener Lhcb1-Klone als Matrize. Die PCR wurde nach Angaben des Herstellers Stratagene durchgeführt, die in Tab. 1.2.3 aufgelisteten Materialen wurden auf Eis gemischt. Tab. 1.2.3: Ansatz zur Durchführung der Mutagenese-PCR nach Stratagene. Material Menge/Konz. Reaktions-Puffer 1x Plasmid 50 ng Mutagenese-Primer sense 125 ng Mutagenese-Primer antisense 125 ng Pfu Ultra HF DNA Polymerase 2,5 U dNTP-Mix Stratagene 1 µl dH2O steril ad 50 µl Die Mutagenese-PCR wurde wie in Tab. 1.2.4 beschrieben durchgeführt. Kapitel I 2 Material und Methode 37 Tab. 1.2.4: PCR-Programm zur Durchführung der Mutagenese-PCR nach Stratagene. Zyklen Temperatur Dauer Beschreibung - 110 °C - Deckel vorheizen 1x 95 °C 30 s Aktivierung 95 °C 30 s Denaturierung 16x 55 °C 1 min Annealing 68 °C 5 min Amplifikation - 4 °C ∞ DNA-Lagerung Material: Plasmid-DNA pDS12-RBSII mit Lhcb1 “Quikchange® II site-directed mutagenesis kit” (Stratagene) 2.6.4.1.2 Identifikation positiver Klone mittels „dirty“-PCR Als schnelle Methode zur Identifikation positiver Klone wurde die „dirty“-PCR mit Bakte- rienkolonien durchgeführt. Die Bezeichnung „dirty“ bezieht sich hierbei auf das (aus Gründen der Zeitersparnis) bewusst unsaubere Arbeiten unter Verwendung von Bakte- rienzellen als Matrize (anstatt aufgereinigter Plasmid-DNA). Die Charakterisierung der neuen Klone geschah jeweils durch eine Wahl von Primern, die beidseitig oder innerhalb des zu untersuchenden DNA-Fragments binden, und soll in Kap. II (3.2.1) anhand eines Beispiels genauer beschrieben werden. Zur Durchführung wurde von Amp-haltigen LB- Festmedien jeweils eine vereinzelte Bakte- rienkolonie mit einer sterilen Spitze gepickt, in 10 µl sterilem dH2O suspendiert und mit den in Tab. 1.2.5 aufgeführten Materialien auf Eis gemischt. Tab. 1.2.5: Ansatz zur Durchführung einer „dirty“-PCR. Material Menge/Konz. Puffer Pwo 1x Bakterien-Suspension 1 µl Triton X-100 (TX) 0,1 % sense Primer 100 ng antisense Primer 100 ng Pwo Polymerase 2,5 U dNTPs je 0,2 mmol/l dH2O steril ad 50 µl Die „dirty“-PCR wurde wie in Tab. 1.2.6 beschrieben durchgeführt. Kapitel I 38 2 Material und Methode Tab. 1.2.6: PCR-Programm zur Durchführung einer „dirty“-PCR. Zyklen Temperatur Dauer Beschreibung - 110 °C - Deckel vorheizen 1x 95 °C 5 min Aktivierung 95 °C 1 min Denaturierung 35x 52 °C 1 min Annealing 72 °C 90 s Amplifikation 1x 72 °C 7 min Amplifikation - 4 °C ∞ DNA-Lagerung Die aus der „dirty“-PCR hervorgegangenen DNA-Amplifikate wurden auf einem analyti- schen 0,8%igen Agarose-Gel (2.6.6.1) auf ihre Länge geprüft und nach Ethidiumbro- mid-Färbung in der Versa Doc mit der Software „Quantity One“ dokumentiert. 2.6.4.1.3 PCR zur Sequenzierung Die genaue Überprüfung hergestellter Klone erfolgte durch Sequenzierung des verän- derten Plasmid-Abschnitts. Hierfür wurde eine Sequenzier-PCR mit dem „BigDye Ter- minator 3.1 System“ (Applied Biosystems, USA) nach Vorgaben der Firma GENterprise (Mainz) durchgeführt. In diesem System, welches auf der Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977) basiert, werden neben 2’-Desoxnukleotiden (dNTP) auch mit Fluo- rophoren beladene Didesoxnukleotide in den neu synthetisierten Strang eingebaut, was einen Abbruch der Amplifikation bewirkt. Statistisch gesehen entstehen bei einer ausreichenden Anzahl von Amplifikations-Zyklen Kettenabbruch-Fragmente jeder Län- ge, welche am Strang-Ende jeweils mit einem basenspezifischen Fluorophor markiert und somit nachweisbar sind. Die Durchführung der Sequenzier-PCR ist in Tab. 1.2.7 dargestellt, verwendete Sequenzier-Primer sind in Tab. 1.2.12 zusammengefasst. Tab. 1.2.7: Ansatz zur Durchführung einer Sequenzier-PCR. Material Menge/Konz. BigDye-Puffer 3.1 1x Plasmid 300 ng Sequenzier- Primer 100 ng BigDyeMix 3.1 2 µl dH2O ad 10 µl Die Sequenzier-PCR wurde wie in Tab. 1.2.8 beschrieben durchgeführt. Kapitel I 2 Material und Methode 39 Tab. 1.2.8: PCR-Programm zur Durchführung der Sequenzier-PCR. Zyklen Temperatur Dauer Beschreibung - 110 °C - Deckel vorheizen 1x 96 °C 5 min Denaturierung 30x 96 °C 5 min Denaturierung 60 °C 4 min Annealing & Amplifikation - 4 °C ∞ DNA-Lagerung Die Sequenzierung erfolgte durch die Firma GENterprise (Mainz), die uneditierten Da- ten wurden mit Hilfe der Software „Chromas“ (Version 1.45; Chromas, Australien) aus- gewertet und mit der kostenlosen Software Lalign (www.ch.embnet.org) auf Sequenz- identität geprüft. Material: „BigDye Terminator 3.1 System“ (Applied Biosystems, USA) 2.6.4.2 PCR-Primer 2.6.4.2.1 Primer für die Mutagenese-PCR Primer, die in punktspezifischen Mutagenesen eingesetzt wurden, sind ausführlich in den folgenden Tab. 1.2.9, 10 und 11 beschrieben. Das Primer-Design folgte den An- gaben des „Quikchange® kit“- Herstellers Stratagene. Tab. 1.2.9: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Mutagenese-Primer. Die im Vergleich zur wildtypischen Lhcb1-Sequenz veränderten Codons sind unterstrichen. Name Sequenz Länge Beschreibung LHCII-S59C fw 5’-GCT GAC CCA GAG ACA TTC TGC AAG 34 Nt Austausch AAC CGT GAG C-3’ S59C LHCII-S59C-rv 5’-G CTC ACG GTT CTT GCA GAA TGT CTC TGG GTC AGC-3’ Lhcb1 V90C 5’-C CCA GAG CTT TTG TCT CGC AAC GGT 42 Nt Austausch Stra fw TGT AAA TTC GGC GAA GC-3’ V90C Lhcb1 V90C 5’-GC TTC GCC GAA TTT ACA ACC GTT GCG Stra rv AGA CAA AAG CTC TGG G-3’ LHCII-S123C fw 5`-CCA AGC TTG GTC CAT GCT CAA TGC 42 Nt Austausch ATC CTT GCC ATA TGG GCC-3` S123C LHCII-S123C rv 5`-GGC CCA TAT GGC AAG GAT GCA TTG AGC ATG GAC CAA GCT TGG-3` LHCII V196C 5’-CC ATG TTC TCA ATG TTT GGA TTC TTC 46 Nt Austausch Stra fw TGT CAA GCT ATT GTA ACT GG-3' V196C LHCII V196C 5’-CC AGT TAC AAT AGC TTG ACA GAA GAA Stra rv TCC AAA CAT TGA GAA CAT GG-3’ Kapitel I 40 2 Material und Methode Tab. 1.2.10: Übersicht über die von Dietz (2008) verwendeten Mutagenese-Primer. Die im Vergleich zur wildtypischen Lhcb1-Sequenz veränderten Codons sind unterstrichen. Name Sequenz Länge Beschreibung LHCII-S106C fw 5`-GGA TCT CAA ATC TTT TGT GAG GGT 41 Nt Austausch GGA CTT GAT TAC TTG GG-3’ S106C LHCII-S106C rv 5’-CC CAA GTA ATC AAG TCC ACC CTC ACAAAA GAT TTG AGA TCC-3’ Tab. 1.2.11: Übersicht über die von Müller (2008) verwendeten Mutagenese-Primer. Die im Vergleich zur wildtypischen Lhcb1-Sequenz veränderten Codons sind unterstrichen. Name Sequenz Länge Beschreibung LHCII-S3C/T5E- 5’-GC ATG CGT AAA TGT GCT GAG ACC AAG fw AAA GTA GCG AGC -3’ Austausch T5E 38 Nt in Mutanten mit LHCII-S3C/T5E- 5’-GCT CGC TAC TTT CTT GGT CTC AGC ACA Austausch S3C rvcompl TTT ACG CAT GC-3’ LHCII-A4Cfw 5’ – GC ATG CGT AAA TCT TGT ACC ACC AAG AAA GTA GCG AGC TCT GG – 3’ LHCII-A4Crv 5’ – CC AGA GCT CGC TAC TTT CTT GGT GGT 43 Nt Austausch A4C ACA AGA TTT ACG CAT GC – 3’ LHCII-T5E-fw 5’-GC ATG CGT AAA TCT GCT GAG ACC AAG AAA GTA GCG AGC -3’ LHCII-T5E- 5’-GCT CGC TAC TTT CTT GGT CTC AGC AGA 38 Nt Austausch T5E rvcompl TTT ACG CAT GC-3’ LHCII-K7Cfw 5’ – GC ATG CGT AAA TCT GCT ACC ACC TGTAAA GTA GCG AGC TCT GG– 3’ LHCII-K7Crv 5’ – CC AGA GCT CGC TAC TTT ACA GGT GGT 43 Nt Austausch K7C AGC AGA TTT ACG CAT GC – 3’ LHCII-V9Cfw 5’ – GCT ACC ACC AAG AAA TGT GCG AGC TCT GGA AGC CCA TGG – 3’ 5’ – CCA TGG GCT TCC AGA GCT CGC ACA 39 Nt Austausch V9CLHCII-V9Crv TTT CTT GGT GGT AGC – 3’ LHCII-A10Cfw 5’ – GCT ACC ACC AAG AAA GTA TGC AGC TCT GGA AGC CCA TGG – 3’ Austausch LHCII-A10Crv 5’ – CCA TGG GCT TCC AGA GCT GCA TAC 39 Nt A10C TTT CTT GGT GGT AGC – 3’ LHCII-S11Cfw 5’ – CC ACC AAG AAA GTA GCG TGC TCT GGA AGC CC – 3’ Austausch LHCII-S11Crv 5’ – GG GCT TCC AGA GCA CGC TAC TTT CTT 31 Nt S11C GGT GG – 3’ LHCII-S12Cfw 5’ – CC ACC AAG AAA GTA GCG AGC TGTGGA AGC CCA TGG – 3’ Austausch LHCII-S12Crv 5’ – CCA TGG GCT TCC ACA GCT CGC TAC 35 Nt S12C TTT CTT GGT GG – 3’ LHCII-S14Cfw 5’ – GCG AGC TCT GGA TGC CCA TGG TAC GGA CCA GAC CG – 3’ Austausch LHCII- 5’ – CG GTC TGG TCC GTA CCA TGG GCA 35 Nt S14C S14Crvcompl TCC AGA GCT CGC – 3’ Kapitel I 2 Material und Methode 41 LHCII-V22Cfw 5’ – GC CCA TGG TAC GGA CCA GAC CGT TGT AAG TAC TTA GGC CC – 3’ LHCII-V22Crv 5’ – GG GCC TAA GTA CTT ACA ACG GTC 40 Nt Austausch V22C TGG TCC GTA CCA TGG GC – 3’ LHCII-S29Cfw 5’- C CGT GTT AAG TAC TTA GGC CCA TTC TGC GGT GAG TCT CCA TCC -3’ LHCII-S29C- 5’- GGA TGG AGA CTC ACC GCA GAA TGG 43 Nt Austausch S29C rvcompl GCC TAA GTA CTT AAC ACG G-3’ LHCII-S34Cfw 5’ – CC GGT GAG TCT CCA TGC TAC TTG ACT GGA GAG TTC CCC – 3’ 38 Nt Austausch S34C LHCII-S34Crv 5’ – GGG GAA CTC TCC AGT CAA GTA GCATGG AGA CTC ACC GG – 3’ LHCII-F40Cfw 5’ – CC TAC TTG ACT GGA GAG TGC CCC GGT GAC TAC GG – 3’ LHCII-F40Crv 5’ – CC GTA GTC ACC GGG GCA CTC TCC 34 Nt Austausch F40C AGT CAA GTA GG – 3’ LHCII-A49Cfw 5’ – C GGT TGG GAC ACT TGC GGA CTC TCT GCT GAC CC – 3’ 33 Nt Austausch A49C LHCII-A49Crv 5’ – GG GTC AGC AGA GAG TCC GCA AGT GTC CCA ACC G – 3’ LHCII-S59Cfw 5’ – GCT GAC CCA GAG ACA TTC TGC AAG AAC CGT GAG C – 3’ LHCII-S59Crv 5’ – G CTC ACG GTT CTT GCA GAA TGT CTC 34 Nt Austausch S59C TGG GTC AGC – 3’ LHCII-C79Sfw 5’ – GG GCT ATG TTG GGT GCT TTG GGA TCT GTC TTC CCA GAG C – 3’ LHCII- 5’ – G CTC TGG GAA GAC AGA TCC CAA 39 Nt Austausch C79S C79Srvcompl AGC ACC CAA CAT AGC CC – 3’ 2.6.4.2.1 Primer für „dirty“-PCR und Sequenzier-PCR Primer, die in der „dirty“- bzw. Sequenzier-PCR verwendet wurden, sind in Tab. 1.2.12 beschrieben und aufgelistet. Tab. 1.2.12: Übersicht über die verwendeten Primer in der ”dirty”-bzw. Sequenzier-PCR. Name Sequenz Länge Beschreibung Ds23 (+) 5´-ATT TGC TTT GTG AGC 17 Nt Sequenzier-Primer „upstream“ der GG-3 MCS im pDS12-Vektor 5´-GGA GTT CTG AGG TCA 22 Nt Sequenzier-Primer ca. 40 bp Ds178 (-) TTA CTG G-3´ „downstream“ der PstI-Schnittstelle in der MCS des pDS12-Vektors Seq 105 (-) 5'-CC ATC ATC TTG TAT TAG 23 Nt Sequenzier-Primer für pDS12-TGA ACC - 3' RBSII-Lhcb1 Strep (+) 5'-TGG AGC CAC CCG CAG 30 Nt zum Einfügen eines „Strep tag“ in TTC GAA AAA GGT GCA-3' eine NsiI-Schnittstelle 5'-CCG GGT TAA TGG TGA 30 Nt C-terminaler Primer für XmaI-Stelle, C-hisan (-) TGG TGA TGG TGT TTT-3’ führt P-G-K-(His)6-TAA ein Kapitel I 42 2 Material und Methode 2.6.5 Restriktion von DNA Der Verdau von methylierter Template-DNA und die Herstellung verschiedener Klone des Lhcb1 mittels Restriktion und Ligation erfolgte durch den Einsatz von Restriktions- enzymen, welche per Definition pro eingesetzter Enzym-Unit 1 µg DNA unter optimalen Bedingungen innerhalb einer Stunde schneiden. Eingesetze Restriktionsenzyme mit ihren wichtigsten Eigenschaften sind in Tab. 1.2.13 aufgelistet. Tab. 1.2.13: Verwendete Restriktionsenzyme. Die Restriktionsenzyme werden von NEB (New England Biolabs, Bad Schwalbach), bezogen und bei -20 °C gelagert. Da sie in glycerinhaltigem Puffer geliefert werden, müssen sie vor der Verwendung nicht aufgetaut werden. Alle verwen- deten Enzyme produzieren „sticky ends“, wie am Sequenzmotiv erkennbar. Hitze- Enzym Sequenzmotiv Puffer/Aktivität Temperatur Inaktivierung NEB1+BSA/ 100 % SacI 5’-GAGCT↓C-3’ NEB2+BSA/ 50 % 37 °C 65 °C, 20 min NEB4+BSA/ 100 % PstI 5’-CTGCA↓G-3’ NEB3+BSA/ 100 % NEB2+BSA/ 75 % 37 °C 80 °C, 20 min BstEII 5’-G↓GTNACC-3’ NEB3+BSA/ 100 % NEB4+BSA/ 75 % 60 °C Nicht möglich DpnI 5’-GACH3↓TC-3’ NEB4 Stratagene-QC-Puffer 37 °C 80 °C, 20 min Die Durchführung der einzelnen Restriktionen ist zur Wahrung der Übersicht in Kap. I (2.6.10.2) sowie in Kap. II (2.1) beschrieben. 2.6.6 Agarose-Gelelektrophorese Durch die Ladung der Phosphatgruppen sind Nukleinsäuren einheitlich negativ geladen und können zur Analyse, Quantifizierung oder Aufreinigung in einem elektrischen Feld in geeigneten Trägermaterialien ihrer Größe nach aufgetrennt werden. Als Trägermate- rial kam in der vorliegenden Arbeit Agarose, ein vernetztes Galactose-Polymer, zum Einsatz. Die Anfärbung erfolgte mit Ethidiumbromid. Dieser aromatische Farbstoff in- terkaliert aufgrund seiner planaren Struktur mit den Heterozyklen der DNA-Basen und kann mit UV-Licht der Wellenlängen 245-366 nm angeregt werden. Angefärbte Gele wurden mit dem „VersaDoc™ Imaging System“ photografiert und mittels „Quantity One“ Software ausgewertet. Material: Agarose TAE-Puffer: 40 mmol/l Tris/Acetat (pH 8,0) 2 mmol/l Ethylendiamintetraacetat Kapitel I 2 Material und Methode 43 DNA-Auftragspuffer (10x): 50 mmol/l Tris/HCl (pH 8,0) 10 mmol/l EDTA 0,025 % Bromphenolblau 0,025 % Xylencyanol 50 % Glycerin Ethidiumbromid-Lösung 0,5 µg/ml DNA-Marker (NEB, USA) “E.Z.N.A. gel extraction kit” (PEQLAB) steriles Aqua dest. 2.6.6.1 Analytische Agarose-Gelelektrophorese Die Analyse von PCR-Produkten und restringierter DNA erfolgte auf 0,8%igen Agaro- se-Mini-Gelen, die sich zur Auftrennung von DNA-Fragmenten mit Größen von 0,5 bis 10 kb eignen. Hierzu wurde 0,8 g Agarose in 100 ml TAE-Puffer durch Erhitzen in der Mikrowelle gelöst und zu je 10 ml auf Glasplatten (7,5 x 5,5 cm), versehen mit Proben- kämmen, polymerisiert. Die DNA wurde mit Auftragspuffer versetzt (1x Endkonzentrati- on), auf das fertige Gel aufgetragen und bei einer Spannung von 70 mV (nach Einlau- fen der Probe auf 150 mV erhöht) aufgetrennt. Nach Inkubation in einer Ethidiumbro- mid-Lösung wurde die DNA in UV-Licht sichtbar gemacht und die Fragmente anhand der seitlich aufgetragenen 100 bp bzw. 1 kb DNA-Längenstandards (Kap. I, 2.3.1) zu- geordnet und fotografiert. 2.6.6.2 Präparative Agarose-Gelelektrophorese nach DNA-Restriktion Die präparativen Trennung restringierter DNA erfolgte in 1%igen Agarose-Gelen (1 g Agarose in 100 ml TAE-Puffer). Die DNA wurde mit Auftragspuffer versetzt (1x End- konzentration), auf das Gel aufgetragen und bei einer Spannung von 70 mV (nach Ein- laufen der Probe auf 150 mV erhöht) in die einzelnen Fragmente aufgetrennt. Nach Inkubation in einer Ethidiumbromid-Lösung wurde die DNA in UV-Licht sichtbar ge- macht, die Fragmente anhand der seitlich aufgetragenen 100 bp bzw. 1 kb DNA- Längenstandards (Kap. I, 2.3.1) zugeordnet und die gewünschten Banden mit einem Skalpell herausgeschnitten. 2.6.6.3 Rückgewinnung restringierter DNA aus Agarose-Gelen Die Extraktion von restringierter Plasmid-DNA aus Agarose-Gel-Stücken erfolgte unter Verwendung des „E.Z.N.A. gel extraction kit“ (PEQLAB) gemäß den Angaben des Her- stellers. Hierzu wurden die Gelstücke mit dem erforderlichen Volumen an „Binde- Puffer“ versetzt, die Agarose durch 7 minütige Hitze-Inkubation bei 60 °C gelöst, die DNA auf Silica-Säulen gebunden, gewaschen und mit 70 µl warmen (50 °C), sterilem Aqua dest. in zwei Durchgängen (je 50 und 20 µl) eluiert. Die photometrische Konzent- rationsbestimmung erfolgte wie zuvor (Kap. I, 2.6.3) beschrieben. Kapitel I 44 2 Material und Methode 2.6.7 Ligation Durch Einsatz ATP-abhängiger DNA-Ligasen ist es möglich eine Phosphodiester- Bindung zwischen dem freien 5’-Phosphat-Ende und dem 3’-Hydroxyl-Ende zweier Oligonukleotide auszubilden. Vektorenfragmente, welche zuvor mit identischen Restrik- tionsenzymen geschnitten wurden, können so neu kombiniert werden. Hierzu wurden in einem 20 µl Ligationsansatz 100 ng Gesamt-DNA eingesetzt. Um eine optimale Ligationsausbeute zu erreichen, wurde das kürzere Insert in einem 4fach stöchiometrischen Überschuss zum längeren Vektor eingesetzt *. Die Ligation erfolgte gemäß den Angaben des Herstellers („rapid ligation kit“, Fermentas) durch Verwendung von 1 µl Ligase in 1x Ligase-Puffer bei Raumtemperatur (30 min). *Berechnung des 4fachen Insert-Überschusses nach folgender Formel: Insert-DNA [ng] = (4 x Vektor-DNA [ng] x Länge Insert [bp]) / Länge Vektor [bp] Material: “rapid ligation kit” (Fermentas) 2.6.8 Transformation in E. coli Die Transformation mutierter Plasmid-DNA erfolgte in chemisch-kompetente E. coli- Bakterien des superkompetenten Stammes XL1-Blue (hier A) oder des Expressions- stammes JM101 (hier B). Hierzu wurde je ein 50 µl Aliquot der Bakterien- Zellsuspension auf Eis aufgetaut und direkt mit 1 µl PCR-Produkt (A) oder 50 ng Vek- tor-DNA (B) in einem 14 ml Falcon „round bottom tube“ (auf Eis) gemischt. Nach einer Inkubationsdauer von 30 min auf Eis wurde die Suspension für 45 s (A) oder 1 min (B) auf 42 °C im Wasserbad erhitzt, um erneut auf Eis (2 min) abgekühlt zu werden. Nach Zugabe von 450 µl NZY+-Flüssigmedium (A, 37 °C) oder 440 µl LB-Flüssigmedium (B, 37 °C) wurden die Bakterien 1 h bei 37 °C phänotypisiert und zur Selektion auf Amp- haltigem LB-Festmedium ausplattiert (100-150 µl). Nach einer Inkubationsdauer von 16 h bei 37 °C, wurde eine Kolonie in LB-Amp Flüssigmedium überführt (14 h, 37 °C, 180 min-1) und am darauffolgenden Tag die amplifizierte Plasmid-DNA isoliert (Kap. I, 2.6.3) und sequenziert (Kap. I, 2.6.4.1.3). Ein Aliquot der Flüssigkultur von JM101-Zellen wurde zudem zur Herstellung einer Dauerkultur verwendet (Kap. I, 2.6.9). Material: NZY+-Flüssigmedium: 22,45 g/l NZCYM BrothEZ Mix 12,5 mmol/l MgSO4 3,6 g/l D-Glucose LB-Flüssigmedium: 1 % Trypton 0,5 % Hefeextrakt 1 % NaCl (pH 7,5) Kapitel I 2 Material und Methode 45 LB-Amp-Festmedium: 1 % Trypton 0,5 % Hefeextrakt 1 % NaCl (pH 7,5) 1,5 % Agar 100 µg/ml Amp 2.6.9 Dauerkulturen Neue Klone des LHCII wurden sowohl in Form von lyophilysierter Plasmid-DNA als auch in Form von E. coli JM101-Dauerkulturen bei -80 °C gelagert. Hierzu wurde, wie in Corbet (2004) beschrieben, 1 ml Bakterien-Flüssigkultur mit Glycerin (zu 16,67 %) versetzt. Nach Bender (2004) sollte die Glycerinkonzentration allerdings höher liegen (64 %). 2.6.10 Durchführung unterschiedlicher Mutagenese-Strategien 2.6.10.1 Punktspezifische Mutagenese mittels „Quikchange® II site-directed mu- tagenesis kit“ Zur Wahrung der Übersicht soll der allgemeine Ablauf der punktspezifischen Mutage- nese mittels „Quikchange® II site-directed mutagenesis kit“ der Firma Stratagene an- hand Abb. 1.2.7 beschrieben werden. Die Durchführung einzelner Methoden wurde bereits zuvor beschrieben. Im Allgemeinen sei darauf hingewiesen, dass unmethylierte Plasmide dam-negativer E. coli-Stämme (z.B. JM110 oder SCS110) für die Verwen- dung in der Mutagenese-PCR ungeeignet sind, da sie nicht durch die Restriktionsen- donuklease DpnI verdaut werden und somit in der Transformation stören. Nach Isolierung eines methylierten Matrizen-Plasmids (Kap. I, 2.6.3) aus ent- sprechenden Bakterienstämmen werden in der Mutagenese-PCR (Abb. 1.2.7 A; Kap. I, 2.6.4.1.1) komplementäre Mutagenese-Primer (Kap. I, 2.6.4.2.1), welche bei einer Länge von ca. 30- 50 bp den gewünschten Basenaustausch mittig tragen, eingesetzt. Nach abgeschlossener linearer Amplifikation wird die methylierte Matrizen-DNA durch die Restriktionsendonuklease DpnI vielfach geschnitten (Kap. I, 2.6.5), während das unmethylierte PCR-Produkt (Abb. 1.2.7 B, roter Doppelring, genicktes Plasmid) durch DpnI nicht verdaut wird. Nach Überprüfung des Amplifikations-Erfolgs mittels analyti- schem Agarose-Gel (Kap. I, 2.6.6.1), werden 50 µl superkompetente Zellen des E. coli Stammes XL1-Blue mit lediglich 1 µl des verdauten PCR-Produkt transformiert (Abb. 1.2.7 C; Kap. I, 2.6.8). Hierbei ist zu beachten, dass es neben einer Plasmid- Amplifikation (Abb. 1.2.7 D), zudem zur Ligation der genickten DNA kommt. Kapitel I 46 2 Material und Methode Abb. 1.2.7.: Schema zur Herstellung von Cys-Mutanten des Lhcb1 durch punktspezifi- sche Mutagenese mittels „Quikchange® II site-directed mutagenesis kit“ (Stratagene). In der Mutagenese-PCR (A) dient ein methylier- ter Vektor (schwarzer Ring) als Matrize, das komplementäre Primer-Pärchen (rote Pfeile) besitzt den gewünschten Basenaustausch (rotes Kreuz). Die methylierte Matrizen-DNA wird im Gegensatz zum PCR-Produkt (ge- nicktes Plasmid mit Mutation, roter Ring) durch DpnI verdaut (B). Nach Transformation von E. coli XL1-Blue-Zellen (blaue Ellipse) mit dem PCR-Produkt (C) wird die genickte DNA ligiert. Nach Amplifikation und Isolierung des mutierten Plasmids (D) erfolgt die Transfor- mation in den Expressionstamm E. coli JM101 (E, schwarze Ellipse) mit nachfolgen- der Sequenzierung und Proteinüberexpressi- on. Nach Isolierung des mutierten Plasmids (Abb. 1.2.7 D) werden Bakterienzellen des gewünschten Expressionsstammes, in diesem Fall chemokompetete E. coli JM101, transformiert (Abb. 1.2.7 E; Kap. I, 2.6.8). Hierbei sollte erwähnt werden, dass die Kompetenz der JM101-Zellen deutlich unter der der superkompetenten XL1-Blue-Zellen liegt. Die geringere Kompetenz wird in der zweiten Transfor- mation allerdings durch den Einsatz grö- ßerer DNA-Mengen nach vorheriger Plasmid-Amplifikation wettgemacht. Letztlich wird eine vereinzelte Kolonie der JM101 Zellen über Nacht amplifiziert, das Plasmid isoliert und das Lcb1-Gen se- quenziert (Kap. I, 2.6.4.1.3 und 2.6.4.2.2). Hierbei reicht in der Regel eine einzelne Sequenzierung mit dem Sequenzier- Primer Seq 105 (-) aus, um den Mutagenese-Erfolg zu prüfen. Zudem wird von jeder neuen Mutante eine –80 °C Dauerkultur (Kap. I, 2.6.9) und eine Plasmid-Mini- Präparation (Kap. I, 2.6.3) angelegt. Kapitel I 2 Material und Methode 47 2.6.10.2 Herstellung von Lhcb1-Konstrukten durch Restriktion und Ligation vor- handener Klone Die Herstellung von „His6 tag“-Klonen durch Restriktion und Ligation bereits vorhande- ner Lhcb1-Klone soll im Folgenden am Beispiel der Mutante S59Ch beschrieben wer- den (Abb. 1.2.8). Hierzu wurden die Cys-Einzelmutante S59C (Kap. I) und die „His6 tag“-Mutante C3.2h (Kosemund, 1999) jeweils mit den Restriktionsendonucleasen SacI und BstEII geschnitten (Kap. I, 2.6.5), durch präparative Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt (Kap. I, 2.6.6.2) und zu einer Cys-Einzelmutante mit C-terminalem „His6 tag“ ligiert (Kap. I, 2.6.7). Abb. 1.2.8: Schematische Darstellung zur Konstruktion der Cys-Einzelmutante S59Ch mit C- terminalem „His6 tag“ aus der Cys-Einzelmutante S59C und „His6 tag“-Mutante C3.2h. Sowohl S59C als auch C3.2h wurden mit den Restriktionsendonucleasen SacI und BstEII geschnitten und über ein Agarose-Gel aufgereinigt. Im Anschluss wurden das Cys-tragende kurze Fragment von S59C und das „His6 tag“ tragende lange Fragment von C3.2h zum Expressionsvektor pDS12-RBSII-S59Ch ligiert, in E. coli JM101 transformiert sowie sequenziert. Kapitel I 48 2 Material und Methode Hierbei waren die Enzyme so gewählt, dass von der Cys-Mutante S59C ein ca. 380 bp kurzes Cys-tragendes Fragment, von der „His6 tag“ Mutante C3.2h ein ca. 3880 bp langes (Cys-freies) Fragment mit C-terminalem „His6 tag“ isoliert werden konnte. Die Restriktion der isolierten Plasmid-DNA erfolgte jeweils als Doppelverdau unter Ver- wendung des NEB-Puffers NEB4 bei 37 °C (Tab. 1.2.14). Da die Aktivität des Enzyms BstEII unter den gewählten Puffer-Bedingungen nicht optimal war, wurde die einge- setzte Enzym-Menge verdoppelt, die Restriktionszeit betrug 3 h. Tab. 1.2.14: Restriktionsansatz zur Herstellung des Klons S59Ch. Material Volumen/Menge Puffer NEB4 1x Plasmid-DNA 5 µg BSA 1x SacI 15 U BstEII 30 U dH2O ad 50 µl Eine Denaturierung der Restriktionsendonuclease BstEII durch Hitzeinkubation war nicht möglich. Stattdessen wurden die DNA-Fragmente direkt mittels präparativem Agarosegel isoliert (Kap. I, 2.6.6.2). Die aufgereinigten DNA-Fragmente (Kap. I, 2.6.6.3) wurden ligiert (Kap. I, 2.6.7), in JM101-Zellen transformiert (Kap. I, 2.6.8) und nach Amplifikation sequenziert (Kap. I, 2.6.4.1.3). Zudem wurde eine –80 °C Dauerkul- tur (Kap. I, 2.6.9) und eine Plasmid-Mini-Präparation (Kap. I, 2.6.3) angelegt. 2.6.10.3 Herstellung von Klonen durch Insertions-PCR Auf die Herstellung von Klonen durch Insertions-PCR soll in der vorliegenden Disserta- tion nicht näher eingegangen werden, dies ist ausführlich in der Diplomarbeit Plunger (2007) dokumentiert und wird außerdem Gegenstand der Dissertationsschrift von C. Dietz (unveröffentlichte Ergebnisse) sein. 2.7 Präparative biochemische Methoden 2.7.1 Isolierung von Pigmenten Für die in dieser Arbeit durchgeführten Rekonstitutionen verschiedener Lhcb1- Mutanten wurden Pigmente aus Erbse (Pisum sativum) in größerer Menge im Dunkeln und unter ständiger Kühlung isoliert und eingetrocknet. Die Lagerung erfolgte bei –20 °C in inerter Atmosphäre unter Stickstoff. Kapitel I 2 Material und Methode 49 2.7.1.1 Anzucht von Pisum sativum Die Anzucht von Pisum sativum erfolgte nach Standard-Protokoll. Dazu wurden zu- nächst Samen in Wasser unter ausreichend Luftzufuhr über Nacht eingequollen und am darauffolgenden Tag in feuchtem Vermiculit ausgesät. In den folgenden 13 Tagen wuchsen die Pflanzen unter Langtagbedingungen bei einer Temperatur von 20 °C un- ter ausreichender Bewässerung im Klimaraum. Material: Pisum sativum var. Lisa Vermiculit (Härte 4, Firma Klein Dämmstoffe, Zellertal) 2.7.1.2 Isolierung von Totalpigmentextrakt aus Pisum sativum Nach 13 Tagen Anzucht wurden die oberen Erbsenblätter ohne Stiel geerntet und mit einer Schere zerkleinert. Die erhaltene Blattmasse (1 kg) wurde mit 1,5 l gekühltem Aufschlusspuffer im Mixer (Waring Blender) weiter zerkleinert, durch drei Lagen Baumwollgaze filtriert und in 500 ml Zentrifugenbecher aufgeteilt. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 4 °C und 10000 Umdrehungen pro min (Upm) in einer Beckmann Kühlzentrifuge (Rotor JLA-10500) wurde der Überstand verworfen und das erhaltene grüne Pellet in insgesamt 500 ml Aceton resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation (10 min, 4 °C, 10000 Upm) wurde der acetonische Überstand, der den Totalpigmentex- trakt enthält, gesammelt, in einen Scheidetrichter überführt und mit frisch destilliertem peroxidfreiem Diethylether (150 ml) überschichtet. Die so behandelten Pigmente wur- den mehrmals vorsichtig ausgeschüttelt und mit Wasser gewaschen. Hierbei gingen die Pigmente in die Etherphase über. Nach Phasentrennung wurde jeweils die annä- hernd farblose wässrige Phase verworfen. Außerdem wurde durch Zugabe von 5 mol/l NaCl (10-20 ml) die Polarität der wässrigen Phase erhöht, um eine bessere Trennung zu erreichen. Die Etherphase wurde letztendlich zur Abtrennung des Restwassers in einer Schliffflasche über Nacht bei –20 °C eingefroren und die Wasserkristalle am dar- auffolgenden Morgen in einem vorgekühlten Glasfilterhalter mit Filterpapier abgetrennt. Die Pigmente in Ether wurden im Rotationsverdampfer eingetrocknet, mit Stickstoff überschichtet und bei –20 °C gelagert. Zudem wurde ein Aliquot zur Bestimmung des Chlorophyllgehalts in Aceton gelöst (Kap. I, 2.7.1.3) und mittels HPLC die Pigmentzu- sammensetzung geprüft (Kap. I, 2.7.1.4). Material: Pisum sativum Blattmaterial Aufschlusspuffer: 1 mol/l Tris (pH 7,8) 1 mmol/l DTT 330 mmol/l Sorbitol 100 % Aceton Kapitel I 50 2 Material und Methode Aqua dest. Diethylether (destilliert) 5 mol/l NaCl Stickstoff 5.0 2.7.1.3 Bestimmung des Chlorophyllgehaltes nach Porra et al. (1989) Die Bestimmung der Chlorophyllkonzentration erfolgte nach Porra et al. (1989) in 80 % Aceton bei den Wellenlängen 750 nm, 663,6 nm und 646,6 nm. Nach Abzug des Kor- rekturwertes bei 750 nm wurden die Chl a- und Chl b- Konzentrationen wie folgt be- rechnet: Chl a = 12,25 x A 663,6 – 2,55 x A 646,6= [µg/ml] x Verdünnungsfaktor Chl b = 20,31 x A 646,6 – 4,91 x A 663,6 = [µg/ml] x Verdünnungsfaktor 2.7.1.4 Überprüfung der Pigmentzusammensetzung mittels analytischer HPLC Die „reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) diente in diesem Ansatz der Auftrennung eines Pigmentgemisches zur Charakterisierung des Totalextrakts und zur Überprüfung der Pigmentstöchiometrie verschiedener LHCII- Klone nach Butanolextraktion (Kap. I, 2.7.1.5). Hierbei werden die einzelnen Pigmente nach Hydrophobizität in einem Acetongradienten getrennt und bei Elution die Absorpti- onsintensitäten bei einer Wellenlänge von 440 nm gemessen. Die entsprechenden Pigmentkonzentrationen der Probe können durch Integration der ermittelten „peak“- Flächen errechnet werden. Hierzu wurde die HPLC durch zwei Leerläufe mit 80 % Ace- ton äquilibriert und die Probenschleife vor Probenauftrag dreimal mit 100 % Aceton gespült. Die zu untersuchende Probe wurde in geringer Konzentration in 80 % Aceton gelöst und luftblasenfrei auf die Säule aufgetragen (20 µl). Material: 100 % Aceton (filtriert und entgast) Wasser reinst (entgast und mit 0,2 mM Hepes oder Tris/HCl pH 7,0 gepuffert) Pigmentextrakte in 80 % Aceton Programm: „ChromolithA“, Dauer: 6,5 min Kapitel I 2 Material und Methode 51 Tab. 1.2.15: Programmierter Gradient (Fluss: 1 ml/min). (A) ist Aceton, (B) ist Wasser reinst (entgast und mit 0,2 mM Hepes oder Tris/HCl pH 7,0 gepuffert). A [%] B [%] t [min] ∆t [min] 70 30 0 0 100 0 3 3 100 0 3,5 0,5 70 30 4 0,5 70 30 6,5 2,5 2.7.1.5 Butanol-Extraktion nach Martinson & Plumley (1995) Um Pigmentstöchiometrien gefalteter Pigment-Protein-Komplexe zu bestimmen, wur- den 50 µl LHCII-Lösung mit 33 µl sec-Butanol und 16,5 µl NaCl versetzt, durch Vorte- xen gemischt, für 2 min bei 4 °C (12000 Upm, Hettich Tischzentrifuge) zentrifugiert und die grüne Butanolphase in ein abgewogenes Reaktionsgefäß pipettiert. Die Überreste wurden auf gleiche Weise nachextrahiert, die Butanolphasen vereinigt und das Buta- nolvolumen berechnet. Hierfür wurde die Butanolphase gewogen und durch die Dichte des Butanols (0,81 g/ml) dividiert. Letztlich wurde der Butanolextrakt mit einem zweifa- chen Volumen an gepuffertem 70 % Aceton gemischt und mit Hilfe der analytische HPLC (Kap. I, 2.7.1.4) untersucht. Hierbei gilt zu beachten, dass ein Gemisch aus 1 ml sec-Butanol und 2 ml 70 % Aceton ein Endvolumen von 2,9 ml besitzt. Daher muss das berechnete Gesamtvolumen aus der quantitativen Pigmentextraktion demnach noch mit dem Umrechnungsfaktor 0,967 (2,9/3) multipliziert werden. Material: 100 % sec-Butanol 5 mol/l NaCl 70 % gepuffertes Aceton 2.7.1.6 Aliquotieren und Aufbewahrung der Pigmente Nach Analyse der Pigmentzusammensetzung mittels HPLC und Bestimmung der Chlo- rophyllkonzentration wurde isolierter Totalpigmentextrakt in 100 % Aceton gelöst, ali- quotiert, unter Stickstoff getrocknet und bei –20 °C im Dunkeln aufbewahrt. Material: Totalextrakt 100 % Aceton Stickstoff 5.0 Kapitel I 52 2 Material und Methode 2.7.2 Überexpression und Isolierung von LHCP aus E. coli als „inclusion bo- dies“ Das Apoprotein (LHCP) diverser LHCII-Mutanten wurde in Bakterien des E. coli – Stammes JM101 überexprimiert und als „inclusion bodies“ (IBs) im Cytoplasma der Bakterien angehäuft. Wie zuvor beschrieben, enthalten die verwendeten Transforman- ten das Expressionsplasmid pDS12-RBSII mit genetisch verändertem Lhcb1-Gen, wel- ches unter Kontrolle des Lac-Operators steht und dessen Transkription durch den In- duktor IPTG (Isopropylthiogalaktosid) aktiviert wird. Zur Herstellung größerer Mengen von IBs der jeweiligen Mutanten wurde auf das Anziehen einer Vorkultur (Dockter, 2005) verzichtet. Stattdessen wurde eine ver- einzelte Kolonie von einer Agarplatte gepickt, direkt in 1000 ml Amp-haltige LB- Flüssigkultur gegeben und über Nacht (12-14 h) bei 37 °C im Schüttler bei 180 Upm inkubiert. Nach deutlicher Eintrübung des Mediums wurde Isopropyl-β-thiogalaktosid (IPTG, zu 1 mmol/l) hinzugefügt um die Produktion des LHCP induzieren. Nach einer Inkubationszeit von 4 h bei 37 °C im Schüttler bei 180 Upm wurde der Kulturansatz für 5 min bei 8000 Upm und 4 °C (Beckmann, Rotor JLA-10500) abzentrifugiert und das erhaltene Pellet in 30 ml Lysis-Puffer resuspendiert. Das Aufbrechen der Bakterienzellen erfolgte in zwei Durchgängen in der „french press“. Das erhaltene Lysat wurde bei 4 °C und 8000 Upm für 5 min zentrifugiert (Beckmann, Rotor JA 20) und das Pellet in 20 ml Detergentien-Puffer resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation (5 min, 4 °C, 8000 Upm) wurde das annähernd weiße Pellet in 20 ml Triton-Puffer resuspendiert und über Nacht im Kühlraum gedreht. Am nächsten Morgen wurde dieser Arbeitsschritt wiederholt und nach erneuter Zentrifuga- tion das Pellet in 20 ml Tris-Puffer resuspendiert. Nach einer letzten Zentrifugation wurde das Proteinpellet in 5 ml Tris-Puffer resuspendiert und nach Bestimmung der Proteinkonzentration am Mikrotiterplatten-Photometer (Kap. I, 2.7.3) bei –20 °C aufbe- wahrt. Material: LB-Amp-Festmedium: 1 % Trypton 0,5 % Hefeextrakt 1 % NaCl (pH 7,5) 1,5 % Agar 100 µg/ml Amp LB-Flüssigmedium: 1 % Trypton 0,5 % Hefeextrakt 1 % NaCl (pH 7,5) 100 µg/ml Amp IPTG (1 mol/l) Kapitel I 2 Material und Methode 53 Lysis-Puffer: 0,8 mg/ml DTT 4 µg/ml DNaseI Detergentien-Puffer: 200 mmol/l NaCl 1 % Desoxycholsäure (w/v) 1 % Nonidet P40 (w/v) 20 mmol/l Tris/HCl (pH 7,5) 2 mmol/l EDTA 10 mmol/l β-Me Triton-Puffer: 0,5 % Triton X-100 (TX) (w/v) 1 mmol/l Ethylendiaminintetraacetat (EDTA) 20 mmol/l Tris/HCl (pH 7,5) Tris-Puffer: 50 mmol/l Tris/HCl (pH 8,0) 1 mmol/l EDTA 2.7.3 Photometrische Quantifizierung der Proteinkonzentration Die Eigenschaft aromatischer Aminosäuren UV-Licht der Wellenlänge von 280 nm zu absorbieren, kann man sich zur Proteinquantifizierung zunutze machen. Da für den LHCP bereits eine Eichgerade zur Quantifizierung besteht (Hobe, 1995), muss nur die Absorption der Proteinlösung bei 280 nm bestimmt werden. Hierzu wurden aus der Proteinsuspension dreimal 10 µl entnommen und jeweils in 990 µl A280-Puffer für 2 min gekocht und nach Abkühlung die Absorption bei 280 nm gemessen. Als Referenz dien- ten 10 µl des entsprechenden Protein-Puffers, welcher vor Messung ebenfalls in 990 µl A280-Puffer für 2 min gekocht wurde. Für die Messung des LHCP in A280-Puffer gilt: 0,1 OD 280 nm ,1 cm = 53 µg/ml Protein Material: A280-Puffer: 10 mmol/l Tris (pH 6,8) 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) 1 mmol/l β-Me 2.7.4 Markierung von LHCP 2.7.4.1 Markierung von LHCP mit SH-reaktiven Spinmarkern LHCII ist als diamagnetisches Makromolekül ohne ungepaartes Elektron nicht für EPR- Messungen zugänglich. Eine Möglichkeit, ungepaarte Elektronen in Proteine einzufüh- Kapitel I 54 2 Material und Methode ren, ist die kovalente Bindung von SH-reaktiven Nitroxid-Spinmarkern, wie dem in die- ser Arbeit verwendeten PROXYL-IA (Abb. 1.2.3) bzw. dem früher verwendeten TEM- PO-IA (Abb. 1.2.2; Bender, 2004; Dockter, 2005), an die Sulfhydryl-Gruppe des Cys. Abb. 1.2.9: Bindung von PROXYL-IA (rot) an die Sulfhydryl-Gruppe eines Cys eines Peptids (schwarz). Das ungepaarte Elektron des Nitroxidmarkers ist als blauer Punkt dargestellt. Abbil- dung verändert nach Volkov (2008). Bei dieser SN2- Reaktion bindet der Spinmarker über die Acetamidgruppe unter der Abspaltung von Iodwasserstoff an die Sulfhydryl-Gruppe des Cys unter Ausbildung eines Thioethers (Abb. 1.2.9). Die Reaktion mit Thiolen ist sehr spezifisch, andere Aminosäuren sind nicht betroffen. Ein Nachteil ist, dass Standard-Reduktionsmittel wie DTT oder β-Me, die vor Markierung eingesetzt werden müssen, um Disulfidbrücken zwischen zwei Cys aufzubrechen, ebenfalls Sulfhydryl-Gruppen enthalten. Da diese Reduktionsmittel außerdem in mehrfach molarem Überschuss zu dem Spinmarker ein- gesetzt werden, besteht hier die Gefahr, dass statt Protein das Reduktionsmittel mar- kiert wird und so die Proteinmarkierungseffizienz sinkt. Um diese „Nebenreaktion“ zu vermeiden, wurde zur Proteinmarkierung das Thiol-freie Reduktionsmittel TCP einge- setzt (Dockter, 2005). Dazu wurden zunächst 1 mg Apoprotein in 0,5 % LDS gelöst, mit 20 mmol/l Natriumphosphat-Puffer versetzt und mit Wasser auf 1 ml aufgefüllt. Nach 2 minütigem Kochen bei 100 °C im Wasserbad wurde der Ansatz bei Raumtemperatur abgekühlt und mit dem Reduktionsmittel TCP (2 mmol/l Endkonzentration) reduziert. Nach einer Inkubationszeit von 2 h bei 37 °C auf dem Drehrad wurde die Lösung mit einem 20fach molaren Überschuss der Spinmarker (gelöst in DMSO) versetzt und über Nacht bei 37 °C im Drehrad inkubiert. Überschüssiger Spinmarker wurde am darauf folgenden Tag durch Proteinfällung (Kap. I, 2.7.4.3 und 2.7.4.4) und darauf folgenden Waschschritten entfernt. Die zur Bestimmung der Markierungseffizienz eingesetzten Spinmarker-Überschüsse sind im Ergebnisteil beschrieben. Kapitel I 2 Material und Methode 55 Material: LHCP 10 % LDS 100 mmol/l Natrium-Phosphat-Puffer (pH 7,0) 100 mmol/l TCP-Stammlösung in DMF 10 mg/ml PROXYL-IA bzw. TEMPO-IA in DMSO 2.7.4.2 Markierung von LHCP mit SH-reaktiven Fluoreszenzmarkern Die Markierung von LHCP mit dem Fluoreszenzfarbstoffen BODIPY-IA bzw. DY731- Mal wurde analog zum Protokoll der Spinmarkierung (Kap. I, 2.7.4.1) durchgeführt. Diese Markierungen erfolgten in Zusammenhang mit Experimenten zur Bestimmung der Markierungseffizienz verschiedener Spinmarker (BODIPY-IA, Kap. I), zur Herstel- lung von heterogenenTrimeren (DY731-Mal, Kap. II) und zur Messung der LHCII- Faltungskinetik (DY731-Mal, Kap. III). Material: LHCP 10 % LDS 100 mmol/l Natrium-Phosphat-Puffer (pH 7,0) 100 mmol/l TCP–Stammlösung in DMF 10 mmol/l BODIPY-IA bzw. DY731-Maleimide in DMSO 2.7.4.3 Fällung von Protein mit Aceton und Essigsäure Im Anschluss an durchgeführte Markierungsreaktionen mit Spinmarkern oder Fluores- zenzmarkern wurde das Protein durch Zugabe von 1/10 Endvolumen an 100 mmol/l Essigsäure und dem 2,3fachen Volumen an 100 % Aceton ausgefällt. Nach 30 minüti- ger Inkubation auf Eis konnte das ausgefallene Protein bei 4 °C und 14000 Upm ab- zentrifugiert werden (Hettich Kühlzentrifuge). Das pelletierte Protein wurde anschlie- ßend mindestens viermal mit eiskaltem Ethanol (70 %) und einmal mit 100 % Ethanol gewaschen. Nach Trocknen bei Raumtemperatur (max. 5 min) wurde das jeweils deut- lich gefärbte Protein in 2x Solubilisierungspuffer gelöst und quantifiziert (Kap. I, 2.7.3). Die Lagerung des markierten Proteins erfolgte bei -20 °C im Dunkeln. Material: LHCP 100 mmol/l Essigsäure 100 % Aceton p.A. 100 % Ethanol p.A. 70 % Ethanol Kapitel I 56 2 Material und Methode 2x Solubilisierungspuffer: 200 mmol/l Tris /HCl (pH 9,0) 10 mmol/l ε-Aminocapronsäure 2 mmol/l Benzamidin 25 % (w/v) Saccharose 4 % LDS 2.7.4.4 Fällung von PROXYL-markiertem Protein mit Trichloressigsäure Alternativ zu der vorher beschriebenen Fällung des LHCP mit Aceton und Essigsäure (Kap. I, 2.7.4.3), kann PROXYL-markiertes Protein auch mit Trichloressigsäure (TCA) gefällt werden. Dies bietet den Vorteil, dass sich spinmarkiertes Protein nach Fällung und Waschen besser löst bzw. auch in hohen Proteinkonzentrationen löslich ist. Hierzu wurde der Markierungslösung bei Raumtemperatur 1/3 Endvolumen 15 % TCA (End- konzentration 5 %) hinzugefügt und nach 10 min Reaktionszeit bei Raumtemperatur für 5 min bei 12000 x g (4 °C) zentrifugiert. Der Überstand wurde sofort entfernt und das Protein-Pellet in eiskaltem Aqua dest. (1 ml auf 1 mg Protein) resuspendiert. Der Fäl- lungsschritt ist als kritisch anzusehen, da die Säure auf Dauer den Nitroxidmarker PROXYL zum Hydroxylamin reduziert. Das resuspendierte Pellet wird erneut zentrifu- giert und gewaschen (je 0,2 ml Aqua dest. auf 1 mg Protein), insgesamt fünfmal. Letzt- endlich wird das pelletierte Protein im gewünschten Puffer gelöst. Die hier beschriebe- ne Methode wurde vorwiegend in Experimenten zur Faltungskinetik des LHCII einge- setzt und ist nicht zur Fällung des TEMPO-markierten Lhcb1 geeignet (sofortige Redu- zierung zum Hydroxylamin; Kroll, 1999). Material: LHCP 15 % TCA Aqua dest. 2.7.5 Detergenzwechsel-Rekonstitution Als Besonderheit lässt sich das Membranprotein LHCII in vitro aus Apoprotein, Pig- ment und Lipid bzw. Detergenz zu funktionalen Pigment-Protein-Komplexen rekonstitu- ieren. Die dabei gebildeten Komplexe sind mit ihren nativen Vorbildern praktisch iden- tisch (Paulsen et al., 1990; Paulsen et al., 1993; Rühle & Paulsen 2004). Vorteil von rekonstituierbaren Proteinen ist die Möglichkeit durch punktspezifische Mutagenese die Peptidsequenz nach Wunsch ändern zu können und beispielsweise eingeführte Cys kovalent mit Spinmarkern zu markieren. Das spinmarkierte Apoprotein kann dann in die native Konformation rückgefaltet werden und ist für die EPR-Spektroskopie zu- gänglich. Bei der Detergenzwechsel-Rekonstitution wird LHCP-Apoprotein zunächst in 2 % LDS gelöst, um es dann mit Totalpigmentextrakt (in Ethanol) zu mischen. Daraufhin wird Octyl-β-D-glucopyranosid (OG) als nicht-ionisches Detergenz hinzugegeben und Kapitel I 2 Material und Methode 57 Dodecylsulfat als Kaliumsalz ausgefällt. Durch Entzug des ionischen Detergenz Dode- cylsulfat werden die hydrophoben Domänen des Apoproteins „gezwungen“ in eine neue Umgebung, in diesem Fall die OG-Mizellen, zu wechseln. Es wird angenommen, dass bei diesem Prozess, initiiert und kontrolliert durch Bindung der Pigmente, die Fal- tung des Proteins stattfindet. Je nach Versuchsansatz wurde hierfür entweder markiertes (in 2xSolubilisie- rungspuffer) oder unmarkiertes Apoprotein (in Tris-Puffer) eingesetzt. Im Folgenden soll eine Rekonstitution mit 120 µg unmarkiertem LHCP beschrieben werden. Es gilt zu beachten, dass die verwendeten Pigmente zügig und stets auf Eis und im Dunkeln verarbeitet werden. Hierzu wurden 120 µg LHCP in 150 µl 2 x Solubilisierungspuffer und 150 µl Aqua dest. gelöst und 2 min im Wasserbad bei 100 °C gekocht. Nach Ab- kühlung der Probe bei Raumtemperatur erfolgte die Zugabe von 4,3 µl frisch angesetz- tem β-Me (1 mol/l) und die Zugabe des Pigments. Der hierfür verwendete Totalpig- mentextrakt (3fach molarer Chl-Überschuss über Protein) wurde zuvor in 1/10 Volumen (w/v) eiskaltem Ethanol (p.A.) gelöst (Ultraschallbad) und unter kräftigem Mischen der Proteinlösung hinzugefügt. Nach 5 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurde dem Gemisch 43 µl 10 % OG hinzugefügt, erneut gut gemischt und wieder 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 43 µl 2 mol/l KCl wurde erneut erneut ordentlich gemischt, 10 min auf Eis inkubiert, um schließlich das ausgefallene Kalium- dodecylsulfat (KDS) durch Zentrifugation (2x) zu pelletieren (4 °C, 12000 Upm, 5 min). Der Überstand mit den rekonstituierten Komplexen wurde abgehoben und direkt wei- terverarbeitet. Die (kurzzeitige) Aufbewahrung des rekonstituierten Proteins erfolgte auf Eis im Dunkeln. Material: 2xSolubilisierungspuffer: 200 mmol/l Tris/HCl (pH 9,0) 10 mmol/l ε-Aminocapronsäure 2 mmol/l Benzamidin 25 % (w/v) Saccharose 4 % LDS β-Me (1 mol/l) Ethanol (p.A.) Totalpigmentextrakt 10 % OG 2 mol/l KCl 2.7.6 Immobilisierung und Trimerisierung des rekombinanten LHCII mittels des „His6 tag“/Ni2+-IDA-Sepharose®-Systems Der Hexahistidyl-Marker („His6 tag“) ist ein gebräuchliches Aminosäuresequenz-Motiv in Proteinen, welches sich zur Durchführung der Affinitätschromatographie eignet und molekularbiologisch an den N- oder C-Terminus von rekombinanten Proteinen inseriert Kapitel I 58 2 Material und Methode wird. Die Sequenz des „His6 tag“ ist mit sechs Aminosäuren recht kurz und bei pH 8,0 ungeladen, so dass die Proteinfaltung bzw. die Konformation des Proteins in der Regel nicht beeinflusst werden. Ein Protein mit „His6 tag“ kann über die Histidine an Ni2+ komplex gebunden werden, welches wiederum, wie in Kap. II genauer beschrieben, an verschiedene Formen der Sepharose komplex gebunden werden kann. Ein Beispiel hierfür ist die in Abb. 1.2.10 dargestellte Ni2+-IDA-Sepharose® der Firma GE Healthcare (Schweden). Hier werden Nickel-Ionen über drei der sechs Koordinationsstellen mit Iminodiessigsäure (Iminodiacetic acid, IDA) komplexiert, es verbleiben also drei Koor- dinationsstellen zur Bindung des „His6 tag“. Abb. 1.2.10: Darstellung der Ni2+-IDA-Interaktion der IDA-Sepharose und freie Koordinations- stellen zur Bindung des „His6 tag“ (nach Qiagen, Hilden 2003). Wie schon 1998 durch Rogl et al. gezeigt wurde, ist es möglich denaturierten LHCP an der Ni2+-Säule (Ni-Säule) zu immobilisieren und rückzufalten. Auch die Bindung bereits rekonstituierter LHCII-Komplexe wurde erfolgreich bewiesen und ist beispielsweise in Rühle & Paulsen (2004) beschrieben. Hierbei kommt es zudem jeweils zur Trimerisie- rung der Komplexe, die im Anschluss durch Zugabe eines Überschusses an Imidazol, welches mit dem gebundenen Protein um die Koordinationsstellen konkurriert, eluiert werden können. Zur Trimerisierung von rekonstituiertem LHCII wurden zunächst Chroma- tographiesäulen von Hand vorbereitet. Hierzu wurde pro 1 mg Protein max. 1 ml Sepharose [Endvolumen, ohne Ethanol; von nun an als ein Säulenvolumen (SV) be- zeichnet] in den Säulen sedimentiert und mit zwei SV 0,3 mol/l NiCl2-Lösung beladen. Überschüssiges Nickel wurde mittels drei SV 50 mmol/l Tris/HCl-Puffer entfernt, ein- hergehend mit einem charakteristischen Farbumschlag der Sepharose von grün zu blau. Die Nickel-beladene Sepharose wurde daraufhin mit zwei SV kaltem (4 °C) OG- Puffer äquilibriert und mit rekonstituierten LHCII-Komplexen beladen. Nach Durchlau- fen der Protein-haltigen Lösung und einer Inkubationszeit von max. 30 min (hierbei wurde daraufgeachtet, dass die Säule nicht trocken lief), wurde die dunkelgrün gefärb- te Säule mit drei SV OG-Puffer und zwei SV TX-Puffer gewaschen. Zu Ende dieser Kapitel I 2 Material und Methode 59 Waschschritte war der Durchfluss in der Regel klar und die Säule im oberen Bereich tief grün gefärbt. Die Elution der Komplexe erfolgte durch Zugabe mehrerer Volumina des Imidazol-haltigen Eluat-Puffers. Grünliche Fraktionen des Eluats wurden aufgefan- gen und weiterverwendet. Die Regenerierung der Sepharose erfolgte durch Waschen mit 2 ml SDS/Imidazol und 2 ml EDTA. Zusätzlich wurde die Sepharose mit ausrei- chend entgastem Aqua reinst gespült und schließlich in 20 % Ethanol kühl (4 °C) gela- gert. Mit dem „His6 tag“/Ni2+-IDA-Sepharose-System kompatible Reagenzien sind mit einsetzbaren Höchstkonzentrationen in Tab. 1.2.16 aufgelistet (GE-Heathcare, Schwe- den). Tab. 1.2.16: Auszug der mit dem „His tag“/Ni2+6 -IDA-Sepharose-System kompatiblen Reagen- zien und der einsetzbaren Höchstkonzentrationen (GE-Heathcare, Schweden). Reagenz Konzentration Reduktionsmittel DTT 5 mmol/l β-Me 20 mmol/l TCP 5 mmol/l Detergentien Nicht-ionische Detergentien (TX, Tween 20) 2 % Cholat (anionisch) 2 % CHAPS (zwitterionisch) 1 % Andere EDTA 1 mmol/l Ethanol 20 % Glycerol 50 % Imidazol 500 mmol/l Harnstoff 8 mol/l GndHCl 6 mol/l Tris, HEPES, MOPS (pH 7,4) 100 mmol/l Material: Sepharose Chelating Sepharose Fast Flow, GE Healthcare, Schweden Aqua reinst 0,3 mol/l NiCl2 50 mmol/l Tris/HCl (pH 7,5) 2 % SDS/0,4 mol/l Imidazol 0,1 mol/l EDTA 20 % Ethanol Kapitel I 60 2 Material und Methode OG-Puffer: 1 % OG (w/v) 0,1 mol/l Tris/HCl (pH 9,0) 12,5 % Saccharose TX-Puffer: 0,05 % TX (v/v) 0,1 mol/l Tris/HCl (pH 7,5) 0,1 mg/ml PG Eluat-Puffer mit Imidazol: 0,05 % TX (v/v) 0,1 mol/l Tris/HCl (pH 7,5) 0,1 mg/ml PG 0,3 mol/l Imidazol 2.7.7 Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation Um rekombinante Lichtsammlerkomplexe nach Detergenzwechsel-Rekonstitution oder Trimerisierung von ungefaltetem Protein und freiem Pigment zu trennen, wurden die Protein-Pigment-Komplexe mit Hilfe der Saccharose-Dichtegradienten- Ultrazentrifugation (UZ) aufgereinigt. Zur Herstellung der Saccharose-Dichtegradienten wurde eine Gradientenlösung gemischt, in Gradientenröhrchen gefüllt und bei -20 °C eingefroren. Durch langsames Auftauen bei 4 °C entsteht im Röhrchen ein linearer Saccharose-Gradient mit der höchsten Saccharosekonzentration am Röhrchenboden. Von solchen aufgetauten Gradienten wurde die oberste Schicht entfernt und vorsichtig das zu trennende Gemisch aufgetragen. Die beladenen Röhrchen wurden genau aus- tariert und bei 4 °C für 16 Stunden bei 37000 (SW 40/41Ti) bzw. 54000 Upm (SW 60Ti) unter Vakuum zentrifugiert. Am folgenden Tag konnten die getrennten Komplexe mit- tels einer Spritze aus den Gradienten gesaugt und analysiert werden. Material: Gradientenlösung: 0,3 mol/l (SW 40/41Ti) bzw. 0,6 mol/l (SW 60Ti) Saccharose 5 mmol/l Tricine (pH 7,8) 0,1 % n-Dodecyl-β-D-Maltosid (LM) bzw. 0,05 % TX 2.7.8 Aufkonzentrierung von LHCII Um EPR-Spektren mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis messen zu können, ist es notwendig LHCII-Proben auf Konzentrationen von 300 µmol/l LHCII aufzukonzent- rieren. Durch die Abnahme des Rauschens werden sowohl die Unsicherheiten der Tik- honov-Regularisierung verringert, als auch die Messzeiten am EPR-Spektrometer ver- kürzt. Kapitel I 2 Material und Methode 61 Deshalb wurden spinmarkierte LHCII-Proben nach UZ-Aufreinigung (Kap. I, 2.7.7) in „Amicon Ultra MW 30“ Zentrifugalfiltereinheiten aufkonzentriert. Diese Filter- einheiten enthalten eine Polycarbonatmembran, welche Proteine bis zu einer Größe von 30 kDa passieren lässt. Rekombinanter LHCII in Detergenzmizellen hat eine Mas- se von über 50 kDa und kann daher, im Gegensatz zum Lösungsmittel, die Membran nicht passieren. Zur Aufkonzentrierung wurden bis zu 4 ml der rekonstituierten LHCII- Monomere nach UZ in einem „Amicon Ultra MW 30“-Röhrchen bei 4 °C und 5000 Upm zentrifugiert (Hettich Kühlzentrifuge). Die Zentrifugation wurde alle 15 min unterbro- chen, abzentrifugierte klare Pufferlösung entfernt und die aufkonzentrierte tiefgrüne LHCII-Lösung durch Vortexen von der Membran gelöst. Bei einem Endvolumen von 50 µl wurde der Vorgang abgebrochen und ein Aliquot der aufkonzentrierten LHCII-Probe gemäß Butler & Kühlbrandt (1988) im Mikrotiterplatten-Photometer quantifiziert (Kap. I, 2.7.9). Material: Amicon Ultra MW-30 Millipore, Cork Irland 2.7.9 Konzentrationsbestimmung von LHCII nach Butler & Kühlbrandt (1988) Die Konzentration von LHCII-Monomeren und -Trimeren kann mittels eines von Butler & Kühlbrandt (1988) bestimmten molaren Extinktionskoeffizienten photometrisch bei einer Wellenlänge von 670 nm ermittelt werden. Dazu wurden drei Aliquots (5 µl) auf- konzentrierter LHCII-Proben mit 495 µl Saccharose-Gradientenlösung (Kap. I, 2.7.7) verdünnt und photometrisch quantifiziert. Hierfür gilt: εLHCII = 5,46 x 105 [cm-1 x M-1] Nach dem Gesetz von Lambert-Beer folgt daraus für eine 1 cm Küvette (Lottspeich, 1998): cLHCII = ELHCII / εLHCII [mol/l] x Verdünnungsfaktor (E = gemessene Absorption; ε = molarer Extinktionskoeffizient; c = Konzentration in mol/l) 2.8 Analytische Methoden Die in diesem Abschnitt beschriebenen analytischen Methoden dienten zum einen der Qualitätskontrolle des rekombinanten LHCII (Kap. I-III) und des nativen LHCII (Kap. IV), sowie der Analyse der Struktur des rekombinanten LHCII mittels EPR- Spektroskopie (Kap. I-III). Kapitel I 62 2 Material und Methode 2.8.1 Gelelektrophorese 2.8.1.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli (1970) Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist eine Methode zur Auftren- nung von Proteingemischen. Die Proteine werden hierbei allein anhand ihrer Größe aufgetrennt. Die Auftrennung wird erreicht, indem man die Proteine in einem elektri- schen Feld mit einem Elektrodenpuffer durch eine Gelmatrix wandern lässt. Diese Gelmatrix entsteht durch eine Radikalkettenpolymerisation von Acrylamid und Bisacry- lamid, wobei Ammoniumpersulfat (APS) als Radikalbildner und N,N,N,N- tetramethylethylendiamin (TEMED) als Katalysator dienen. Um zu verhindern, dass die Eigenladung der Proteine Einfluss auf deren Wanderungsstrecke ausübt, wird ein ioni- sches Detergenz (SDS) eingesetzt, welches die Eigenladung der Proteine überlagert. Hierbei ist zu beachten, dass eine Proportionalität zwischen der Anzahl geladener SDS-Moleküle und der Proteinmasse besteht (ca. 1,4 g SDS/1 g Protein). Nach der Behandlung mit SDS sind alle Proteine gleichmäßig negativ geladen, so dass eine Auf- trennung nach der Proteingröße gewährleistet ist. Um schärfere Proteinbanden zu erhalten, wird in den meisten Fällen eine dis- kontinuierliche SDS-PAGE nach Laemmli (1970) durchgeführt. Das bedeutet, dass dem Trenn-Gel noch ein Sammel-Gel vorgeschaltet wird, welches gleiche Ausgangs- bedingungen für alle in der Probe enthaltenen Proteine schaffen soll. Bei dem Sammel- Gel handelt es sich um ein weitporiges Gel, bei dem die Proteingröße keinen Einfluss auf die Wanderungsgeschwindigkeit hat. Hier wird ein starker elektrischer Feldgradient aufgebaut, der dafür sorgt, dass auf alle Proteine die gleiche beschleunigende Kraft ausgeübt wird. Das Ergebnis ist ein „Zusammenschieben“ der Proben, so dass alle Proteine vom gleichen Startpunkt aus getrennt werden können. Herstellung der PA-Gele In der vorliegenden Arbeit wurden 0,75 mm dicke Gele mit 4,5%igem Sammel-Gel und 10%igen oder 15%igen Trenn-Gelen verwendet. Nach Aufbau einer Gießkammer, die 10 Gele gleichzeitig fasst, wurden die Lösungen für Sammel- und Trenn-Gel gemischt (Tab. 1.2.17) und, um Luftblasen im Gel zu vermeiden, mittels Wasserstrahlpumpe entgast. Nach Zugabe von APS und TEMED in die Trenn-Gel-Lösung wurde die Gieß- kammer rasch zu etwa ¾ der Gesamthöhe befüllt. Damit sich beim Polymerisieren des Trenn-Gels ein gerader Rand bildet, wurde jedes Gel mit 400 µl Wasser überschichtet. Nach Polymerisation wurde das Wasser mit Filterpapier gründlich entfernt, die Sam- mel-Gel-Lösung ebenfalls mit APS und TEMED versetzt und rasch auf das Trenn-Gel gegossen. Außerdem wurde in jedes Gel ein Kamm gesteckt, damit sich beim Polyme- risieren entsprechende Probentaschen bilden. Nach einer Polymerisationsdauer von ca. einer Stunde wurden die Kämme entfernt und die fertigen Gele in angefeuchteter Kapitel I 2 Material und Methode 63 Cellophanfolie bei 4 °C gelagert. Unter diesen Bedingungen betrug die Haltbarkeit ca. 2 Wochen. Tab. 1.2.17: Zusammensetzung der Acrylamidlösungen zur Herstellung von 10 Gelen. Stammlösungen Trenn-Gel 10 % Trenn-Gel 15 % Sammel-Gel 4,5 % 30 % Acrylamid/ 1 % Bisacrylamid 18 ml 27,4 ml 6 ml 1 M Tris/HCl (pH 8,8) 22,6 ml 22,6 ml ----- 1 M Tris/HCl (pH 6,8) ----- ----- 5,2 ml 80 % Glycerin 3,4 ml 3,4 ml 5 ml Aqua dest. 11,2 ml 1,8 ml 23,4 ml APS 10 % 400 µl 400 µl 200 µl TEMED 26 µl 26 µl 20 µl Zur Denaturierung der Proteine wurden die Proben mit ¼ Volumen Sparmix versetzt und 2 min bei 100 °C gekocht. Danach wurden Proben mit Proteinmengen von 2 bis 3 µg in die Geltaschen geladen. Um später die genauen Molekularmassen der aufge- trennten Proteine bestimmen zu können, wurde zudem eine Tasche mit 3 µl SDS7- Laufmarker (Kap. I, 2.3.2) beladen. Zum Sammeln des Proteins wurde die Elektropho- rese mit einer Spannung von 70 Volt gestartet, diese wurde dann, sobald die Probe das Trenngel erreicht hatte, auf 150 bis 200 Volt erhöht. Als Laufpuffer wurde SDS- Puffer verwendet. Material: Midget-Gelkammersystem Glas- und Aluminiumoxidplatten Spacer, Kämme SDS-Laufpuffer: 25 mmol/l Tris 192 mmol/l Glycin 0,1 % (v/v) SDS; 0,5 mmol/l EDTA Sparmix (4x): 4 % SDS 1,4 mol/l β-Me 24 % Glycerin 100 mmol/l Tris (pH 7,0) 20 mmol/l Bromphenolblau 2.8.1.2 Schwach-denaturierende Gelelektrophorese („grüne Gele“) nach Peter & Thornber (1991) Unter schonenden Bedingungen eignet sich die Gelelektrophorese zur Isolierung und Auftrennung von intakten Protein-Pigment-Komplexen. Im Unterschied zur denaturie- Kapitel I 64 2 Material und Methode renden SDS-PAGE enthielten die „grünen Gele“ nur 10 % Polyacrylamid, zudem wurde die Spannung reduziert, die Laufkammer gekühlt. Auf ein Aufkochen der Proben mit denaturierendem Sparmix wurde verzichtet. Die Elektrophorese wurde entweder mit LDS-Laufpuffer oder mit Deriphat-Puffer durchgeführt, wie in einzelnen Experimenten angegeben. Zur Durchführung wurde zu den rekonstituierten Komplexen ohne weitere Vor- behandlung etwa 1/5 Volumen an 80%igem Glycerin zur Erhöhung der Dichte zugege- ben. Zur Schonung der Komplexe wurde die Elektrophoresekammer abgedunkelt, auf 4 °C gekühlt und eine Spannung von 40 V angelegt, bis die Proben vollständig in das Sammel-Gel eingelaufen waren. Bei Erreichen des Trenn-Gels wurde die Spannung auf 80 bis 100 V erhöht. Material: Glycerin 80 % Deriphat-Puffer: 0,15 % Deriphat 48 mmol/l Glycin 12mmol/l Tris LDS-Laufpuffer: 25 mmol/l Tris 192 mmol/l Glycin 0,1 % LDS 0,5 mmol/l EDTA 2.8.1.2.1 Umkristallisation von Deriphat nach H. Paulsen Da Deriphat als Feststoff der Firma Henkel nicht länger zur Verfügung steht, war es notwendig flüssiges „Deriphat 160C“ in der schwach denaturierenden Gelelektrophore- se einzusetzen. Da aber sowohl die Konzentration als auch die Natur des Lösungsmit- tels unbekannt war, war eine Aufreinigung des Deriphat durch Umkristallisation unum- gänglich. Hierzu wurde flüssiges „Deriphat 160 C“ eingetrocknet, zunächst durch Ab- kühlung auf -20 °C mit anschließender Gefriertrocknung. Da dies allerdings zu dauer- haften Schäden an der Vakuumkammer des Lyophilisators führte, wurde in Folgean- sätzen zunächst der Großteil des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer im warmen Wasserbad verdampft. Getrockenes „Deriphat 160C“ wurde daraufhin in 1-Propanol aufgeschlämmt und sehr vorsichtig auf der Heizplatte im Abzug aufgekocht (Brandge- fahr). Durch langsames Abkühlen bis auf -20 °C wurde das Deriphat kristallisiert und der Bodensatz filtriert. Das Filtrat wurde zunächst am Rotationsverdampfer und darauf- folgend im Lyophilisator eingetrocknet und bei Raumtemperatur gelagert. Material: 1-Propanol Kapitel I 2 Material und Methode 65 2.8.1.3 Coomassie-Brilliant-Blaufärbung Sowohl denaturierende als auch schwach denaturierende Gele können nach elektrophoretischer Auftrennung der Proteine mit dem Farbstoff Coomassie-Brilliant- Blau angefärbt werden, um einzelne Proteinbanden sichtbar zu machen. Dieser Triphenylmethanfarbstoff, der Komplexe mit Proteinen bildet, bindet unspezifisch an kationische, unpolare und hydrophobe Bereiche der Proteine. Zur Anfärbung der Prote- inbanden wurden die Gele 20 min in Coomassie-Färbelösung geschwenkt und danach für 20 min im ersten Entfärber, welcher Essigsäure und Ethanol zur Fixierung der Pro- teine und Entfernung des überschüssigen Farbstoffs enthält, inkubiert. Anschließend wurden die Gele so lange in einem zweiten Entfärber geschwenkt bis die Gele mit Ausnahme der Proteinbanden vollständig entfärbt sind. Nach Abwaschen des Entfär- bers mit Aqua dest. wurde das Gel fotografiert und in Einmachfolie auf dem Geltrockner getrocknet. Material: Coomassie-Lösung (100 ml): 175 mg Coomassie Brilliant Blue (Serva, Heidelberg) 50 ml Ethanol 7 ml Essigsäure 43 ml Aqua dest. Entfärber 1: 20 % Ethanol 7 % Essigsäure Entfärber 2: 10 % Essigsäure 2.8.1.4 Densitometrische Auswertung von PA-Gelen mittels Versa Doc Die densitometrische Auswertung von PA-Gelen in Lhcb1-Nachmarkierungsversuchen (Kap. I und Kap. II) erfolgte nach Auftrennung der fluoreszenzmarkierten Proteine in einem 15%igen SDS-Gel mittels Versa Doc. Dazu wurde BODIPY durch Licht der Wel- lenlänge 510 nm für 60 Sekunden belichtet und mit geöffneter Blende (Blende 3,5) die Fluoreszenzemission bei 543 nm fotografiert. DY731 wurde dagegen im UV-Bereich angeregt und die Fluoreszenz-Emission bei 759 nm fotografiert. Im zweiten Schritt wurde die Intensität der Proteinbanden nach Coomassie-Färbung (Kap. I, 2.8.1.3) be- stimmt und dann mit der Software „Quantity One“ (BioRad) analysiert. 2.8.2 Spektroskopie 2.8.2.1 Absorptionsspektroskopie Mit Hilfe der Absorptionsspektroskopie konnten in der vorliegenden Arbeit die Konzent- rationen von Pigmenten und Protein in verschiedenen Arbeitsschritten ermittelt werden. Wie in Kap. I (2.7.1.3) beschrieben, wurde vor Durchführung der Rekonstitution mittels Kapitel I 66 2 Material und Methode Absorptionsspektroskopie die Konzentration des Chlorophylls im Totalpigmentextrakt nach Porra et al. (1989) geprüft. Auch die Bestimmung der LHCP-Konzentration erfolg- te durch Absorptionsmessungen. Diese wurden, wie in Kap. I, 2.7.3 beschrieben, durch Messung der Proteinabsorption bei 280 nm ermittelt. Die Proteinkonzentration des ge- falteten LHCII nach Rekonstitution wurde dagegen nach Butler & Kühlbrandt (1988) (Kap. I, 2.7.9) durch Messung der Absorption bei 670 nm bestimmt. 2.8.2.2 Fluoreszenzspektroskopie Die Fluoreszenzspektroskopie ermöglicht es, die Energieleitung innerhalb einer Anord- nung von Chromophoren zu verfolgen. Sowohl in rekonstituiertem als auch in nativem LHCII können so Rückschlüsse gezogen werden, ob die Pigment-Protein-Komplexe korrekt gefaltet und intakt sind. Diese Eigenschaft des LHCII nutzend, wurden Emissi- onsspektren von rekombinanten LHCII-Monomeren und -Trimeren nach UZ- Aufreinigung aufgenommen (Kap. I-III) sowie von nativen LHCII-Trimeren in Insertions- versuchen (Kap. IV). Hierzu wurde die eingestellte Probe durch blaues Licht der kon- stanten Wellenlänge 470 nm über den Monochromator angeregt und über einen Emis- sionsbereich von 600 bis 800 nm vermessen. Sind die Komplexe intakt, übertragen das angeregte Chl b und die Carotinoide die Anregungsenergie vollständig auf Chl a. Da sich die Komplexe aber nicht wie in vivo in der Thylakoidmembran befinden, sondern in Detergenz-Mischmizellen, kann die Anregungsenergie nicht photochemisch genutzt werden und wird als Fluoreszenzlicht von Chl a bei einer Wellenlänge von 680 nm emittiert. Ist der Energietransfer dagegen aufgrund unvollständiger Faltung oder Zer- störung der Komplexe gestört, kann Chl b die Energie nicht auf Chl a übertragen und fluoresziert bei der charakteristischen Wellenlänge von 653 nm. Weiterhin können un- gebundene Chl bei unzureichender Aufreinigung oder Zerfall der Komplexe aggregie- ren. Unter den gewählten Messbedingungen (Raumtemperatur) emittiert ungebunde- nes Chl a bei ca. 675 nm. Alle Messungen von Fluoreszenz-Emissionsspektren fanden in Lösung in einer 5 mm dicken Küvette bei Raumtemperatur statt. Bei hohen Probenkonzentrationen wurde stets die „front face“-Apparatur eingesetzt. Messparameter: Anregung: 470 nm Detektion: 600–800 nm Slit: 3/3 Lamp Level: 2 Signal: S/R Integrationszeit: 0,1 s Kapitel I 2 Material und Methode 67 2.8.2.3 Circular-Dichroismus (CD)-Spektroskopie Die Circular-Dichroismus (CD) -Spektroskopie ist eine Methode, die unter anderem zur Analyse von Proteinsekundärstrukturen oder zur Untersuchung der Faltung und Entfal- tung von Proteinen eingesetzt wird. Sie beruht auf der Eigenschaft von optisch aktiven, chiralen Molekülen, links- und rechtszirkular polarisiertes Licht unterschiedlich stark zu absorbieren. Dazu wird in einem Monochromator linear polarisiertes Licht erzeugt, wel- ches dann durch einen photoelastischen Modulator unter dem Einfluss eines hochfre- quenten elektrischen Wechselfeldes in links- und rechtszirkular polarisiertes Licht um- gewandelt wird. Nach Durchdringen der Probe wird die Intensität der links- bzw. rechtszirkular polarisierten Komponente der austretenden Welle durch einen mit dem Modulator synchron geschalteten Detektor gemessen und die mit rechtsdrehendem Licht gemessene Absorption von der mit linksdrehendem Licht gemessenen Absorption subtrahiert. Im Prinzip stellen CD-Spektren also Differenzspektren dar. Diese gemes- sene Differenz ∆ε = εL-εR wird als sogenannte Elliptizität θ angegeben (Lottspeich, 1998). Es gilt: θ (λ)= const. (εL-εR)x c x d [degree cm²/dmol] Eine weitere Anwendung der CD-Spektroskopie findet sich in der Untersuchung der Kopplung von chromophoren Gruppen in Biomolekülen durch Messungen im sichtba- ren und im nahen Infrarotspektralbereich. Hierbei kann eine enge elektronische Kopp- lung, wie sie z.B. zwischen den an den LHCII gebundenen Chlorophyllen und Caroti- noiden besteht, zu einer Anhebung oder Absenkung von elektronischen Niveaus füh- ren, welche im CD-Spektrum als deutliche positiv/negativ Bandenpaare sichtbar wer- den. Liegen die Chlorophyllmoleküle hierbei in enger Nachbarschaft zueinander, kön- nen sich ihre π–Elektronenwolken gegenseitig beeinflussen und es kann durch Ener- gietransfer entweder zu einer Signalverstärkung oder zu einem Aufspalten der Banden („excitonic split“) kommen. Solch eine Signalverstärkung kann man bei der engen Kopplung zweier LHCII-Moleküle beobachten, das Aufspalten der Banden bei enger Kopplung benachbarter Chlorophyllmoleküle, so dass CD-Spektren im sichtbaren Be- reich des Lichtes Aussagen über Chlorophyllbindung und den Abstand der Chlorophyl- le zueinander im LHCII zulassen. Bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Proben handelte es sich zum einen um aufgereinigte LHCII-Monomere und -Trimere verschiedener Mutanten (Kap. I-III), sowie um native Trimere in Insertionsversuchen (Kap. IV), die auf ihre Intaktheit und ihren Oligomerisierungsgrad geprüft wurden. Hierzu wurden die Proben in Quarz- Küvetten bei folgenden Parametern CD-spektroskopisch untersucht: Kapitel I 68 2 Material und Methode Messparameter: Wellenlängenbereich: 400-750 nm Data Pitch: 1 nm Response: 2 s Bandwidth: 4 nm Accumulation: 1 Sensitivity: Standard Scanning Speed: 100 nm/min 2.8.2.4 EPR-Spektroskopie Alle in dieser Arbeit gemessenen EPR-Spektren des rekombinanten LHCII wurden an PROXYL-markierten Proben durchgeführt. Lediglich in der Versuchsreihe zum Ver- gleich der Markierungseffizienz und chemischen Stabilität verschiedener Spinmarker wurde LHCII mit dem Marker TEMPO spinmarkiert (Kap. I). Die Herstellung einzelner spinmarkierter LHCII-Proben wurde nach unterschiedlichen Protokollen durchgeführt und ist jeweils in Material und Methode oder im Ergebnisteil der einzelnen Kapitel be- schrieben. 2.8.2.4.1 continuous wave-EPR (CW-EPR) Die CW-EPR-Messungen zur Messung der Zugänglichkeit einzelner Proteindomänen („CW progressive power saturation measurements“) wurden von Dr. Aleksei Volkov am Max-Planck-Institut für Polymerforschung (Mainz) durchgeführt. Eine genaue Be- schreibung der Methode und der verwendeten Materialien findet sich in Kap. III (3.1.1.1) der vorliegenden Dissertation. 2.8.2.4.2 Puls-EPR Die Vier-Puls DEER-Messung der heterogenen Trimere aus den Proteinen st106/160h und C3.2h (Kap. II) sowie der Proben der Diplomanden A. Müller (2008) und C. Dietz (2008) wurden von Prof. Dr. Gunnar Jeschke an der Eidgenössischen Hochschule in Zürich (Schweiz) an einem Elexsys EX 580 EPR-Spektrometer mit einem dielektri- schen Puls-ENDOR-Resonator EN4118X-MD-4 (Bruker, Rheinstetten) durchgeführt. Der Resonator war auf Q ~ 100 überkoppelt. Alle übrigen Vier-Puls DEER-Messungen wurden von Dr. Aleksei Volkov am Max-Planck-Institut für Polymerforschung (Mainz) an einem Elexsys EX 580 EPR- Spektrometer mit einem Flexline Split-Ring Resonator ER 4118X_MS3 (Bruker, Rheinstetten) durchgeführt. Der Resonator war auf Q ~ 100 überkoppelt. Alle Puls-Messungen wurden bei 50 K durchgeführt, die Kühlung geschah durch den Eisatz flüssigen Heliums (Oxford CF935 Cryostat, Oxford ITC4 Temperatur- Kontrolleinheit). Echodetektierte feldabgetastete EPR-Spektren wurden mit der Hahn- Echo-Pulssequenz π/2-τ-π-τ-echo (Schweiger & Jeschke, 2001) mit 15mT Feld- Kapitel I 2 Material und Methode 69 Abtastung vermessen. Die Zwischenpuls-Verzögerung τ war 200 ns lang bei einer Pulslänge von 16 ns für den π/2-Puls und von 32 ns für den π-Puls. Die Integrations- fensterbreite lag bei 200 ns. Vier-Puls DEER-Abstandsmessungen wurden bei X-Band-Freqenzen mit einer π/2(νobserver)-τ1-π(ν observer)-t`-π(νpump)-(τ1 + τ2 – t`)-π(ν observer)-t2-echo Pulssequenz mit einem [(+x)-(-x)] Phasenzyklus, angelegt an den π/2-Puls, durchgeführt. Die Zeit t` wurde in Stufen von 8 ns schrittweise erhöht, die Zeit τ1 =200 ns wurde konstant gehal- ten. τ2 variierte zwischen 0,8 µs und 2,5 µs (in Abhängigkeit des T2- Relaxationsverhalten und der Abstandslänge). Die dipolare Evolutionszeit wurde defi- niert als t= t`-τ1, die Datenanalyse wurde bei t>0 ns durchgeführt. Die Pumpfrequenz (νpump) war auf das Zentrum der Resonator-Senke eingestellt und stimmte mit dem Ma- ximum des Nitroxid-EPR-Spektrums überein, die Beobachterfrequenz (νobserver) lag 65 MHz höher und stimmte mit dem Niedrig-Feld-Maximum des Nitroxid-EPR-Spektrums überein. Der Beobachterpuls für den π/2-Puls und den π-Puls war jeweils 32 ns lang, der Pumppuls (π) war 12 ns (Volkov) bzw. 20 ns (Jeschke) lang. Die Breite des Integra- tionsfensters lag bei 32 ns. Die Protonenmodulation geschah durch Übereinanderle- gung von 8 unterschiedlichen τ1-Werten, angefangen bei τ1= 200 ns mit einer schritt- weisen Erhöhung um je 8 ns. Die Messdauer eines DEER-Experimentes lag zwischen 8 und 12 Stunden. Die Datenauswertung der DEER-Experimente erfolgte jeweils durch Prof. Dr. Gunnar Jeschke oder durch Dr. Aleksei Volkov mittels der von Gunnar Jesch- ke geschriebenen Software „DeerAnalysis2006“, welche freizugänglich ist unter http://www.mpip-mainz.mpg.de/~jeschke/distance.html. Methode und Durchführung der Drei-Puls ESEEM-EPR-Experimente sind in Kap. III (3.1.1.1) der vorliegenden Dissertationsschrift genau beschrieben. Kapitel I 70 3 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Einleitung Grundvoraussetzung zur Durchführung von EPR-Experimenten an rekombinantem LHCII war die gerichtete, effiziente und dauerhaft stabile Markierung der Pigment- Protein-Komplexe mit paramagnetischen Spinmarkern. Ziel der Experimente des vor- liegenden Kapitels war daher nicht nur eine Optimierung der Spinmarkierung an sich, sondern auch die möglichst effiziente Herstellung einer Vielzahl neuer Lhcb1-Cys- Klone durch Mutagenese des Lhcb1-Gens. Zur Optimierung der Wirtschaftlichkeit sol- cher Mutagenesen bei gleichzeitiger Minimierung des Arbeitsaufwandes wurde daher eine moderne Mutagenese-Technik basierend auf einer einzelnen PCR-Reaktion ge- testet und mit bewährten Methoden verglichen (Kap. I, 3.2). Hierbei entstandene Mut- anten des Lhcb1 wurden überexprimiert, rückgefaltet und sowohl biochemisch als auch spektroskopisch analysiert und charakterisiert (Kap. I, 3.4). Zur Verbesserung der Mar- kierungsausbeute und zur Optimierung der Spinzahl in Protein-Pigment-Komplexen wurde zudem die Verwendung eines alternativen Spinmarkers getestet (Kap. I, 3.5). 3.2 Herstellung neuer Klone mittels punktspezifischer Mutagenese Zur Herstellung neuer Lhcb1-Klone wurden unterschiedliche Strategien angewendet. Hierbei kamen sowohl altbewährte Techniken, wie die später beschriebene Restriktion und Ligation bereits vorhandener Klone, als auch moderne Techniken, wie die im Fol- genden beschriebene punktspezifische Mutagenese mittels „Quikchange® II site- directed mutagenesis kit“ (Stratagene) zum Einsatz. Die von Plunger (2007) verwende- te Insertions-PCR, soll in dieser Arbeit nicht genauer behandelt werden. Die bis dato gebräuchliche Technik zur Herstellung neuer Lhcb1-Cys-Klone war die punktspezifischer Mutagenese nach Chen & Przybyla (1994), welche auf zwei auf- einanderfolgenden PCR-Schritten sowie einer Kombination von Restriktion und Ligati- on basiert (Hörnemann, 2005). Ein Vorteil dieser Methode war zum einem die Verwen- dung kurzer kostengünstiger Mutagenese-Primer sowie das Vorhandensein einer viel- fach bewährten und durchsichtigen Methodenbeschreibung. Nachteil hingegen war ein verhältnismäßig großer Arbeitsaufwand, bedingt durch zeitaufwändige PCR- Reaktionen, Restriktionen, gefolgt von entsprechenden Aufreinigungsschritten mit teils hohen DNA-Verlusten, sowie geringen Ligations- und Transformationsausbeuten Hinzu kamen oftmals hohe Kosten durch das „screening“ mehrerer Kolonien mittels Sequen- zierung. Aus diesen Gründen sollte das „Quikchange® II site-directed mutagenesis kit“ Kapitel I 3 Ergebnisse 71 der Firma Stratagene, welches einen deutlich geringeren Zeitaufwand durch Einspa- rung zahlreicher Arbeitsschritte verspricht, getestet werden. Nachteilig zu bewerten sind hierbei allerdings hohe Anschaffungskosten sowie fehlende Angaben zu Puffer- Rezepten, die ein Nachkochen der Methode mit eigenen Materialien verhindern soll. Das allgemeine Prinzip der punktspezifischen Mutagenese nach Stratagene ist in Ma- terial und Methode dieses Kapitels unter 2.6.10.1 genau dargestellt und soll folgend am Beispiel der Herstellung der Mutanten S59C und S59C/V90C demonstriert werden. Nach Durchführung der Mutagenese-PCR, wurden die Matrizen-Plasmide der jeweiligen PCR-Ansätze zunächst mit der Restriktionsendonuklease DpnI verdaut und mittels Agarose-Gel (Abb. 1.3.1) auf Erfolg der Amplifikation geprüft. Beide PCR- Produkte besitzen die erwartete Größe von ca. 4,3 kb und weisen, obwohl hier lediglich ein Fünftel des PCR-Volumens aufgetragen wurde, eine deutliche DNA-Bande auf, was auf eine erfolgreiche Amplifikation schließen lässt. Abb. 1.3.1: Agarose-Gel (0,8 %) zur Untersuchung der Mutagenese-PCR nach DpnI-Verdau. Auf Spur 1 wurde 10 µl des PCR-Produktes des Mutagenese-Ansatzes S59C, auf Spur 2 10 µl des Mutagenese-Ansatzes S59C/V90C und auf Spur 3 5 µl der 1 kb DNA-Leiter als Marker aufgetragen. Dass es sich bei den jeweiligen Banden um die Matrizen-DNA handelt, kann dagegen ausge- schlossen werden. Das unverdaute Matrizen- Plasmid (in diesem Fall lediglich 10 ng DNA) wäre auf dem Gel zum einen kaum sichtbar gewesen und zum anderen, falls wirklich unverdaut, durch die „super-coil“ Struktur des Plasmids weniger weit gewandert als das „genickte“ PCR-Produkt. Nach erfolgreicher PCR-Amplifikation wur- den im weiteren Protokollverlauf 50 µl superkom- petente Zellen des E. coli-Stammes XL1-Blue mit lediglich 1 µl des verdauten PCR- Produkts transformiert. Dies führte in 98 % der durchgeführten punktspezifischen Mu- tagenesen (Tab. 1.2.2) zu hohen Ausbeuten von bis zu mehreren tausend Kolonien pro LB-Amp-Festmedium (nicht gezeigt). Nach Isolierung der mutierten Plasmid-DNA aus XL1-Blue-Zellen wurden Bakterienzellen des chemokompetenten Expressionsstammes JM101 transformiert, was ebenfalls zu guten Transformationsausbeuten führte. Von allen durchgeführten Mutagenesen wurde letztlich eine vereinzelte Kolonie der JM101- Zellen über Nacht vermehrt, das Plasmid isoliert und das Lhcb1-Gen sequenziert. In der Regel reichte eine einzelne Sequenzierung mit dem Sequenzier-Primer Seq 105 (-) aus, um den erfolgreichen Aminosäurenaustausch zu bestätigen. Zudem wurde von Kapitel I 72 3 Ergebnisse jeder neuen Mutante eine –80 °C Dauerkultur angelegt und das isolierte Plasmid ly- ophilysiert eingefroren. Um die Wirtschaftlichkeit der punktspezifischen Mutagenese weiter zu erhöhen, wurde die Mutagenese der Mutante V90C/S123C zum einen, wie zuvor beschrieben, mit dem „Quikchange® II site-directed mutagenesis kit“ (Stratagene) durchgeführt, zum anderen mit entsprechenden, in der Arbeitsgruppe vorrätigen Enzymen und Lösungen nachgekocht. Überlegung war hierbei die verhältnismäßig hohen Materialkosten des Mutagenese-„kit“ einzusparen. Alle hierfür verwendeten Produkte waren vorher in an- deren Versuchsansätzen für funktionstüchtig befunden worden. Das Ergebnis dieser DpnI-verdauten PCR-Ansätze in Abb.1.3.2 zeigt, dass die Amplifikation mit dem Mutagenese-„kit“ (Spur 2), wie zuvor gezeigt (Abb. 1.3.1), her- vorragend funktioniert. Wieder ist eine deutliche DNA-Bande mit der erwarteten Größe von ca. 4,3 kb vorhanden. Die Intensität ist im Vergleich zu Abb. 1.3.1 geringer, jedoch wurde in diesem Gel nur die Hälfte an PCR-Produkt aufgetragen. Neben der Plasmid- Bande ist zudem noch eine diffuse Bande einer Größe unter 100 bp zu sehen, wobei es sich vermutlich um die überschüssigen Mutagenese-Primer handelt. Diese waren zuvor (Abb. 1.3.1) nicht mehr sichtbar, da sie durch die längere Laufzeit das Gel be- reits verlassen hatten. Abb. 1.3.2: Agarose-Gel (0,8 %) zur Untersuchung verschiedener Ansätze der Mutagenese-PCR V90C/S123C nach DpnI-Verdau. Auf Spur 1 wurde 5 µl der 100 bp DNA-Leiter als Marker aufgetragen, auf Spur 2 5 µl des Pro- duktes nach PCR mit dem „Quikchan- ge kit“, auf Spur 3 5 µl des Produktes nach PCR mit entsprechenden Lösun- gen aus dem Labor und auf Spur 3 5 µl des 1 kb DNA-Leiter (Fermentas) als Marker. Auch in Spur 3, dem nachgekoch- ten PCR-Ansatz, sind die Mutage- nese-Primer als diffuse Bande zu- sehen, das erwartete PCR-Produkt bei 4,3 kb ist hingegen nicht exi- stent. Auch eine Wiederholung des Versuchs führte zu keinem positiven Ergebnis, weshalb bei allen nachfolgenden Muta- genesen auf das Mutagenese-„kit“ der Firma Stratagene zurückgegriffen wurde. Kapitel I 3 Ergebnisse 73 3.3 Herstellung neuer Klone des Lhcb1 mittels Restriktion und Ligati- on am Beispiel der Mutante S59Ch Eine altbewährte Technik zur Herstellung neuer Lhcb1-Mutanten ist die Neukombinati- on bereits vorhandener Klone mittels Restriktion, Aufreinigung und Ligation (Kap. I, 2.6.10.2). Wie in Tab. 1.2.2 zusammengefasst, wurden mittels Restriktion und Ligation die Klone S59Ch (Kap. I), stC79Sh und st106/160h (Kap. II) und V196Ch (Hebel, 2007) hergestellt. Im Fall der Mutante S59Ch wurden die Ausgangsklone S59C und C3.2h (siehe auch Abb. 1.2.8) mit den Restriktionsendonukleasen SacI und BstEII verdaut und, wie in Abb. 1.3.3 dargestellt, mittels Agarose-Gel analysiert. Wie erwartet wurde sowohl das Konstrukt S59C (Spur 2) als auch C3.2h (Spur 3) sauber in zwei Fragmen- te von ca. 380 und 3900 bp geschnitten. Abb. 1.3.3: Restriktion der Vektoren S59C (Spur 2) und C3.2h (Spur 3) zur Herstellung der Lhcb1-Mutante S59Ch. Die Vektoren wurden mit den Restriktion- sendonukleasen SacI und BstEII ge- schnitten und auf einem 0,8 % Agarose- Gel aufgetrennt. In Spur 1 wurden 5 µl 100 bp Leiter aufgetragen, auf Spur 2 2 µl S59C, auf Spur 3 2 µl C3.2h und auf Spur 4 5 µl 1 kb Leiter. Der restliche Restriktionsansatz wur- de mittels präparativer Agarose- Gelelektrophorese aufgetrennt, das kurze Fragment von S59C sowie das lange Fragment von C3.2h aus dem Agarose-Gel isoliert und zum Vektor S59Ch ligiert. Nach Transformation in Zellen des E. coli Expressions- Stammes JM101, wurden von lediglich vier gewachsenen Kolonien zwei sequenziert. Eine vorgeschaltete „dirty“-PCR zur Identifizierung positiver Klone und zur Einsparung von Sequenzierkosten (Kap. I, 2.6.4.1.2), war in dieser Versuchsreihe wenig sinnvoll, da die Unterscheidung des ungeschnittenen bzw. religierten C3.2h-Vektors von kor- rekt-ligiertem S59Ch-Vektor mittels vorhandener Primer nicht möglich war. Beide Kolo- nien wurden positiv auf eine erfolgreiche Ligation sequenziert und enthielten sowohl den C-terminalen „His6 tag“ als auch den Einzelaustausch des Ser 59 zu Cys. Nach Anlegen einer Dauerkultur wurde die neuen Mutante überexpremiert, das Produkt auf- gereinigt und charakterisiert (Kap. I, 3.4). Kapitel I 74 3 Ergebnisse 3.4 Biochemische und spektroskopische Charakterisierung neuer LHCII-Klone 3.4.1 Herstellung der rekombinanten Apoproteine Rekombinantes Apoprotein neuer Klone des LHCII wurde durch Überexpression des mutierten Lhcb1-Gens im E. coli Expressionstamm JM101 nach Induktion mit IPTG produziert. Hierzu wurden Zellen der entsprechenden Dauerkulturen zunächst auf LB- Amp-Festmedium vereinzelt, um mit einer Einzelkolonie eine Flüssigkultur zu inokulie- ren. Im Gegensatz zu vorherigen Versuchsvorschriften wurde darauf verzichtet eine geringvolumige Flüssigvorkultur anzuziehen. Stattdessen wurde am Vorabend der Überexpression eine Kolonie gepickt und die Hauptkultur direkt angeimpft. Dies brach- te neben der Einsparung eines Arbeitsschrittes hohe Erträge an rekombinantem Apoprotein. Die Ausbeuten lagen je nach Klon bei bis zu 250 mg aufgereinigtem Apoprotein pro Liter Flüssigkultur. Nach standardisierter Aufreinigung der IBs wurden der Grad der Aufreinigung und die molekulare Masse der neuen Mutanten mittels SDS-PAGE ermittelt. Abb. 1.3.4 zeigt das Ergebnis eines solchen Gels, hier wurde eine Auswahl der neu produzierten Mutanten im Vergleich zu Apoprotein mit nativer Lhcb1-Sequenz (D7f.3) aufgetragen. Alle neuen Klone verhielten sich identisch zu D7f.3 und liefen auf Höhe eines Polypep- tids von ca. 25 kDa. Neben dieser dominanten Bande zeigen alle Proben, wenn über- haupt, lediglich eine vernachlässigbar geringe Verschmutzung mit Fremdprotein. Abb. 1.3.4: Denaturierende SDS-PAGE (15%iges Gel) zur Überprüfung der Aufreinigung und der molekularen Masse der IBs verschiedener Lhcb1-Klone nach Coomassie-Blau Anfärbung. In Spur 1 und 9 wurden jeweils 3 µl SDS7-Marker aufgetragen, auf Spur 2 2 µg IBs des Apopro- teins D7f.3 mit nativer Aminosäure-Sequenz, auf den Spuren 3 bis 8 je 2 µg IBs verschiedener neuer Mutanten. Kapitel I 3 Ergebnisse 75 Auch die beiden nicht dargestellten neuen Klone (S59C, S59C/V90C) verhielten sich wildtypisch, die Mutante S59Ch mit C-terminalem „His6 tag“ besaß eine Masse von ca. 27 kDa (vergleichbar mit der Mutante C3.2hmit nativer Aminosäure-Sequenz und C- terminalem „His6 tag“), die beiden doppelt affinitätsmarkierten Klone stC79Sh und st106/160h von ca. 28 kDa (Daten nicht gezeigt). 3.4.2 Rekonstitution der neuen Mutanten zu funktionalen Protein-Pigment- Komplexen Zur Überprüfung der Funktionalität der neuen Mutanten wurde Apoprotein aller neuen Klone durch Zugabe von Pigment-Totalextrakt mit anschließendem Wechsel des De- tergenz zu Protein-Pigment-Komplexen rekonstituiert und mittels UZ aufgereinigt. Die durch Hebel (2007), Plunger (2007), Dietz (2008) und Müller (2008) hergestellten Klo- ne wurden in den jeweiligen Diplomarbeiten beschrieben und charakterisiert. Das Er- gebnis von Rekonstitution und Aufreinigung verschiedener neuer Klone ist in Abb. 1.3.5 dargestellt. Alle neuen Mutanten verhielten sich sowohl bei Rekonstitution als auch Aufreinigung unauffällig und bildeten im Gradienten (A) jeweils eine deutliche grüne Bande (*). Abb. 1.3.5: Charakterisierung verschiedener neuer LHCII-Mutanten nach Detergenzwechsel- Rekonstitution. (A) Ergebnis der Aufreinigung mittels UZ. Die in (A) markierten Komplex- Banden (*) wurden sowohl CD-spektroskopisch (B) als auch Fluoreszenz-spektroskopisch (C und D) untersucht. (D) stellt einen vergrößerten Ausschnitt der Fluoreszenz-Spektren von (C) zur Verdeutlichung der Chl b-Emission dar. CD-Spektren (B) sind zur besseren Übersichtlichkeit gestaffelt dargestellt. Kapitel I 76 3 Ergebnisse Die spektroskopische Untersuchung zeigte, dass es sich bei den jeweiligen Banden um voll funktionstüchtige monomere LHCII-Komplexe handelt. Sowohl in der CD- Absorption (B) als auch in der Fluoreszenz-Emission (C und D) verhielten sich alle neuen Klone dem Wildtyp (WT) entsprechend. Die CD-Absorption resultierte bei allen Mutanten in den typischen Minima bei 491, 650 und 678 nm des monomeren LHCII (B) (Hobe, 1994). Auch der Energietransfer von Chl b zu Chl a war bei allen Mutanten wei- testgehend vollständig. Nach Anregung des Chl b bei 470 nm, zeigt sich vor allem die Fluoreszenz-Emission des Chl a bei 680 nm (C). Nichtfunktionale Komplexe sowie freies Chl b zeigen nach Anregung eine Emission bei 653 nm (Rühle & Paulsen, 2004). Ob es sich bei der vergleichsweise schwachen Chl b-Emission der neuen Mutanten, insbesondere bei der Probe 90/123 (D, grüne Linie), um einen sehr geringen Anteil an ungebundenen Chl b oder an schlecht gefalteten Komplex handelt, kann hier nicht ge- sagt werden. Festzuhalten bleibt das der Anteil vernachlässigbar klein ist. Die Fähigkeit zur Rekonstitution der neuen Mutanten konnte zudem durch die schwach denaturierende LDS-PAGE bestätigt werden und soll in Abb. 1.3.6 beispiel- haft anhand der beiden Mutanten S123C und V196C verdeutlicht werden. Wie dort erkennbar ist, bilden beide Klone eine deutlich grüne Bande rückgefalteter Protein- Pigment-Komplexe. Im Vergleich zu D7f.3 ist die Intensität der Banden leicht schwä- cher. Vergleicht man das Verhältnis Apoprotein zu gefaltetem Komplex nach Coomas- sie-Färbung (B), so fällt auf, dass beide Mutanten etwas geringere Faltungs-Ausbeuten besitzen als D7f.3 mit wildtypischer Peptidsequenz. Während D7f.3 zu geschätzten 60 % gefaltet vorliegt, ist die Ausbeute bei S123C ca. 50 %, bei V196C ca. 40 %. Abb. 1.3.6: Schwach denaturierende LDS-PAGE (10%iges Gel) zur Charakterisierung neuer LHCII- Klone nach Detergenzwechsel-Rekonstitution. (A) zeigt zwei zusammengefügte Ausschnitte des Gels vor Anfärbung, (B) nach Coomassie-Blau- Anfärbung. Von links nach rechts sind jeweils 12 µl der Rekonstitution der LHCIIb-Klone S123C und V196C, sowie des maturen LHCII (D7f3) auf- getragen. Alle anderen hergestellten Mutanten waren ebenfalls rekonstituierbar und bildeten stabile Protein-Pigment-Komplexe mit vergleichba- ren Faltungs-Ausbeuten zwischen 40 und 60 % (Daten nicht gezeigt). Auch wenn die Fal- tungsausbeuten mancher Mutanten hinter denen des WT zurückblieben, sei darauf hin- gewiesen, dass die besagten Faltungsaus- beuten anhand von schwach denaturierenden Gelen bestimmt wurden, instabile bezie- Kapitel I 3 Ergebnisse 77 hungsweise in ihrer Konformation gestörte Komplexe wären auf dem Gel zerfallen (Mick, 2004). Da zudem die zuvor dargestellten spektroskopischen Methoden äußerst sensibel auf Veränderungen in der Pigmentanordnung und -komposition reagieren, konnte davon ausgegangen werden, dass die jeweiligen Aminosäureaustausche die Struktur und Funktionalität der Komplexe nicht beeinträchtigten und sie somit für EPR- spektroskopische Versuche geeignet sind. 3.4.3 Rekonstitution und Trimerisierung neuer Mutanten mit C-terminalem „His6 tag“ zu funktionalen Protein-Pigment-Komplexen Zur effizienten Herstellung trimerer EPR-Proben des spinmarkierten LHCII wurden zahlreiche Lhcb1-Klone C-terminal mit einem „His6 tag“ zur Trimerisierung mittels Ni- Säule versehen. Dies geschah entweder durch Restriktion und Ligation bereits vorhan- dener Klone bzw. durch Einfügen von Cys in den Cys-freien Klon C79Sh mit C- terminalem „His6 tag“ (Müller, 2008) oder dessen Derivate (Tab. 1.2.2). Das Oligomeri- sierungsverhalten der durch Hebel (2007), Plunger (2007), Dietz (2008) und Müller (2008) hergestellten Klone ist in den jeweiligen Arbeiten beschrieben. Als Exempel soll hier die bis dato unbeschriebene Mutante S59Ch mit dem Klon C3.2h verglichen wer- den (Abb. 1.3.7). Wie zuvor Mutante S59C, zeigte auch die „His6 tag“-Mutante S59Ch keinerlei Auffälligkeiten bei der Rekonstitution zu monomerem Protein-Pigment-Komplex (Daten nicht gezeigt), die spektroskopische Analyse der Monomere lieferte wildtypische Er- gebnisse. Auch die Trimerisierung auf der Ni-Säule zeigte keinerlei Abweichungen zu der wildtypischen Mutante mit C-terminalem „His6 tag“ (C3.2h). Wie in Abb. 1.3.7 zu sehen ist, zeigt S59Ch nach UZ die gleiche Auftrennung in trimere Komplexe (*) und monomere Komplexe (oberhalb der Trimere). Lediglich die Laufweiten im Gradient (präparationsbedingt) sowie die Intensität der Monomerbanden unterscheiden sich, wobei letzter Punkt nicht weiter quantifiziert wurde, da in anderen C3.2h-Präparationen ähnlich hohe Trimerisierungsausbeuten erzielt worden waren (Kap. II). Kapitel I 78 3 Ergebnisse Abb. 1.3.7: Spektroskopische Charakterisierung der mittels Restriktion und Ligation hergestell- ten LHCII-Mutante S59Ch nach Detergenzwechsel-Rekonstitution, Trimerisierung und Aufreini- gung via UZ (linke Bildhälfte) im Vergleich zur Mutante C3.2h mit C-terminalem „His6 tag“. Die im Saccharose-Gradienten markierten Komplex-Banden (*) wurden sowohl CD-spektroskopisch (rechte Bildhälfte, oben) als auch Fluoreszenz-spektroskopisch (rechte Bildhälfte, unten) unter- sucht. Dass es sich bei der markierten Bande (*) um trimeren LHCII handelt, wird durch die CD-Spektren belegt. Hier zeigte die trimere Mutante S59Ch genau wie C3.2h zusätz- lich bei 473 nm ein negatives Minimum (Rühle & Paulsen, 2004). Auch der Energie- transfer von Chl b zu Chl a war in trimeren Komplexen vollständig. Wie für monomere Komplexe schon berichtet (Kap. I, 3.4.2), resultierte die Anregung des Chl b in einer Fluoreszenz-Emission des Chl a bei 680 nm, ein sicheres Indiz für funktionale LHCII- Komplexe. Neben solchen unproblematischen Aminosäure-Austauschen fielen in den Dip- lomarbeiten von Hebel (2007; Mutante V196Ch), Dietz (2008; S106Chc und deren De- rivate) und Müller (2008; Mutanten S29Ch, F40Ch und A49Ch, sowie deren Derivate) mehrere Mutanten mit geringeren Trimerisierungsausbeuten auf. Zudem zeigten un- markierte Trimere der Mutante S123Ch (und deren Derivate) deutliche Abweichungen Kapitel I 3 Ergebnisse 79 in ihrer CD-Absorption. Im Unterschied zu trimerem LHCII mit wildtypischer Proteinse- quenz und C-terminalem „His6 tag“ (C3.2h, Abb. 1.3.7) ähnelte bei S123Ch das CD- Differenzspektrum mehr dem der Mutanten E107V bzw. D111V mit deutlich negativem Minimum bei 473 nm (Yang et al., 2008). Durch Markierung mit Spinmarkern wurde der Effekt vollständig aufgehoben, die PROXYL-markierten Trimere des S123Ch waren spektroskopisch identisch zu C3.2h. Weiterhin wurde insbesondere bei unmarkierten N-terminalen Cys- Doppelmutanten (Müller, 2008) die Oligomerisierung durch Ausbildung von Disulfid- Brücken negativ beeinträchtigt, konnte aber durch den Einsatz von Reduktionsmittel oder durch Markierung der Cys mit Spinmarkern aufgehoben werden. Die Oligomeri- sierung von „His6 tag“-freien Mutanten, beispielsweise durch Trimerisierung in Liposo- men (Boggasch, 2006), sowie vieler Cys-Doppelmutanten, wurde nicht getestet. Zur Wahrung der Übersicht sind alle während der Dissertation produzierten LHCII-Klone mit Rekonstitutions- und Trimerisierungsverhalten in Tab. 1.3.1 zusammengefasst. Tab. 1.3.1: Übersicht aller während der Dissertation produzierten LHCII-Klone (auch der Diplo- manden Hebel, 2007; Plunger, 2007; Dietz, 2008; Müller, 2008) und deren Rekonstitutions- und Trimerisierungsverhalten. +++ bedeutet wildtypische Rekonstitution und Trimerisierung, ++ zu- friedenstellende Trimerisierung, + schwache Trimerisierung, --- keine Trimerisierung, n.g. „nicht getestet“. Mit (*) gekennzeichnete Proben zeigen spektroskopische Abweichungen. Trimerisierung Trimerisierung Hersteller Klon Rekonstitution unmarkiert PROXYL-markiert Dockter S59C +++ n.g. n.g. S59Ch +++ +++ +++ V90C +++ n.g. n.g. S123C +++ n.g. n.g. V196C +++ n.g. n.g. S59C/V90C +++ n.g. n.g. V90C/S123C +++ n.g. n.g. V90C/V196C +++ n.g. n.g. S123C/V196C +++ n.g. n.g. stC79Sh +++ +++ +++ st106/160h +++ +++ +++ Plunger S3Chh +++ +++ +++ Hebel V196Ch +++ +++ + Müller C79Sh +++ +++ +++ P3 +++ +++ +++ P14 +++ +++ +++ P29 +++ +++ + P3/14 +++ +++ +++ P3/29 +++ + + P3/59 +++ + + P14/29 +++ + n.g. P29/59 +++ + + A4Ch +++ +++ +++ Kapitel I 80 3 Ergebnisse Trimerisierung Trimerisierung Hersteller Klon Rekonstitution unmarkiert PROXYL-markiert Müller K7Ch +++ +++ +++ V9Ch +++ +++ +++ A10Ch +++ +++ +++ S11Ch +++ +++ +++ S12Ch +++ +++ +++ S14Ch +++ +++ +++ V22Ch +++ +++ +++ S29Ch +++ + + S34Ch +++ +++ +++ F40Ch +++ --- --- A49Ch +++ --- --- S3C/S14Ch +++ +++ +++ S3C/S29Ch +++ + + S3C/S59Ch +++ +++ +++ S14C/S29Ch +++ + n.g. S29C/S59Ch +++ + + Dietz V90Ch +++ +++ +++ S106Chc +++ ++ + S123Ch +++ +++ * +++ V90C/S106Ch +++ ++ n.g. V90C/S123Ch +++ ++ n.g. 3.5 Optimierung der Spinmarkierung des rekombinanten LHCII 3.5.1 Vergleich der Markierungsausbeuten bei Verwendung unterschiedlicher Spinmarker Wie in Kapitel III genauer beschrieben, war es zur Durchführung von zeitabhängigen EPR-Faltungsexperimenten äußerst vorteilhaft, den chemisch wenig stabilen Spinmar- ker TEMPO durch das stabilere Pyrrolderivat PROXYL (Kroll, 1999) zu ersetzen. Kon- sequenterweise wurden daher Nachmarkierungsversuche zum Test der Markierungsef- fizienz analog zu früheren Versuchen mit TEMPO (Bender, 2004; Dockter, 2005) wie- derholt und zudem die chemische Stabilität der Nitroxid-Marker geprüft. Hierzu wurde Apoprotein der Cys-Einzelmutante V196C nach Standard-Rezept mit TEMPO-IA bzw. PROXYL-IA markiert (Abb. 1.3.8). In jeweils drei Ansätzen wurden die Spinmarker in 10fach, 20fach bzw. 50fach molarem Überschuss zu Protein eingesetzt. Nach Inkuba- tion wurde überschüssiger Marker durch Fällung und Waschen des Proteins quantitativ entfernt. Zur Überprüfung der Markierungsausbeute wurde das spinmarkierte Apopro- tein mit dem Fluoreszenzmarker BODIPY-IA (50fach molarer Überschuss zu Protein), welcher ebenfalls spezifisch und mit sehr hoher Ausbeute an Sulfhydryle bindet (Hu- schenbett, 2001), nachmarkiert. Als positive bzw. negative Referenz wurden ein Aliquot von V196C bzw. des Cys-Null-Klons C79S nur mit BODIPY-IA markiert. Die BODIPY- Fluoreszenz (Abb. 1.3.8, C) der jeweiligen Markierungsansätze wurde im denaturie- renden Gel densitometrisch ausgewertet (Abb. 1.3.8, B), bezogen auf die jeweils auf- getragene Proteinmenge (Coomassie-Anfärbung, Abb. 1.3.8, D). Die BODIPY- Kapitel I 3 Ergebnisse 81 Emission zeigt deutlich, dass die Positiv-Kontrolle (V196C-BODIPY, Spur 8) die inten- sivste Emission aufweist, sie wurde gemäß Huschenbett auf einen Markierungsgrad von 100 % gesetzt. Der Cys-Null-Klon C79S (Spur 7) dagegen zeigt bei gleicher Be- handlung keine fluoreszierende Bande (0 % Markierung), womit frühere Ergebnisse (Bender, 2004; Dockter, 2005) bestätigt wurden. Vergleicht man die Ansätze der PRO- XYL-Markierung bzw. der TEMPO-Markierung untereinander, so fällt auf, dass mit steigendem Einsatz an jeweiligem Spinmarker die BODIPY-Emission schwächer wird. Bei Einsatz eines jeweils 50fachen Spinmarker-Überschusses ist praktisch keine BO- DIPY-Markierung mehr erkennbar (2,2 % im TEMPO-Ansatz bzw. 1,9 % im PROXYL- Ansatz). Bei direktem Vergleich der beiden Spinmarker (Abb. 1.3.8, B) ist ersichtlich, dass die BODIPY-Fluoreszenz in den PROXYL-Ansätzen stets niedriger ist als in den TEMPO-Ansätzen. Abb. 1.3.8: Versuch zur Markierungseffizienz verschiedener Spinmarker an LHCP in Abhängig- keit der eingesetzten Spinmarker-Konzentration. Es wurden auf Bahn 1–6, sowie Bahn 8 je 2 µg der Cys-Einzelmutante V196C aufgetragen, auf Bahn 7 2 µg des Cys-Null-Klon C79S, auf Bahn 9 3 µl SDS7 Marker. (A) Zur Markierung des Apoproteins wurden auf Bahn 1, 2, 3 jeweils ein 10fach, 20fach bzw. 50fach molarer Überschuss der Spinmarkers PROXYL-IA eingesetzt, auf Bahn 4, 5 und 6 entsprechende Überschüsse des Spinmarkers TEMPO-IA. Nach Inkubation, Fällung und Aufreinigung der Ansätze folgte bei den Proben der Bahnen 1-8 noch eine Markie- rung mit dem Fluoreszenzfarbstoff BODIPY-IA (50fach molarer Überschuss). (B) Densitometri- sche Auswertung der Fluoreszenz und Berechnung der relativen BODIPY-Markierungseffizienz bezogen auf die Fluoreszenz-Intensität der Positiv-Kontrolle ohne vorherige Spinmarkierung (Bahn 8). (C) Aufnahme der BODIPY-Fluoreszenz einzelner Banden in der SDS-PAGE. (D) Aufnahme der Coomassie-Blau-Färbung des gleichen Gels. Kapitel I 82 3 Ergebnisse Geht man davon aus (Bender, 2004; Dockter, 2005), dass in BODIPY- Nachmarkierungsversuchen eine Markierungseffizienz des Fluoreszenz-Farbstoffes von 10 % umgekehrt eine Markierungseffizienz des Spinmarkers von 90 % bedeutet, so ergeben sich die in Tab. 1.3.2 zusammengefassten Markierungsausbeuten der Cys- Einzelmutante V196C. Tab. 1.3.2: Markierungseffizienzen der Cys-Einzelmutante V196C für verschiedene Nitroxid- Marker (TEMPO-IA und PROXYL-IA) in Abhängigkeit des eingesetzten molaren Spinmarker- Überschuss. molarer Überschuss 10x 20x 50x TEMPO 57 % 83 % 97,8 % PROXYL 74,5 % 90,1 % 98,1 % Bei 10fach molarem Überschuss an TEMPO liegen die Markierungseffizienzen für V196C mit lediglich 57 % deutlich niedriger als die für die Mutante S3Ch gemessenen Werte von 87,4 % (Dockter, 2005). Das gleiche gilt für den Einsatz eines 20fach mola- ren Überschuss, hier zeigt V196C 83 % Markierung, S3Ch jedoch 93,7 % (Dockter, 2005). Umgekehrt übertrifft die Markierungsausbeute des V196C die von S3Ch bei einem 50fach molaren Überschuss (97,8 % zu 93,9 %). Im Unterschied zum Spinmar- ker TEMPO wurden mit PROXYL durchweg höhere Markierungseffizienzen erzielt. So waren schon bei Einsatz eines 10fach molaren Überschusses ca. 75 % des V196C- Apoproteins markiert, bei einem 20fachen Überschuss bereits 90 % und bei einem 50fachen Überschuss rund 98 %. Daraus schlussfolgernd wurde LHCP fortan mit ei- nem 20fach molaren Überschuss an PROXYL markiert, da dies die beste Relation zwi- schen Markierungseffizienz und Verbrauch an teurem Spinmarker darstellte. Wie schon zuvor für den Austausch der Aminosäuren beschrieben, wurde durch die Markierung mit PROXYL die Faltung der verschiedenen Mutanten zu funktionalen Pigment-Protein-Komplexen nicht beeinträchtigt. Sowohl die in der Arbeitsgruppe be- reits vorhandenen Mutanten, als auch neu hergestellte Klone rekonstituierten problem- los und zeigten nach Aufreinigung CD-und Fluoreszenzdaten identisch zu unmarkier- ten Proben (Abb. 1.3.5). Auch die Trimerisierung der Komplexe (sofern dies möglich war, vgl. Tab. 1.3.1) führte in der Regel zu unauffälligen Ergebnissen. Ausnahme blie- ben die Mutanten 29, 40, 49, 106 (bzw. deren Derivate), sowie Position 196. Während bei ersteren der Effekt auf der Mutagenese an sich beruht, entstehen bei Mutante 196 erst durch die Spinmarkierung Probleme in der Trimerisierung (Hebel, 2007). Weiterhin zeigte sich, dass umgekehrt durch die Spinmarkierung die Trimerisierungsprobleme in manchen unmarkierter Doppelmutanten, bedingt durch die Verhinderung von Disulfid- Brücken, eliminiert wurden (Müller, 2008). Kapitel I 3 Ergebnisse 83 3.5.2 Vergleich von TEMPO- und PROXYL-markiertem LHCII bezüglich Spin- marker-Stabilität und DEER-Abständen Wie schon angesprochen wurde, ist das Vorhandensein ungepaarter Elektronen in der Messprobe eine grundlegende Voraussetzung zur Anwendung der EPR- Spektroskopie. Daher stellt die Reduktion eingeführter paramagnetischer Nitroxid- Marker ein Problem in der Herstellung intakter EPR-Proben dar. Das Redoxpotential vieler Reduktionsmittel, wie zum Beispiel der Ascorbinsäure (Galla, 1988) oder DTT (Burmeister Getz et al., 1999), ist ausreichend, um bestimmte Nitroxid-Spinmarker wie das in der Diplomarbeit (Dockter, 2005) verwendete TEMPO zum Hydroxylamin zu reduzieren. Durch diese Reduktion wird der Marker diamagnetisch und absorbiert kei- ne Mikrowellen mehr. Andere Spinmarker wie das in das vorgestellte Pyrrolderivat PROXYL zeigen eine deutlich höhere chemische Stabilität gegenüber reduzierenden Reagenzien und werden selbst im deutlich sauren Milieu nur langsam in die reduzierte Form überführt (Kroll, 1999). Da während der Rekonstitution des LHCII Reduktionsmit- tel wie DTT oder β-Me zur Gewährleistung der Faltung unabdingbar sind, muss davon ausgegangen werden, dass bei Benutzung von TEMPO-Spinmarkern auch bei hohen Markierungseffizienzen stets ein Teil des Signals durch Reduktion verloren geht. Zu- dem erforderten die Experimente zur EPR-Faltungskinetik eine Fällung des LHCP nach Spinmarkierung mit 5%iger TCA, da dies zu einer drastischen Erhöhung der Protein- Löslichkeit führte (ein Phänomen, welches nur bei spinmarkiertem Apoprotein auftrat). Literaturangaben sagen unter solchen Versuchsbedingungen für TEMPO-Spinmarker eine starke Reduktion voraus, für PROXYL dagegen nicht (Kroll, 1999). Um diese An- gaben zu prüfen, wurde Apoprotein der Doppelmutante S106C/S160Ch mit einem 20fach molaren Überschuss an TEMPO bzw. PROXYL markiert, mit Aceton/ Essigsäu- re gefällt, gewaschen und auf gleiche Protein-Konzentrationen eingestellt. Nach einer Inkubationsdauer von 40 min bei Raumtemperatur in 5%iger TCA wurde von beiden Ansätzen das in Abb. 1.3.9 gezeigte EPR-ESE Spektrum gemessen, welches als eine Art Mikrowellen-Absorptionspektrum direkten Aufschluss über die Anzahl an Nitroxid- Radikalen (Spinzahl) in der Probe gibt. Wie deutlich erkennbar ist, absorbiert die PRO- XYL-Probe bei gleicher Proteinkonzentration deutlich mehr Mikrowellen, was in einem höheren zentralen Peak bei 332 mT resultiert. Kapitel I 84 3 Ergebnisse Abb. 1.3.9: EPR-ESE Spektren zum Vergleich der chemischen Stabilität unterschiedlicher, kovalent gebundener Nitroxid-Spinmarker bei gleicher Proteinkonzentration. Beide Proben wur- den 40 min bei Raumtemperatur in TCA (5 %) inkubiert. Die schwarze Linie stellt Apoprotein der Mutante S106C/S160Ch -PROXYL dar, die rote S106C/S160Ch-TEMPO. Auch wenn hierbei beachtet werden muss, dass die Markierungseffizienz des PRO- XYL-Markers gegenüber der TEMPO-Markierung höher liegt (Kap. I, 3.5.1), kann dies nicht der alleinige Grund für die annähernd doppelt so starke Absorption der PROXYL- Probe sein. Wendet man die zuvor anhand von Einzelmutanten gemachten Daten auf Doppelmutanten an, sollte der Unterschied in der Markierungseffizienz maximal bei ca. 15 % liegen (TEMPO ca. 66 % Doppelmarkierung, PROXYL ca. 80 % Doppelmarkie- rung) und nicht, wie hier ermittelt, bei ca. 50 %. Apoprotein derselben Markierungs-Charge, aber ohne TCA-Behandlung, wurde zudem rekonstituiert und mittels UZ aufgereinigt. Die isolierten Monomere wurden auf gleiche Konzentrationen eingestellt, nach Zugabe von Glycerin als Frostschutz in flüs- sigem Stickstoff eingefroren und EPR-DEER vermessen (Abb. 1.3.10). Wie anhand der zuvor ermittelten Daten vermutet (Nachmarkierungsversuche und ESE-EPR), ist die gemessene Modulationstiefe der TEMPO-markierten Monomere S106C/S160Ch (Abb. 1.3.10 A, rote Linie) deutlich geringer als die der PROXYL-markierten Monomere (B, schwarze Linie). Kapitel I 3 Ergebnisse 85 Abb. 1.3.10: Ermittlung der intramolekularen Spinabstände mittels DEER. Vergleich von mo- nomeren LHCII-Komplexen der Mutante S106C/S160Ch, markiert mit TEMPO (rote Linien) bzw. PROXYL (schwarze Linien). (A) zeigt die Hintergrund-korrigierten Primär-Daten, (B) die aus den Primär-Daten mittels Tikhonov-Regularisierung errechneten Spin-Spin-Abstände, dar- gestellt als Abstandsverteilung. Für beide Proben wurden die gleichen Prozessierungsparame- ter verwendet. Zeitnullpunkt 130 ns, Start der Hintergrundkorrektur bei 640 ns, Regulierungspa- rameter α=10. In den ermittelten Abstandsverteilungen (B) fällt auf, dass die gemessenen Abstände in beiden Markierungsansätzen einander ähnlich sind. Insgesamt ist die Verteilung der Abstände der LHCII-Probe mit den größeren TEMPO-Markern etwas breiter und resul- tiert in einem Maximum bei ca. 4 nm sowie einem großen Anteil von Abständen zwi- schen 4,5 und 6,5 nm. Die PROXYL-Probe dagegen zeigt zwei Maxima bei ca. 4 und 5 nm und ist insgesamt weniger breit verteilt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass EPR-Messungen mit PROXYL-markierten Proteinen zum einen mindestens genauso genaue Messdaten liefern wie entsprechende Messungen mit TEMPO-markiertem LHCII, zum anderen kostbare EPR-Messzeit durch Erhöhung der Spinzahl minimiert wird. Daher wurde in allen folgenden EPR-Experimenten (Kap. II und III) PROXYL- markierter LHCII verwendet. Kapitel I 86 4 Diskussion 4 Diskussion 4.1 Herstellung neuer Lhcb1-Klone mittels punktspezifischer Mutage- nese Wie in der allgemeinen Einleitung und in der Einleitung zu Kapitel III ausführlich darge- legt, besitzt die EPR-Spektroskopie gegenüber anderen Methoden zahlreiche Vorteile in ihrer Anwendbarkeit zur Aufklärung von Proteinstrukturen und zur Entschlüsselung der Strukturdynamik von Proteinen. Wie bei anderen Methoden sollte auch hier nicht unberücksichtigt bleiben, dass die Durchführung von SDSL-Studien durch Produktion vieler einzelner, spinmarkierter Mutanten des zu untersuchenden Proteins einen ver- hältnismäßig hohen Arbeitsaufwand (und damit auch finanziellen Aufwand) darstellt. Neben der Verbesserung der Spin-Signalintensität durch eine effizientere Protein- Markierung, war auch die Verringerung des Arbeitsaufwandes in der Herstellung neuer Cys-Mutanten des LHCII Ziel der Untersuchungen dieses Kapitels. Wie in den Ergebnissen zur Mutagenese gezeigt werden konnte, funktioniert die Produktion neuer Cys-Klone durch Verwendung des Stratagene Mutagenese-„kit“ op- timal und stellt eine deutliche Verbesserung dar. Nachteile gegenüber altbewährter Methoden sind die etwas höheren Anschaffungskosten für die längeren Mutagenese- Primer, sowie die Kosten für das Mutagenese-„kit“ an sich. Hauptvorteil bleibt der deut- lich geringere Arbeitsaufwand mit hoher Reproduzierbarkeit einzelner Arbeitsschritte. Wie Müller (2008) zeigen konnte, war es ohne übermäßigen Aufwand möglich bei Vor- handensein der Primer bis zu 10 neue Cys-Einzelmutanten binnen 7 Arbeitstagen, an- gefangen bei der Mutagenese, über zweifache Transformation und Sequenzierung bis zum aufgereinigten und charakterisierten Genprodukt, herzustellen. Durch die gute Reproduzierbarkeit und die stets hohen Ausbeuten an XL1-Blue-Transformanten musste zudem, ohne vorherige Prüfung mittels „dirty“-PCR, in 98 % der Fälle jeweils nur eine vereinzelte Kolonie sequenziert werden, eine weitere Zeit- und Kostenerspar- nis. Der Versuch die Reaktion mit entsprechenden Chemikalien und Enzymen der Ar- beitsgruppe zu imitieren, schlug fehl, obwohl alle eingesetzten Produkte zuvor getestet und für funktionstüchtig befunden waren. Vergleichbare Experimente der Arbeitsgruppe Hansson (Carlsberg Research Center, Kopenhagen, Dänemark; mündliche Mitteilung) zeigten aber, dass das Nachkochen möglich ist und bei Verwendung der superkompe- tenten XL1-Blue-Zellen eine ausreichend hohe Anzahl an Bakterien transformiert wird. Hierbei sei darauf hingewiesen, dass der Einzel-Erwerb von dNTPs, der Enzyme Pfu Polymerase und DpnI sowie der superkompetenten Bakterienzellen aus finanzieller Sicht kaum einen Vorteil bringt. Sinnvoller scheint hier, die Verwendung halber Volumi- na der einzelnen Reaktanden im PCR-Ansatz. Da in der Transformation lediglich 1 µl Kapitel I 4 Diskussion 87 des verdauten PCR-Produktes benötigt wird, scheint dieser Schritt im Volumen über- dimensioniert. Entsprechende Experimente mit PCR-Ansätzen von lediglich 25 µl Vo- lumen, welche vorbeugend Mineralöl überschichtet sind (Verdunstungsschutz), sind derzeit Gegenstand der Untersuchungen der Dissertation von C. Dietz. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Umstellung der Mutagenese auf die moderne Methode erhebliche Vorteile bietet. Das erbrachte Ergebnis, also die effi- ziente Herstellung neuer Cys-Mutanten des Lhcb1-Gens mit vergleichsweise wenig Arbeitsaufwand, rechtfertigt die höheren Grundkosten der Methode. Berücksichtigt man alle durchzuführenden Arbeitsschritte, liegen die Kosten durch Einsparung von Arbeits- zeit und Sequenzierungen, insbesondere bei Verwendung geringerer Volumina, deut- lich unter dem finanziellen Aufwand früherer Methoden. Hinsichtlich zukünftiger SDSL- Studien gilt dies insbesondere, wenn vor Mutagenese-Start ein möglichst vollständiges Versuchs-Konzept, wie z.B. der N-terminale „Cys-Walk“ (Müller 2008) existiert und eine Großzahl der Mutanten synchron produziert werden kann. 4.2 Herstellung von Lhcb1-Klonen durch Neukombination bereits exis- tierender Klone Zurzeit stehen der eigenen Arbeitsgruppe eine große Anzahl an Cys-Mutanten des LHCII für Markierungsexperimente mit Iodacetamid- oder Maleimidmarkern zur Verfü- gung. Für kommende EPR-Abstandsstudien werden weitere Mutanten produziert wer- den müssen, beispielsweise durch Neukombination bereits vorhandener Klone. Eine einfache Möglichkeit hierfür ist die Restriktion zweier Mutanten, die jeweils eine der gewünschten Mutationen tragen, mit anschließender Ligation der isolierten Schnittprodukte. Anwendung fand diese Methode in der Produktion der einfach affini- tätsmarkierten Klone V196Ch (Hebel, 2007) und S59Ch (Kap. I), sowie der doppelt affinitätsmarkierten Klone stC79Sh und st106/160h (Kap. II). Wie beschrieben, waren alle 4 Mutagenesen erfolgreich, jedoch (je nach Reproduzierbarkeit einzelner Arbeit- schritte) meist langwierig. Während die Restriktion meist problemlos funktionierte, wa- ren sowohl die Wiedergewinnung der geschnittenen DNA, als auch die Ligation mit darauffolgender Transformation in JM101 oftmals schlecht reproduzierbar. So mussten beispielsweise oft hohe DNA-Verluste in den Aufreinigungsschritten, sowie geringe Transformationserfolge in E. coli JM101 trotz guter Kompetenz (3x105 Kolonie-bildende Einheiten pro µg DNA) in Kauf genommen werden. Eine Überprüfung des Ligationser- folgs solcher Kolonien erwies sich zudem als schwierig, da sich die Matrizen nur mini- mal von den Ligationsprodukten unterschieden. Meist konnte nur ein „screening“ mit- tels Sequenzierung Gewissheit bringen. In Anbetracht der aufgetretenen Probleme ist, falls möglich, die punktspezifische Mutagenese effizienter und der Mutagenese mittels Restriktion und Ligation vorzuziehen. Zu diesem Zweck wurden zwei affinitätsmarkierte Klone produziert, die kein Cys tragen [C79Sh mit C-terminalem „His6 tag“ (Müller, 2008) und stC79Sh mit N-terminalem „Strep tag“ und C-terminalem „His6 tag“ (Kap. II)] Kapitel I 88 4 Diskussion und sich als Matrizen zur effizienten Herstellung neuer affinitätsmarkierter Cys-Klone eignen. Zur Produktion neuer Doppelmutanten können analog bereits vorhandene Ein- zelmutanten in der PCR als Matrize dienen. 4.3 Beeinflussung der Struktur des rekombinanten LHCII durch SDSL Die Charakterisierung der überexprimierten und rückgefalteten Genprodukte neu pro- duzierter Klone des Lhcb1 entspricht größtenteils den Ergebnissen früherer Studien der Arbeitsgruppe Paulsen. Alle neu produzierten Mutanten zeigen hohe Expressions- ausbeuten, die Aufreinigung nach Standard-Methode funktioniert einwandfrei (Hobe, 1995). Die Vereinfachung des Protokolls zur Überexpression führt zur leichten Steige- rung der Protein-Ausbeute bei Einsparung von Arbeitszeit. Alle von Hebel (2007), Plunger (2007), Dietz (2008), Müller (2008) sowie die in dieser Arbeit produzierten Klo- ne ließen sich problemlos durch Wechsel des Detergenz zu funktionalen Protein- Pigment-Komplexen rückfalten (Paulsen et al., 1993). Schonend aufgereinigte Proben zeigten stets spektroskopische Eigenschaften identisch zu denen des nativen LHCII- Monomers (Rühle & Paulsen, 2004). Weder die recht konservativen Austausche der Aminosäuren Ser oder Val gegen Cys, noch die Einführung des „His6 tag“ an den C- Terminus (Rogl et al., 1998) beeinflussten die Fähigkeit zur Rückfaltung oder die Stabi- lität der rekombinanten Protein-Monomere signifikant. Einzige Ausnahme ist der Aus- tausch des Val 196 in Helix H4. Rekonstituierte Monomere dieser Mutante zerfallen im Acrylamid-Gel unter schwach denaturierenden Bedingungen etwas stärker als rekom- binante Pigment-Protein-Komplexe mit nativer Peptidsequenz. Diese Abweichung wur- de als wenig kritisch angesehen. Mick (2004) konnte zeigen, dass bestimmte Amino- säuren-Austausche in der lumenalen Schleife des LHCII die Stabilität der Komplexe ernsthaft beeinflussen. Solche Mutanten besitzen nach schonender Aufreinigung im Deriphat-Gel Faltungsausbeuten identisch zu Komplexen mit nativer Peptidsequenz, in der deutlich stringenteren schwach denaturierenden LDS-PAGE zerfallen sie dagegen. Auch wenn der Anteil gefalteter Komplexe der Mutante V196Ch im LDS-Gel im Ver- gleich zum Wildtyp niedriger ist, so bildet ein großer Teil des Proteins stabile Komple- xe. Wurde die gleiche Probe dagegen schonend mittels UZ aufgereinigt, war die Fal- tungsausbeute identisch zu der der anderen Mutanten. Ob die verminderte Stabilität nach Austausch der Position 196 in Zusammenhang mit der Bindung des Chl3 an Glu- tamin (Gln) 197 steht, kann nicht ausgeschlossen werden. Yang et al. (1999) konnten zeigen, dass der Austausch des Chl-bindenden Gln 197 gegen Glu oder Ser zum Ver- lust der Bindestelle führt. Rekonstituierte Mutanten wiesen entsprechend veränderte Pigmentstöchiometrien mit geringerem Chl-Anteil auf und waren zudem thermisch in- stabiler. Entsprechende Untersuchungen an rekonstituierten Monomeren der Mutante V196Ch durch Hebel (2007) zeigten wildtypische Absorptions-, CD- und Fluoreszenz- spektren der aufgereinigten Monomere, sowohl mit als auch ohne Spinmarkierung. Auch die Stöchiometrie der gebundenen Pigmente (Chl a/b: 1,32) entsprach annä- Kapitel I 4 Diskussion 89 hernd den Literaturwerten für den nativen Komplex (Chl a/b: 1,4; Dainese & Bassi, 1991) bzw. denen des rekombinanten LHCII (Chl a/b: 1,1±0,2; Paulsen et al., 1990). Die Betrachtung der Kristallstruktur des nativen LHCII unterstützt die Annahme, dass der Austausch bzw. die Bindung des Spinmarkers an Position 196 nicht automatisch den Verlust des Chl3 bedeutet. Auch wenn die Mutation direkt neben der Bindestelle liegt, so ist Position 196 durch die α-helikale Sekundärstruktur in ihrer Ausrichtung um ca. 90° versetzt zur Chl-Bindestelle, was die Beeinflussung der Chl-Bindung deutlich reduzieren müsste. Neben den konservativen Aminosäuren-Austauschen des Ser bzw. Val gegen Cys, wurden auch weniger konservative Austausche getestet. Aus zahlreichen SDSL- Studien ist bekannt, dass auch weniger konservative Austausche die Struktur oder Funktionalität des mutierten Proteins nicht zwangsläufig beeinflussen. Weder der Aus- tausch von Val, Gln bzw. Leucin (Leu) gegen Cys im Protein F-Actin (Scoville et al., 2009), noch der Austausch von Phenylalanin (Phe), Lysin (Lys), Alanin (Ala), Isoleucin (Ile) oder Thr in Arrestin (Hanson et al., 2007) bereiteten Probleme. Sogar ein „Cys- Walk“ von Transmembranhelix 1 zu Transmembranhelix 2 des Rhodopsin mit nicht- konservativen Austauschen von His, Tyrosin (Tyr), Prolin (Pro), Arginin (Arg) oder Asparagin (Asp) blieb ohne Folgen für Struktur oder Funktionalität des Proteins (Alten- bach et al., 2001). Auch in LHCII beeinflussen die wenig-konservativen Austausche des Thr 5 gegen Glu oder des Phe 40 gegen Cys nicht die Fähigkeit der Proteine mo- nomere Pigment-Protein-Komplexe zu bilden. Die spektroskopische Untersuchung zeigte keinerlei Abweichungen (Müller, 2008). Lediglich das Trimerisierungsverhalten letzterer Mutante (F40Ch) ist, genau wie das der Klone S29Ch, A49Ch, S106Chc, S123Ch und V196Ch, bzw. deren Derivate (sofern getestet), abweichend vom affinitätsmarkierten LHCII mit wildtypischer Protein- sequenz. Wie in Müller (2008) diskutiert, scheint der Grund für die etwas geringeren (S29Ch) bzw. deutlich geringeren Trimerisierungsausbeuten (F40Ch und A49Ch), wel- che zudem mit einer verminderten Trimerstabilität einhergehen, eher unabhängig von der Art des Austausches (konservativ bzw. wenig-konservativ) zu sein. Vielmehr führt die Einführung des Cys an sich, entweder indirekt durch eine Änderung der Tertiär- struktur im N-Terminus oder direkt durch Störung der Lipid-Bindung, zu einem Verlust des Phospholipids PG, welches für die Ausbildung von Trimeren essentiell ist (Nuss- berger et al., 1993). Im Falle der Mutante S29Ch könnte die Chl b-Bindestelle Tyr 24 das Problem darstellen. Die Entfernung der Cα-Atome beider Seitengruppen beträgt lediglich 0,7 nm. Zudem liegt Position 29 inmitten einer kurzen Schleifenstruktur, deren Konformation durch Bindung des PROXYL erheblich beeinflusst werden kann. Dadurch könnte Chl9 an der Bindung an Tyr 24 gehindert werden. Da PG (0,9 nm) bzw. Chl9 (0,4 nm) dieser Bindestelle sehr nahe kommen, könnte die Bindung bzw. Lage des PG so weit beeinflusst werden, dass die Trimerisierung verhindert wird. Wie in Müller (2008) diskutiert, könnte zudem die Ausbildung von inter-monomeren Kontakten durch Kapitel I 90 4 Diskussion die N-terminale Domäne bei der Trimerisierung verhindert werden (Hobe, 1995). Ähnli- che Konformationsänderungen, einhergehend mit dem Verlust der Trimerisierbarkeit, sind in den N-terminalen Schleifen-Positionen 40 und 49 denkbar. Abgesehen vom Verlust der Trimerisierbarkeit durch den Aminosäurenaustausch an sich, zeigen neues- te Berechnungen von PROXYL-Rotameren basierend auf den Strukturdaten von Standfuss et al. (2005) durch Dr. Y Polyhach (AG Jeschke, ETH Zürich, Schweiz), dass PROXYL-markierte Proben der Mutanten 40 und 49 (sowie 52) durch gegenseiti- ge sterische Behinderungen der PROXYL-Marker vermutlich nicht in der Lage sind, stabile Trimere auszubilden. Der Grund für das untypische Trimerisierungsverhalten von Mutanten der Posi- tion 106 konnte bisher nicht geklärt werden. Insbesondere die geringen Trimerisierung- sausbeuten, sowie das Auftreten atypischer CD-Trimer-Spektren nach Markierung mit Fluoreszenz-Farbstoffen (Wiegand, 2008), nicht aber nach Markierung mit den deutlich kleineren Spinmarkern, waren hier auffällig. Ähnlich abweichende CD-Spektren zeigten Trimere der Mutante 123, bzw. deren Derivate, welche im Zuge von Untersuchungen zu Konformationsänderungen der lumenalen Schleife durch Dietz (2008) durchgeführt wurden. Solche Proben entsprachen in ihrem CD-Absorptionsverhalten eher den Mut- anten E107V bzw. D111V mit deutlich negativem Minimum bei 473 nm (Yang et al., 2008) oder Neoxanthin-freien Trimeren des LHCII (Hobe et al., 2006). Im Gegensatz zu Position 106 trat in Mutanten der Position 123 diese auffällige Änderung lediglich bei unmarkierten Trimeren auf, spinmarkierte Proben zeigten das typische Trimerspektrum des C3.2h. Hierbei zeigten beide Proben wildtypische Pigmentstöchiometrien mit nor- malem Neoxanthingehalt. Inwiefern solche Änderungen der CD-Absorption ein Indiz für mögliche Strukturänderungen innerhalb der lumenalen Schleife des LHCII sein können (Yang et al., 2008), ist derzeit Gegenstand der Untersuchungen der Dissertation von C. Dietz und soll in Kapitel III kurz diskutiert werden. Die Trimerisierungsprobleme der spinmarkierten Mutante V196Ch (Hebel, 2007) werden bei Betrachtung der Kristallstruktur (Standfuss et al., 2005) verständlich. Wie zuvor geschildert, übt der eigentliche Austausch der Aminosäure lediglich minima- len Einfluss auf die Stabilität der Komplexe aus. Auch die Trimerisierbarkeit unmarkier- ter Komplexe ist unauffällig. Die Spinmarkierung dagegen senkt die Ausbeute an stabi- len Trimeren drastisch. Während der Spinmarker in monomerem LHCII ausreichend Platz zwischen Ch3, Chl4 und Chl12 besitzt und in die Peripherie des Proteins zeigt, wird das Raumangebot durch die Assemblierung des gegenüberliegenden Monomers im Trimer durch dessen Chlorophylle, sowie durch die Bindung des Lipids DGDG, deutlich minimiert. Berechnungen zur Simulation von PROXYL-Rotameren durch Dr. Y. Polyhach bestätigen diese Annahme. In der Simulation treten für viele Rotamere des PROXYL an Monomer A insbesondere sterische Probleme mit dem Phythol-Schwanz des Chl12 (Monomer A) und dem Lipid DGDG (Monomer A) sowie mit Chl5 und DGDG des Monomer C auf. Die Besetzung dieser DGDG-Bindestellen mit dem nativem Lipid Kapitel I 4 Diskussion 91 in rekombinantem LHCII ist bis dato nicht geklärt, prinzipiell jedoch nicht auszuschlie- ßen. Dünnschichtchromatographische Untersuchungen bestätigen einen nicht uner- heblichen Anteil des nativen Lipids in den Totalpigmentextrakten, die in der Rekonstitu- tion eingesetzt werden (Daten nicht gezeigt). Weiterhin ist nicht auszuschließen, dass auch im Fall der Position 196 durch das Vorhandensein des Markers direkt oder indi- rekt die Bindung des Phospholipids PG gestört wird, welches für die Trimerisierung essentiell ist (Hobe, 1995). Alle verbleibenden Mutanten zeigen ein unauffälliges Tri- merisierungsverhalten oder wurden bisher nicht auf ihr Trimerisierungsverhalten getes- tet [die Trimerisierung von Cys-Doppelmutanten macht erst seit Bestehen des Proto- kolls zur Herstellung heterogener Trimere (Kap. II) Sinn]. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass durch das Vorhandensein zahl- reicher Cofaktoren die Anzahl mutierbarer Positionen im LHCII gegenüber anderen Proteinen, wie beispielsweise dem Rhodopsin mit lediglich einem Cofaktor, deutlich eingeschränkt ist. Zukünftige Mutationen sollten aber nicht wie bisher auf eher konser- vative Aminosäurenaustausche beschränkt bleiben, vielmehr sollte die Lage der Ami- nosäure Hauptaugenmerk zur Wahl der Mutationsposition sein. Zu vermeiden sind insbesondere die Mutationen von Chl-Bindestellen bzw. solche Positionen, in denen der Spinmarker die Chl-Bindung sterisch behindert. In trimeren Komplexen sollte zu- dem darauf geachtet werden, dass die Spinmarker sich nicht gegenseitig sterisch be- hindern. Zu bevorzugen sind zudem Aminosäure-Positionen die in die Peripherie des Proteins deuten (Altenbach et al., 2008). Hierbei ist allerdings zwischen Monomer und Trimer zu unterscheiden, wie das Beispiel V196Ch deutlich macht. Mit Hilfe der durch die AG Jeschke durchgeführten Rotamersimulationen, lassen sich in Zukunft noch vor Mutagenese-Beginn potenzielle Mutationspositionen vorhersagen und die durch die Spinmarkierung verbundenen Risiken bezüglich der Faltbarkeit und Trimerisierbarkeit gut berechnen. Die Bindung der zahlreichen Cofaktoren sollte hierbei weniger als Nachteil angesehen werden. Durch einfache Überprüfung der spektroskopischen Ei- genschaften, der Pigmentstöchiometrie, des Oligomerisierungsgrades oder der Stabili- tät gegenüber Hitze oder Chemikalien können neue LHCII-Mutanten hinreichend cha- rakterisiert werden, um die Beeinflussung der Struktur durch SDSL, auch bei wenig- konservativen Austauschen, ausschließen zu können. 4.4 Optimierung des EPR-Signals durch Markierung des LHCP mit PROXYL Ein weiteres Anliegen dieser Versuchsreihe vor Beginn der eigentlichen EPR- Messungen war die Optimierung der Spinmarkierung des rekombinanten LHCII. Wie durch Jeschke & Polyhach (2007) spezifiziert werden konnte, liegt die optimale Pro- benkonzentration zur Messung von Spin-Spin-Abständen von etwa 4 nm im X-Band bei ca. 2 mmol/l. LHCII-Konzentrationen aufgereinigter Komplexe liegen nach Verdünnung mit Glycerin in der Regel lediglich zwischen 0,2 und 0,6 mmol/l Protein. Hinzu kommt, Kapitel I 92 4 Diskussion dass bei Verwendung des Spinmarkers TEMPO ein Anteil des Spinsignals durch Re- duktion verloren geht (Dockter, 2005), was zu einer Verlängerung der erforderlichen EPR-Messzeit und zu einer Abnahme der Messgenauigkeit führt (Jeschke & Polyhach, 2007). Durch den Austausch des Spinmarkers TEMPO gegen das Pyrrolderivat PRO- XYL konnte dieses Problem minimiert werden. In Nachmarkierungsversuchen konnte bewiesen werden, dass die Markierungseffizienz des LHCII durch Verwendung des PROXYL leicht gesteigert werden konnte. Ausschlaggebend für die deutliche Verbes- serung des Spinsignals in aufgereinigten und aufkonzentrierten LHCII-Proben scheint aber die höhere chemische Stabilität des PROXYL im Vergleich zu TEMPO zu sein. Schon frühere Versuche zeigten, dass TEMPO bei Verwendung der Reduktionsmittel DTT oder β-Me effizient zum diamagnetischen Hydroxylamin reduziert wird (Dockter, 2005). Das Pyrrolderivat PROXYL zeigte dagegen eine deutlich gesteigerte Toleranz gegen Reduktion (Kroll, 1999). Ein einfacher Test durch Inkubation des TEMPO- bzw. PROXYL-markierten LHCP in TCA bestätigte dieses Ergebnis. In diesem Zusammen- hang sollte aber erwähnt werden, dass eine zeitabhängige Reduktionsreihe von Spin- marker-Stammlösungen mit gleichen Ausgangskonzentrationen repräsentativer gewe- sen wäre. Zahlreiche EPR-Versuche mit PROXYL-markierten Proben bestätigten je- doch im Durchschnitt eine deutlich bessere Signalintensität gegenüber TEMPO- markierten Proben. Ein weiterer positiver Effekt der PROXYL-Markierung zeigt sich in DEER- Abstandsmessungen. Die Verbesserung der Signalintensität an sich führt schon zur Verbesserung der erhaltenen Abstandsdaten bei gleichzeitiger Verkürzung der Mess- zeit. Durch Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses in DEER-Proben wird das „ill-posed problem“ der Tikhonov-Regularisierung minimiert und damit die erhaltene Abstandsinformation genauer. Im Falle des PROXYL kommt hinzu, dass der Pyrrol- Ring im Vergleich zum Pyridin-Ring des TEMPO, eine geringere interne Dynamik auf- weist, bedingt durch die geringeren Unterschiede in möglichen Konformeren. Dies führt zusätzlich zu einer verbesserten Auswertbarkeit der Primärdaten und letztendlich zu genaueren Abstandsinformationen. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Ar- beit der Spinmarker TEMPO nicht weiter verwendet. Stattdessen wurden alle folgen- den EPR-Experimente an PROXYL-markiertem LHCII durchgeführt (Kap. II und III). Kapitel I 5 Schlussfolgerung 93 5 Schlussfolgerung Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass in den Vorversuchen optimale Ausgangsbedingungen geschaffen werden konnten, um eine umfassende EPR- Messreihe an rekombinantem LHCII durchzuführen. Durch die Etablierung einer mo- dernen Mutagenese-Technik und durch Optimierung der Spinmarkierung konnten ins- besondere mit Hilfe der Diplomanden C. Dietz und A. Müller eine große Anzahl neuer, funktionaler LHCII-Mutanten für EPR-Experimente produziert werden (Kap. III). Bevor die entsprechenden EPR-Ergebnisse dargestellt und interpretiert werden sollen, soll im folgenden Kapitel zunächst das Problem der Herstellung heterogen spinmarkierter LHCII-Trimere (Seimetz, 2004; Dockter, 2005; Plunger, 2007) erneut aufgegriffen wer- den. Kapitel I 94 5 Schlussfolgerung Kapitel II Immobilisierung des rekombinanten LHCII mittels Affi- nitätschromatographie: Bindungsverhalten sowie Ex- perimente zur Herstellung heterogener LHCII-Trimere. 1 Einleitung Eine wichtige Voraussetzung zur Weiterentwicklung und Übertragung der EPR-DEER- Messmethodik auf Membranproteine ist das Vorhandensein von hochaufgelösten Kris- tallstrukturen auf atomarer Ebene. Nur so können Änderungen in der Messmethodik und daraus resultierende Primärdaten richtig interpretiert werden. Diese Vorausset- zung ist für den LHCII seit mehreren Jahren gegeben (Kühlbrandt et al., 1994; Liu et al., 2004; Standfuss et al., 2005), was ihn zum idealen Untersuchungsobjekt für DEER- EPR macht. Bisherige DEER-Abstandsmessungen lieferten bereits eine Vielzahl neuer In- formationen bezüglich der LHCII-Struktur in Lösung (Bender, 2004; Jeschke et al., 2005) und wurden entweder an trimerisierten Cys-Einzelmutanten wie beispielsweise der Mutante S160Ch (Abb. 2.1.1 A, rechts) oder an monomeren Cys-Doppelmutanten (beispielsweise S106C/S160Ch, Abb. 2.1.1 A, links) des rekombinanten LHCII durch- geführt. Letztere Messungen stellten sich als die eleganteren heraus, da mit ihnen in- tramolekulare Abstandsverteilungen (also innerhalb eines Monomers) gemessen, so- wie deren Änderung in Abhängigkeit von äußeren Faktoren verfolgt werden konnten. Problematisch war hierbei der direkte Vergleich mit den bekannten Daten der Kristall- struktur, da diese lediglich von trimerem LHCII existieren. Bisher gemessene Abstände in monomeren Cys-Doppelmutanten zeigten zwar eine dynamische Lage des N- Terminus gegenüber der Struktur im kristallinen Trimer (Jeschke et al., 2005), dabei blieb aber unklar, ob dies eine Folge des Übergangs vom Kristall in Lösung oder vom Trimer zum Monomer darstellte. Um solche Sachverhalte zu prüfen, ist es von großem Interesse, Spin-Spin- Kopplungen des trimeren LHCII in Lösung zu messen und mit den Kristalldaten zu ver- gleichen. Versucht man allerdings die intramolekularen Abstände des monomeren Komplexes in homogenen markierten Trimeren zu messen (Abb. 2.1.1 B), treten durch das Vorhandensein von insgesamt 6 Spinmarkern eine Vielzahl von möglichen Ab- ständen auf, die in den meisten Cys-Doppelmutanten in einer breiten Abstandvertei- lung resultieren. Kapitel II 96 1 Einleitung Abb. 2.1.1: Mögliche EPR-DEER Proben zur Messung von Spin-Spin-Kopplungen in monome- rem und trimerem LHCII am Beispiel der Cys-Doppelmutante S106C/S160Ch (106/160) und der Cys-Einzelmutante S160Ch (160). Die angegebenen Abstände beziehen sich auf Cα-Abstände innerhalb der LHCII-Kristallstruktur (PDB-Eintrag 2BHW). Schaubild (A) zeigt durchführbare Abstandsmessungen in doppelt markierten Monomeren (links) und in einfach markierten Trime- ren (rechts). Schaubild (B) verdeutlicht das Problem der Überlappung mehrerer Spin-Spin- Abstände innerhalb eines homogen markierten Trimers aus Cys-Doppelmutanten. Zur besseren Übersichtlichkeit ist jeder mögliche Abstand nur einmal statt dreimal gezeigt. In Schaubild (C) ist ein heterogenes Trimer dargestellt, bestehend aus einem doppelt markierten Monomer (grau) sowie zwei unmarkierten Monomeren (farbig). Hier ist die intramolekulare DEER-Messung mög- lich. Die Abbildung wurde mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). Kapitel II 2 Material und Methode 97 Solche Messungen sind nur mit Mutanten möglich, in welchen die intramolekularen Abstände des Monomers im Trimer deutlich unterschiedlich zu allen intermolekularen Abstandskombinationen sind. Die resultierende bimodale Verteilung könnte nach Mes- sung der entsprechenden trimeren Cys-Einzelmutanten Hintergrund-korrigiert werden. Versuche zu solchen Messungen sind derzeit in Bearbeitung (Trimere V90C/S106Ch, C. Dietz), stellen aber aufgrund der zeitaufwändigen Korrekturmessungen eher einen Kompromiss dar (Abb. 2.1.1B; von fünf möglichen Abständen müssen vier korrigiert werden). Eine elegante Lösung des Problems überlappender Abstände in homogen mar- kierten LHCII-Trimeren bieten Abstandsmessungen in heterogen spinmarkierten Trime- ren (Abb. 2.1.1 C). Solche Trimere setzen sich aus einem doppelt spinmarkierten und zwei unmarkierten LHCII-Monomeren zusammen. Zahlreiche Vorversuche zeigten al- lerdings, dass die Herstellung solcher Proben äußerst schwierig ist (Seimetz, 2004; Dockter, 2005; Plunger, 2007). Allen bis dato durchgeführten Versuchen war gemein, dass sie auf der Immobilisierung von trimerisiertem LHCII auf Ni2+-IDA-Säulen aufbau- ten. Die hierbei erzielten Ergebnisse waren oftmals widersprüchlich oder schlecht re- produzierbar. Hauptproblem war stets die geringe Bindungsausbeute von aufgereinig- ten LHCII-Trimeren an die Affinitätssäule durch eine Verhinderung der Bindung des C- terminalen Histidyl-Restes. Ziel dieser Versuchsreihe war es daher, das Bindungsver- halten des trimeren LHCII an unterschiedlichen Affinitätssäulen unter variierenden Be- dingungen zu untersuchen und soweit zu optimieren, dass die Herstellung heterogen markierter LHCII-Trimere zur Durchführung von EPR-DEER Abstandsmessungen mög- lich ist. 2 Material und Methode Allgemein gebräuchliche Materialien und Methoden wurden bereits in Kapitel I be- schrieben und sind durch entsprechende Verweise gekennzeichnet. Im Folgenden sol- len lediglich speziellen Methoden, die im Zusammenhang mit der Immobilisierung des LHCII auf Affinitätssäulen stehen, vorgestellt werden. 2.1 Molekularbiologische Herstellung von Lhcb1-Klonen mit N- terminalem „Strep tag“ und C-terminalem „His6 tag“ mittels Re- striktion und Ligation Die Herstellung doppelt affinitätsmarkierter Klone des Lhcb1 („stLhcb1h“-Klone) erfolg- te mittels Restriktion und Ligation bereits vorhandener Mutanten. Solche Klone besit- zen neben einem N-terminalen „Strep tag“ zusätzlich einen C-terminalen „His6 tag“ und wurden stC79Sh („Strep tag“-C79S-„His6 tag“, Kontroll-Protein ohne Markierungsanker) und st106/160h („Strep tag“-S106C/S160C-„His6 tag“) benannt. Der Herstellungspro- Kapitel II 98 2 Material und Methode zess ist am Beispiel des stC79Sh in Abb. 2.2.1 schematisch dargestellt. Hierzu wurden die Plasmide der „Strep tag“-Mutante D7f.3-S2 (R. Lauterbach, unveröffentlicht) sowie die der „His6 tag“-Mutanten C79Sh (Müller, 2008) bzw. S106C/S160Ch (Bender, 2004) jeweils mit SacI und PstI restringiert, die entstandenen Fragmente durch präparative Agarose-Gelelektrophorese getrennt und zu Klonen mit zwei Affinitätsmarkern ligiert. Abb. 2.2.1: Schematische Darstellung der Konstruktion von Lhcb1-Klonen mit N-terminalem „Strep tag“ und C-terminalem „His6 tag“ am Beispiel der Mutante stC79Sh. Plasmide des Klons C79Sh mit C-terminalem „His6 tag“ (Müller, 2008) und des Klons D7f.3-S2 mit N-terminalem „Strep tag“ (Lauterbach, unveröffentlicht) wurden mit SacI und PstI restringiert und die Frag- mente mittels Agarose-Gel getrennt. Im Anschluss wurden das „His6 tag“-tragende kurze Frag- ment von C79Sh und das „Strep tag“-tragende lange Fragment von D7f.3-S2 zu dem Expressi- onsvektor pDS12-RBSII-stC79Sh ligiert. Kapitel II 2 Material und Methode 99 Die Auswahl der Klone hatte verschiedene Hintergründe. Bei der Cys-Doppelmutante 106/160 handelt es sich um eine der bestuntersuchten Mutanten der AG Paulsen, be- zogen auf EPR-DEER Messungen. Daher lag es nahe, heterogene Trimere des Klones st106/160h mit den vorliegenden DEER-Daten der monomeren Doppelmutante 106/160 zu vergleichen. Der Klon stC79Sh dagegen wurde als Ausgangsklon zur Her- stellung weiterer doppelt affinitätsmarkierter Cys-Klone mittels punktspezifischer Muta- genese produziert. Zur Herstellung der neuen Klone wurde isolierte Plasmid-DNA (Kap. I, 2.6.3) der Klone S106C/S160Ch bzw. C79Sh und D7f.3-S2 mit den in Tab. 1.2.13 vorgestell- ten Restriktionsenzymen SacI und PstI, wie in Abb. 2.2.1 dargestellt, verdaut. Die En- zyme waren so gewählt, dass bei den „His6 tag“-Klonen (C79Sh, S106C/S160Ch) ne- ben einem ca. 3400 bp langen „Abfall“-Fragment, ein 829 bp kurzes Fragment entsteht, welches einen Teil der Sequenz des Lhcb1 inklusive C-terminalem „His6 tag“ enthält, nicht aber den N-Terminus. Bei der „Strep tag“-Mutante D7f.3-S2 dagegen war neben dem 829 bp kurzen „Abfall“-Fragment, ein 3430 bp langes Fragment zu erwarten, wel- ches nur die Sequenz des N-Terminus inklusive „Strep tag“ besitzt. Die Restriktion der isolierten Plasmid-DNA einzelner Klone erfolgte jeweils als Doppelverdau unter Ver- wendung des Puffers NEB2 bei 37 °C wie in Tab. 2.2.1 beschrieben. Da die Aktivität beider Enzyme in dem gewählten Puffer nicht optimal ist, wurde die eingesetzte En- zym-Menge verdoppelt und die Restriktionszeit auf 3 h erhöht. Tab. 2.2.1: Restriktionsansatz zur Herstellung von Klonen mit zwei Affinitätsmarkern. Als Plas- mid-DNA wurden pDS12-RBSII-Vektoren der Klone S106C/S160Ch (Bender 2004), C79Sh (Müller 2008), sowie D7f.3-S2 (R. Lauterbach, unveröffentlicht) eingesetzt. Material Volumen/Menge Puffer NEB2 1x Plasmid-DNA 5 µg BSA 1x SacI 40 U PstI 40 U dH2O ad 50 µl Die Denaturierung der Restriktionsendonukleasen erfolgte durch Hitzeinkubation (20 min) bei 65 °C im Wasserbad, die Isolierung der gewünschten DNA-Fragmente mittels Agarose-Gelelektrophorese, wie zuvor in Kap. I (2.6.6.2) beschrieben. Die Ligation wurde gemäß den Angaben des Herstellers duchgeführt (Rapid Ligation Kit, Fermentas), analog zu Ligationen in Kap. I (2.6.7). In diesem Fall wurde das „His6-tag“-codierende kurze DNA-Fragment (829 bp) des Vektors der Mutante C79Sh (bzw. S106C/S160Ch) mit dem „Strep tag“ codierenden Fragment (3430 bp) des Vektors der Mutante D7f.3-S2 verknüpft. Nach Transformation des Vektors in E. coli JM101-Zellen (Kap. I, 2.6.8), wurde der Ligationserfolg mittels „dirty“-PCR (Kap. I, Kapitel II 100 2 Material und Methode 2.6.4.1.2) sowie durch Sequenzierung (Kap. I, 2.6.4.1.3) geprüft. Positive Klone wur- den zur Herstellung von Dauerkulturen (Kap. I, 2.6.9) verwendet. 2.2 Präparative und analytische biochemische Methoden 2.2.1 Überexpression, Markierung und Rekonstitution von LHCP Die Überexpression des Klones C3.2h (Kosemund, 1999) mit C-terminalem „His6 tag“ sowie der Klone stC79Sh und st106/160h mit N-terminalem „Strep tag“ und C- terminalem „His6 tag“ erfolgte wie in Kap. I (2.7.2) beschrieben. Die Markierung der Apoproteine des Klones st106/160h mit dem Fluoreszenzmarker DY731-Mal oder mit dem Spinmarker PROXYL-IA wurde in Kap. I (2.7.4) erläutert. Unmarkiertes oder mar- kiertes Apoprotein wurde durch Zugabe eines Totalpigmentextraktes bei gleichzeitigem Detergenzwechsel zu funktionalen Pigment-Protein-Komplexen rekonstituiert (Kap. I, 2.7.5) und der Erfolg nach Aufreinigung via UZ (Kap. I, 2.7.7) mittels Fluoreszenz- (Kap. I, 2.8.2.2) und CD-Spektroskopie (Kap. I, 2.8.2.3) überprüft. 2.2.2 Affinitätschromatographie Die Affinitätschromatographie ist ein chromatographisches Trennverfahren zur Isolation von Molekülen aus einem Stoffgemisch. Mit Hilfe dieser Methode können beispielswei- se Proteine eines Zelllysats selektiv an Oberflächen gebunden werden, während un- gewollte Gemischbestandteile mit den Waschfraktionen entfernt werden. Vorausset- zung ist in diesem Verfahren die spezifische Interaktion des Analyten mit einem Ligan- den, der an eine stationäre Matrixoberfläche gebunden ist. Diese stationäre Phase besteht häufig aus einem Gel aus quervernetzter Agarose (Sepharose®), welche mit einem geeigneten Liganden bestückt ist. Als Ligand kann, wie in den folgenden Ab- schnitten erläutert, beispielsweise Nickel, welches spezifisch die Aminosäure His kom- plexiert, oder „Strep-Tactin®“ (kurz Strep-Tactin) dienen, welches das Peptid „Strep tag“ mit hoher Affinität bindet. Insbesondere das Arbeiten mit rekombinanten Proteinen kann durch die Insertion entsprechender Affinitätsmarker deutlich erleichtert werden und eröffnet, neben der Möglichkeit der Protein-Aufreinigung, oftmals weitere Möglich- keiten. Im Falle des LHCII beispielsweise ist durch die Immobilisierung eine gezielte Trimerisierung auf der Säulenmatrix möglich. Zum besseren Verständnis werden im Folgenden verwendete Methoden der Affinitätschromatographie zur Immobilisierung und Trimerisierung des LHCII im Detail dargestellt. 2.2.2.1 Immobilisierung des LHCII mittels „His6 tag“ Die folgenden Versuche zur Untersuchung der Wechselwirkung des C-terminalen „His6 tag“ mit Nickel-aktivierten Oberflächen wurden alle mit der LHCII-Mutante C3.2h getes- tet, welche der Aminosäuresequenz des maturen Lhcb1 mit angehängtem C- terminalen „His6 tag“ entspricht. Die Rekonstitution zu funktionalen Protein-Pigment- Kapitel II 2 Material und Methode 101 Komplexen nach der Detergenzwechsel-Methode sowie die spektroskopische Charak- terisierung der aufgereinigten Komplexe erfolgte wie vorher beschrieben (Kap. II, 2.2.1). 2.2.2.1.1 „His6 tag“/Ni2+-NTA-Sepharose® Wie in Kap. I (2.7.6) erläutert, ist der „His6 tag“ ein gebräuchliches Aminosäurese- quenz-Motiv in rekombinanten Proteinen zur Durchführung der Affinitätschroma- tographie. Ein „His6 tag“ tragendes Protein kann über die His an Ni2+-Ionen komplex gebunden werden, welche wiederum an verschiedene Formen der Sepharose komplex gebunden werden können. Ein Beispiel hierfür ist die in Abb. 2.2.2 dargestellte Nitri- loessigsäure-Sepharose (NTA-Sepharose, Qiagen; rot gefärbt), welche Ni2+ an vier Koordinationsstellen komplexiert. Somit bleiben zwei Bindestellen frei, welche durch zwei His eines „His6 tag“ (blau dargestellt) besetzt werden können. Abb. 2.2.2: „His6 tag“/Ni2+-NTA-Sepharose-Interaktion (nach Qiagen, Hilden 2003). Darstellung der Komplexierung des Ni2+ an die vier Koordinationsstellen der Nitriloessigsäure (rot). Die zwei verbleibenden Bindungsstellen des Ni2+ können durch zwei His (blau) besetzt werden. Die Stabilität des His-Ni2+-Komplexes kann durch verschiedene Chemikalien beein- flusst werden. Neben den in Tab. 2.2.2 aufgelisteten Reagenzien ist eine ausführliche Beschreibung in dem Protokoll-Buch The QIAexpressionist (S. 74/75, Qiagen, Hilden 2003) zu finden. Kapitel II 102 2 Material und Methode Tab. 2.2.2: Liste der mit dem „His6 tag“/Ni2+-NTA-Sepharose-System kompatiblen Reagenzien mit einsetzbaren Höchstkonzentrationen (Qiagen, Hilden 2003). Reagenz Konzentration Reduktionsmittel DTT 1 mmol/l β-Me 20 mmol/l Detergentien Nicht-ionische Detergentien (TX, Tween) 2 % kationische Detergentien 1 % anionische Detergentien (SDS) 0,3 % zwitterionische Detergentien (CHAPS) 1 % Andere EDTA 1 mmo/l Ethanol 20 % Glycerol 50 % Imidazol >100 mmol/l Harnstoff 8 mol/l GndHCl 6 mol/l NaCl 2 mol/l CaCl2 5 mmol/l MgCl2 4 mol/l Tris, HEPES, MOPS 100 mmol/l Die Immobilisierung mit einhergehender Trimerisierung des rekombinanten LHCII via „His6 tag“/Ni2+-NTA-Sepharose-System erfolgte analog zur Immobilisierung auf Ni2+- IDA-Sepharose (Kap. I, 2.7.6). Apoprotein der Mutante C3.2h wurde mittels Deter- genzwechsel-Rekonstitution gefaltet und auf Säulen aufgetragen, welche nach Stan- dard-Protokoll mit Ni2+-Ionen beschickt und äquilibriert worden waren. Die Waschschrit- te mit OG- und TX-Puffer erfolgten mit entsprechenden Volumina, die Elution mit 300 mM Imidazol (Eluat-Puffer). 2.2.2.1.2 „His tag“/Ni2+-IDA-Sepharose® und „His tag“/Ni2+6 6 -IDA-Fractogel® Neben der zuvor beschriebenen NTA-Sepharose wurde zudem die Bindung des LHCII mit C-terminalem „His6 tag“ an Ni2+-IDA-Sepharose® der Firma GE Healthcare sowie Ni2+-IDA-Fractogel® der Firma Novagen/Merck getestet. Wie schon in Kap. I (2.7.6) gezeigt, werden an IDA im Gegensatz zu NTA-Sepharose die Ni2+-Ionen über lediglich drei Koordinationsstellen komplex gebunden. Somit ist das Nickel im Vergleich zur NTA-Sepharose weniger fest gebunden, umgekehrt bleiben drei Koordinationsstellen zur Bindung des „His6 tag“ (Abb. 1.2.10). Die Immobilisierung mit einhergehender Tri- merisierung der LHCII-Mutante C3.2h auf Ni2+-IDA-Sepharose erfolgte wie zuvor in Kap. I (2.7.6) beschrieben. Im Unterschied zu Sepharose®, einer Matrix basierend auf Agarose, besteht Fractogel aus einem ungeladenen, synthetischen Polymer auf Me- thacrylat-Basis mit hoher chemischer Stabilität und Porengrößen von 40-90 µm. Die Kapitel II 2 Material und Methode 103 Polymere bilden lange „Tentakel“ aus, welche an die Fractogel-Matrix gebunden sind und in der Peripherie über die IDA-Gruppen mit Kationen wie beispielsweise Ni2+ bela- den werden können. Hauptvorteil dieser Matrix ist laut Hersteller die geringe sterische Behinderung, da durch die Tentakel-Strukturen auch schwer zugängliche Molekül- Bereiche erreichen werden können. Die Vorbereitung und Nickel-Beladung der IDA-Fractogel-Matrix richtete sich weitestgehend nach den Vorgaben des Herstellers Novagen. Hierzu wurde die Fracto- gel-Agarose in Chromatographie-Säulen überführt (hierbei gilt: 1 ml sedimentiertes Fractogel pro 1 mg Protein) und mit zwei Säulenvolumen (SV) Aqua dest. gewaschen. Die Nickel-Beladung erfolgte durch Zugabe von 5 SV NiSO4. Hierbei färbte sich die Matrix nicht wie von IDA-Sepharose gewohnt stark grün, sondern lediglich schwach grün. Auch der gewohnte Farbumschlag von grün nach blau durch Äquilibrieren der Säule mit zwei SV Äquilibrierungspuffer fiel schwach aus. Der Versuchsvorschrift fol- gend wurde zudem mit einem SV 300 mM NaCl nachgespült und mit drei SV kaltem (4 °C) OG-Puffer die Säule vorbereitet. Analog zum Sepharose-Protokoll (Kap. I, 2.7.6) wurde die Rekonstitutitionslösung aufgetragen und nach langsamen Durchlauf mit drei SV OG-Puffer und zwei SV TX-Puffer gewaschen. Die Elution der gebundenen Kom- plexe von der schwach grün gefärbten Matrix erfolgte durch Zugabe von 300 mmol/l Imidazol im Eluat-Puffer, grünliche Fraktionen des Eluats wurden aufgefangen und bis zur weiteren Verwendung dunkel auf Eis gelagert. Die Regeneration der Fractogel- Agarose erfolgte nach Herstellerangaben durch Waschen mit drei SV Regenerations- puffer, einem SV HCl, zwei SV NaCl, 10 SV NaOH, zwei SV NaCl und 10 SV Regene- rationspuffer. Nach Äquilibrierung mit 10 SV Äquilibrierungspuffer konnte die Fractogel- Agarose erneut mit Ni2+ beladen werden. Material: Äquilibrierungspuffer: 300 mmol/l NaCl 25 mmol/l Natrium-Phosphat(pH8,0) Spüllösung: 300 mmol/l NaCl NiSO4: 100 mmol/l OG-Puffer: 1 % OG (w/v) 0,1 mol/l Tris/HCl (pH 9,0) 12,5 % Saccharose (w/v) TX-Puffer: 0,05 % TX (v/v) 0,1 mol/l Tris/HCl (pH 7,5) 0,1 mg/ml PG Kapitel II 104 2 Material und Methode Eluat-Puffer mit Imidazol: 0,05 % TX (v/v) 0,1 mol/l Tris/HCl (pH 7,5) 0,1 mg/ml PG Imidazol 300 mmol/l Regenerations-Puffer: 300 mmol/l NaCl 100 mmol/l EDTA 20 mmol/l Natrium-Phosphat(pH7,9) 2.2.2.1.3 Immobilisierung des LHCII mittels „His6 tag“ nach Ultrazentrifugation Um trimeren LHCII nach Oligomerisierung an der Ni-Säule erneut an Ni2+-Sepharose zu binden, ist es unausweichlich, das Imidazol aus dem Protein-haltigen Eluat zu ent- fernen. Eine Möglichkeit hierzu ist die Aufreinigung des Eluats mittels UZ. Um die Aus- wirkung der Ultrazentrifugation bzw. des Lösungsmittels auf das Bindungsverhalten des „His6 tag“ an Ni2+-Sepharose zu testen, wurde C3.2h durch Detergenzwechsel re- konstituiert (Kap. I, 2.7.5). Ein Aliquot der Rekonstitution wurde mittels Ni-Säule trime- risiert (Kap. I, 2.7.6) und via UZ aufgereinigt (Kap. I, 2.7.7). Sowohl monomerer als auch trimerer LHCII in LM-haltiger Saccharoselösung wurden erneut nach Standard- Protokoll in (Kap. I, 2.7.6) auf IDA-Sepharose aufgetragen, als Referenz diente ein Aliquot der ursrünglichen C3.2h Rekonstitutionslösung. Nach den entsprechenden Waschschritten wurden die Eluate der Ni-Säule erneut durch UZ aufgereinigt und so- wohl CD- (Kap. I, 2.8.2.3) als auch Fluoreszenz-spektroskopisch (Kap. I, 2.8.2.2) un- tersucht. Die Berechnung der Trimerausbeute in den einzelenen Teilversuchen erfolgte durch Konzentrationsbestimmung von LHCII nach Butler & Kühlbrandt (1988; Kap. I, 2.7.9) und Volumenbestimmung. 2.2.2.1.4 Einfluss von Ni2+-Ionen in der Proteinlösung auf die Immobilisierung des „His6 tag“ Ein Grund für eine verringerte Bindungsausbeute von LHCII-Trimeren an Ni-Säulen könnte die Blockierung des „His6 tag“ durch Ni2+-Ionen sein, welche möglicherweise aus der vorherigen Oligomerisierung auf der Ni-Säule verschleppt werden. Um die Auswirkung einer Verunreinigung der Proteinlösung mit Ni2+-Ionen auf das Bindungs- verhalten des „His6 tag“ an Ni2+-Sepharose zu testen, wurde C3.2h durch Deter- genzwechsel-Rekonstitution gefaltet (Kap. I, 2.7.5), mit 0,2 mmol/l bzw. 2 mmol/l NiCl2- Lösung versetzt und nach Standard-Rezept auf die Ni-Säule aufgetragen (Kap. I, 2.7.6) und nach Standard-Protokoll trimerisiert. Als Referenz in der Trimerisierung diente die gleiche C3.2h Rekonstitutionslösung ohne NiCl2. Die Eluate der Ni-Säule wurden mit- tels UZ aufgereinigt (Kap. I, 2.7.7) und sowohl CD- (Kap. I, 2.8.2.3) als auch Fluores- zenz-spektroskopisch (Kap. I, 2.8.2.2) untersucht. Kapitel II 2 Material und Methode 105 2.2.2.1.5 Einfluss von Detergentien auf die Immobilisierung des „His6 tag“ Um den Einfluss verschiedener Detergentien auf die Bindung des „His6 tag“ der Trime- re an immobilisierte Ni2+-Ionen Ni-Kationen zu prüfen, wurde C3.2h rekonstituiert (Kap. I, 2.7.5), auf der Ni-Säule trimerisiert (Kap. I, 2.7.6) und mittels UZ aufgereinigt (Kap. I, 2.7.7). Die LHCII-Trimere wurden aus den Gradienten abgezogen, Absorptions-, Fluo- reszenz und CD-spektroskopisch untersucht (Kap. I, 2.8.2) und wie bei Hobe (1995) beschrieben mittels Zugabe von KCl und „Bio Beads“ ausgefällt. Hierbei wurden je 1 ml 0,1%ige LM-Lösung 22 mg KCl und 34 mg entgaste „Bio Beads“ hinzugefügt und über Nacht im Kühlraum bei 4 °C gedreht. Am folgenden Tag wurden die Detergenz- bindenden „Bio Beads“ entfernt und gegen die dreifache Menge frischer „Bio Beads“ ersetzt. Dieser Schritt wurde mehrfach stündlich wiederholt. Die ausgefällten Trimere wurden aliquotiert, abzentrifugiert (Überstand verworfen) und jeweils in 500 µl Deter- genzlösung bzw. Detergenz-haltigem Puffer auf Eis solubilisiert. Es wurden folgende Kombinationen getestet: zum einen die Bindung von Trime- ren (jeweils ca. 40 µg) in 1%iger OG-Lösung auf Ni2+-IDA-Sepharose, Ni2+-IDA- Fractogel und Ni2+-NTA-Sepharose. Die einzelnen Säulen wurden wie zuvor beschrie- ben präpariert (Kap. II, 2.2.2.1), die Proben aufgetragen und gewaschen. Zum anderen wurden ca. 55 µg der ausgefällten Trimere in 1 % TX bzw. zu je 30 µg in jeweils ver- schiedenen LM- oder TX-haltigen Saccharose-Puffern rückgelöst und nach Standard- Methode auf Ni2+-IDA-Sepharose aufgetragen, gewaschen und eluiert (Kap. I, 2.7.6). In einem weiteren Ansatz wurden ca. 40 µg der gefällten Trimere als Referenz in 1%iger OG-Lösung solubilisiert. Außerdem wurden zwei Aliquots zu je 50 µg in zwei unter- schiedlichen Rekonstitutions-„Mock“-Puffern rückgelöst. Diese wurden durch „Nachko- chen“ einer Detergenzwechsel-Rekonstitution ohne Apoprotein hergestellt, wobei einer der Puffer mit Totalpigmentextrakt versetzt wurde, der zweite jedoch nicht. Nach KCl- Zugabe wurde analog zur Standard-Rekonstitution das ausgefällte KDS gründlich ab- zentrifugiert. Der verbleibende Überstand der einzelnen „Mock“-Puffer wurde zum Lö- sen je eines Trimer-Aliquots verwendet. Die rückgelösten Trimere wurden nach Stan- dard-Protokoll auf Ni2+-IDA-Sepharose aufgetragen, gewaschen und eluiert (Kap. I, 2.7.6). Die Eluate der Ni-Säulen wurden erneut durch UZ aufgereinigt (Kap. I, 2.7.7) und sowohl CD- (Kap. I, 2.8.2.3) als auch Fluoreszenz-spektroskopisch (Kap. I, 2.8.2.2) untersucht. Material: „Bio Beads“ (entgast) OG-Lösung (1 %) TX-Lösung (1 %) Saccharose-Puffer LM: 0,5 mol/l Saccharose 5 mmol/l Tricine pH 7,8 0,1 % LM Kapitel II 106 2 Material und Methode Saccharose-Puffer TX 0,5 mol/l Saccharose 5 mmol/l Tricine pH 7,8 0,05 % TX Rekonstitutions-„Mock“-Puffer ohne Lhcb1 und ohne Pigment-Totalextrakt Rekonstitutions-„Mock“-Puffer ohne Lhcb1, aber mit Pigment-Totalextrakt 2.2.2.2 Immobilisierung des LHCII mittels „Strep tag“/Strep-Tactin-System Eine weitere Möglichkeit der Immobilisierung rekombinanter Proteine bietet die Ver- wendung des sogenannten „Strep tag“, eines kurzen Peptidmotivs mit hoher Affinität zu Strep-Tactin-Sepharose (Abb. 2.2.3; 8 Aminosäuren: WSHPQFEK). Analog zur Inserti- on des Hexahistidyl-Restes kann dieses Peptidmotiv ebenfalls molekularbiologisch mit rekombinanten Proteinen fusioniert werden (Lauterbach, unveröffentlicht). Dieses von der Firma IBA (Institut für Bioanalytik, Göttingen) entwickelte System zur Affini- tätschromatographie basiert auf der Bindung des Biotin (Vitamin H) an Streptavidin (aus Streptomyces avidinii) und stellt eine hochaffine nichtkovalente Bindung dar. Streptavidin wurde genetisch zu Strep-Tactin modifiziert und besitzt eine hundertfach gesteigerte Affinität zum „Strep tag“. Abb. 2.2.3: Strukturformel und Aminosäuresequenz des „Strep tag“ Wie schon in Kap. I (2.7.6) für den „His6 tag“ beschrieben, sind auch für den „Strep tag“ aufgrund seiner geringen Größe keine Interaktionen mit dem Fusionspartner zu erwar- Kapitel II 2 Material und Methode 107 ten, so dass die Bioaktivität des Fusionsproteins nicht beeinflusst werden sollte. Um eine effiziente Bindung des „Strep tag“ an Strep-Tactin-Sepharose zu erreichen, sollte allerdings die Verwendung bestimmter Chemikalien, wie in Tab. 2.2.3 aufgeführt, ein- geschränkt werden. Tab. 2.2.3: Liste der mit dem „Strep tag“/Strep-Tactin-System kompatiblen Reagenzien mit einsetzbaren Höchstkonzentrationen (IBA, Göttingen). Reagenz Konzentration Reduktionsmittel DTT 50 mmo/l β-Me 50 mmol/l Nicht-ionische Detergentien OG 2,34 % LM 0,007 % TX 2 % DM (Decyl- β-D-Maltosid) 0,35 % NG (N-nonyl- β-D-Glucopyranosid) 0,2 % Tween 20 2 % Ionische Detergentien SDS 0,1 % Zwitterionische Detergentien CHAPS 0,1 % Andere EDTA 50 mmol/l Ethanol 10 % Glycerol 25 % Imidazol 250 mmol/l Harnstoff 1 mol/l Guanidin 1 mol/l NaCl 5 mol/l CaCl2 1 mol/l MgCl2 1 mol/l Ammoniumsulfat 2 mol/l Insbesondere die Detergentien LM, OG oder TX sowie die in Rekonstitutionsversuchen notwendigen Reduktionsmittel DTT oder β-Me, dürfen nur bis zu bestimmten Konzent- rationen eingesetzt werden. Werden diese Richtlinien befolgt, ist es nach Angaben des Herstellers möglich 50 bis 100 nmol rekombinantes Protein pro 1 ml sedimentierten Säulenmaterials zu binden (entspricht 1,25 bis 2,5 mg LHCP pro 1 ml Säulenmaterial). Die Aufreinigung des Fusionsproteins erfolgt, wie in Abb. 2.2.4 gezeigt, in meh- reren Binde- und Waschschritten. Nach Bindung des Fusionsproteins an Strep-Tactin (1), werden ungebundene Proteine mit einem Waschpuffer entfernt (2). Die Elution des aufgereinigten Fusionsproteins erfolgt durch kompetetive Bindung des Desthiobiotin, einem Biotin-Derivat, welches im Gegensatz zu Biotin reversibel an Strep-Tactin bindet (3). Kapitel II 108 2 Material und Methode Abb. 2.2.4: Aufreinigung eines affinitätsmarkierten, rekombinaten Fusionsproteins mittels des „Strep tag“/Strep-Tactin-System (abgeändert nach IBA, Göttingen), Erläuterungen im Text. Zur Regeneration der Säulenmatrix wird zunächst Desthiobiotin durch die Bindung von HABA (4-Hydroxy-Azobenzen-2-Carbonylsäure) kompetitiv verdrängt und eluiert (4). Die Bindung an Strep-Tactin führt zu einem Farbumschlag des HABA von Gelb zu in- tensivem Rot (4). Erfolgt dieser Farbumschlag, kann davon ausgegangen werden, dass die Säulenmatrix sowohl Fusionprotein-frei als auch Desthiobiotin-frei ist. Durch ausreichendes Waschen der Matrix mit einem entsprechenden Waschpuffer kann in einem letzten Arbeitsschritt das HABA eluiert werden, wobei wieder der Farbumschlag zu Gelb erfolgt. Zurück bleibt die regenerierte gräulich gefärbte Säulenmatrix. 2.2.2.2.1 Immobilisierung und Trimerisierung von rekombinantem LHCII mittels „Strep tag“ Wie zuvor in diesem Kapitel beschrieben, wurde der „Strep tag“ molekularbiologisch mit dem N-Terminus des Lhcb1 fusioniert, so dass das Peptid die N-proximale Se- quenz der Domäne bildet und eine hohe Zugänglichkeit (Müller, 2008) für die Binde- stellen des Strep-Tactin zeigen sollte. Ziel war es den Affinitätsmarker zum einen auf seine Nutzung zur effizienten Trimerisierung des rekonstituierten LHCII zu testen (R. Lauterbach, unveröffentlicht) und zum anderen auf die Möglichkeit der Bindung von LHCII-Trimeren. Um die dazu nötige, vom „Strep tag“ unabhängige, Trimerisierung zu Kapitel II 2 Material und Methode 109 ermöglichen, waren beide Mutanten zusätzlich mit einem C-terminalen „His6 tag“ aus- gestattet. Die Überexpression (Kap. I, 2.7.2) des Klones C3.2h mit C-terminalem „His6 tag“ und der doppelt affinitätsmarkierten Klone stC79Sh und st106/160h sowie die Re- konstitution der aufgereinigten Apoproteine zu funktionalen Protein-Pigment- Komplexen nach der Detergenzwechsel-Methode (Kap. I, 2.7.5) erfolgten wie zuvor beschrieben. Die Trimerisierung mittels N-terminalem „Strep tag“ erfolgte auf 500 µl Strep-Tactin pro 500 µg LHCII. Hierbei sei darauf hingewiesen, dass die verwendeten Puffer sich teilweise in ihrem pH-Wert von entsprechenden „His6 tag“/Ni-Säulen-Puffern unterscheiden. Zur Oligomerisierung wurde 1 SV Strep-Tactin sedimentiert und mit je 4 SV Puffer-W und 4 SV OG-Puffer (4 °C) äquilibriert. Nach Auftragen und Durchlaufen der Proteinlösung im Kühlraum (4 °C), wurden ungebundene Komplexe durch Wa- schen mit 4 SV OG-Puffer entfernt und die Trimerisierung durch Auftrag von 4 SV PG- haltigem TX-Puffer induziert. Letztlich wurden gebundene Komplexe mittels 4 SV BE- Puffer eluiert, grüne Fraktionen aufgefangen und mittels UZ (Kap. I, 2.7.7) zur spektro- skopischen Charakterisierung (Kap. I, 2.8.2.2 und 2.8.2.3) aufgereinigt. Die Regenera- tion des Säulenmaterials erfolgte durch Waschen mit mehreren SV Regenerations- und Waschpuffer, sowie mit 0,1 % SDS, 20 % EtOH, 50 mmol/l EDTA sowie Aqua dest. . Material: Puffer-W: 100 mmol/l Tris/HCl (pH 8) 150 mmol/l NaCl OG-Puffer: 1 % OG (w/v) 0,1 mol/l Tris/HCl (pH 8) 12,5 % Sacchrose (w/v) TX-Puffer: 0,05 % TX (v/v) 0,1 mol/l Tris/HCl (pH 7,5) 0,1 mg/ml PG D-Biotin-Eluat (BE)-Puffer: 0,05 % TX (v/v) 0,1 mol/l Tris/HCl (pH 8) 0,1 mg/ml PG 2,5 mmol/l D-Biotin Regenerations-Puffer: 1 mmol/l Tris/ HCl (pH 8) 0,15 mol/l NaCl 1 mmol/l EDTA 1 mmol/l HABA Kapitel II 110 2 Material und Methode Wasch-Puffer: 1 mmol/l Tris/ HCl (pH 8) 0,15 mol/l NaCl 1 mmol/l EDTA 0,1 % SDS 20 % EtOH 50 mmol/l EDTA 2.2.2.2.2 Aufeinanderfolgende Immobilisierung von Klonen mit zwei Affinitäts- markern: Trimerisierung mittels C-terminalem „His6 tag“ und nachfolgende Bin- dung der Trimere mittels N-terminalem „Strep tag“ Um die Fähigkeit der Immobilisierung des trimeren LHCII an Strep-Tactin zu testen, wurde in einem ersten Versuchsansatz stC79Sh nach Standard-Protokoll rekonstituiert (Kap. I, 2.7.5) und mittels „His6 tag“ an Ni2+-IDA-Sepharose trimerisiert (Kap. I, 2.7.6). Ein Aliquot der trimeren Komplexe wurde mittels UZ aufgereinigt (Kap. I, 2.7.7), das andere auf Eis dunkel gelagert. Weiterhin wurden, wie zuvor beschrieben (Kap. II, 2.2.2.2.1), zwei Strep-Tactin-Säulen vorbereitet, wobei die Säulen nach Äquillibrieren direkt mit TX- statt mit OG-Puffer gespült wurden, da dieser bereits PG enthält und somit gewährleistet ist, dass Trimere nicht zu Monomeren zerfallen. Zum Vergleich wurde eine der beiden Strep-Tactin-Säulen mit dem unaufgereinigten Ni-Säulen-Eluat beschickt, die andere mit aufgereinigten Trimeren. Der folgende Waschschritt geschah mit TX-Puffer, die Elution und die Regeneration des Säulenmaterials erfolgten wie zu- vor berichtet. Die Eluate wurden durch UZ aufgereinigt (Kap. I, 2.7.7) und sowohl CD- (Kap. I, 2.8.2.3) als auch Fluoreszenz-spektroskopisch (Kap. I, 2.8.2.2) untersucht. 2.2.2.2.3 Herstellung heterogen markierter Trimere des rekombinanten LHCII Wie im Ergebnisteil dieses Kapitels beschrieben, wurden unterschiedliche Ansätze zur Herstellung heterogener LHCII-Trimere durchgeführt. Zum Test der Methode wurde eine Mischung aus rekonstituierten Monomeren der Mutante st106/160h (Dy731- markiert; Kap. I, 2.7.4.2) und Monomeren von C3.2h (Verhältnis 1:5) auf der Ni-Säule trimerisiert (Kap. I, 2.7.6) und ohne vorherige Aufreinigung auf Strep-Tactin immobili- siert. Das Eluat wurde mittels denaturierender SDS-PAGE analysiert (Kap. I, 2.8.1.1) sowie durch UZ aufgereinigt (Kap. I, 2.7.7) und sowohl CD- (Kap. I, 2.8.2.3) als auch Fluoreszenz-spektroskopisch (Kap. I, 2.8.2.2) untersucht. Zur Herstellung einer EPR- DEER-Probe aus heterogenen Trimeren wurden 5 mg PROXYL-markierte (Kap. I, 2.7.4.1) Monomere von st106/160h mit C3.2h-Monomeren im Verhältnis 1:8 gemischt und mittels „His6 tag“ trimerisiert (Kap. I, 2.7.6). Ohne vorherige Aufreinigung wurde das Ni-Säulen-Eluat sofort an Strep-Tactin gebunden, mit TX-Puffer gewaschen, eluiert und mittels UZ aufgereinigt. Die isolierten trimeren Komplexe wurden auf eine Konzent- ration von 520 µmol/l LHCII aufkonzentriert, mit Glycerin versetzt (40 %) und von Prof. Dr. Gunnar Jeschke an der ETH Zürich im DEER-Spektrometer abstandsvermessen. Kapitel II 3 Ergebnisse 111 3 Ergebnisse 3.1 Versuche zur Bindung des LHCII mittels C-terminalem „His6 tag“ Die nachfolgend beschriebene Versuchsreihe zur Untersuchung der Immobilisierung des aufgereinigten LHCII mittels C-terminalem „His6 tag“ stellt eine Fortsetzung frühe- rer Experimente zur Herstellung des heterogen trimerisierten LHCII dar (Seimetz, 2004; Dockter, 2005). Grundlage früherer Versuche war die Idee spinmarkierte LHCII- Monomere, die gleichzeitig einen C-terminalen „His6 tag“ tragen, mit einem Überschuss an LHCII zu mischen, der weder den Spinmarker noch den Affinitätsmarker besitzt. Nach Trimerisierung dieses Mischansatzes in Liposomen (Boggasch, 2006) besitzen dann alle entstehenden Trimere eine zueinander proportionale Zahl an Spinmarkierun- gen und Affinitätsmarkern mit entweder keinem bzw. einem, zwei oder drei markierten Monomeren. Belädt man eine Ni-Säule mit diesem Gemisch aus Trimeren, sollten Tri- mere ohne „His6 tag“ nicht binden, solche mit einem „His6 tag“ dagegen binden, aber schwächer als Trimere mit zwei oder drei „His6 tag“. Dieses unterschiedlich starke Bin- dungsverhalten könnte man sich zunutze machen und die verschiedenen Trimerkom- binationen mit einem steigenden Imidazolgradienten nacheinander von der Säule eluie- ren und somit von einander trennen. Nach Identifizierung der einfach markierten, hete- rogenen Trimere, beispielsweise durch Vorversuche mit Fluoreszenz-markiertem LHCII, könnten entsprechende EPR-Proben produziert werden. Voraussetzung dieses Versuchsprotokolls ist die Immobilisierung des trimeri- sierten LHCII auf der Ni-Säule. In diversen Vorversuchen (Seimetz, 2004; Dockter, 2005; Plunger, 2007) scheiterte die Probenherstellung an diesem Protokollschritt. Da- her soll im folgenden Abschnitt die Bindung des LHCII mittels C-terminalem „His6 tag“ an unterschiedliche Ni2+-Affinitätssäulen unter variierenden Bedingungen getestet wer- den. 3.1.1 Trimerisierungs-Ausbeuten bei Verwendung unterschiedlicher Säulen- materialien In einem Vorversuch wurde das Bindungsverhalten des rekonstituierten LHCII an un- terschiedliche Säulenmaterialen getestet (IDA-Sepharose, IDA-Fractogel und NTA- Sepharose). Das grundlegende Bindungsprinzip, nämlich die Immobilisierung der Pro- teine mittels C-terminalem „His6 tag“ an komplex gebundenes Nickel, war allen Mate- rialien gemein. Unterschiede gab es lediglich im Aufbau der jeweiligen Säulen- Matrizen, was zuvor schon erläutert wurde (Kap. II, 2.2.2.1). So bilden die Polymere des IDA-Fractogels, im Gegensatz zu IDA-Sepharose, lange „Tentakel“ aus, die, termi- nal mit IDA-Gruppen bestückt, auch einen sterisch schwer erreichbaren „His6 tag“ bin- den können. Ein Ni2+-Ion an NTA-Sepharose besitzt im Vergleich zu IDA-Materialen Kapitel II 112 3 Ergebnisse nur zwei freie Koordinationsstellen für His, NTA-Sepharose eignet sich aber laut Her- steller durch die festere Bindung des Nickel besser zur Immobilisierung des „His6 tag“. Um das Bindungsverhalten des rekombinaten LHCII an unterschiedliche Mate- rialien zu prüfen, wurde die Mutante C3.2h durch Detergenzwechsel-Rekonstitution gefaltet und auf die vorbereiteten Säulenmaterialen aufgetragen (Abb. 2.3.1, A und B). Zu beachten ist, dass auf Säule 1 (IDA-Sepharose) und Säule 3 (NTA-Sepharose) je- weils 1 mg Protein (auf je 1 ml Säulenmaterial), auf Säule 2 (IDA-Fractogel) dagegen 0,5 mg Protein (auf 0,5 ml Säulenmaterial) immobilisiert wurden. Nach Äquilibrieren der Ni-Säulen (also vor Protein-Zugabe; Abb. 2.3.1 A), fiel zunächst auf, dass das IDA- Fractogel (Probe 2) im Gegensatz zu den Sepharosen kaum Färbung annimmt und weiß bleibt. Auch nach Immobilisierung der Komplexe auf den Säulen und nach Waschschritten mit OG- und TX-Puffer (B) zeigte sich wenig Färbung. Während die Sepharosen durch die LHCII-Bindung insbesondere im oberen Säulenbereich deutlich grün gefärbt waren, zeigte die Fractogel-Säule nur eine schwache Grünfarbung mit dunkel-grünem oberen Rand. Die Eluate der jeweiligen Säulen wurden via UZ aufge- reinigt (C), die einzelnen Banden isoliert und spektroskopisch untersucht. Mittels CD- Spektroskopie konnten die markierten Banden (*) als trimere Komplexe identifiziert werden, der Energietransfer von Chl b auf Chl a war vollständig gewährleistet (Daten nicht gezeigt). Abb. 2.3.1: Vergleich der Immobilisierung und des Trimeri- sierungsverhaltens von rekonstituiertem LHCII (C3.2h) auf unterschiedlichen Säulenmaterialen mit komplex gebunde- nem Ni2+. Säule 1 wurde mit IDA-Sepharose, Säule 2 mit IDA-Fractogel und Säule 3 mit NTA-Sepharose befüllt. (A) zeigt das Säulenmaterial nach Beschickung mit NiCl2 und Äquilibrierung. (B) zeigt das Säulenmaterial mit gebunde- nen LHCII-Komplexen nach Waschen mit OG- und TX- Puffer. In (C) ist das Eluat der jeweiligen Säulen nach Auf- reinigung im Saccharose-Dichtegradient dargestellt, die Banden des trimeren LHCII sind markiert (*). Die jeweiligen Prozentzahlen geben die Menge an trimerisiertem LHCII bezogen auf die in der Rekonstitution eingesetzte Menge an Apoprotein wieder. In Probe 2 (IDA-Fractogel) wurde im Vergleich zu Probe 1 und 3 nur die Hälfte an Protein (bei entsprechend halbem Säulenvolumen) eingesetzt. Die mittels Absorptionsspektroskopie ermittelte LHCII- Konzentration verrechnet mit dem abgezogenen Pro- benvolumen, ergab für beide Sepharosen eine Aus- beute von ca. 25 % trimerem LHCII bezogen auf die in der Rekonstitution eingesetzte Menge an Apopro- tein. Dagegen konnten von IDA-Fractogel nur ca. 16 % des rekonstituierten Proteins als Trimer eluiert werden. Wichtig ist es in diesem Zu- Kapitel II 3 Ergebnisse 113 sammenhang zu betonen, dass aus versuchstechnischen Gründen auf dem Fractogel- Gradienten nur die halbe Proteinmenge aufgetragen wurde, was von vornherein zu deutlich schwächeren Banden im Saccharose-Dichtegradienten führte. Allerdings ist in Abb. 2.3.1 C deutlich zu erkennen, dass in den Dichtegradienten der Sepharoseproben (1 und 3) das Verhältnis Trimer (markierte Bande) zu Monomer (Bande über Trimer- bande) deutlich auf Seiten der Trimere liegt, während das Verhältnis im Gradienten der Fractogel-Probe (2) etwa 1:1 ist. Da weder das IDA-Fractogel, noch die NTA- Sepharose eine Verbesserung in der Bindungs- bzw. Trimerisierungsausbeute des LHCII zeigten, wurden die nachfolgenden Versuche zunächst mit der bewährten IDA- Sepharose durchgeführt. 3.1.2 Einfluss verschiedener Faktoren auf die Bindung des LHCII an Ni-Säulen 3.1.2.1 Bindung des monomeren und trimeren LHCII nach Ultrazentrifugation Wie zuvor berichtet, stellt die Immobilisierung von trimerem LHCII auf Säulen- Materialien eine Grundlage zur Produktion heterogener Trimere dar. Die in früheren Arbeiten schon oftmals bemängelte Bindungsausbeute des aufgereinigten LHCII an Ni- Säulen sollte in dieser Versuchsreihe mit IDA-Sepharose als Säulenmatrix untersucht werden. Hierzu wurde wieder C3.2h durch Detergenzwechsel-Rekonstitution gefaltet und in zwei Fraktionen aliquotiert, wobei eine auf Ni2+-IDA-Sepharose trimerisiert und via Saccharose-Dichtegradient in monomeren und trimeren LHCII aufgereinigt wurde. Die andere Fraktion der Rekonstitution wurde auf Eis gelagert. Diese drei Proben wur- den, wie in Abb. 2.3.2 gezeigt, zu gleichen Proteinmengen auf Ni2+-IDA-Sepharose immobilisiert, wobei Probe 1 den ursprünglichen Rekonstitutionsansatz darstellt, Probe 2 den aufgereinigten monomeren LHCII und Probe 3 den aufgereinigten trimeren LHCII. Wie aus (A) deutlich hervorgeht, waren nach den Waschschritten vor allem die Komplexe der Rekonstitution gebunden (Säule 1 A, stark grün gefärbt), die aufgereinig- ten Monomere wurden nur zu einem geringen Anteil immobilisiert (2 A), die Trimere (3 A) praktisch nicht. Kapitel II 114 3 Ergebnisse Abb. 2.3.2: Bindungs- und Trimerisierungsverhalten von monomerem und trimerem LHCII auf Ni2+-IDA-Sepharose nach vorheriger Ni-Säulen-Immobilisierung und Aufreinigung via UZ. (A) zeigt das Säulenmaterial mit gebundenen LHCII-Komplexen nach Waschen mit OG- und TX- Puffer. In (B) ist das Eluat der jeweiligen Säulen nach Aufreinigung im Saccharose- Dichtegradient dargestellt, die Banden des trimeren LHCII sind markiert (*). Auf Säule 1 wurde als Positiv-Kontrolle 200 µg C3.2h nach Detergenzwechsel-Rekonstitution aufgetragen („Reko“; Proteinmenge bezogen auf eingesetzte Menge an Apoprotein). Die gleiche Rekonstitution wur- de auf Ni2+-IDA-Sepharose trimerisiert und mittels UZ aufgereinigt. Hiervon wurden je 200 µg der Monomere bzw. Trimere auf Säule 2 bzw. 3 aufgetragen (Proteinmenge bezogen auf aufge- reinigten LHCII). Die jeweiligen Prozentzahlen geben die Menge an immobilisierten LHCII- Trimeren bezogen auf die jeweils eingesetzte Menge an Protein wieder. In der rechten Bildhälf- te ist die spektroskopische Charakterisierung der isolierten Komplexe mittels Fluoreszenz- Emission (Anregung des Chl b bei 470 nm, normiert auf max. Emission) und CD-Absorption dargestellt (zur Übersichtlichkeit gestaffelt gezeigt). Die im Saccharose-Gradient aufgereinigten Eluate bestanden in allen drei Proben vor- wiegend aus Trimeren (*). Probe 1 zeigte wie vorher (Kap. II, 3.1.1) eine Bindungs- und Trimerisierungsausbeute von ca. 25 % des in der Rekonstitution eingesetzten Apopro- teins, Probe 2 enthielt noch ca. 3 % des aufgetragenen Proteins, Probe 3 nur noch 1,3 %. Hierbei ist zu beachten, dass sich in Probe 1 die Trimerisierungsausbeute auf die in der Rekonstitution eingesetzte Menge an Apoprotein bezieht. Da in der Deter- genzwechsel-Rekonstitution unter optimalen Bedingungen 50-70 % des eingesetzten Kapitel II 3 Ergebnisse 115 Proteins zu funktionalen Protein-Pigment-Komplexen falten, bedeutet dies bei 200 µg eingesetztem Apoprotein nach optimaler Faltung (70 %) 140 µg gefaltetes Protein. Da im Eluat nach Aufreinigung ca. 25 % trimerer Komplex detektiert wurden (entspricht 50 µg LHCII), bedeutet dies eine Trimerisierungsausbeute von ca. 36 % bezogen auf das gefaltete Protein. Auf Säule 2 und 3 wurden im Gegensatz zu Säule 1 jeweils 200 µg aufgereinigtes, gefaltetes Protein aufgetragen. Richtig genommen müsste man die hier angegebenen Bindungsausbeuten von 3 % und 1,3 % also mit einer Positiv-Kontrolle von 36 % vergleichen, was die Bindungsausbeuten gegenüber rekonstituierten unauf- gereinigten Komplexen noch verkleinert. Im Unterschied zu den rekombinanten C3.2h-Komplexen, die die Ni-Säule nur einmal passiert haben (Abb. 2.3.2, rechte Bildhälfte unten, schwarze Linie), zeigen die trimerisierten Komplexe nach der zweiten Ni-Säule (grüne Linie, rote Linie) eine etwas negativere CD-Absorption bei 473 nm, identisch zu wildtypischem LHCII (Rühle & Paulsen, 2004). Der Energie-Transfer von Chl b zu Chl a ist in allen Proben gewähr- leistet (obere Bildhälfte). 3.1.2.2 Einfluß von Ni2+-Ionen in der Proteinlösung auf die Bindung des „His6 tag“ an Ni2+-IDA-Sepharose Als mögliche Ursache für die geringe Bindungsausbeute des LHCII an IDA-Sepharose nach vorheriger Standard-Trimerisierung wurde die Blockierung der „His6 tag“ der Pro- teinproben mit Kationen wie Ni2+ oder Cd2+, z.B. als Überbleibsel der Trimerisierung bzw. durch Verunreinigung der verwendeten Chemikalien, gehandelt. Um den Einfluß freier Kationen in der Proteinlösung zu testen, wurde C3.2h mittels Detergenzwechsel- Rekonstitution gefaltet, mit 0,2 bzw. 2 mmol/l NiCl2 versetzt und zu gleichen Mengen auf Ni2+-IDA-Sepharose aufgetragen. Als Referenz diente C3.2h der gleichen Rekonsti- tution ohne NiCl2. Nach den einzelnen Waschschritten waren auf allen drei Säulen grüne Komplexe gebunden (Abb. 2.3.3, A), wobei die Referenz (Probe 1) und die Pro- be 2 mit 0,2 mmol/l NiCl2 deutlich stärker gefärbt waren als Probe 3 mit 2 mmol/l NiCl2. Kapitel II 116 3 Ergebnisse Abb. 2.3.3: Einfluß von Ni2+-Ionen auf das Bindungs- verhalten der LHCII-Mutante C3.2h an Ni2+-IDA- Sepharose. Auf Säule 1 wurde als Positiv-Kontrolle LHCII nach Detergenzwechsel-Rekonstitution („Re- ko“) aufgetragen, auf Säule 2 bzw. 3 die gleiche Re- konstitutionslösung mit 0,2 mmol/l bzw. 2 mmol/l NiCl2. (A) zeigt das Säulenmaterial mit gebundenen LHCII-Komplexen nach Waschen mit OG- und TX- Puffer. In (B) ist das Eluat der jeweiligen Säulen nach Aufreinigung mittels UZ dargestellt, die Banden des trimeren LHCII sind markiert (*). Die jeweiligen Pro- zentzahlen geben die Menge an trimerisiertem LHCII bezogen auf die in der Rekonstitution eingesetzte Menge an Apoprotein wieder. Das aufgereinigte Eluat (Abb. 2.3.3, B) spiegelte dieses Ergebnis wider. Während die Referenz- probe (1) wie zuvor eine Trimerisierungs- und Bindungsausbeute von ca. 25 % des in der Re- konstitution eingesetzten Proteins zeigte, konn- ten von Probe 2 (0,2 mmol/l NiCl2) ca. 20 % Tri- mere eluiert werden, von Probe 3 (2 mmol/l NiCl2) etwa 8 % Trimere. Die in Abb. 2.3.3 B markierten Banden (*) zeigten jeweils die typi- schen CD-Spektren des trimeren C3.2h, der Energietransfer von Chl b auf Chl a war vollständig gewährleistet (Daten nicht gezeigt). 3.1.2.3 Einfluß verschiedener Detergentien in der Proteinlösung auf die Bindung des „His6 tag“ an Ni2+-IDA-Sepharose Neben der Blockierung des „His6 tag“ durch Kationen wurde die Veränderung der Mi- zellen-Zusammensetzung als mögliche Ursache der Verhinderung der Bindung gehan- delt. Um die Effekte von Detergentien auf die Immobilisierung des trimeren LHCII zu testen, wurde C3.2h wie zuvor rekonstituiert, trimerisiert und mittels UZ in Saccharose- Gradienten aufgereinigt. Isolierte Trimere wurden nach Hobe (1995) mittels KCl und „Bio Beads“-Behandlung gefällt. Die ausgefällten Trimere wurden in einzelnen Ver- suchsansätzen in unterschiedlichen Detergentien rückgelöst und kurz zentrifugiert, um nicht gelöste Komplexe zu sedimentieren. Die Konzentration der gelösten Protein- Pigment-Komplexe wurde nach Butler & Kühlbrandt (1988; Kap. I, 2.7.9) bestimmt. In einem ersten Ansatz wurden Trimere in 1%iger OG-Lösung solubilisiert, um Detergenz-Bedingungen ähnlich denen des Rekonstitutionspuffers zu schaffen. Die gelösten Komplexe wurden auf unterschiedliche Ni2+-beladenene Säulenmaterialien aufgetragen und nach Standard-Bedingungen gewaschen (Abb. 2.3.4). Während IDA- Kapitel II 3 Ergebnisse 117 Sepharose (A, Probe 1) und NTA-Sepharose (A, Probe 3) nach Waschen der Säulen eine leicht grünliche Färbung zeigten, war das Fractogel (A, Probe 2) kaum gefärbt. Abb. 2.3.4: Bindungsverhalten von LHCII-Trimeren (C3.2h) auf unterschiedlichen Säulenmate- rialien nach vorheriger Fällung und Solubilisierung in 1%iger OG-Lösung. Auf jede Säule wur- den ca. 40 µg Trimere aufgetragen, als Säulenmaterialien wurden IDA-Sepharose (1, IDA-S), IDA-Fractogel (2, IDA-F) und NTA-Sepharose (3, NTA-S) getestet. (A) zeigt die Säulenmateria- lien mit immobilisierten Komplexen nach dem Waschen mit TX-Puffer, (B) die aufgefangenen Eluatfraktionen, (C) die mittels UZ aufgereinigten Eluate mit dem prozentualen Anteilen an Tri- meren bezogen auf die aufgetragene Proteinmenge. In der rechten Bildhälfte ist die spektro- skopische Charakterisierung der Komplexe mittels Fluoreszenz-Emission (Anregung des Chl b bei 470 nm, normiert auf max. Emission) und CD-Absorption dargestellt (zur Übersichtlichkeit gestaffelt gezeigt). Die Eluate (B) aller Säulen waren gleichmässig schwach gefärbt (E670< 0,1) und be- standen vornehmlich aus intakten LHCII-Trimeren mit C3.2h-typischem CD- Absorptionsverhalten und unauffälliger Energieübertragung, wie die Auftrennung im Saccharose-Gradienten (C*) und die nachfolgende spektroskopische Untersuchung zeigte (Abb. 2.3.4, rechte Seite). Die berechnete Bindungsausbeute der Trimere lag, ausgehend von 100 % aufgetragenen Trimeren, mit 6-7,5 % bei den einzelnen Materia- lien zwar etwas höher als in den Saccharose-Dichtegradienten-Lösungen (Abb. 2.3.2, Kapitel II 118 3 Ergebnisse Probe 3), war aber nicht ausreichend, um die Herstellung heterogen markierter LHCII- Trimere zu testen. Da die Verwendung unterschiedlicher Säulenmaterialien erneut keine Vorteile brachte, wurden die nachfolgenden Versuche wie zuvor lediglich auf Ni2+-IDA- Sepharose durchgeführt. Wie in Abb. 2.3.5 dargestellt, verbesserte weder das Rücklö- sen ausgefällter Trimere in 1%iger TX-Lösung (Probe 1), noch das Rücklösen in LM- oder TX-haltigem Saccharose-Puffer (Probe 2 und 3) die Bindungsausbeuten der tri- meren Komplexe. Alle drei Säulen zeigten eine sehr schwache grünliche Färbung nach dem Waschen mit OG-Puffer (A), die Extinktion der Eluate bei 670 nm (B) war so ge- ring, dass eine weitere Untersuchung nicht in Betracht gezogen wurde. Abb. 2.3.5: Bindungsverhalten von LHCII- Trimeren (C3.2h) auf Ni2+-IDA-Sepharose nach vorheriger Fällung und Solubilisierung in ver- schiedenen Detergentien bzw. Detergenz- haltigen Puffern. Auf jede Säule wurden ca. 40 µg trimerisierte Komplexe aufgetragen, die in Säule 1 in 1%iger TX-Lösung solubilisiert waren, in Säule 2 in LM-haltigem Saccharosepuffer, in Säule 3 in TX–haltigem Saccharosepuffer. (A) zeigt die Säulenmaterialien mit immobilisierten Komplexen nach dem Waschen mit OG-Puffer, (B) die aufgefangenen Eluatfraktionen. Im dritten und letzten Ansatz dieser Versuchsreihe wurde ein Aliquot der Komplexe als Kontrolle in 1%iger OG-Lösung solubilisiert. Zwei weitere Aliquots wurden in verschie- denen Rekonstitutions-„Mock“-Puffer gelöst. Hiermit sind Puffer gemeint, die identisch sind zur Lösung nach Detergenzwechsel-Rekonstitution. Auch sie besitzen als Deter- genz vornehmlich OG (1 %), jedoch kann angenommen werden, dass zudem ein ge- ringer Restanteil an LDS sowie pflanzliche Lipide aus dem Totalpigmentextrakt vor- handen sind. Zur Herstellung der Puffer wurde eine Detergenzwechsel-Rekonstitution einmal ohne bzw. einmal mit Totalpigmentextrakt durchgeführt, jedoch jeweils ohne Protein. Die Puffer wurden nach KCl-Fällung gründlich zentrifugiert und der Überstand zum Lösen der ausgefällten Trimere verwendet. Während die Solubilisierung der ein- gesetzten 50 µg Trimere in 1%iger OG-Lösung problematisch war und nur 80 % der Trimere gelöst werden konnten, wurde dieses Problem in den Rekonstitutions-„Mock“- Puffern nicht beobachtet. Die gelösten Komplexe wurden nach CD-spektroskopischer Untersuchung sofort auf Ni2+-IDA-Sepharose aufgetragen und nach kurzer Wartezeit gewaschen. Hierbei war es wichtig zügig zu Arbeiten, um die Dissoziation der Trimere durch die hohe OG-Konzentration zu verhindern (Nussberger et al., 1993). Im Gegen- satz zu bisherigen Vorversuchen, zeigten beide Säulen mit Rekonstitutions-„Mock“- Kapitel II 3 Ergebnisse 119 Puffer (Abb. 2.3.6 A, Probe 2 ohne Pigment, Probe 3 mit Pigment) eine deutliche Grün- färbung. Insbesondere die Probe mit Pigment war im oberen Säulenbereich sogar dun- kelgrün gefärbt. Abb. 2.3.6: Bindungsverhalten von LHCII-Trimeren (C3.2h) auf Ni2+-IDA-Sepharose nach vor- heriger Fällung und Solubilisierung in verschiedenen Detergentien bzw. Detergenz-haltigen Puffern. Auf Säule 1 wurden ca. 40 µg Trimere in 1%iger OG-Lösung aufgetragen, auf Säule 2 ca. 50 µg Trimere in einem pigmentfreien Rekonstitutions-„Mock“-Puffer, auf Säule 3 ca. 50 µg Trimere in pigmenthaltigem Rekonstitutions-„Mock“-Puffer. (A) zeigt die Säulenmaterialien mit immobilisierten Komplexen nach dem Waschen, (B) die aufgefangenen Eluatfraktionen, (C) die mittels Saccharose-Gradient aufgereinigten Komplexe mit dem prozentualen Anteilen an eluier- ten Trimeren bezogen auf die aufgetragenen Proteinmenge. In der rechten Bildhälfte ist die spektroskopische Charakterisierung der Komplexe mittels Fluoreszenz-Emission (Anregung des Chl b bei 470 nm, normiert auf max. Emission) und CD-Absorption dargestellt (zur Übersicht- lichkeit gestaffelt gezeigt). Die Referenzprobe mit OG dagegen zeigte wie zuvor (Abb. 2.3.4) lediglich eine schwa- che Grünfärbung. Dieses Ergebnis wurde sowohl in der Elution (B) als auch in der Auf- reinigung mittels UZ (C) bestätigt. Von allen drei Säulen konnten intakte LHCII-Trimere eluiert werden, mit jeweils wildtypischem Energie-Transfer (rechte Bildhälfte oben, Flu- oreszenz-Emission) und C3.2h-typischen CD-Absorptionsspektren des trimeren LHCII. Wie in Abb. 2.3.6 deutlich erkennbar ist, wurden von OG-solubilisierten Trimeren (Pro- Kapitel II 120 3 Ergebnisse be 1) wieder nur etwa 7 % an Ni2+-IDA-Sepharose rückgebunden, während Trimere in pigmentfreier Rekonstitutions-„Mock“-Lösung zu 17 % und in pigmenthaltiger Rekonsti- tutions-„Mock“-Lösung sogar zu 24 % immobilisiert werden konnten. Im letzten Fall bedeutet dies zwar noch immer einen Verlust von 76 % der Trimere, die nicht ein zwei- tes Mal an die Ni-Säule gebunden werden konnten. Die erneute Bindung von 24 % der Trimere stellt allerdings eine deutliche Steigerung zu den bisherigen Ergebnissen dar und sollte als wichtiger Hinweis gewertet werden, um das Problem der geringen Bin- dungsausbeute Hexahistidyl-markierter Trimere lösen zu können. 3.2 Immobilisierung des rekombinanten LHCII mittels N-terminalem „Strep tag“ Aufgrund der bisher unzureichenden Bindungsausbeuten des trimeren LHCII mittels C- terminalem „His6 tag“ an Ni2+-Affinitätssäulen wurde in einem weiteren Versuchsansatz eine andere Strategie der Affinitätschromatographie getestet: das „Strep tag“/Strep- Tactin-System. Die Peptidsequenz des „Strep tag“ wurde im Zuge der Dissertationsar- beit von R. Lauterbach (unveröffentlicht) molekularbiologisch mit dem N-Terminus des Lhcb1 fusioniert, so dass das Peptid die N-proximale Sequenz der Domäne bildet und, nach letzten Erkenntnissen, eine hohe Zugänglichkeit für die Bindestellen des Strep- Tactin besitzen sollte (Müller 2008). Ziel war es, den „Strep tag“ zum einen erneut auf seine Nutzung zur effizienten Trimerisierung des LHCII zu testen und zum anderen auf die Möglichkeit der Bindung des bereits trimerisierten LHCII im Zuge der Herstellung heterogener Trimere. Dies war wie zuvor beschrieben (Kap. II, 3.1) weder mit einem „His6 tag“ noch mit einem „His12 tag“ tragenden LHCII (Plunger, 2007) in ausreichender Menge gelungen. Zu diesem Zweck wurden auf Basis des von R. Lauterbach herge- stellten Lhcb1-Klones D7f.3-S2, in welchem N-terminal die Sequenz des „Strep tag“ (Aminosäuren 1-8) mit der maturen Sequenz des Lhcb1 (D7f.3; Aminosäuren 9-340) fusioniert ist, zwei neue „Strep tag“-Klone konstruiert, die zudem C-terminal noch einen „His6 tag“ tragen. Die Idee, die diesem Ansatz zur Herstellung heterogen markierter Trimere zugrunde liegt, ist die Mischung von spinmarkierten Monomeren, die neben dem C- terminalen „His6 tag“ auch den N-terminalen „Strep tag“ tragen, mit unmarkierten Mo- nomeren, die lediglich den C-terminalen „His6 tag“ besitzen. Anschließend erfolgt die Trimerisierung mittels C-terminalem „His6 tag“ auf Ni2+-IDA-Sepharose (Abb. 2.3.7, linkes Schaubild). Setzt man hier das unmarkierte Protein in einem hohen Überschuss zu spinmarkiertem Protein ein (hier 8:1), so können vier unterschiedliche Arten von Trimeren entstehen: solche ohne Spinmarkierung, die statistisch gesehen 67 % aus- machen, und solche, die ein, zwei oder drei spinmarkierte Monomere enthalten und zusammen 33 % ausmachen. Kapitel II 3 Ergebnisse 121 Abb. 2.3.7: Schematische Darstellung zur Herstellung heterogen markierter LHCII-Trimere nach der „unsauberen Methode“. Unmarkierte LHCII-Monomere mit C-terminalem „His6 tag“ werden im ersten Schritt (linkes Schaubild) in hohem Überschuss mit Monomeren gemischt (hier 8:1), die neben zwei Affinitätsmarkern auch Spinmarker tragen. Dieser Mischansatz wird auf Ni2+-IDA-Sepharose trimerisiert. Das Eluat, bestehend aus vier Populationen von Trimeren, wird im zweiten Schritt auf Strep-Tactin aufgetragen (rechtes Schaubild), um spinmarkierte Tri- mere mit „Strep tag“ vom Überschuss an unmarkierten Trimeren ohne „Strep tag“ (statistisch 67 %) zu trennen. Bei den verbleibenden markierten Trimeren (von nun an 100 %) überwiegt sta- tistisch der Anteil der Trimere mit einem spinmarkierten Monomer (87 %), gegenüber 12,4 % zweifach und 0,6 % dreifach markierter Trimere. Da einfach spinmarkierte Trimere überwiegen, eignet sich das Gemisch zur Herstellung der EPR-DEER Probe. Die Bedeutung einzelner Sym- bole ist im unteren Schaubild dargelegt. Kapitel II 122 3 Ergebnisse Theoretisch könnte man mit solch einer Probe ohne weitere Abtrennung der unmarkier- ten Trimere Spin-Spin-Kopplungen messen, da von spinmarkierten Trimeren statistisch einfach markierte Trimere mit einem Anteil von 87 % deutlich überwiegen sollten. Un- markierte Trimere würden in der DEER-Messung nicht stören, da sie kein EPR-Signal liefern. In solch einem Fall wird es aber schwierig eine Probe mit ausreichend hoher Spinkonzentration herzustellen. Geht man davon aus, dass DEER- Abstandsmessungen mit LHCII-Konzentrationen von 300 µmol/l gute Signale liefern, müsste eine Probe, die zu lediglich 33 % aus spinmarkierten Trimeren besteht (und von denen nur 28,7 % einfach markiert sind), auf eine Konzentration von etwa 2,5 mmol/l LHCII aufkonzentriert werden. Dies ist allerdings kaum möglich. Um die störenden, unmarkierten Trimere aus der Lösung zu entfernen, kommt der N-terminale „Strep tag“ zum Einsatz, welcher nur in spinmarkierten Trimeren vor- handen ist. Wie in Abb. 2.3.7 im rechten Schaubild dargestellt, werden spinmarkierte Trimere mittels „Strep tag“ an Strep-Tactin-Sepharose gebunden, während unmarkierte Trimere im Waschschritt entfernt werden. Statistisch werden daraufhin zu 87 % einfach markierte, zu 12,4 % zweifach markierte und zu 0,6 % dreifach markierte Trimere von der Matrix eluiert. Da hier, wie in früheren Versuchen beabsichtigt (Seimetz, 2004; Dockter, 2005), die einzelnen Populationen von markierten Trimeren nicht voneinander getrennt werden können, EPR-DEER Messungen wegen des geringen Anteils mehr- fach markierter Trimere aber prinzipiell möglich sind, stellt diese Methode einen Kom- promiss dar. Daher wird die Methode im Folgenden auch als „unsauber“ bezeichnet. 3.2.1 Molekularbiologische Konstruktion der Lhcb1-Klone stC79Sh und st106/160h Wie im Methodenteil dieses Kapitels ausführlich beschrieben, wurden die doppelt affini- tätsmarkierten Klone stC79Sh und st106/160h durch Restriktion und Ligation bereits vorhandener Lhcb1-Klone konstruiert. Lyophilisierte Plasmide des Klons D7f.3-S2 wur- den erfolgreich in Bakterienzellen des Stammes E. coli JM101 transformiert und durch Sequenzierung geprüft. Die Restriktion der isolierten Plasmide der Klone D7f.3-S2, C79Sh und S106C/S160Ch mit den Endonukleasen SacI und PstI resultierte wie er- wartet in zwei unterschiedlich langen Fragmenten von ca. 800 und ca. 3400 bp (Daten nicht gezeigt). Die gewünschten Fragmente wurden nach Auftrennung im präparativen Agarose-Gel erfolgreich isoliert, miteinander ligiert und in den Expressionstamm E. coli JM101 transformiert. Aus den Transformanten beider Ansätze wurden aus über 50 Kolonien jeweils zwei ausgewählt und mittels „dirty“-PCR überprüft. Durch Wahl eines „Strep tag“-spezifischen „forward“-Primers und eines „His6 tag“-spezifischen „reverse“- Primers, sollten lediglich doppelt affinitätsmarkierte Klone im analytischen Agarose-Gel eine definierte Bande um die 770 bp zeigen. Bei negativen Klonen, die also nur einen der beiden Affinitätsmarker besitzen, wäre kein definiertes PCR-Produkt zu erwarten. Kapitel II 3 Ergebnisse 123 Abb. 2.3.8: Herstellung von stLhcb1h-Klonen. Agarose-Gel (0,8 %) zur Untersuchung des Ligation-Erfolgs mittels „dirty“-PCR. Auf Bahn 1 bzw. 6 wurden jeweils 5 µl 100 bp bzw. 1 kb DNA-Marker aufgetragen, auf Bahn 2 bzw. 3 je 10 µl PCR-Produkt der „dirty“-PCR der Kolonien stC79Sh und auf Bahn 4 bzw. 5 je 10 µl PCR-Produkt der Kolonien st106/160h. Das Ergebnis der Gel-Elektrophorese ist in Abb. 2.3.8 dargestellt. Sowohl die ge- wählten stC79Sh-Kolonien als auch die gewählten st106/160h-Kolonien zeigen jeweils ein deutliches PCR-Produkt mit der erwarteten Größe von ca. 800 bp und sprechen für eine erfolgreiche Ligation der Restriktionsprodukte zu den gewünschten stLhcb1h-Klonen. Eine im Anschluss durch- geführte Sequenzierung durch die Firma GENterprise (Mainz) bestätigte die erfolgrei- che Konstruktion der doppelt affinitätsmarkierten Klone stC79Sh und st106/160h. 3.2.2 Biochemische Charakterisierung der LHCII-Mutanten stC79Sh und st106/160h: Rekonstitution sowie Trimerisierung mittels C-terminalem „His6 tag“ oder mittels N-terminalem „Strep tag“ Nachdem die Klone stC79Sh und st106/160h erfolgreich durch Restriktion und Ligation aus vorhandenen Lhcb1-Klonen hergestellt werden konnten, sollte im Folgenden die Überexpression, die Rekonstitution sowie das Bindungsverhalten auf Affinitätssäulen überprüft werden. Dazu wurden beide Apoproteine nach Standard-Protokoll in E. coli JM101 in Form von „inclusion bodies“ überexprimiert und aufgereinigt. Die ermittelte Masse der neuen Klone (28 kDa) lag etwas über den Massen des WT (25,5 kDa) und der „His6 tag“ Klone (27 kDa; Daten nicht gezeigt). Die aufgereinigten Apoproteine wurden im Folgenden mittels Detergenzwechsel-Rekonstitution zu Protein-Pigment- Komplexen gefaltet, wahlweise mittels „His6 tag“ oder „Strep tag“ auf Ni2+-IDA- Sepharose bzw. Strep-Tactin immobilisiert, eluiert und via UZ aufgereinigt. Ein Teil der rekonstituierten monomeren Komplexe wurde zunächst ohne Tri- merisierung aufgereinigt, um das Faltungsvermögen der neuen Klone zu prüfen (Abb. 2.3.9, linke Bildhälfte). Kapitel II 124 3 Ergebnisse Abb. 2.3.9: Spektroskopische Charakterisierung der Mutanten stC79Sh und st106/160h im Vergleich zu rekombinantem LHCII mit wildtypischer Sequenz und C-terminalem „His6 tag“ (C3.2h). Alle Mutanten wurden mittels Detergenzwechsel-Rekonstitution gefaltet und via UZ aufgereinigt (linke Bildhälfte). In der rechten Bildhälfte ist die spektroskopische Charakterisie- rung der Komplexe mittels CD-Absorption (oben; gestaffelt gezeigt) und Fluoreszenz-Emission (unten; Anregung des Chl b bei 470 nm, normiert auf max. Emission) dargestellt. Der Vergleich der monomeren Komplexe von stC79Sh und st106/160h mit dem Klon C3.2h (wildtypische Lhcb1-Sequenz, versehen mit C-terminalem „His6 tag“) zeigt weder CD-spektroskopisch noch Fluoreszenz-spektroskopisch signifikante Abweichungen. Wie in Abb. 2.3.9 (rechte Bildhälfte oben) dargestellt, besitzen die neuen Klone im CD- Spektrometer die „fingerprint“-typischen Absorptions-Minima des monomeren LHCII bei 491, 650 und 678 nm. Auch die Energieübertragung von Chl b zu Chl a ist im hohen Maße gewährleistet, ersichtlich an der Fluoreszenz-Emission des Chl a bei 680 nm nach Anregung des Chl b bei 470 nm (Abb. 2.3.9, rechts unten). Lediglich ein geringer Anteil der Anregungsenergie wird durch Chl b bei 655 nm emittiert, was vermutlich im Zusammenhang mit einer unvollständigen Aufreinigung der Proben steht (Saccharose- Dichtegradienten in linker Bildhälfte zeigen Chlorophyll-haltigen Hintergrund). Kapitel II 3 Ergebnisse 125 Trägt man LHCII-Monomere der neuen Mutanten nach Detergenzwechsel- Rekonstitution auf Ni2+-IDA-Sepharose auf, wird ein Teil der Protein-Pigment-Komplexe durch Bindung des „His6 tag“ immobilisiert sowie trimerisiert und kann daraufhin mit einem Imidazol-haltigen Puffer eluiert werden. Die mittels UZ aufgereinigten Trimere (Abb. 2.3.10, linke Bildhälfte) verhalten sich sowohl in der quantitativen Ausbeute an LHCII-Trimeren als auch in der spektroskopischen Charakterisierung (rechte Bildhälfte) identisch zu C3.2h. Abb. 2.3.10: Trimerisierung der Mutanten stC79Sh und st106/160h mittels C-terminalem „His6 tag“ und spektroskopische Charakterisierung im Vergleich zu rekombinantem LHCII mit wildty- pischer Sequenz und C-terminalem „His6 tag“ (C3.2h). Alle Mutanten wurden mittels Deter- genzwechsel-Rekonstitution gefaltet, auf Ni2+-IDA-Sepharose trimerisiert und via UZ aufgerei- nigt (linke Bildhälfte). In der rechten Bildhälfte ist die spektroskopische Charakterisierung der Komplexe mittels CD-Absorption (oben; gestaffelt gezeigt) und Fluoreszenz-Emission (unten; Anregung des Chl b bei 470 nm, normiert auf max. Emission) dargestellt. Vergleicht man die CD-Spektren aufgereingter Trimere beider Klone mit C3.2h- Trimeren, so zeigen alle Proben die Trimer-typischen Minima bei 473, 491, 650 und 678 nm (Abb. 2.3.10, rechts oben). Auch die Energieübertragung zwischen den Chlo- rophyllen funktioniert vollständig (rechts unten). Nach Anregung des Chlorophyll b bei Kapitel II 126 3 Ergebnisse 470 nm werden lediglich Lichtquanten der Wellenlänge um 680 nm durch Chl a emit- tiert. Zwar erscheint die Ausbeute an Trimeren des Klons stC79Sh im Vergleich zu st106/160h in den dargestellten Gradienten etwas geringer, durchschnittlich erreichten beide Mutanten aber ähnlich hohe Trimerisierungsausbeuten wie C3.2h (ca. 25 % des in der Rekonstitution eingesetzten Apoproteins; siehe Kap. II, 3.1). Im Gegensatz zu allen zuvor konstruierten LHCII-Klonen der Arbeitsgruppe können doppelt affinitätsmarkierte Klone nicht nur mittels C-terminalem „His6 tag“, son- dern auch mittels N-terminalem „Strep tag“ immobilisiert und trimerisiert werden. Trägt man LHCII-Monomere nach Detergenzwechsel-Rekonstitution auf eine Strep-Tactin- Säule auf, werden die Komplexe auch hier zu einem hohen Anteil gebunden und zu Trimeren oligomerisiert. Nach Elution und Aufreinigung zeigen die trimeren Komplexe spektroskopisch wiederum keinerlei signifikanten Unterschiede zu C3.2h (Abb. 2.3.11). Abb. 2.3.11: Trimerisierung der Mutanten stC79Sh und st106/160h mittels N-terminalem „Strep tag“ und spektroskopische Charakterisierung im Vergleich zu rekombinantem LHCII mit wildty- pischer Sequenz und C-terminalem „His6 tag“ (C3.2h). Alle Mutanten wurden mittels Deter- genzwechsel-Rekonstitution gefaltet. Beide stLhcb1h-Klone wurden an Strep-Tactin trimerisiert und via UZ aufgereinigt (linke Bildhälfte). In der rechten Bildhälfte ist die spektroskopische Cha- rakterisierung der Komplexe mittels CD-Absorption (oben; gestaffelt gezeigt) und Fluoreszenz- Emission (unten; Anregung des Chl b bei 470 nm, normiert auf max. Emission) dargestellt. Kapitel II 3 Ergebnisse 127 Sowohl die CD-Absorptions- als auch die Fluoreszenz-Emissionsspektren sind iden- tisch zu den zuvor gemessenen Spektren „His6 tag“-trimerisierter Komplexe (Abb. 2.3.10). Lediglich die Ausbeute an trimerisiertem Protein scheint im Vergleich zur Oli- gomerisierung mittels „His6 tag“ etwas geringer zu sein. Im hier dargestellten Beispiel war dies aufgrund der unsauberen Trennung im Saccharose-Dichtegradienten schwer zu quantifizieren. Interessanterweise beinhaltet die grüne „Schmier“ oberhalb der ab- gezogenen Trimerbande (*) ebenfalls größtenteils trimeren LHCII und nicht wie erwar- tet monomere Komplexe (CD-Daten nicht gezeigt), weshalb davon ausgegangen wer- den kann, dass die Trimerisierungsausbeute an Strep-Tactin in einer ähnlichen Grö- ßenordnung liegt wie an Ni-Säulen. 3.2.3 Immobilisierung des trimeren LHCII mittels „Strep tag“/Strep-Tactin- System Nachdem doppelt affinitätsmarkierte Klone, wie zuvor beschrieben, nach Deter- genzwechsel-Rekonstitution sowohl über das „His6 tag“/Ni2+-IDA-Sepharose-System als auch über das „Strep tag“/Strep-Tactin-System erfolgreich immobilisiert und trimeri- siert werden können, sollte in dieser Versuchsreihe das Bindungsverhalten unaufgerei- nigter und aufgereinigter Trimere an Strep-Tactin untersucht werden. Die vorherige Trimerisierung erfolgte nach Standard-Methode mittels „His 2+6 tag“/Ni -IDA Sepharose- System. Wie in Abb. 2.3.12 A dargestellt, wurde in einem ersten Versuchsansatz der LHCII-Klon stC79Sh mittels „His6 tag“ auf der Ni-Säule trimerisiert und mit max. 250 mM Imidazol eluiert, da höhere Imidazol-Konzentrationen die Bindungseffizienz des „Strep tag“ an Strep-Tactin herabsetzen können. Ein Aliquot des Ni-Säulen-Eluats wur- de mittels UZ aufgereinigt. Wie im Saccharose-Gradienten A1 ersichtlich ist, resultierte die Trimerisierung in einer hohen Ausbeute an Trimeren (A1*), welche unaufällige CD- Absorptions- und Fluoreszenz-Emissionsspektren zeigten (rechte Bildhälfte, Vergleich mit trimerem C3.2h). Ein zweites Aliquot des Ni-Säulen-Eluats mit gleicher Protein- menge wurde ohne Aufreinigung auf Strep-Tactin aufgetragen. Wie anhand der Gra- dienten A2 und A3 zu sehen ist, wurden aufgetragenen Komplexe annähernd vollstän- dig an Strep-Tactin gebunden. Keiner der beiden Waschschritte der Strep-Tactin-Säule mit TX-Puffer enthält größere Mengen an LHCII (A2, A3). Das Eluat der Strep-Tactin- Säule dagegen besteht ebenfalls vorwiegend aus trimeren Lichtsammel-Komplexen (A4*), welche unauffällige CD-Absorptions- und Fluoreszenz-Emissions-Spektren zei- gen. Kapitel II 128 3 Ergebnisse Abb. 2.3.12: Immobilisierung von trimerem LHCII an Strep-Tactin am Beispiel der doppelt affini- tätsmarkierten Mutante stC79Sh nach Detergenzwechsel-Rekonstitution. In (A) wurde stC79Sh mittels „His6 tag“ trimerisiert und ein Aliquot mittels Ultrazentifugation aufgereinigt (A1). Ein zweites Aliquot des Ni-Säulen-Eluats wurde ohne Aufreinigung an Strep-Tactin immobilisiert: A2 zeigt den ersten Waschschritt mit TX-Puffer, A3 den zweiten Waschschritt mit TX-Puffer und A4 das Eluat der Strep-Tactin-Säule. In (B) wurde stC79Sh mittels „His6 tag“ trimerisiert und via UZ aufgreinigt (B1). Die im Gradienten markierten Trimere (B1*) wurden abgezogen und in Dichte- gradienten-Lösung an Strep-Tactin immobilisiert (Waschschritte hier nicht gezeigt): das Eluat der Strep-Tactin-Säule wurde ebenfalls via UZ aufgereinigt (B2). In der rechten Bildhälfte sind die CD-Absorptionsspektren (oben; zur Übersichtlichkeit gestaffelt) und Fluoreszenz-Emissions- Spektren (unten; Anregung bei 470 nm, normiert auf max. Emission) der markierten (*) Banden aus Saccharose-Dichtegradienten dargestellt und mit Trimeren der „His6 tag“-Mutante C3.2h verglichen. In einem zweiten Versuchsansatz (B) wurden die Komplexe ebenfalls mittels Ni- Säule trimerisiert und via UZ aufgereinigt [B1(*), ebenfalls mit unauffälligen CD- und Fluoreszenz-Spektren]. Die funktionalen stC79Sh-Trimere wurden aus dem Gradienten isoliert und in Dichtegradienten-Lösung (0,6 mol/l Saccharose; 0,1 % LM; 5 mM Tricine pH 7,8) an Strep-Tactin immobilisiert. Auch hier wurden die Komplexe vollständig an die Säulenmatrix gebunden, die folgenden Waschschritte mit TX-Puffer blieben farblos und wurden daher nicht aufgereinigt. Die Elution der trimeren Komplexe erfolgte voll- Kapitel II 3 Ergebnisse 129 ständig durch die Zugabe von Desthiobiotin, das spektroskopische Verhalten war un- auffällig (B2*). Die geringere Menge an trimerem LHCII in Gradient B2 im Vergleich zu Probe A4 liegt in der geringeren Protein-Auftragsmenge begründet (auf A4 wurde ca. die doppelte Menge an Protein aufgetragen). Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass es möglich ist, trimeren LHCII mittels N-terminalen „Strep tag“ vollständig an Strep-Tactin zu immobilisieren. Hierbei scheint es keine Rolle zu spielen, ob die trimeren Komplexe vor der Bindung an Strep-Tactin im Saccharose-Gradienten aufgereinigt wurden oder nicht. Da letzterer Ansatz einen zeitaufwendigen Zentrifugationschritt von 16 h erspart, wurde dieses Pro- tokoll zur Herstellung heterogener Trimere des LHCII vorgezogen. 3.2.4 Herstellung heterogen markierter LHCII-Trimere: Oligomerisierung auf der Ni-Säule sowie Aufreinigung mittels „Strep tag“/Strep-Tactin-System Im vorangegangen Kapitel konnte gezeigt werden, dass trimerer LHCII via „Strep tag“ vollständig an Strep-Tactin immobilisiert werden kann. Damit ist eine Grundvorausset- zung erfüllt, auf welcher das in Abb. 2.3.7 dargestellte Prinzip zur Trennung spinmar- kierter Trimere von unmarkierten beruht. Um die Herstellung heterogen markierter Tri- mere nachweisen zu können, wurde in einem Vorversuch auf den Einsatz von Spin- markern verzichtet. Stattdessen wurde die Mutante st106/160h, welche sowohl in der lumenalen Schleife (Position 106) als auch in der stromalen Schleife (Position 160) ein Cys besitzt, mit dem Fluoreszenz-Akzeptorfarbstoff Dy731 kovalent markiert. Sowohl das Fluoreszenz-markierte Apoprotein mit doppeltem Affinitätsmarker, als auch die unmarkierte Mutante C3.2h mit C-terminalem „His6 tag“ wurden mittels Deter- genzwechsel-Rekonstitution gefaltet und in drei unterschiedlichen Ansätzen auf Ni2+- IDA-Sepharose trimerisiert. Im ersten Ansatz wurde das unmarkierte Protein mit dem markierten Protein im Verhältnis 5:1 vor Trimerisierung gemischt, im Ansatz 2 wurde als „Strep tag“-negative Kontrolle lediglich Protein der Mutante C3.2h trimerisiert, als „Strep tag“-positive Kontrolle in Ansatz 3 lediglich Fluoreszenz-markiertes Protein der Mutante st106/160h. Kapitel II 130 3 Ergebnisse Abb. 2.3.13: Herstellung und Aufreinigung heterogener LHCII-Trimere. In (A) sind die Strep- Tactin-Säulen nach Trimerbeladung und nach Waschen mit TX-Puffer dargestellt. (B) zeigt ausgewählte Fraktionen der Strep-Tactin-Säule nach UZ sowie CD-Absorptions- und Fluores- zenz-Emissionsspektren einzelner Banden. (C) zeigt ausgewählte Fraktionen der Strep-Tactin- Säule nach Auftrennung mittels SDS-PAGE (oben, Coomassie-Blau Färbung; unten, Fluores- zenz-Emission des Dy731-markierten Proteins). In Ansatz 1 wurden Rekonstitutionen von C3.2h und von Fluoreszenz-markiertem st106/160h (st106/160h-M) im Verhältnis 5:1 gemischt und auf Ni2+-IDA-Sepharose trimerisiert. Das Gemisch aus Trimeren wurde umgehend auf eine Strep-Tactin-Säule aufgetragen und mit TX-Puffer gewaschen (A, 1). Der Durchfluss wurde in B (1DF) und C (1DF1, 1DF2) charakterisiert, das Eluat in B (1E) sowie C (1E). Als Ansatz 2 wur- den C3.2h-Trimere auf Strep-Tactin aufgetragen und gewaschen (A, 2), der Durchfluss in B (2DF) sowie C (2DF1, 2DF2) charakterisiert. In Ansatz 3 wurden Fluoreszenz-markierte Trimere der Mutante st106/160h ebenfalls an Strep-Tactin gebunden und gewaschen (A3) und der Durchfluss (B, 3DF bzw. C, 3DF1 und C, 3DF2), sowie das Eluat (B, 3E sowie C, 3E) charakte- risiert. In der rechten Bildhälfte ist die spektroskopische Charakterisierung der Komplexe mittels CD-Absorption (zur Übersichtlichkeit gestaffelt gezeigt) und Fluoreszenz-Emission (Anregung des Chl b bei 470 nm, normiert auf max. Emission) dargestellt. Nach Auftragen der Negativ-Kontrolle aus C3.2h-Trimeren (Abb. 2.3.13, A2) auf Strep- Tactin zeigte sich, dass ohne vorhandenen „Strep tag“ keine Interaktion zwischen dem LHCII und dem Strep-Tactin stattfindet. Die C3.2h-Trimere werden nicht auf der Säule immobilisiert und können infolgedessen durch den Waschschritt mit TX-Puffer vollstän- Kapitel II 3 Ergebnisse 131 dig entfernt werden, wie deutlich an der schwach grün-gefärbten Säule (A2) zu sehen ist. Die Gesamtheit der intakten Trimere befindet sich demnach im Durchfluss, was sowohl durch Ultrazentrifugation (B, 2DF*) und spektroskopische Charakterisierung, als auch in der SDS-PAGE (C, 3DF1 und 3DF2) gezeigt werden konnte. Eine Elution von Komplexen war nach den Waschschritten nicht mehr möglich. Ansatz 3 hingegen, die Positiv-Kontrolle, bestehend aus homogen Fluoreszenz- markierten Trimeren der Mutante st106/160h, wurde nahezu vollständig an Strep- Tactin gebunden und färbte die weiße Matrix tief grün (A3). Nur ein geringer Anteil des Proteins wurde durch Waschschritte entfernt (C, Banden 3DF1 und 3DF2). Die aus dem Saccharose-Dichtegradienten isolierte, diffuse Komplex-Bande (B, 3DF) zeigte weder einen ausreichenden Energietransfer von Chl b zu Chl a (rechte untere Bildhälf- te, dunkel-blaues Fluoreszenz-Spektrum mit ausgeprägter Chl b-Schulter bei 655 nm), noch das typische CD-Signal des LHCII (rechts oben, dunkel-blaue Linie, 3DF*st106/160h-M). Die gebundenen Komplexe der Positiv-Kontrolle (A3) hingegen konnten durch Zugabe des Desthiobiotin eluiert und mittels Dichtegradient (B, 3E*) separiert werden. Die isolierten Trimere zeigten die schon früher beobachteten Ände- rungen der CD- und Fluoreszenz-Spektren der Mutante 106/160 nach Markierung mit dem Fluoreszenz-Marker Dy731 (Christian, 2008). Diese besteht zum einen in einer negativeren CD-Absorption im Bereich der Soret-Region bei 473 nm (rechts oben, hell- blaue Linie 3E*st106/160h-M), sowie in einem deutlichen Energie-Transfer der Chloro- phylle auf den Akzeptor-Farbstoff. Dies hat zur Folge, dass die Fluoreszenz-Emission des Chl a bei 680 nm abnimmt (dadurch wird auch ein geringer Anteil an Chl b Fluo- reszenz sichtbar, der ansonsten durch die deutlich intensivere Fluoreszenz des Chl a verdeckt wird), gleichzeitig kommt es zur Emission des DY731 bei 758 nm. In der SDS-Page (C) ist zudem ersichtlich, dass C3.2h eine Masse von 27 kDa (C, 2DF1), Dy731-markierter st106/160h (C, 3E) dagegen eine Masse von 29 kDa be- sitzt. Außerdem kann hier durch selektive Anregung des Farbstoffes das markierte Protein vom unmarkierten Protein unterschieden werden [C3.2h (2DF1) fluoresziert nicht, während st106/160h (3E) fluoresziert]. Auch in Versuchsansatz 1, welcher die Mischtrimere aus unmarkiertem und markiertem Protein enthält, bindet zumindest ein Teil der Komplexe an Strep-Tactin und färbt die Säule deutlich grün (A1). Sowohl im Dichtegradienten (B, 1DF) als auch im Gel (C, 1DF1 und 1DF2) wird deutlich, dass ein Großteil des trimeren Proteins nicht an die Säule bindet und mit dem Waschpuffer von der Säule entfernt wird. Diese Frak- tionen zeigen einerseits das typische Trimer-Signal des C3.2h in der CD-Absorption (1DF*, schwarze Linie; Minimum bei 473 nm ist weniger negativ als bei 491 nm), zum anderen wird in der SDS-PAGE deutlich, dass sich die Trimere zum Großteil aus un- markiertem Protein zusammensetzen. Über der sehr deutlichen Bande des C3.2h bei 27 kD ist lediglich eine schwache Bande des doppelt affinitätsmarkierten Proteins zu sehen, welche lediglich eine schwache Dy731-Emission zeigt. Das entsprechende Kapitel II 132 3 Ergebnisse Säulen-Eluat dieses Ansatzes besteht größtenteils aus LHCII-Trimeren (B, 1E*). Diese Trimere zeigen neben dem Energietransfer von Chl b zu a noch den Ansatz eines Energietransfers zu dem Akzeptor-Dye. Dies ist erkennbar in dem untypischen, aber nur schwach sichtbaren Anstieg der Fluoreszenz ab 720 nm (graue Linie), was auf das Vorhandensein von Fluoreszenz-markiertem Protein hindeutet. Dieses Ergebnis wird auch in der CD-Absorption bestätigt. Zur Verdeutlichung wurde die Soret-Region aus- gewählter CD-Spektren der Abb. 2.3.13 vergrößert in Abb. 2.3.14 dargestellt. Abb. 2.3.14: Ausschnitt der CD- Absorptionsspektren im Bereich der Soret- Absorption der in Abb. 2.3.13 B dargestellten Trimer-Proben 1E* (Eluat der Mischprobe C3.2h/st106/160h-M, grau), 2DF* (Trimere des C3.2h, rot) und 3E* (Eluat der homogen markier- ten Trimere st106/160h-M, blau). Zusätzlich wurden rechnerisch durch Addition der Spektren 2DF* und 3E* das hypothetische Vergleichspekt- rum eines Gemischs von C3.2h-Trimeren und st106/160h-M-Trimeren (C3.2h+st106/160h-M, grün) erstellt. Wie hier deutlich zu sehen ist, zeigen die Mischtrimere des Eluats von Ansatz 1 (1E*, grau) weder das typische CD-Spektrum der Trimere des C3.2h (2DF*, rot), noch das der homogen Fluoreszenz-markierten Trimere (3E*, blau). Ähnlich wie zuvor für die homogen Fluoreszenz-markierten Trimere gese- hen (blau), zeigt das Eluat der Mischtrimere (grau) eine Verstärkung des Minimums bei 473 nm gegenüber C3.2h. Interessanterweise ähnelt das Spektrum der Mischtrimere vielmehr einem errechneten (und daher hypothetischen) Additions-Spektrum (C3.2h+st106/160h-M, grün) der unmarkierten Trimere (rot) mit den homogen markier- ten Trimeren (blau). Auch in diesem Fall sind die Minima bei 473 und 491 nm identisch. Dass es sich bei dem Eluat des Mischansatzes (1E*, grau) wirklich um hetero- gen markierte Trimere des LHCII handelt, wird durch die SDS-PAGE bestätigt (Abb. 2.3.13, C, 1E). Hier ist deutlich eine Doppelbande bei 27 und 29 kDa erkennbar. Nach densitometrischer Auswertung des Coomassie-gefärbten Gels ist die obere Bande et- was intensiver. Zudem zeigt sie die Emission des Akzeptorfarbstoffs und kann somit als Bande des Fluoreszenz-markierten st106/160h identifiziert werden. Die gemesse- nen Proteinverhältnisse decken sich gut mit der statistischen Erwartung. Bei einer Mi- schung von 1:5 (markiertes zu unmarkiertes Protein), sollten 51,2 % der Trimere C3.2h-homogen sein, 38 % einfach markiert, 10 % zweifach und 0,8 % dreifach mar- kiert sein. Nach Abtrennung der homogen unmarkierten Trimere verbleiben lediglich heterogen und homogen Fluoreszenz-markierte Trimere. Bei diesen sollte rechnerisch das Verhältnis von markierten zu unmarkierten Monomeren 2:1,4 sein, was sich nähe- Kapitel II 3 Ergebnisse 133 rungsweise mit dem Verhältnis der Bandenintensitäten deckt (Abb. 2.3.14, C, 1E). Da der Ansatz mit C3.2h-Trimeren keinerlei Bindung an Strep-Tactin zeigte, muss es sich bei den eluierten Trimeren des Mischansatzes (A1) um heterogene Trimere handeln und nicht um eine Mischung homogen markierter und homogen unmarkierter Trimere, was im folgenden Abschnitt weiter experimentell belegt werden soll. 3.2.5 Herstellung heterogen spinmarkierter LHCII-Trimere zur Durchführung von DEER-Abstandsmessungen Nach den Ergebnissen der Vorversuche erschien es möglich mit der „unsauberen“ Me- thode (Abb. 2.3.7) heterogen markierte Trimere des LHCII produzieren zu können. Ob es sich bei den isolierten Trimeren solcher Misch-Trimerisierungen, wirklich um hetero- gene Trimere oder um eine 1:1 Mischung homogen markierter und homogen unmar- kierter Trimere handelt, konnte nur indirekt bewiesen werden, da unmarkierte Trimere ohne „Strep tag“ nicht an Strep-Tactin binden können. Einen direkten Nachweis bietet die Abstandsmessung mittels DEER-EPR. Sollten solche Proben wider Erwarten zur Hälfte aus homogen markierten Trimeren bestehen, so wäre in EPR-DEER Messungen der spinmarkierten Mutante 106/160 neben dem Monomer-Abstand von 3,9 nm noch eine Vielzahl anderer Abstände zwischen 4 und 7 nm zu detektieren (Abb. 2.1.1). Dies würde in einer breiten Abstandsverteilung resultieren. Um die bisherigen Ergebnisse mittels EPR-Spektroskopie zu verifizieren, wurde daher in diesem Versuchansatz eine spinmarkierte LHCII-Probe nach der „unsaube- ren“ Methode (Abb. 2.3.7) im großen Maßstab hergestellt. Im Gegensatz zu den Vor- versuchen wurde hier das Apoprotein von st106/160h kovalent mit dem Spinmarker PROXYL markiert. Nach Detergenzwechsel-Rekonstitution wurde das spinmarkierte Protein im Verhältnis 1:8 mit rekonstituiertem C3.2h gemischt, auf der Ni-Säule trimeri- siert und im Anschluss an Strep-Tactin gebunden. Die Säule wurde mit TX-Puffer ge- waschen bis der Durchfluß farblos war. Das gebundene Protein wurde mit Desthiobio- tin von der dunkelgrün gefärbten Säule eluiert und mittels UZ aufgereinigt (Abb. 2.3.15 A). Kapitel II 134 3 Ergebnisse Abb. 2.3.15: Aufreinigung und Charakterisierung heterogener LHCII-Trimere aus st106/160h- PROXYL und C3.2h (gemischt im Verhältnis 1:8) zur Durchführung von EPR-DEER- Messungen. Die Herstellung der Probe erfolgte nach dem Prinzip der „unsauberen“ Methode (Abb. 2.3.7). Die linke Bildhälfte zeigt das Ergebnis der Probenaufreinigung nach UZ. Die Ban- den mit LHCII-typischem Sedimentationsverhalten (*1 und *2) wurden isoliert und sowohl CD- als auch Fluoreszenz-spektroskopisch untersucht. CD-Spektren (rechts oben) sind zur Über- sichtlichkeit gestaffelt dargestellt, Fluoreszenz-Spektren (rechts unten; Anregung bei 470 nm) wurden auf die max. Emission normiert. Die schwach ausgebildete obere Bande im Gradienten (A*1) bestand aus funktionalen LHCII-Monomeren, die stark ausgebildete untere Bande (A*2) aus funktionalen Trime- ren. Sowohl Monomere als auch Trimere zeigten unauffällige CD-Absorptionsspektren des rekombinanten LHCII sowie einen vollständigen Energietransfer von Chl b auf Chl a. Die Trimerbanden aus mehreren Gradienten-Röhrchen wurden isoliert, vereinigt und EPR-DEER vermessen. Kapitel II 3 Ergebnisse 135 Abb. 2.3.16: EPR-DEER Abstandsmessung von heterogenen Trimeren (schwarze Linien) be- stehend aus der PROXYL-markierten Mutante st106/160h und unmarkiertem C3.2h. (A) zeigt die Hintergrund-korrigierten Original-Daten, (B) die durch Tikhonov-Regularisierung errechne- ten Spin-Spin-Abstände, dargestellt als Abstandsverteilung. Zum Vergleich sind zusätzlich die Hintergrund-korrigierten Original-Daten sowie die Abstandsverteilung der monomeren Mutante S106C/S160Ch (rote Linien) gezeigt (identische Daten zu Abb. 1.3.10). Für beide Proben wur- den die gleichen Prozessierungsparameter verwendet: Zeitnullpunkt 130 ns, Start der Hinter- grundkorrektur bei 640 ns, Regulierungsparameter α=10. Wie in Abb. 2.3.16 (A) erkennbar ist, resultierte die DEER-Messung der heterogenen Trimere (schwarz) im Vergleich zu hochkonzentrierten Monomeren der Mutante S106C/S160Ch (rot) in einem EPR-Spektrum mit weniger gutem Signal-Rausch- Verhältnis, welches aber ausreichend interpretierbar war. Die Tikhonov-regularisierte Abstandsverteilung der heterogenen Trimere zeigt ein recht definiertes, dominantes Hauptmaximum bei 4,15 nm, die Monomere stattdessen den bereits beschriebenen (Abb. 1.3.10) etwas breiteren Doppelpeak bei 4 und 5 nm. Zudem war in heterogenen Trimeren noch ein zweites definiertes Maximum bei 2,9 nm, sowie ein breites Neben- maximum mit langen Abständen (5,5 bis 7 nm) detektierbar. Aufgrund des drastischen Unterschieds der Signal-Rausch-Verhältnisse beider Proben ist eine Interpretation die- ser Nebenmaxima rein spekulativ (mündliche Mitteilung, Prof. Dr. G. Jeschke, ETH, Zürich), was später diskutiert werden soll. Kapitel II 136 4 Diskussion 4 Diskussion 4.1 Versuch der Herstellung heterogener LHCII-Trimere durch wieder- holte Immobilisierung mittels „His6 tag“ Ziel dieser Versuchsreihe war es, eine Methode zur Herstellung heterogen spinmar- kierter LHCII-Proben zu entwickeln. Früheren Versuchsansätzen folgend (Seimetz, 2004; Dockter, 2005) wurde das Bindeverhalten des LHCII mittels „His6 tag“ an Ni2+- Affinitätssäulen erneut getestet. Diesen Ansätzen lag die Idee zugrunde, ein Trimer- gemisch, bestehend aus Populationen von einfach, zweifach und dreifach affinitäts- markierten Trimeren, durch Immobilisierung an der Ni-Affinitätssäule aufzutrennen. Durch die unterschiedlich starke Interaktion der einfach, zweifach und dreifach Hexa- histidyl-markierten Trimere, sollten diese theoretisch bei unterschiedlichen Imidazol- konzentrationen eluieren. Grundlegende Voraussetzung zur Anwendung dieses Prinzips ist die reprodu- zierbare Bindung des trimeren LHCII an die Ni-Säule. Diese Voraussetzung war bisher nicht gegeben (Seimetz, 2004; Dockter, 2005; Plunger, 2007) und sollte daher erneut untersucht werden. Für das ungefaltete Apoprotein (Rogl et al., 1998) oder monomeren LHCII direkt nach Detergenzwechsel-Rekonstitution ist die Immobilisierung mittels C- terminalem „His6 tag“ an Ni-Affinitätssäulen problemlos möglich. Wie entsprechende Vorversuche zeigten, können je nach Säulenmaterial bis zu 25 % des in der Rekonsti- tution eingesetzten Proteins oligomerisiert werden (Abb. 2.3.1). Aus früheren Versu- chen ist bekannt, dass rekombinanter LHCII in der Detergenzwechsel-Rekonstituiton zu einem hohen Prozentsatz zu funktionalen Protein-Pigmentkomplexen faltet (Paulsen et al., 1993). Bei einer Trimerisierungsausbeute von 25 % kann dies einerseits bedeu- ten, dass ein Teil der Protein-Pigment-Komplexe keine Möglichkeit hat an die Affini- tätssäulen komplex zu binden, obwohl die eingesetzten Proteinmengen (1 mg LHCII pro 1 ml Sepharose) weit unterhalb der Bindekapazität des Trägermaterials liegen. Andererseits ist bekannt, dass monomerer LHCII durch „Waschen“ mit hochkonzent- rierten Detergenzlösungen instabil wird und zerfällt (Nussberger et al., 1993). Demzu- folge kann nicht ausgeschlossen werden, dass ein Teil der rekonstituierten Komplexe, gebunden an die Ni-Säule, durch das Waschen mit 1%igem OG-Puffer und durch den nachfolgenden Wechsel des Detergenz (0,05 % TX) zerstört wird und somit die Trime- risierungsausbeute gesenkt wird. Deutlich geringere Bindungsausbeuten als „frisch“ rekonstituierter LHCII zeigen Protein-Pigment-Komplexe, die mittels Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation aufgereinigt wurden. Hierbei scheint es gleichgültig zu sein, ob das Protein als Mono- mer oder als Trimer vorliegt (Abb. 2.3.2). Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass das Kapitel II 4 Diskussion 137 Problem der erneuten Immobilisierung mittels Hexahistidyl-Rest nicht mit dem oligome- ren Zustand der Komplexe zusammenhängt. Eine frühere Vermutung war, dass in der Trimerisierung der C-Terminus des rekombinanten LHCII mit angehängtem Affinitäts- marker beispielsweise zwischen den Monomeren im Trimer zu liegen kommt und daher nicht, wie in der Kristallstruktur gezeigt (Standfuss et al., 2005), ins Lösungsmittel ge- richtet ist. Die verminderte Zugänglichkeit des C-terminalen Affinitätsmarkers im trime- ren Komplex würde hier die verschlechterte Bindungsfähigkeit erklären. In solch einem Fall sollten aber zum einen aufgereinigte Monomere genauso gut an der Affinitätssäule immobilisiert werden können wie „frisch“ rekonstituierte Monomere, nur trimerisierte Komplexe würden ihre Fähigkeit zur Bindung verlieren. Zum anderen wäre unter sol- chen Umständen zu erwarten gewesen, dass die Verwendung des IDA-Fractogels im direkten Vergleich zu IDA- oder NTA-Spharose Vorteile in der Bindung des LHCII zeigt, da nach Herstellerangaben durch die langen „Tentakel“ des Säulenmaterials auch ein wenig zugänglicher „His6 tag“ komplex gebunden werden kann. Die Vermutung, dass eine Verunreinigung der LHCII-Lösung mit zweiwertigen Kationen wie Ni2+ oder Cd2+ die Bindungsfähigkeit des Hexahistidyl-Restes an die Affi- nitätssäulen beeinträchtigen kann, wurde zunächst bestätigt. Hintergrund war hier die Annahme, dass solche Kationen entweder aus der ersten Affinitätschromatographie verschleppt werden oder verwendete Puffer durch die Verwendung unreiner Chemika- lien „verschmutzt“ sind. Ein diesbezüglich durchgeführter Versuch mit „frisch“ rekonsti- tuiertem LHCII, versetzt mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ni-Kationen, zeigte eine deutliche Abnahme der Bindungsausbeute mit steigender Ni2+-Konzentration (Abb. 2.3.3). Vergleicht man aber die Bindungsausbeuten des LHCII in Ni2+-versetzten Lösungen mit denen der aufgereinigten Komplexe nach Ultrazentrifugation, müssten in der eingesetzten Saccharose-Dichtegradienten-Lösung mehr als 30 Ni-Kationen pro His zur Verfügung stehen (entspricht 2 mmol/l NiCl2). Eine solch starke Verunreinigung der Lösungen kann sicher ausgeschlossen werden. Frühere Versuche durch Seimetz (2004) zeigten zudem, dass auch eine Behandlung der aufgereinigten LHCII-Proben mit dem Komplexbildener EDTA, welcher in direkter Konkurrenz zum Hexahistidyl-Rest um gebundenes Ni2+ steht, die erneute Immobilisierung nicht ermöglicht. Aus diesen Versuchsansätzen kann gefolgert werden, dass die Belegung des Affinitätsmarkers mit zweiwertigen Kationen nicht als Hauptgrund für die starke Verhinderung der Bindung des aufgereinigten LHCII an die Ni-Säule in Frage kommt. Als weiterer Erklärungsansatz für das schlechte Bindungsverhalten des aufge- reinigten LHCII wurde von Seimetz (2004) die Zusammensetzung der Detergenzmizel- le bzw. der verwendeten Detergenz-haltigen Lösungen diskutiert. Analog zum schlech- ten Bindungsverhalten in Saccharose-Dichtegradienten-Lösung (Abb. 2.3.2), führte bei Seimetz (2004) die Verdünnung rekonstituierter Monomere mit LM-haltiger Saccharo- selösung abhängig von der Inkubationsdauer ebenfalls zu einer Verschlechterung der Bindung mittels Hexahistidyl-Rest. Dass diese Verschlechterung der Bindung in direk- Kapitel II 138 4 Diskussion tem Zusammenhang zur Zusammensetzung der Detergenzmizelle steht, konnte hier in einem Versuchsansatz mit ausgefällten Trimeren, welche in verschiedenen Detergen- tien oder Detergenz-Mischlösungen rückgelöst wurden, eindeutig bestätigt werden (Abb. 2.3.4, 2.3.5 und 2.3.6). Um möglichst definierte Mizellenzusammensetzungen zu testen, wurde trimerisiertem LHCII durch „Bio Beads“-Behandlung das Detergenz zu- nächst komplett entzogen. Bei entsprechender Salzzugabe bildet LHCII stabile Aggre- gate ohne dabei zu Monomeren zu zerfallen. Dass durch die Behandlung mit „Bio Beads“ native Lipide, wie das für die Trimerisierung essentielle PG, entfernt werden, kann ausgeschlossen werden (Rigaud et al., 1998; Yang et al., 2008). In Detergenzlö- sungen rückgelöste Komplexe wurden sicherhaltshalber kurz zentrifugiert, um ungelös- te Proteinaggregate zu entfernen, und wurden zudem vor Wiederbindung an die Affini- tätssäule spektroskopisch charakterisiert. Während trimere Komplexe, solubilisiert in LM, TX oder in verschiedenen Detergenz-haltigen Saccharoselösungen, praktisch nicht rückgebunden wurden, wurden OG-solubilisierte Trimere immerhin zu 6 % an ver- schiedenen Ni-Affinitätssäulen immobilisiert. Wie zuvor bereits erwähnt, neigen LHCII- Trimere, solubilisiert in höheren Konzentrationen des Detergenz OG, bei längerer In- kubation dazu zu Monomeren zu zerfallen (Nussberger et al., 1993). Dies kann in die- sem Fall als Grund für die leicht bessere Bindungseffizienz aber ausgeschlossen wer- den. Zum einen erfolgte die Beschickung der Affinitätssäule mit Protein sofort nach der Solubilisierung auf Eis, zum anderen wurde ein Aliquot des solubilisierten Proteins mit- tels CD-Absorption positiv auf trimeren LHCII getestet. Eine signifikante Verbesserung der Wiederbindung an die Affinitätssäule (17 % bis 25 % des eingesetzten Proteins) zeigten Trimere, die in einem Rekonstitutions- „Mock“-Puffer rückgelöst wurden. Insbesondere ein „Mock“-Puffer versetzt mit einem Totalpigmentextrakt zeichnete sich durch gute Bindungsausbeuten der trimeren Kom- plexe aus. Vergleicht man diesen „Mock“-Puffer mit allen zuvor getesteten Detergenz- haltigen Lösungen, fallen vor allem drei Unterschiede auf, die im Folgenden einzeln diskutiert werden sollen: der pH-Wert der Lösungen, das Vorhandensein von nativen Lipiden im eingesetzten Totalpigmentextrakt sowie das Vorhandensein eines Restes an Dodecylsulfat aus der Rekonstitutionsreaktion. Hierbei ist insbesondere der erste Punkt, der abweichende pH-Wert, ein ernst- zunehmender und bisher unzureichend geprüfter Unterschied. Sowohl der in der Re- konstitution als auch der auf der Affinitätssäule verwendete OG-Puffer besitzen jeweils einen basischen pH-Wert von 9. Alle anderen bisher verwendeten Puffer, in denen monomerer oder trimerer LHCII gelöst war, zeigen deutlich niedrigere pH-Werte, die im neutralen Bereich von pH 6,8 bis 7,6 liegen. Das grundlegende Prinzip der komplexen Bindung des „His6 tag“ an Ni2+ ist stark abhängig vom pH-Wert der Lösung oder ge- nauer gesagt von der Stärke der Protonierung der His-Reste. Während der Hexahisti- dyl-Rest im Basischen deprotoniert ist und komplex an die Ni-Säule binden kann, wird im niedrigen pH der Stickstoff des His protoniert, was die Bindung an die Affinitätssäule Kapitel II 4 Diskussion 139 verhindert. Inwiefern die Senkung des pH-Wertes von 9 auf 7,6 ausreichend ist, den Hexahistidyl-Rest zu protonieren, kann an dieser Stelle nicht gesagt werden. Hierbei gilt es zu bedenken, dass LHCII in wässriger Lösung durch die Detergenzmizelle ge- schützt wird und nicht vorhergesagt werden kann, inwiefern die gemessenen pH-Werte für die Grenzschicht von Mizelle mit wässriger Lösung, in welcher sich der C-Terminus des LHCII voraussichtlich befindet, zutreffend sind. Allerdings kann der Einfluss des pH-Wertes auf die Bindung des monomeren und trimeren LHCII unter geringem Ar- beitsaufwand getestet werden. Hierzu sollte ausgefällter LHCII in Detergenzlösungen mit variierenden pH-Werten solubilisiert, CD-spektroskopisch charakterisiert und auf Ni2+-Affinitätssäulen rückgebunden werden. Ein weiterer Unterschied in der Zusammensetzung der verwendeten Puffer liegt im Vorhandensein nativer Lipide im pigmenthaltigen „Mock-Puffer“. Dünnschicht- chromatographische Analysen mehrerer Totalpigmentextrakte zeigten stets große Mengen an den nativen Lipiden Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), DGDG, PG und Sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG). Von den genannten vier Lipiden ist im Hin- blick auf die Immobilisierung des C-terminalen „His6 tag“ an Ni-Affinitätssäulen insbe- sondere DGDG von Interesse, da die verbesserte Auflösung der LHCII-Struktur durch Standfuss et al. (2005) drei Bindestelle für dieses Lipid im Trimer in unmittelbarer Nähe der einzelnen C-Termini offenbarte (Abb. 2.4.1). Abb. 2.4.1: DGDG-Bindestellen in der Kristallstruktur des LHCII-Trimers nach Standfuss et al. (2005; PDB-Eintrag 2BHW). In (A) und (C) ist das Peptidrückgrat des Trimers mit gebundenem DGDG (rot) in lumenaler Aufsicht gezeigt, in (B) und (D) als Seitenansicht. (C) und (D) zeigen jeweils einen vergrößerten Ausschnitt. Hier ist das Proteinrückgrat (Aminosäuren 190-232) des Monomer A grau, das des Monomer B lila dargstellt. C-Term bedeutet C-Terminus, H4 Trans- membranhelix 4. Die Abbildung wurde mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). Kapitel II 140 4 Diskussion Während frisch rekonstituiertem LHCII sowie den Trimeren, die in pigmenthaltigem Rekonstitutions-„Mock“-Puffer rückgelöst wurden, pro LHCII-Protein zwischen 10 und 50 DGDG-Moleküle zur Verfügung stehen (Schätzwert nach visueller Auswertung der Dünnschicht-Chromatogramme), sind alle anderen getesteten Lösungen frei von nati- vem DGDG. In diesem Zusammenhang muss zudem die Frage gestellt werden, ob in rekombinanten Trimeren, oligomerisiert mittels Ni-Säule, diese Bindestellen mit nati- vem Lipid besetzt sind. Nussberger et al. (1993) konnten nachweisen, dass native LHCII-Trimere durch 2 tägige Inkubation in 1,2%iger OG-Lösung zum einen langsam zu Monomeren zerfielen und zum anderen keine signifikanten Mengen an Galactolipi- den mehr gebunden hatten. Bedenkt man, dass rekonstituiertes Protein nach Bindung an die Affinitätssäule mehrmals mit 1%iger OG-Lösung gewaschen wird, ist fraglich, ob hierbei das gebundene DGDG nicht vom Protein gewaschen wird. Dieser Hypothese folgend wäre in rekombinanten, aufgereinigten Trimeren diese Bindetasche entweder frei oder mit Detergenz besetzt. Dass dieser Gedanke nicht abwegig ist und durch Hinweise gestützt werden kann, soll in Kap. III dieser Dissertationsschrift im Zusam- menhang mit strukturellen Änderungen in der lumenalen Schleife des LHCII diskutiert werden. Wie in Abb. 2.4.1 C und D vergrößert dargestellt ist, bindet die polare Kopf- gruppe des Lipids DGDG in unmittelbarer Nähe des lumenalen Endes der Trans- membranhelix H4 des Monomer A (grau) im trimeren LHCII. Der Abstand des Zuckers zu einzelnen Aminosäurenresten beträgt hierbei zwischen 4,5 Å und 6,5 Å. Gleichzeitig liegt das Lipid in engem Kontakt zum C-Terminus des Monomer B (lila) im trimeren Komplex. Hier gemessene Abstände des polaren Zuckers zu einzelnen Seitenketten der Aminosäuren in unmittelbarer Nähe betragen zwischen 2,7 Å und 9 Å. Die Hypo- these, die sich aus dieser neuen strukturellen Information entwickelt, ist, dass das Lipid DGDG, ähnlich wie für das Lipid PG nachgewiesen (Nussberger et al., 1993), eine Funktion als eine Art „molekularer Klebstoff“ innehaben könnte und in dieser Funktion die Position des C-Terminus B an der rigiden Helix H4 des Monomer A fixieren kann. Für solch eine Hypothese spricht zum einen die Behinderung der Trimerisierung durch Markierung der Position 196 (in H4) mit Spinmarker (Kap. I), was möglicherweise eine Blockierung der DGDG-Bindestelle zur Folge hat. Desweiteren ist es möglich, LHCII- Proben mit hohem DGDG-Gehalt zu trimerisieren, auch wenn PG abwesend ist (Hobe, 1995). Solche Trimere sind allerdings deutlich instabiler als Trimere mit PG. Wie in Abb. 2.4.1 weiterhin ersichtlich ist, kommen die einzelnen C-Termini des trimeren LHCII so zu liegen, dass sie aus der Membranebene hinaus in das Lösungs- mittel zeigen. Ein C-terminal angehängter Affinitätsmarker sollte in diesem Fall eine gute Zugänglichkeit zur Ni-Säule besitzen. Greift man die obige Hypothese wieder auf, könnte die Nichtbesetzung der DGDG-Bindestelle dazu führen, dass der C-Terminus nicht in seiner Position fixiert wird. Wie in Abb. 2.4.2 gezeigt, liegt der C-Terminus des Monomer B in der Nähe der lumenalen Schleife des Monomer A und wird durch die Kapitel II 4 Diskussion 141 Interaktion des Trp 222 (Monomer B) mit Helix H3 (Monomer A) in seiner Position fi- xiert (Barros & Kühlbrandt, 2009). Fällt nun die hypothetische Fixierung durch DGDG weg, wäre es vorstellbar, dass das Ende des C-Terminus B inklusive angehängtem Affinitätsmarker (hier nicht gezeigt) beispielsweise auf der lumenalen Schleife des Mo- nomer A (H2) zu liegen kommt und damit die Fähigkeit zur Bindung an die Ni-Säule deutlich eingeschränkt wird. Abb. 2.4.2: Ausschnitt aus der Kristall- struktur des LHCII-Trimers (PDB-Eintrag 2BHW). Darstellung der Interaktion des Trytophan 222 des Monomer B mit der Helix H3 von Monomer A, sowie des C- Terminus des Monomer B mit dem DGDG A als lumenale Aufsicht. Das Peptidrück- grat ist grau dargestellt, DGDG ist rot, die Seitenkette des Tryptophan 222 blau. C- Term bedeutet C-Terminus, H steht für Helix. Die Abbildung wurde mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). Es kann lediglich spekuliert werden, inwiefern die Bindung von Detergenz in die, nach obiger Hypothese leere, DGDG-Bindestasche die Konformation des C- Terminus wirklich beeinflussen kann. Vorstellbar wäre eine Situation, in welcher die einzelnen Detergentien durch die unterschiedliche Länge ihrer Alkylketten auf ver- schiedene Weise in der Bindetasche zu liegen kommen. Der unterschiedliche Aufbau der Detergenz-Kopfgruppen im Vergleich zum Dissaccharid des DGDG könnte in die- sem hypothetischen Modell die Fixierung des C-Terminus stören und somit das zuvor erwähnte „Umklappen“ begünstigen und damit die Bindung des „His6 tag“ verhindern. Auch der dritte Unterschied zwischen den in den Immobilisierungs-Versuchen getesteten Puffern, nämlich das hypothetische Vorhandensein eines nicht gefällten Restes an Dodecylsulfat aus der Detergenzwechsel-Rekonstitution, lässt lediglich Raum für Spekulationen. In solch einem Fall wäre beispielsweise vorstellbar, dass LDS genau wie zuvor für nicht-ionische Detergentien angenommen mit seiner Alkylkette in die Bindetasche des DGDG binden kann. Dodecylsufat besitzt allerdings eine deutlich kleinere Kopfgruppe und könnte daher einen geringeren sterischen Einfluss auf den C- Terminus ausüben, was wiederum das „Umklappen“ des C-Terminus weniger begüns- tigen würde. Ob das Dodecylsulfat durch die eingebrachte negative Ladung bzw. die mitgeführte Hydrathülle einen stabilisierenden Effekt auf den C-Terminus ausüben kann, was wiederum in einer verbesserten Zugänglichkeit des angebrachten Affini- tätsmarkers resultieren würde, bleibt höchst fraglich. Insbesondere die in Dodecylsul- fat-Mizellen beobachtete Senkung des lokalen pH-Wertes (Lima et al., 2002), sollte hierbei vielmehr die Protonierung des Hexahistidyl-Restes begünstigen, was die Bin- Kapitel II 142 4 Diskussion dungseffizienz des „His6 tag“ verschlechtern statt verbessern müsste. Von LHCII- Trimerisierungsstudien (Rogl et al., 1998) ist aber bekannt, dass ungefalteter LHCII, denaturiert in Harnstoff, in hohem Maß an der Ni-Säule immobilisiert wird und durch Waschen mit einer 2%igen LDS-Lösung nicht abgewaschen werden kann. Insofern scheint Dodecylsulfat zumindest keinen negativen Einfluss auf die Bindung des Hexa- histidyl-Restes auszuüben. Insgesamt betrachtet ist die Situation in einer solchen OG/LDS-Mischmizelle nur schwer nachvollziehbar und es bleibt spekulativ, inwiefern negative Ladungen in solchen Mischmizellen deren Eigenschaften ändern können, bzw. inwiefern die Interak- tion zwischen Mizelle und den hydrophoben Domänen des Membranproteins beein- trächtigt wird. Experimente zur Faltungskinetik des LHCII (Kap. III), durchgeführt durch Z. Joly-Lopez (DAAD-RISE Programm, 2007) zeigten bereits, dass die Eigenschaften von Detergenz-Mischmizellen (6 % OG, 1 % TX) durch Zumischen von 0,02 % des anionischen Detergenz Desoxycholat deutlich verändert wurden. Chlorophylle, welche zuvor zur Aggregation neigten, blieben hier bis zu 45 min stabil in Lösung. Hier hatte das Einbringen weniger geladener Moleküle in die Mizelle eine beachtliche, aber un- vorhersehbare Wirkung erzielt. Großer Vorteil der zuvor diskutierten, hypothetischen Gründe für die geringe Bindungseffizienz des trimeren LHCII an Ni-Affinitätssäulen, ist ihre schnelle Überprüf- barkeit unter vergleichsweise geringem Arbeitsaufwand. Genau wie für die Verände- rung des pH-Wertes diskutiert, sind Versuche zur Bindung der LHCII-Trimere, solubili- siert in Mischmizellen mit varierendem LDS-Gehalt, schnell durchgeführt. Auch hierbei sollte stets darauf geachtet werden, solubilisierte Komplexe vor Bindung an die Ni- Affinitätssäule CD-spektroskopisch auf ihren Oligomerisierungsgrad zu prüfen. Versu- che zur Bindung des DGDG erfordern etwas mehr Arbeitsaufwand. Da in kommerziell erhältlichem DGDG nicht ausgeschlossen werden kann, dass die Alkylketten oxidiert wurden, ist fraglich, wie gut das Lipid in die Bindetasche binden kann. Zumindest Kris- tallisationsansätze mit peripher gebundenem DGDG zwischen zwei Trimeren reagieren sehr empfindlich auf solch eine Oxidation (Nussberger et al., 1993). Daher wäre es von Vorteil, natives DGDG, möglichst in inerter Schutzatmosphäre, selbst aus Erbsenpflan- zen zu isolieren. Hier wäre es sicherlich interessant, zum einen DGDG in unterschiedli- chen Konzentrationen zu Detergenz-solubilisierten Trimeren zuzumischen, zum ande- ren wäre es sinnvoll zu testen, inwiefern DGDG in der Trimerisierungsreaktion einen Einfluss auf rekombinanten LHCII ausüben kann. Durch entsprechende DGDG- Konzentrationen in Ni-Säulen-Puffern sowie im Saccharose-Gradient könnte geprüft werden, ob die Immobilisierungseigenschaften der Trimere verbessert werden. Letztendlich bleibt die Erkenntnis, dass es erstmalig gelungen ist, zuvor isolierte rekombinante LHCII-Trimere in signifikanter Menge mittels „His6 tag“ an einer Ni2+- Affinitätssäule zu immobilisieren. Hierbei erreichte Bindungsausbeuten eignen sich zwar nicht zur Herstellung von heterogen markierten Trimeren im großen Maßstab. Kapitel II 4 Diskussion 143 Das eigentliche Problem der Verhinderung der Immobilisierung der Trimere konnte aber stark eingegrenzt werden, so dass es möglich sein sollte, mit überschaubarem Arbeitsaufwand die Bindungsausbeute des trimeren LHCII an Ni-Affinitätssäulen weiter zu steigern. 4.2 Versuch der Herstellung heterogener LHCII-Trimere durch Immobi- lisierung mittels „Strep tag“ Nachdem das Problem der unzureichenden Immobilisierung des trimeren LHCII mittels „His6 tag“ nicht ausreichend behoben werden konnte, wurde alternativ das von R. Lau- terbach (unveröffentlicht) im Labor etablierte System der „Strep tag“/Strep-Tactin- Immobilisierung aufgegriffen und mit der Trimerisierungsmethode mittels C-terminalem „His6 tag“ kombiniert. Die Konstruktion der doppelt affinitätsmarkierten Klone stC79Sh und st106/160h mittels Restriktion und Ligation bereits vorhandener Klone funktionier- te, analog zur Konstruktion von „His6 tag“-Klonen in Kapitel I dieser Arbeit, problemlos. Wie zuvor diskutiert, sind solche Konstruktionen vergleichsweise zeitaufwendig. Daher wurde auch hier für zukünftige Mutagenesen ein doppelt affinitätsmarkierter Klon ohne Cys konstruiert (stC79Sh), welcher als Ausgangsklon zur Herstellung weiterer Cys- Klone mittles punktspezifischer Mutagenese dienen kann. Die biochemische Charakterisierung der neuen Mutanten zeigte, dass sie auf- grund der 8 zusätzlichen N-terminalen Aminosäuren in der denaturierenden SDS- PAGE wie erwartet ein leicht verändertes Laufverhalten zeigen. Während Mutanten mit C-terminalem „His6 tag“ eine Bande bei 27 kDa bilden, besitzt das Apoprotein der neu- en Klone aufgrund der zusätzlichen Aminosäuren ein Masse von ca. 28 kDa. Die Rück- faltung der neuen Mutanten mittels Detergenzwechsel-Rekonstitution nach Paulsen et al. (1993) und die Trimerisierung mittels „His6 tag“ auf der Ni-Säule funktionierten prob- lemlos und resultierten in den erwarteten spektroskopischen Eigenschaften (Abb. 2.3.9 und 2.3.10). Wie in Kapitel I diskutiert, kann rekombinanter LHCII unter Umständen sehr empfindlich auf Mutationen der Peptidsequenz reagieren. Aufgrund der Bindung zahlreicher Kofaktoren können aus Mutationen resultierende negative Auswirkungen bezüglich der Komplex-Stabilität oder Pigment-Bindung verhältnismässig einfach de- tektiert werden. Da die neuen doppelt affinitätsmarkierten Mutanten sich in Rekonstitu- tion und Trimerisierung spektroskopisch unauffällig verhalten, kann davon ausgegan- gen werden, dass die 8 zusätzlichen N-terminalen Aminosäuren des „Strep tag“ keinen signifikanten Einfluss auf die Proteinstruktur ausüben. Im Unterschied zu allen bisher konstruierten Klonen der AG Paulsen können die doppelt affinitätsmarkierten Klone sowohl an Ni-Säulen als auch an Step-Tactin- Oberflächen immobilisiert werden, was wie später diskutiert neue Möglichkeiten der Probenpräparation ermöglicht. Dass die zuletzt genannte Interaktion spezifisch für den „Strep tag“ mit Strep-Tactin ist, konnte durch das Bindungsunvermögen des „Strep tag“-freien Klones C3.2h bewiesen werden (Abb. 2.3.13). Interessanterweise lassen Kapitel II 144 4 Diskussion sich die N-terminal immobilisierten Mutanten auf der Strep-Tactin-Säule ebenfalls durch Zugabe des Lipids PG trimerisieren. Bindungs- und Trimerisierungsausbeuten sowie spektroskopische Eigenschaften sind hierbei identisch zu den mittels „His6 tag“- immobilisierten Mutanten (Abb. 2.3.11). Insofern lässt sich feststellen, dass die Immo- bilisierung von LHCII nach Detergenzwechsel-Rekonstitution mittels „Strep tag“ keiner- lei Vorteile, aber auch keine Nachteile bietet. Vergleicht man dagegen beide Affinitäts- marker hinsichtlich der Immobilisierung trimerer Komplexe, so ist der „Strep tag“ klar im Vorteil. Sowohl unmarkierte als auch spin- oder Fluoreszenz-markierte Trimere werden zu annähernd 100 % an Strep-Tactin immobilisiert (Abb. 2.3.12 und 2.3.13). Dieses hohe Bindungsvermögen ist zusätzlich unabhängig von der Aufreinigung der Trimere nach Ni-Säulen-Elution (Abb. 2.3.12). Eluiert man trimeren LHCII mit entsprechend geringerer Imidazol-Konzentration (250 mmol/l) von der Ni-Säule, so kann die Probe direkt an Strep-Tactin gebunden werden und, beispielsweise, von Imidazol befreit oder ein Pufferwechsel durchgeführt werden. Zusätzlich ermöglicht diese Eigenschaft die Herstellung heterogen markierter Trimere nach der „unsauberen Methode“. Durch Beimischung eines hohen Überschus- ses unmarkierten Proteins zu Fluoreszenz- oder spinmarkiertem st106/160h vor der Trimerisierung ist es möglich einfach markierte Trimere im hohen Überschuss zu mehr- fach markierten Trimeren zu produzieren. Der Hauptteil der gebildeten Trimere, beste- hend aus „Strep tag“-freiem LHCII, kann einfach abgetrennt werden (Abb. 2.3.13). Wie entsprechende Vorversuche mit Fluoreszenz-markiertem st106/160Ch in Trimermi- schungen zeigten, wird ein Großteil der Trimere nicht auf Strep-Tactin immobilisiert. Solche Trimere enthalten aber keine signifikanten Mengen an Fluoreszenz-markiertem Apoprotein und somit auch keinen „Strep tag“. Nach erfolgreicher Bindung eluierte Tri- mere solcher Mischansätze zeigten dagegen in der SDS-PAGE die mengenmäßig er- wartete Mischung aus unmarkiertem und markiertem LHCII. Auch das spektroskopi- sche Verhalten solcher heterogen Fluoreszenz-markierter Trimere ist interessant. Wie schon früher beschrieben, zeigen DY731-markierte Trimere der Mutante 106/160 ein wildtypisches Trimersignal in der CD-Absorption (Christian, 2008). Heterogen DY731- markierte Trimere zeigen dagegen ein „Misch“-Signal nativer und rekombinanter Trime- re, was in Kap. III dieser Dissertationsschrift weiter diskutiert werden soll. Die zuvor angesprochene Unsicherheit, ob die Ergebnisse nicht aus einer 1:1 Mischung homogen unmarkierter und homogen markierter Trimere resultieren, kann letztlich durch die DEER-Abstandsmessung ausgeschlossen werden. Die ermittelte Abstandsverteilung der trimeren EPR-Probe mit PROXYL-Markierungen in der lumena- len und der stromalen Schleife (Pos 106 und 160) zeigt vor allem Abstände zwischen 3,5 und 5 nm und ist damit einer monomeren Probe recht ähnlich. Da die spinmarkier- ten LHCII-Komplexe aber CD-spektroskopisch eindeutig als Trimere identifiziert wur- den, ist dies ein starkes Indiz für die erfolgreiche Herstellung einer heterogen markier- ten Trimerprobe des LHCII mit nur einem doppelt spinmarkiertem Monomer im Trimer. Kapitel II 4 Diskussion 145 Wie schon zuvor angesprochen, kann über die zusätzlich auftretenden kürzeren und längeren Abstände aufgrund des schlechteren Signal-Rausch-Verhältnisses gegenüber doppelt spinmarkierten Monomeren lediglich spekuliert werden. Tatsache ist aber, dass in einer homogen markierten Probe bzw. in einer 1:1 Mischung aus homogen unmar- kierten und homogen markierten Trimeren die längeren Abstände deultich hätten überwiegen müssen (Abb. 2.1.1 B). Da, wie zu Beginn des Kapitels angesprochen, die hier vorgestellte Methode lediglich einen Kompromiss darstellt und die EPR-Proben neben einfach markierten Trimeren einen gewissen Anteil zweifach und dreifach mar- kierter Trimere enthalten kann, ist nicht ausszuschließen, dass die gemessenen länge- ren Abstände durch intermolekulare Spin-Spin-Kopplung zwischen Monomeren im Tri- mer hervorgerufen werden. Hierüber könnten sicherlich höher konzentrierte Proben des heterogen markierten LHCII sowie der Vergleich zu der DEER-Abstandsverteilung einer Probe homogen markierter Trimere der Cys-Doppelmutante S106C/S160Ch Auf- schluss geben. Im ersteren Fall ist jedoch zu bedenken, dass bei Einsatz der doppelten Menge an spinmarkiertem LHCII (also 10 mg), entsprechend 70 mg unmarkiertes Pro- tein und bis zu 175 mg Totalpigmentextrakt eingesetzt werden müssten. Kapitel II 146 5 Schlussfolgerung 5 Schlussfolgerung Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Herstellung heterogen markierter LHCII-Proben für EPR-DEER Messungen letztendlich erfolgreich war. In diesem Zu- sammenhang konnte die eigentlich angestrebte Methode der doppelten Immobilisie- rung des LHCII mittels „His6 tag“ zwar verbessert, aber nicht ausreichend weiterentwi- ckelt werden. Erst der Umstieg auf die Strategie der Verwendung unterschiedlicher Affinitäts-chromatographischer Systeme in Reihe mit vorheriger Konstruktion von dop- pelt affinitätsmarkierten Mutanten des LHCII, führte zum Erfolg. Die letztlich vorgestell- te Methode stellt im Gegensatz zu der früher diskutierten doppelten Immobiliserung mittels „His6 tag“, zwar eine „unsaubere“ Lösung zur Herstellung heterogen markierter Trimere dar, die Rückbindung von annähernd 100 % des trimerisierten LHCII ist aber beachtlichtlich, insbesondere in Hinblick auf die benötigten Proteinmengen in EPR- DEER Proben. Als Nachteil gegenüber der zuvor diskutierten Immobiliserung mittels „His6 tag“ ist die Herstellung einer Vielzahl neuer, doppelt affinitätsmarkierter Klone des LHCII zu nennen. Durch die erfolgreiche Konstruktion eines doppelt affinitätsmarkierten Ausgangsklons (stC79Sh) in Verbindung mit der vorgestellten Optimierung der punkt- spezifischen Mutagenese (Kap. I), ist der benötigte zusätzliche Arbeitsaufwand aber überschaubar. Trotzdem sollte auch weiterhin an einer Optimierung des Prinzips der doppelten Immobilisierung mittels „His6 tag“ gearbeitet werden, bis auch hier die Pro- duktion heterogen markierter Trimere erfolgreich ist. Nicht verschwiegen werden sollen andere interessante Nutzungsmöglichkeiten der neu konstruierten doppelt affinitätsmarkierten Mutanten des LHCII. Wie schon vor- her erwähnt, bietet die ausordentlich hohe Bindungsausbeute des trimeren LHCII an Strep-Tactin die Möglichkeit trimerisiertes Protein beispielsweise nach Markierungsre- aktionen schnell und effizient von ungebundenem Farbstoff „vorzureinigen“. Hierbei muss aber in Kauf genommen werden, dass der eluierte LHCII nach Elution mit Desthiobiotin verunreinigt ist. Weiterhin könnte man versuchen durch die feste Bindung des „Strep tag“ an das Protein Streptavidin die von Boggasch (2006) beschriebene Methode zur gerichteten Insertion des rekombinanten LHCII in Liposomen weiterzu- entwickeln. Statt des dort genutzten, irreversibel gebundenen hydrophilen „Anker“- Protein GFP („green fluorescent protein“), könnte Streptavidin, reversibel gebunden an den N-terminalen „Strep tag“, zum Einsatz kommen. Vorteil wäre hier die effiziente Entfernung des „Ankers“ nach geglückter Insertion. Kapitel III EPR-spektroskopische Untersuchung der Struktur des LHCII in Lösung. 1 Einleitung Die dreidimensionale Struktur eines Proteins ist ausschlaggebend für seine Funktion. Das Wissen um die Struktur eines Proteins gewährt somit Einblick in dessen Arbeits- weise und Aufgabenbereiche. Gängige Methoden zur Aufklärung von Proteinstrukturen sind insbesondere die Kristallographie, sowie die Kernspinresonanz (NMR)- und Elektronenspinresonanz (EPR)-Spektroskopie. Die Struktur des majoren Lichtsammel- komplex konnte vor ca. 15 Jahren mittels hochauflösender Elektronenmikroskopie be- reits größtenteils aufklärt werden (Kühlbrandt et al., 1994), der LHCII zählt damit zu den ersten kristallographisch erfassten Membranproteinen (Booth & Curnow, 2006). Während Kühlbrandt et al. (1994) die Struktur der Aminosäuren 26 bis 100 und 116 bis 224 nativer LHCII-Trimere aus Erbse bis auf 3,4 Å auflösten, erweiterten Liu et al. (2004) die Strukturdaten auf die Reste 14 bis 231 des LHCII aus Spinat bei 2,72 Å, gefolgt von Standfuss et al. (2005) bei einer Auflösung von 2,5 Å (Erbsen-LHCII). Die Lage der ersten 9 Aminosäuren der N-terminalen Domäne blieb kristallographisch un- geklärt. Als Grund hierfür wird zum einen der heterogene Aufbau nativer Trimere aus den Genprodukten Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3 mit jeweils variierender N-terminaler Pep- tidsequenz diskutiert (Standfuss & Kühlbrandt, 2004), andererseits legen EPR- spektroskopische Versuche der eigenen Gruppe einen gewissen Grad an N-terminaler Strukturflexibilität in rekombinanten Trimeren des LHCII nahe (Jeschke et al., 2005). Die Erfassung solcher flexiblen Strukturdomänen gestaltet sich in kristal- lographischen Experimenten als schwierig, da nur Proteinstrukturen erkannt werden können, die sich im Kristall in einem absolut identischen Zustand befinden. Die Entde- ckung von dynamischen Proteindomänen ist folglich nur möglich, wenn einzelne Pro- ben des gleichen Proteins in unterschiedlichen stationären Zuständen präpariert und kristallographisch erfasst werden können. Insbesondere hier liegen die Stärken der NMR- und EPR-Spektroskopie, beide Methoden eignen sich besonders zur Struktur- aufklärung von Makromolekülen in Lösung und damit zur Beobachtung von Strukturdy- namik. Versuche, LHCII mittels NMR-Spektroskopie zu untersuchen, gestalten sich bisher allerdings als schwierig. Aufgrund einer Molekülgröße (Detergenzhülle einge- schlossen) von über 25 kDa kommt der Einsatz der etablierten 1H-NMR-Spektroskopie oder auch der „nuclear Overhauser effect“ (NOE)-Spektroskopie mit verschiedenen Kernspins nicht in Frage. Zur Durchführung von 19F-NMR war die obligatorische kova- lente Markierung des rekombinanten LHCII mit 19F-Markern zwar erfolgreich, nachfol- gende NMR-Messungen bis dato aber problematisch (Dietz, 2008). Kapitel III 148 1 Einleitung Im Unterschied dazu sind EPR-spektroskopische Untersuchungen an rekombi- nantem LHCII seit mehreren Jahren etabliert. Die kovalente Einführung von Spinmar- kern mittels SDSL (Berliner, 1976; Hubbel et al., 1998) macht den LHCII für die EPR- Spektroskopie zugänglich (Bender, 2004) und resultierte bereits in einer Vielzahl an Erkenntnissen bezüglich der Struktur der Protein-Pigment-Komplexe in Lösung. Früher durchgeführte CW-spektroskopische Untersuchungen zur Lage einzelner Domänen des spinmarkierten LHCII zeigten bereits die aus der Kristallstruktur erwarteten Daten (Dockter, 2005) und verifizierten die Stärken der Methode zur Strukturbestimmung in Membranproteinen (Farahbakhsh et al., 1993; Steinhoff et al., 1994). Gleiches gilt für DEER-spektroskopische Abstandsmessungen in doppelt spinmarkierten Monomeren oder dreifach markierten Trimeren des LHCII. Bisher durchgeführte Experimente an kristallographisch aufgelösten Domänen des rekombinanten LHCII bestätigten die Kris- tallstruktur; die kristallographisch unvollständig aufgeklärte N-terminale Domäne zeigte dagegen in Lösung eine flexible Struktur (Jeschke et al., 2005). Wie in Kap. I ausführlich dargelegt, resultierte die Verbesserung der Mutagene- se-Technik verbunden mit einer effizienten Spinmarkierung des LHCII in einer Vielzahl neuer, funktionaler LHCII-Mutanten, die für EPR-spektroskopische Experimente zur Verfügung standen. Hauptziele der vorliegenden Dissertationsschrift waren, mit Hilfe der neuen LHCII-Klone verschiedene Puls-EPR-Techniken zur Entschlüsselung von Membranprotein-Strukturen zu etablieren und diese zur weiteren Verifizierung der Struktur des monomeren und trimeren LHCII in Lösung anzuwenden. Hierzu sollte zu- nächst die Möglichkeit der Erfassung lokaler Strukturen mittels verschiedener Puls- EPR-Monitore an rekombinantem LHCII getestet werden. Aufgereinigte Proben des einzeln spinmarkierten LHCII, eingefrorenen in einem glasartigen stationären Zustand, wurden mittels Puls-EPR-Methoden vermessen und mit gängigen Methoden der CW- EPR sowie mit aktuellen Daten der Kristallstruktur verglichen. Doppelt markierte Mo- nomere und dreifach markierte Trimere, ebenfalls in stationärem Zustand eingefroren, sollten mittels DEER-EPR vermessen werden. Die Ergebnisse dieser eher globalen „Abstandskartographie“ sollten mit einer Datenbank möglicher Spinmarker-Rotamere, simuliert anhand aktueller Daten der Kristallstruktur des trimeren LHCII (Standfuss et al., 2005), verglichen und auf Strukturunterschiede geprüft werden. Nach Verifizierung der Puls-EPR-Techniken sollten in einem zweiten Schritt kristallographisch nicht er- fasste oder potentiell dynamische Domänen des LHCII in Lösung untersucht werden sowie die Detektion von zeitaufgelöster Strukturdynamik mittels Puls-EPR in Faltungs- experimenten getestet werden. Zur Wahrung der Übersicht sind in diesem Kapitel auch Messergebnisse der Diplomanden A. Müller (2008) und C. Dietz (2008) dargestellt und unter Einbeziehung aktueller Sichtpunkte diskutiert. Kapitel III 2 Material und Methode 149 2 Material und Methode Allgemein gebräuchliche Materialien und Methoden wurden bereits in Kapitel I be- schrieben und sind durch entsprechende Verweise gekennzeichnet. Mutantenbezeich- nungen aller Cys-Klone des LHCII sind in diesem Kapitel aus Gründen der Leserlich- keit in der Namensgebung auf die Mutationspositionen reduziert (siehe Kap. I, Tab. 1.2.2). In fast allen Positionen wurde das Cys im konservativen Austausch gegen Ser oder Ala eingeführt, Ausnahmen sind lediglich Position 4 (Ala) und 7 (Lys). 2.1 Präparation des spinmarkierten LHCII in stationärem Zustand für CW-EPR- und Puls-EPR-Messungen Einzel- und Doppelmutanten des Lhcb1 mit punktspezifisch eingeführten Cys wurden wie zuvor beschrieben konstruiert (Kap. I, 2.6), in E. coli JM101 überexprimiert (Kap. I, 2.7.2) und kovalent mit PROXYL markiert (Kap. I, 2.7.4.1). Spinmarkiertes Apoprotein wurde nach Standard-Protokoll mittels Detergenzwechsel-Rekonstitution zu LHCII- Monomeren gefaltet (Kap. I, 2.7.5), gegebenenfalls auf der Ni-Säule trimerisiert (Kap. I, 2.7.6) und mittels UZ aufgereinigt (Kap. I, 2.7.7). Die Funktionalität der isolierten Kom- plexe wurde mittels Fluoreszenz-Energietransfer (Kap. I, 2.8.2.2) und CD- Spektroskopie (Kap. I, 2.8.2.3) geprüft. Aufgereinigte, funktionale Komplexe wurden auf Konzentrationen von bis zu 800 µmol/l LHCII gebracht (Kap. I, 2.7.8), 1:1 mit 80%igem Glyzerin als Gefrierschutz verdünnt, in 3 mm EPR-Kapillaren überführt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren (Kap. I, 2.8.2.4.2). Die Durchführung der CW-EPR- und ESEEM-EPR-Messungen ist in Kap. III (3.1.1.1) genau beschrieben. DEER-EPR Messungen wurden wie in Kap. I (2.8.2.4.2) beschrieben durchgeführt. Die Prozessierungsparameter waren: Zeitnullpunkt 130 ns, Start der Hintergrundkorrektur 640 ns, Regularisierungsparameter α=10. DEER-Proben der Diplomanden A. Müller (2008) und C. Dietz (2008) wurden im Unterschied zum Standard-Protokoll nach Isolierung und Charakterisierung der Komplexe wie in Kap. III (3.1.1.1) beschrieben deuteriert und dann mit einer Endkon- zentration von 300-400 µmol/l LHCII (in 40 % deuteriertem Glyzerin) in flüssigem Stick- stoff schockgefroren. 2.2 Präparation des spinmarkierten LHCII für zeitaufgelöste Puls-EPR- Messungen Zeitaufgelöste Puls-EPR-Messungen wurden mit der Einzelmutante 196 (ESEEM- EPR) und den Doppelmutanten 106/160 sowie 90/196 (DEER-EPR) durchgeführt. Die Konstruktion der Mutante 106/160 ist in Bender (2004) dargelegt, die Konstruktion von 196 sowie 90/196 in Kap. I (2.6). Die Überexpression der Apoproteine in E. coli JM101 Kapitel III 150 2 Material und Methode (Kap. I, 2.7.2), deren Markierung mit PROXYL (Kap. I, 2.7.4.1) und Aufreinigung durch Fällung mit TCA (Kap. I, 2.7.4.4) erfolgte wie vorher beschrieben. Da in zeitaufgelösten EPR-Messungen die Faltung des LHCII durch Schockfrie- ren gestoppt wurde, konnten Proteinkonzentrationen im Nachhinein nicht weiter erhöht werden. Um der Anforderung ausreichend hoher Spinkonzentrationen für EPR- spektroskopische Untersuchungen nachzukommen, wurde das Rekonstitutionsproto- koll für zeitaufgelöste Messungen der LHCII-Faltung (Booth & Paulsen, 1996; Horn et al., 2007) grundlegend verändert. Nach einer 20fachen Erhöhung der Proteinkonzent- ration, mussten Pigment- und Detergenz-Konzentrationen an die veränderten Verhält- nisse angepasst werden. Die in der Faltungsreaktion erforderlichen Pigmente wurden zwar wie im Standard-Protokoll beschrieben aus Erbsen-Thylakoiden isoliert (Kap. I, 2.7.1), um aber den Anteil natürlicher Lipide zu erhöhen, wurden die Pigmente nicht in Diethylether überführt. Stattdessen wurden die nativen Pigmente mittels Aceton aus den Thylakoiden gelöst und sofort am Rotationsverdampfer bei 25 °C Wassertempera- tur im Dunkeln eingetrocknet. Im Kolben verbliebenes Restwasser wurde manuell ab- gezogen, die Pigmente erneut in Aceton gelöst und wieder eingetrocknet. Dieser Schritt wurde mehrmals wiederholt, bis der Totalpigmentextrakt wasserfrei war. Durch den höheren Gehalt an nativen Lipiden war es möglich, die Löslichkeit der Pigmente in Ethanol auf die erforderliche Konzentration von 20 mg/ml zu steigern. Die Rekonstitution des LHCII erfolgte nach dem Prinzip der Verdünnungsme- thode (Horn et al., 2007), musste aber für zeitaufgelöste EPR-Experimente modifiziert werden. Hierzu wurde eine Proteinlösung mit 160 µmol/l spinmarkiertem LHCP vorbe- reitet. Das Apoprotein der spinmarkierten Mutanten wurde für 2 min in Rekonstituti- onspuffer 2 gekocht. Nach Abkühlung der Lösung bei RT wurde der klaren Lösung β- Me (10 mmol/l) hinzugefügt. Möglichst zeitnah wurde Totalpigmentextrakt zu 20 mg/ml in kaltem Ethanol im Ultraschallbad gelöst und kurz zentrifugiert. Pigment-Aliquots die nicht komplett löslich waren, wurden in der Regel verworfen, da sie erfahrungsgemäß nicht zum Rekonstitu- tionserfolg führten. Totalpigmentextrakte mit geringen Konzentrationen an Xanthophyl- len wurden nachträglich mit Lutein und Neoxanthin angereichert, so dass mindestens ein zweifach molarer Überschuss (über Protein) an den jeweiligen Xanthophyllen in der Rekonstitution verhanden war. Die gelösten Pigmente wurden mit Rekonstitutionspuf- fer 1 gemischt (dreifach molarer Überschuss an Chl über Protein), 30 s geschüttelt und sofort weiterverarbeitet. Die Rekonstitution wurde durch manuelles Mischen (1:1) der jeweils frisch an- gesetzten Rekonstitutionslösungen 1 und 2 initiiert. Hierzu wurde die pigmenthaltige Lösung 1 in die proteinhaltige Lösung 2 gegeben, durch mehrmaliges „auf- und ab- pipettieren“ vermischt und bei RT dunkel gestellt. Nach der jeweiligen Reaktionszeit wurden 50 µl des Rekonstitutionsgemisches 1:1 mit 80%igem Glyzerin verdünnt, kurz auf dem Vortexer geschüttelt, sofort mit einer Spritze in EPR-Quarzkapillaren überführt Kapitel III 2 Material und Methode 151 und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Dieser Vorgang benötigte etwa 10±1 s, die Faltungszeit wurde beim Schockfrieren gestoppt. Jeder Datenpunkt in kinetischen EPR-Messungen entspricht damit einer eigens gemischten LHCII-Probe mit einer Pro- teinkonzentration von etwa 40 µmol/l. Die Durchführung der DEER-Messungen ist in Kap. III (3.2.3) genau beschrieben. Die hier angewendete Methode mit manuellem Mi- schen der Pigment- und Proteinlösungen war auf Faltungszeiten oberhalb von 30 s beschränkt. Material: kaltes Ethanol (p.A.) Totalpigmentextrakt (nach modifiziertem Protokoll) Rekonstitutionslösung 1: 100 mmol/l Lithiumborat (pH 8,1) 12,5 % (w/v) Saccharose 6 % (w/v) OG 1 % (v/v) TX 0,26 % (w/v) PG 0,02 % (w/v) Deoxycholat 10 mmol/l β-Me Rekonstitutionslösung 2: 160 µmol/l spinmarkierter LHCP 1 % (w/v) LDS 100 mmol/l Lithiumborat (pH 8,1) 12,5 % (w/v) Saccharose β-Me (1 mol/l) Glyzerin 80 % 2.3 Simulation der theoretischen Abstandsverteilung in PROXYL- markierten LHCII-Mutanten Theoretische Abstandsverteilungen verschiedener monomerer und trimerer Mutanten des LHCII wurden anhand der Kristallstruktur des trimeren LHCII (Standfuss et al., 2005) durch Dr. Y. Polyhach (ETH Zürich, Schweiz) wie folgt berechnet. Die Spinson- denseitenkette des PROXYL hat sechs Rotationsfreiheitsgrade (Diederwinkel χ1 bis χ6). Basierend auf Molekulardynamiksimulationen wurden für jeden Freiheitsgrad eini- ge diskrete Werte des Diederwinkels definiert, die "erlaubt" sind. Jeder dieser Werte kann zunächst einmal mit jedem anderen kombiniert werden. Je nach gewünschter Genauigkeit erhält man dabei zwischen etwa 200 und 600 Kombinationen (Rotamere). Alle in der MD-Simulation beobachteten Strukturen (100.000 Schnappschüsse) wurden dann dem nächstgelegenen Rotamer zugeordnet. Manchen Kombinationen von Die- derwinkeln wird dabei keine der beobachteten Strukturen zugeordnet. Die endgültige Bibliothek besteht nur aus den Rotameren, die in der MD-Simulation auch tatsächlich Kapitel III 152 2 Material und Methode beobachtet werden. Das waren in dem Fall des Spinmarkers PROXYL 293 unter- schiedliche Konformations-Rotamere. Eine frühere Software zur Berechnung der Konformations-Rotamere lieferte bereits genaue Datensätze (Jeschke et al., 2007; Volkov, 2008; Hilger et al., 2009), die Weiterentwicklung führte zur Optimierung des Programms mit genaueren Vorhersagen. Die in dieser Dissertationschrift gezeigten theoretischen Abstandsverteilungen wurden mit der optimierten Software berechnet und weichen daher moderat von den in Volkov (2008) gezeigten Vorhersagen ab. Eine detaillierte Beschreibung der Berechnung zur Erstellung der Datenbank ist im Abschnitt „supporting information“ der Veröffentlichung zur DEER-Faltungskinetik des LHCII in Kap. III (3.2.3) zu finden. Eine Veröffentlichung zur Anwendung der optimierten Software in Datensätzen kristallographisch aufgelöster Membranproteine ist geplant (Polyhach, unveröffentlicht). Kapitel III 3 Ergebnisse 153 3 Ergebnisse 3.1 Puls-EPR-Experimente an LHCII-Proben in stationärem Zustand Primäre Ziele dieser Versuchsreihe war zum einen die Verifizierung und Weiterentwick- lung von Puls-EPR-Techniken zur Strukturaufklärung von Membranproteinen sowie die Sammlung von Daten bezüglich der LHCII-Struktur in Lösung. Zur Verifizierung der Puls-EPR-Techniken wurden aus der Vielzahl neuer LHCII-Mutanten kristallographisch erfasste ausgewählt und in stationärem Zustand vermessen. In einer folgenden Ver- suchsreihe sollten mit Hilfe der verifizierten Puls-Techniken kristallographisch nicht erfasste bzw. potentiell dynamische Domänen untersucht werden. Während die nach- folgend beschriebenen EPR-ESEEM- und Relaxationsmessungen an Cys- Einzelmutanten der Erfassung lokaler Strukturinformationen dienten, lieferten DEER- Messungen (Kap. III, 3.1.2) sehr spezifische Daten zur Lage ganzer Proteindomänen. 3.1.1 Detektion lokaler Strukturinformation durch Messung der Wasserzu- gänglichkeit mittels ESEEM-EPR Eine etablierte Technik zur Bestimmung lokaler Strukturinformation in Membranprotei- nen ist die CW-EPR-Spektroskopie (Hubbel et al., 1998). Während mit dieser Technik lediglich die Zugänglichkeit des Spinmarkers für hydrophile (Kalium- tris(oxalato)chromat, CrOx) bzw. lipophile (O2) paramagnetische Substanzen bestimmt werden kann (Dockter, 2005), erlauben verschiedene Puls-EPR-Techniken die Detek- tion der direkten Interaktion von Spinmarkern mit ihrer lokalen Umgebung, also unab- hängig von zugefügten paramagnetischen „Quenchern“. Hervorzuheben sei hier die ESEEM-EPR, die es erlaubt den Abstand des Spinmarkers zu umliegenden Deuteri- um-Kernen im Umkreis von 3 bis 6 Å sehr genau vorherzusagen. Um das Potential und die Genauigkeit solcher Puls-EPR-Messungen zur Strukturaufklärung von Membran- proteinen zu prüfen, wurden verschiedene Cys-Einzelmutanten des rekombinanten LHCII mittels Puls-EPR und CW-EPR vermessen und die Ergebnisse untereinander sowie mit aktuellen Daten der Kristallstruktur des LHCII (Standfuss et al., 2005) vergli- chen. Kapitel III 154 3 Ergebnisse 3.1.1.1 Publikation I. Volkov et al. (2009) Pulsed EPR determination of water ac- cessibility to spin-labeled amino acid residues in LHCIIb. Biophys. J., 96, 1124-1141. Pulsed EPR determination of water accessibility to spin-labeled amino acid residues in LHCIIb. Running title: EPR accessibility studies on LHCIIb. A. Volkov1, C. Dockter2, T. Bund,2 H. Paulsen2, G. Jeschke3 1 Max-Planck-Institute for Polymer Research Postfach 3148, 55021 Mainz, Germany 2 Institute of General Botany, Johannes Gutenberg University Mainz, Müllerweg 6, 55099 Mainz, Germany 3 Lab. Phys. Chem., ETH Hönggerberg, 8093 Zürich, Switzerland *Corresponding author, Tel.: +41-44 632 5702, Fax: +41-44 632 1021 E-mail address: gunnar.jeschke@phys.chem.ethz.ch Keywords: EPR, LHCIIb, membrane protein, site-directed spin labeling, ESEEM, electron spin relaxation. Kapitel III 3 Ergebnisse 155 ABSTRACT Membrane proteins reside in a structured environment with some of their residues be- ing accessible to water, some being in contact with alkyl chains of lipid molecules, and some being buried in the protein. Water accessibility of residues may change during folding or function-related structural dynamics. Several techniques based on the com- bination of pulsed electron paramagnetic resonance (EPR) with site-directed spin label- ing can be used to quantify such water accessibility. Accessibility parameters for differ- ent residues in major plant light harvesting complex LHCIIb are determined by electron spin echo envelope modulation (ESEEM) spectroscopy in the presence of deuterated water, deuterium contrast in transversal relaxation rates, analysis of longitudinal relaxa- tion rates and line shape analysis of electron-spin echo detected EPR spectra as well as by the conventional techniques of measuring the maximum hyperfine splitting and progressive saturation in continuous-wave EPR. Systematic comparison of these pa- rameters allows for a more detailed characterization of the environment of the spin- labeled residues. These techniques are applicable independently of protein size and require about 10-20 nmol of singly spin-labeled protein per sample. For a residue close to the N-terminus, in a domain unresolved in the existing x-ray structures of LHCIIb, all methods indicate high water accessibility. Kapitel III 156 3 Ergebnisse INTRODUCTION Membrane proteins define the functionality of the interface between living cells and their environment and play an important role in cell energetics. Their function can be understood in detail only if their structure and in many cases also their structural dy- namics is known. Despite recent progress structure determination of membrane pro- teins remains a challenging task (1, 2). Membrane proteins do not crystallize easily and current size limitations of NMR techniques (3), in particular for α-helical species, ex- clude many proteins of interest. Electron cryomicroscopy provides an interesting alter- native technique although it usually requires at least two-dimensional crystals for ob- taining highly resolved structures (4). In principle, near-atomic resolution can also be achieved with electron cryomicroscopy based on single-particle reconstruction tech- niques, as was recently demonstrated on a rotavirus particle (5). Applicability of such a high-resolution approach to membrane proteins remains to be shown. In this situation alternative techniques for characterization of membrane protein structure are of great interest. In particular, there is a lack of approaches that provide reliable information on partially ordered structures and on structural changes in membrane proteins. Such in- formation is required to characterize folding intermediates and flexible domains that are involved in regulatory processes. It cannot easily be obtained with established tech- niques since signal assignment to particular sites in the protein molecule fails for lack of resolution in ensembles with a broad conformational diversity. Site-directed spin la- beling (SDSL) techniques circumvent this problem as the signal originates exclusively from the labeled sites (6, 7) so that site-specific ensemble-averaged information can be obtained. No crystallization is required and the techniques are applicable to proteins reconstituted into membranes, liposomes, or detergent micelles. The same applies to site-directed fluorescence labeling techniques (8, 9, 10), which have the advantage of higher sensitivity and can be applied even to single molecules in vivo (11). However, compared to such fluorescence labeling, spin labeling offers two advantages. First, nitroxides have a size that is comparable to the size of amino acid side groups, while chromophores are often significantly larger. Second, the weak coupling of spins to their environment allows for a separation of interactions by pulsed EPR experiments (12). Such separation of interactions improves reliability of the interpretation of signals and precision of their quantification. Fluorescence and SDSL EPR techniques thus nicely complement each other. To date the majority of SDSL studies on membrane proteins has been per- formed with continuous-wave (CW) EPR approaches (6, 7). Pulsed EPR techniques were applied mostly for long-range distance measurements (13, 14, 15, 16). In this work we explore the potential of several pulsed EPR techniques for determination of water accessibility of spin-labeled residues in membrane proteins. Kapitel III 3 Ergebnisse 157 Due to the dependence of the fluorescence spectrum on the polarity of a chro- mophore’s environment, water accessibility can be characterized by fluorescence tech- niques (8, 9, 10). Likewise, EPR spectra are sensitive to the polarity of the environ- ment. In particular, the Azz principle value of the 14N hyperfine tensor and the gxx princi- pal value of the g tensor depend on the dielectric constant of the environment and on hydrogen bonding to the nitroxide (17, 18). Accordingly, these parameters correlate with immersion depth in the membrane (19). An alternative way of characterizing water accessibility by CW EPR relies on relaxation enhancement by water-soluble paramag- netic quenchers that can be detected by progressive saturation measurements (20). Both techniques measure parameters that depend strongly on proximity of water but can also be modified by other influences. Here we propose electron spin echo enve- lope modulation (ESEEM) spectroscopy as the main new technique for obtaining a reliable water accessibility parameter in a large transmembrane protein by quantifica- tion of hyperfine couplings to deuterium nuclei in deuterated water molecules. This technique can provide estimates of the distance and number of nuclear spins in the proximity of an electron spin on length scales between about 3 and 6 Å (21, 12). Thus ESEEM is suitable to provide a water accessibility parameter, as was demonstrated before in studies on water penetration in micelles (22) and along the membrane (23, 24, 25, 26), on localization of peptides in membranes (27, 28), and in detection of changes in water accessibility of a fatty acid by interaction with a protein binding pocket (29). Deuterium exchange of water also influences transversal relaxation of electron spins at low temperatures as such relaxation is mainly driven by proton spin diffusion (30, 31, 32). This technique can be applied to the same samples as used for ESEEM, provided that samples with protonated water have also been prepared. It is sensitive to proton concentration on length scales between about 7 and 20 Å and thus provides access to an intermediate-distance water accessibility parameter. Longitudinal relaxation is related to spin label dynamics, which is influenced by the local solvation cage around a spin label (33). As water solvation cages are unique with respect to their hydrogen-bond related rigidity, this parameter may also be corre- lated to water accessibility, although in a more indirect way. Local dynamics also influ- ences the line shape in echo-detected EPR spectra (33, 34, 35). In this work we com- pare all these different water-accessibility related parameters on a model system. Our model system is the main light-harvesting complex LHCIIb of photosystem II of green plants. It consists of a membrane protein and several cofactors, such as chlorophyll a and b, carotenoids and lipids that are non-covalently bound to it. The pro- tein, in turn, consists of a 232 amino acid polypeptide chain and features three trans- membrane helices (36, 37, 38). LHCIIb is involved in a number of regulatory proc- esses, which are associated with conformational changes (39, 40, 41), and self- assembles from its components in vitro on a time scale of a few minutes (42, 43). Kapitel III 158 3 Ergebnisse Crystal structures of the complex, except for the first few residues of the N- terminal domain of the protein, are available (37, 38). Hence, sites with high, moderate and low water accessibility can be predicted. With respect to the N-terminal domain an earlier EPR study suggested that it exists in at least two different conformational states and that at least one of those should be exposed to water (14). This manuscript is structured as follows: In the Results section we define, for each of the techniques, a water accessibility parameter. In ideal cases this parameter is proportional to local water concentration in a certain region around the spin label. This parameter is then determined for several spin-labeled LHCIIb mutants as well as for two reference samples consisting of free spin labels, one in an aqueous solvent and one in a solution of the detergent-containing buffer used for LHCIIb purification. In the Discussion section we compare relative water accessibilities obtained by the various methods and consider the influence of other changes in spin label environment for each of these parameters. The data are also discussed in terms of the structure of de- tergent-solubilized, monomeric LHCIIb as compared to trimeric LHCIIb in crystals and in terms of the localization of the N terminus. We conclude with considerations on ap- plying the entire toolbox to the same protein sample. MATERIALS AND METHODS Mutagenesis, Expression, Spin labeling and Reconstitution Several mutant versions of the Lhcb1*2 (AB80) gene (44) from pea (Pisum sativum) that contain a single cysteine were constructed by replacing serine or valine at different protein sites. The mutation positions as well as a schematic picture of the LHCIIb pro- tein are shown in Figure 1. In all mutants the native single cysteine at position 79 was replaced by serine. Protein overexpression in Escherichia coli was performed as de- scribed previously in (45). The purified apoproteins were dissolved (1 mg/ml) in an aqueous solution of 0.5% LDS (Applichem, Darmstadt), 20 mM sodium phosphate (Merck, Darmstadt) (pH 7), and 2 mM tris-(2-cyanoethyl)phosphine (Alfa Aesar, Waard Hill MA, USA) (1 M in DMF) and were incubated 2 h at 37°C. The proteins were then spin labeled on cysteine by adding 3-(2-iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl (IAA-PROXYL) (Sigma) (10 mg/ml DMSO solution, 20-fold molar excess over protein) and incubated overnight at 37°C on a shaker. The labeling efficiency was determined to be at least 90%. In the following spin-labeled mutants are abbreviated in the form S52r for a serine at position 52 that was mutated to a cystein and then labeled by IAA-PROXYL. Spin-labeled proteins were precipitated by adding 5% trichloracetic acid (Merck, Darmstadt) at room temperature and immediate centrifugation (12000 g for 5 min at 4 Kapitel III 3 Ergebnisse 159 °C). This step has to be performed fast, as reduction of the spin label can occur (46). The protein pellet was washed 5 times with distilled water and dried for 15 min at am- bient temperature. The spin-labeled protein was then reconstituted with a pigment ex- tract from pea thylakoids (47) isolated as described in (45) to self-assemble in the bio- logically relevant light-harvesting complex LHCIIb. Monomeric LHCIIb was purified by ultracentrifugation on 0.1 to 1 M sucrose density gradients containing 0.1% (w/w) n-dodecyl-β-D-maltoside (Merck, Darmstadt) and 5 mM Tris-HCl (pH 7.8) (Serva). After spinning for 16 h at 230000 g at 4°C, the band containing monomeric LHCIIb was collected and concentrated by “Centricon” centrifugal filter units (30 kDa), (Millipore) up to ca. 600 µM. The mutants thus prepared were checked by fluorescence- and CD-spectroscopy in order to detect possible struc- tural changes due to the mutations and spin labeling. The fluorescence spectra of all the used mutants showed the characteristic peak of chlorophyll a fluorescence at 680 nm when exciting chlorophyll b at 470 nm. The CD spectra were used as a fingerprint and showed characteristic peaks at 491 nm, 649 nm and 680 nm for all the used mu- tants. The concentrated protein was then mixed 1:1 with 80% glycerol (Roth, Karlsruhe) as a cryoprotectant (14) to a final concentration of around 300 µM. Samples for saturation measurements were prepared in the same way, with the only difference that to some of them tris(oxalato)chromium(III) complex [Cr(ox) 3-3] (Aldrich) was added to the final concentration of 10 mM. A solution of IAA-PROXYL in water (300 µM) with 0.8% DMSO was measured as a reference. This sample will be further referred to as Reference 1. Another refer- ence sample is prepared as follows: IAA-PROXYL was dissolved in DMSO (20 mg/ml). The solution was then added to the buffer consisting of 0.275 M saccharose, 0.1% n- dodecyl-β-D-maltoside and 5 mM Tris-HCl (pH 7.8) to obtain a spin label concentration of 600 µM. This buffer simulates the one after ultracentrifugation on a sucrose gradient. The spin label solution in buffer is then mixed with an equal volume of 80% glycerol. Such a sample also allows the detection of micellization effects of the unbound spin probe. In the case of deuterated samples the buffer was prepared with deuterated wa- ter. Glycerol d8 (Isotec, purchased by Sigma-Aldrich) was diluted with D2O (Aldrich) to a concentration of 80%. The reference sample contains some DMSO, which is not the case for the protein sample. This sample will be further referred to as Reference 2. The concentration of samples for three-pulse ESEEM measurements was kept at 300 µM, as slight concentration effects were observed in the data. Slightly different concentrations were used for V196r (395 µM) and S52r (263 µM), but these are still assumed to be in the range where concentration effects are smaller than other experi- mental errors. For CW progressive saturation measurements the concentration was also kept fixed at 300 µM. The sample concentration for CW EPR and relaxation measurements Kapitel III 160 3 Ergebnisse was not specifically adjusted. After preparation all samples were in a concentration range between 130 and 400 µM and no significant effects were observed in CW EPR spectra or relaxation data when reproducing experiments for the same mutant at differ- ent concentrations in this range. In echo-detected EPR (ESE) experiments concentra- tion varied from 150 to 300 µM. As the observed effects on line shape are relaxation induced (33) and no effects on relaxation time were detected in this concentration range, we assume that this variation is not a significant source of errors. The sample concentration by W-band measurements was 300 µM. Figure 1: Schematic structure of light harvesting complex IIb (LHCIIb). Each circle with a letter represents an amino acid residue. Circles with numbers show mutation positions where spin labels were attached in this work. Cylinders represent helices and chlorophylls are symbolized by schematic porphyrin formulas. Other pigments and lipids are not shown. The gray oval around the protein represents the micelle as expected from analyzing the crystal structure. (36, 37, 38). The top corresponds to the stromal side and the bottom to the lumenal side of the thy- lakoid membrane. Deuterium exchange experiments 4 ml of the reconstituted purified LHCIIb sample, prepared as described above, in buffer consisting of 0.275 M sucrose, 0.1 % n-dodecyl-β-D-maltoside, 5 mM Tris-HCl (pH 7.8) was concentrated at 3000 g in a 30 kDa Centrikon filter unit at 4°C until the sample volume reached 50 µl. The sample was then diluted to the volume of 250 µl with the same buffer as described above, however this time prepared with deuterated water. After that the sample was again concentrated to 50 µl. This procedure was re- peated five times. Concentration was adjusted by dilution with buffer and determined photometrically at 670 nm. The samples were then mixed with glycerol-d8 [80% solution Kapitel III 3 Ergebnisse 161 in D2O (Aldrich)] as a cryoprotectant to a final buffer:glycerol ratio of 1:1 (v/v). The CD and fluorescence spectra of the samples after the deuteration did not show changes compared to the samples that were not deuterated. X- Band CW measurements Experimental CW EPR spectra were measured on a Miniscope 200 spectrometer (Magnettech GmbH, Berlin) with a TE102 rectangular resonator at a temperature of 103 K with liquid nitrogen cooling using a TC HO2 temperature controller (Magnettech). Samples were loaded into 3 mm home made quartz capillaries (50-100 µL volume), shock frozen in liquid nitrogen, and rapidly inserted into the resonator at 103 K. We checked that the typical microwave power of 10 µW applied during these measurements did not lead to saturation broadening. The modulation amplitude was set to 0.2 mT with the width of the central line of nitroxide spectrum being around 1 mT. The sweep width was 15 mT. Ten scans were averaged with 4096 data points and a scan time of 60 s each. Data analysis The 2Azz values were obtained by fitting the minima and maxima of the nitroxide spec- trum by fifth-order polynomials (48) using the home-written MATLAB (The MathWorks, Natick, MA) based “DynAnalysis” program that is available from the authors on request. The error in these measurements is dominated by determination of these relatively broad extrema. CW progressive power saturation measurements The saturation measurements were performed on Bruker Elexsys EX 580 EPR spec- trometer (Bruker) with a loop gap resonator (JagMar, Krakόv) at X-band frequencies. Samples were inserted into a TPX capillary and subjected to continuous N2 or air flow at 295 K for at least 15 minutes before measurement. Continuous gas flow was upheld during measurements. Samples with [Cr(ox) ]3-3 as a relaxation agent were measured in N2 atmosphere. A Bruker ER4111VT variable temperature unit was used for tempera- ture control at 295 K. The microwave power was increased from 23 dB to 8 dB in 3 dB steps. The modulation amplitude was set to 0.1 mT with the width of the central line of nitroxide spectrum at this temperature being about 0.3 mT in the unsaturated spectra. The sweep width was 7.5 mT with 512 data points. Kapitel III 162 3 Ergebnisse Data analysis The CW spectra were background-corrected using a home-written MATLAB program, by subtracting a first-order polynomial fitted to the first and last 15% of the data points. The intensity of the central nitroxide peak (A) was determined manually with Origin (Microcal Software Inc., Northampton, MA). In saturation measurements the intensity dependence of the central nitroxide peak as a function of microwave power (P) is measured. This data was fitted by a home-written MATLAB program to Eq. 1 (49)  1   A I P P= 1+ 2 ε −1  (1)   P  1  2 The amplitude scaling factor I, the homogeneity coefficient ε and the power P1/2, where the intensity of the nitroxide peak is reduced to half of its unsaturated value, are adjust- able parameters. The saturation power P1/2 is directly proportional to the relaxation rate of the spin label which increases due to collision with paramagnetic species such as O2 or [Cr(ox) ]3-3 . This increase is directly proportional to the collision frequency and thus is a measure for relative spin label accessibility to the paramagnetic quenchers (20). As [Cr(ox) ]3-3 is well soluble in water (50) while oxygen is better soluble in membranes or the hydrophobic core of micelles (51, 52, 53), water or membrane accessibility of the spin label can thus be probed (20). To factor out contributions of other relaxation mechanisms and technical pa- rameters of the spectrometer and resonator a dimensionless accessibility parameter Π(Quencher) is calculated by Eq. 2 (50) P1(Quencher) −P1(N2) Π(Quencher) 2 2 ∆H(DPPH)= ⋅ , (2) ∆H P1(DPPH) 2 where P1/2(DPPH) is the power where the intensity of the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) peak is reduced to the half of its unsaturated value, ∆H(DPPH) the line width of the DPPH line, and ∆H is taken as the average line width of the central line of nitroxide spectrum with and without quencher. Accessibility parameters for O2 were multiplied by 5 as the measurements were performed with air rather than pure oxygen. Kapitel III 3 Ergebnisse 163 Pulse EPR measurements Experimental X-band pulsed EPR measurements were performed on a Elexsys E580 EPR spec- trometer (Bruker) at frequencies of about 9.3 GHz using a Flexline split-ring resonator ER 4118X_MS3 (Bruker). The resonator was overcoupled to Q ~ 100. Temperature was kept at 50 K with liquid helium cooling and was controlled by a CF935 (Oxford In- struments, Witney, Oxon) cryostat with an ITC4 temperature controller (Oxford Instru- ments LTD, Oxford). The waiting time between repetitions was 6 ms. Samples were loaded into 3 mm O.D. capillaries (50-100 µL volume) home- made from Herasil tubing, shock-frozen in liquid nitrogen, and rapidly inserted into the resonator at 50 K. EPR spectra were measured with field-swept echo-detected EPR using a Hahn echo sequence π/2-τ-π-τ-echo (12) and a 15 mT field sweep. The inter- pulse delay time τ was 200 ns and the pulse lengths were 16 ns for the π/2 pulse and 32 ns for the π pulse. Transversal relaxation data were acquired with a Hahn echo sequence π/2-τ-π- τ-echo and applying a [(+x)-(-x)] phase cycle to the π/2 pulse. An initial interpulse delay τ of 200 ns and an increment of 8 ns were used. The integrated echo intensity was measured as a function of this increment with an integration gate of 32 ns length cen- tered at the echo maximum. The pulse lengths were 16 ns for the π/2 pulse and 32 ns for the π pulse. Three-pulse ESEEM measurements were performed with a π/2-τ-π/2-T-π/2-τ- echo pulse sequence with a standard phase cycle (12). The pulse length of the π/2 pulses was 16 ns and the interpulse delay τ = 344 ns, corresponding to a proton blind spot, was kept constant. Suppression of the proton modulations at the blind spot im- proves precision of the fitting of the deuterium modulation. The second interpulse delay T with an initial value of 80 ns was incremented in steps of 8 ns. The integration gate length was 32 ns. Longitudinal relaxation data were acquired with an inversion recovery pulse sequence π-T-π/2-τ-π-τ-echo with a [(+x)-(-x)] phase cycle applied to the π/2 pulse. The delay time T with an initial value of 2000 ns was incremented in steps of 5800 ns and the interpulse delay τ = 400 ns was kept constant. The pulse lengths were 52 ns for the π/2 pulse, 104 ns for the π pulse of the detection echo subsequence and 24 ns for the inversion pulse. The integration gate length of 104 ns matched the longest pulse in the detection subsequence to maximize signal-to-noise ratio (54). This combination of a hard inversion pulse with soft echo detection is sufficient to eliminate contributions by spectral diffusion at temperatures of 40 K and higher (55). The inversion pulse was tuned by maximizing the negative echo at a delay time T = 1000 ns. Other flip angles Kapitel III 164 3 Ergebnisse and phases were generally adjusted with a π/2-τ-π-τ-echo pulse sequence by changing the amplitude and the phase of the pulse at τ = 400 ns, except for ESE experiments where the signal phase was tuned at τ = 200 ns. W-band pulse EPR measurements were performed on an Elexsys EX 680 EPR spectrometer (Bruker) using W-band EN600-1021H TeraFlex ENDOR resonator (Bruker). The resonator was not overcoupled. All pulse measurements were performed at 50 K with liquid helium cooling by an CF935 (Oxford Instruments, Witney, Oxon) cryostat with an ITC4 temperature controller (Oxford Instruments LTD, Oxford). Samples were loaded with a syringe into 0.87 mm outer diameter and 0.7 mm inner diameter home made quartz capillaries to the height of about 3 mm, and inserted in the resonator at 50 K. Because of a less favorable ratio between excitation bandwidth and spectral width at W band longitudinal relaxation data (T1) were acquired with a saturation re- covery pulse sequence saturation-T-π/2-τ-π-τ-echo and a [(+x)-(-x)] phase cycle ap- plied to the π/2 pulse. The saturation pulse substitutes for the inversion pulse in the inversion recovery pulse sequence. Actually this experiment is less susceptible to spectral diffusion effects than the inversion recovery experiment used at X band. It be- comes possible at W band as the resonator does not need to be overcoupled and the solid-state amplifier can provide much longer saturation pulses than the travelling wave tube amplifier used at X band. The delay time T with an initial value of 22000 ns was incremented in steps of 5800 ns, and the interpulse delay τ = 400 ns was kept con- stant. The pulse lengths were 48 ns for the π/2 pulse and 96 ns for the π pulse for the detection subsequence and 20000 ns for the saturation pulse. The integrator gate width was 96 ns. The saturation pulse was set to the maximum power value. The ex- periment was performed on the field corresponding to the maximum of the nitroxide spectrum. The flip angles and phases for the saturation recovery experiment were ad- justed with a π/2-τ-π-τ-echo pulse sequence by changing the amplitudes and the phases of the pulses at τ = 400 ns. Flip angles could not be adjusted with the same precision as at X-band. As small misadjustments of flip angles cause only slight sensi- tivity losses, but no changes in recovery curves, this does not lead to an additional er- ror in the relaxation times. The waiting time between the repetitions was 15 ms. Data analysis Relaxation curves could not always be fitted by monoexponential decay functions. To compare different relaxation behavior between the mutants we define the relaxation parameters τ1 and τ2 that serve to quantify the decay by a single number. For monoex- ponential fits τ2 was taken directly from the fit. Otherwise it was taken as the time Kapitel III 3 Ergebnisse 165 where echo intensity has decayed to 1/e of its initial value, which was the case for the two reference samples. To determine this value for non-exponential decay curves, we fitted transversal relaxation curves by a biexponential decay of the form V(t) = A exp(-t/TA) + B exp(-t/TB) , (3) and longitudinal relaxation decays by the corresponding form -2*V(t)+C. The relaxation parameter τ1 or τ2 is then obtained as the time where V(t) has decayed from its initial value A+B to (A+B)/e. This time is determined numerically from the four parameters A, B, TA, and TB by a home-written Matlab program, as the equation cannot be solved analytically. Compared to directly extracting the 1/e time from the experimental trace, this method has the advantage that it averages noise and depends less on the effi- ciency of echo inversion (55). Even if non-exponential decays are nicely fitted by Eq. (3) the relaxation behav- ior cannot necessarily be interpreted in terms of two distinct contributions. Computation of the relaxation time distribution from a sum of exponential decays is an ill-posed prob- lem where apparently bimodal distributions may fit data due to a broad monomodal distribution rather well. Therefore we refrain from interpreting the contributions of the two components in physical terms. A distribution of relaxation times is indeed expected in glassy samples, where local environments of the spin probes vary. Note that transversal relaxation parameters relate to twice the interpulse delay τ. Decay curves acquired by Hahn echo experiments were fitted over the maxima of the proton or deuterium modulation as described in (30) to minimize the influence from destructive interference of nuclear modulations. ESEEM data were analyzed with a home-written MATLAB program. Phase, frequency and intensity of the deuterium modulation were determined from the spec- trum that was obtained by fitting a 11th order polynomial background function to the primary data, subtracting this background function and dividing the difference by the background function, applying a Hamming window, zero-filling the data to four times the original length of the data set, Fourier transformation and computation of the mag- nitude spectrum. By virtue of the division step that corresponds to a deconvolution, modulation depth information is preserved in the spectrum. Alternatively, modulation depth was determined by deconvolution and baseline correction of the primary data as above and fitting an oscillation with Gaussian decay envelope and fixed frequency as well as variable amplitude, phase and Gaussian width to the time domain data (see Results section). As a third alternative, primary time-domain data were analyzed in terms of the number and distance of closest approach of the deuterium nuclei using the spherical shell model (21) as implemented in a home-written MATLAB program (56). All programs for data analysis are available upon request. Kapitel III 166 3 Ergebnisse RESULTS Maximum extrema splitting 2Azz in CW spectra at low temperature The maximum extrema splitting 2Azz in the solid state corresponds to twice the hyper- fine coupling constant along the lobes of the pπ orbital on the 14N nucleus of the nitrox- ide. Localization of the unpaired electron in this orbital corresponds to a charge- separated state, while localization in the pπ orbital on oxygen corresponds to a neutral state. Hence spin density in the 14N orbital and thus Azz increase with polarity of the environment (17, 18, 19). In addition hydrogen bonding of solvent molecules influences the spin density distribution, so that Azz depends not only on polarity but also on protic- ity of the solvent. Hence Azz values can provide information about relative water acces- sibility of spin labels in membranes (57, 19, 24, 23) and polarity of the spin label envi- ronment in proteins (17). Here we use Azz directly as an accessibility parameter. To a first approximation changes in Azz between different environments are dominated by the contribution from water and in this regime, Azz scales roughly linearly with water concentration. Accordingly, proton donor profiles expected in membranes were found to be similar to profiles of the isotropic hyperfine coupling a0 whose dependence on polarity and hydrogen bonding is the same as the one of Azz (19). The dependence of Azz on the mutation position in LHCIIb is shown in Figure 2. As no difference in Azz values between deuterated and non-deuterated samples was observed, the average from both measurements was taken, except for mutants S160r and V196r, where only one measurement was performed. The estimated errors are shown in the plot. The maximum error for IAA-PROXYL in different solvents was esti- mated to be 0.05 mT. The Reference 2 sample corresponds to the case of full water accessibility and does indeed exhibit the maximum Azz value. Among the protein sam- ples the mutants S3r, S52r and S59r form a group with large Azz, V90r and S123r a group with intermediate Azz, and S160r and V196r a group with low Azz. Kapitel III 3 Ergebnisse 167 Figure 2: Azz values as a function of spin label environment. Data from reference measure- ments on the free spin probe IAA-PROXYL in various solvents are shown as horizontal lines. A semiquantitative estimate of the polarity of the spin label environment for the different residues in LHCIIb can be obtained by comparison to Azz of IAA-PROXYL in solvents with different polarity. The data for several solvents are shown in Figure 2 as horizontal lines. Although micelles are present in the reference sample, the nitroxide has an environment comparable to the one in a water/glycerol mixture without deter- gents (dielectric constant ε = 64 at 25 °C). Mutants S3r, S52r, and S59r have environ- ments less polar than this mixture but more polar than methanol (ε = 32.6 at 25 °C), V90r and S123r have an environment with a polarity comparable to the one of metha- nol, and mutants S160r and V196r have an environment with a polarity similar to the one of isopropanol (ε = 18 at 25 °C). The range of Azz values observed on detergent- solubilized LHCIIb labeled with IAA-PROXYL (3.45-3.65 mT) is similar to the one found for membrane-solubilized bacteriorhodopsin labeled with 1-oxyl-2,2,5,5- tetramethylpyroroline-3-methyl)methanethiosulfonate (3.50-3.675 mT) (17) but differs significantly from the one observed with DOXYL-labeled lipids in lipid bilayers (3.20- 3.50 mT) (19). Because of the different structure of the DOXYL moiety compared to the PROXYL moiety 2Azz values should not be compared between these two families of spin labels. The correlation of the polarity dependence of isotropic hyperfine couplings for different spin labels has been addressed in a recent study (58). We also checked whether the EPR lineshapes at 295 K, which are dominated by effects of label mobility, correlate with water accessibility. We observe intermediate mobility with rotational correlation times in the nanosecond range (1-10 ns) for most Kapitel III 168 3 Ergebnisse mutants, except for S123r and S160r, which exhibit slower motion (data not shown). No correlation between mobility and water accessibility was found. CW progressive saturation measurements. The dependence of the intensity of the central nitroxide peak on microwave power is generally well fitted by Eq. 1 both in the absence and presence of relaxation agents. Typical data are shown in Figure 3 for mutant S52r whose environment is highly polar according to the Azz value and mutant V196r whose environment is only weakly polar. Although differences in the curves can be discerned they are less impressive than the clear differences in Azz. Figure 3: Peak-to-peak amplitude of the central nitroxide line as a function of microwave power for progressive saturation measurements at 295 K on LHCIIb mutants (a) S52r and (b) V196r. ● N2, ▼ N2/[Cr(ox)3]3-, ■ 20% O2 (air). Solid lines are fits by Eq. 1. Kapitel III 3 Ergebnisse 169 Variation of the water accessibility parameter Π(CrOx) computed by Eq. 2 for [Cr(ox) ]3-3 as a relaxation agent is rather small among all the mutants, except for mutant S3r, which exhibits [Cr(ox)3]3- accessibility similar to the one of unbound spin label in the buffer (Figure 4). The negative value for [Cr(ox)3]3- accessibility of the V196r mutant is due to experimental errors in determination of P1/2 and is interpreted as non- accessibility to [Cr(ox) 3-3] . Variation of the oxygen accessibility parameter is generally small although sig- nificantly larger than the experimental error. Mutants S123r, S160r and V196r exhibit enhanced oxygen accessibility correlated with very low [Cr(ox)3]3- accessibility. Such behavior is usually interpreted as an exposure to a lipid environment, or, in our case, a location in the core of the micelle exposed to detergent alkyl chains. Figure 4: Accessibility parameters Π(CrOx) (dark gray bars) and Π(O2) (light gray bars) deter- mined by CW progressive saturation measurements at 295 K for different mutation positions in LHCIIb. The originally determined oxygen accessibility parameter was multiplied by a factor of five, as measurements were performed in air with only 20% oxygen. The relative error of these measurements was estimated to be 1% for [Cr(ox) ]3-3 accessibility and 5% for oxygen accessibility. The main error is assumed here to stem from the error of quencher concentration. A systematic bias may be introduced by the bulkiness of [Cr(ox) ]3-3 , which is much larger than a water molecule, and by its nominal charge of -3e, which can lead to repulsion by negatively charged detergent or lipid headgroups. This bias cannot be quantified as a relative error. Kapitel III 170 3 Ergebnisse ESEEM Differences in water accessibility between different mutants are clearly seen in primary three-pulse ESEEM data. Typical data sets are shown in Figure 5a-c. In most of our measurements modulation depths larger than 10% were observed, which makes the use of linearized analytical expressions for data analysis somewhat precarious (59). Therefore our main data analysis method is based on modulation depth. Nevertheless, fits by the spherical shell model (21) were also performed and are compared to modu- lation depths. Figure 5: Three-pulse ESEEM time-domain data (a-c) and spectra (d) of (a) the Reference 2 sample (dashed line in (d)), (b) mutant S52r (dash-dot line), and (c) mutant V196r (solid line). Kapitel III 3 Ergebnisse 171 In previous work ESEEM-based water accessibility parameters were defined in different ways. In a simple definition the intensity of the deuterium ESEEM peak is normalized to the intensity of the proton peak (23). However, this definition depends on the assumption that the local concentration of non-water protons in contact with the spin label is invariable. This assumption may not apply to membrane proteins. Due to suppression effects for protons it also depends rather strongly on the choice of the first interpulse delay τ in the three-pulse ESEEM sequence. A more robust definition is based on the modulation depth K, defined as the peak-to-peak amplitude between the first maximum and first minimum of the deuterium modulation (27). This parameter is a direct measure for the distance and concentration of deuterium nuclei. However, the definition by a visual fit that involves averaging of proton modulations leads to de- creased precision. Furthermore modulation depth also depends strongly on the choice of τ. The deuterium modulation depth k can be determined precisely in the following way. The primary ESEEM data are corrected for the unmodulated part by fitting a poly- nomial function B(t) (12), subtracting B(t) from the primary data, and dividing the differ- ence by B(t) to obtain a deconvoluted and normalized nuclear modulation function N(t). Fourier transformation of N(t) provides the complex ESEEM spectrum and computation of the absolute value the magnitude spectrum. Typical magnitude ESEEM spectra are shown in Figure 5d. Due to proper normalization the amplitude I(νD) of the peak at the deuterium frequency νD in these spectra is proportional to the modulation depth, as previously noted in Baute and Goldfarb (60). The proportionality constant may depend on implementation of the Fourier transform algorithm and on the number of data points. For that reason I(νD) is unlikely to be comparable between studies performed in different labs. From the real and imaginary peak intensities in the complex spectrum, Re(νD) and Im(νD), the phase φ of the deuterium modulation can be estimated as φ=atan[Im(νD)/ Re(νD)]. A damped har- monic oscillation D(t ) = k 2 2D cos(2πν DT +φ )exp(−T /τ 0 ), (4) is then least-square fitted to N(t) by varying deuterium modulation depth kD, damping constant τ0 and phase φ while keeping νD fixed. The Gaussian damping function was found to provide good fits of the decay of the oscillation for all our samples. The modu- lation depth kD is directly related to the primary data and is thus independent of the choice of computational algorithm. It is related to an orientation average 〈k〉 of the modulation depth k in the theoretical description of three-pulse ESEEM (12). Kapitel III 172 3 Ergebnisse The relation is given by k kD = [1− cos(2πν τ )], (5) 2 D where time τ in the second factor on the right-hand side (suppression factor) is the de- lay between the first two pulses. To the modulation depth parameter as defined in (27) kD is related through kD ≈ K/2. The suppression factor 1-cos(2πνDτ) can range between 0 and 2. To minimize the influence of proton modulations on the fit of the deuterium modulation, we performed our measurements at τ = 344 ns, which corresponds to the j = 5 blind spot of proton modulation (νH τ = 5, where νH is the proton Larmor frequency). Compared to the choice of τ = 204 ns in (25), which corresponds to the j = 3 proton blind spot, this value leads to stronger suppression of the broad wings due to hydro- gen-bonded deuterons and thus to more stable fits of the modulation that stems exclu- sively from non-hydrogen-bonded deuterons. For τ = 344 ns the suppression factor has a value of 1.21, for τ = 204 ns it has a value of 1.89, and for the j = 4 blind spot at τ = 272 ns it has a value of 1.92. According to ESEEM theory k depends on the number n and distances ri of nu- clei coupled to the electron spin. By fitting with fixed frequency νD, only deuterium nu- clei contribute to kD. Neglecting effects of the small deuterium quadrupole coupling on modulation depth and assuming sufficiently long distances the contribution of each individual deuteron is proportional to r-6 (21). The modulation depth is thus dominated by deuterons at the distance of closest approach. However, the contribution of directly hydrogen-bonded deuterons, which leads to the low-intensity broad wings of the deute- rium peaks in Figure 5d (25, 26), is suppressed in kD, as the Gaussian damping func- tion guards against fitting of fast-decaying components of the modulation. Our fitting procedure thus selects the narrow spectral component whose intensity and corre- sponding modulation depth are proportional to the concentration of D2O molecules that are not hydrogen-bonded to the spin label (25). For these molecules at sufficiently long distances r>3 Å, the modulation depth k at any orientation and thus also its orientation average 〈k〉 scales as ν -2D (12). To obtain a three-pulse ESEEM based water accessibility parameter Π(D2O) that is independent of the choice of interpulse delay τ and the exact static field B0 for the measurement, we define 2 (  Π D2O) 2kD ν= ⋅ D . (6) 1− cos (2πν Dτ )    2 MHz   Kapitel III 3 Ergebnisse 173 By normalization of the deuterium frequency to a standard value of 2 MHz we ensure that at X-band frequencies with τ = 344 ns our accessibility parameter is similar to the parameter K defined in (27). As the phase of the echo and the microwave frequency were checked after every experiment and were found to be stable, the main error in this parameter is as- sumed to result from noise. Differences in relaxation behavior between the different mutants might also introduce small errors, although most of the relaxation effects are corrected for by the deconvolution. As a rather good signal-to-noise ratio can be ob- tained the error for these measurements is estimated to be as small as 5 %. The modulation depth is influenced by the number of nuclei and their distance of closest approach. These influences can be separated by fitting the whole modulation by the spherical shell model, since the damping of the modulation, quantified by our empirical parameter τ0, depends on the distance, but not on the number of nuclei (21). Such an analysis provides a distance of closest approach 0.35 nm for all LHCIIb mu- tants, corresponding to van-der-Waals contact of the closest non-hydrogen-bonded water molecules. As this distance does not significantly vary, variations in modulation depth are exclusively due to variations in the average number n of deuterons. This number ranges between about 0.2 for the least accessible sites V90r and V196r and 0.55 for the most accessible site S59r. Even larger values of about 0.8 are found for the reference samples with unbound spin labels. Note that these values may not be unique, as was pointed out in previous work (25), where longer distances of closest approach were assumed. The error in the water accessibility parameter n determined by this analysis method is assumed to be larger than the one in Π(D2O), as only a few deuterium modulations were taken for analysis and only their local minima and maxima are used. The error of this evaluation method is thus assumed to be 10%. The various water accessibilities determined from ESEEM data are presented in Figure 6. Kapitel III 174 3 Ergebnisse Figure 6: Water accessibility parameters obtained by different analysis procedures from deute- rium three-pulse ESEEM data. For each sample are given: Π(D2O) (light gray bars, left vertical scale), the deuterium peak intensity in ESEEM spectra normalized to Reference 1 sample (white bars, arbitrary units), and the average number of deuterium nuclei obtained by a spheri- cal shell model fit (dark gray bars, right vertical scale). As seen in Figure 6 the accessibility parameter Π(D2O), the deuterium peak intensity I, and the average number n of deuterium nuclei correlate very well with each other. Among these parameters Π(D2O) is best suited for comparison of measurements on different proteins and in different laboratories. However, if the technique is applied at the same EPR frequency with the same interpulse delay τ, and data sets with the same number of points are background-corrected and Fourier-transformed by the same pro- grams, Π(D2O) is related to I by Π(D2O) = C x I with a constant factor C. In contrast to Π(CrOx), Π(D2O) for all LHCIIb mutants, including mutant S3r, is significantly smaller than for the reference samples. Unlike with [Cr(ox) ]3-3 the slight water accessibility of the V196r mutant can still be detected. In general, differences in water accessibility between different sites are better visible than with the progressive saturation experiments. Water accessibility of mutant V90r is smaller than might have been expected from the Azz measurement, but the difference does not significantly ex- ceed experimental error. Relaxation measurements Since many stochastical processes can influence relaxation in the solid state and mechanisms are not quantitatively understood for protein samples in glassy frozen so- Kapitel III 3 Ergebnisse 175 lutions, interpretation of relaxation data is not as straightforward as interpretation of CW EPR and ESEEM data. Here we try to understand the effects that govern electron spin relaxation of nitroxide labels in LHCIIb on the basis of empirical relaxation parameters. Such understanding would be useful, as relaxation measurements provide unique in- formation and are technically not as demanding as many other pulse experiments. The 1/e time τ1 for longitudinal relaxation was determined from biexponential fits as described in the Materials and Methods section. The fits are indistinguishable from the data with bare eyes and no particular problems were encountered in this analysis (primary data not shown). No significant differences were observed between samples prepared with normal and deuterated water (Table 1). There might be a slight trend towards shorter τ1 values on deuteration, but the differences do not exceed experimen- tal error. This maximum error for τ1 determination was estimated to be 10%. Table 1: Longitudinal (τ1) and transversal (τ2) effective relaxation times (see text) at different mutation positions in LHCIIb at X-band frequencies of about 9.4 GHz. Mutant τ1/ µs τ2/ ns H2O D2O H2O D2O Reference 1 1331 1350 3200 4030 Reference 2 1352 1337 3408 5063 S3r 1070 1029 2178 3893 S52r 1054 1029 2185 3532 S59r 1140 1181 2369 5174 V90r 1021 978 2140 2525 S123r 1063 1027 2118 2488 S160r 871 871 1924 2468 V196r 862 705 2000 1923 Determination of the effective transversal relaxation time τ2, which coincides with the phase memory time Tm for stretched exponential and monoexponential decays, is more complicated. This is because the maxima of the nuclear modulation have to be fitted in modulated echo decays [see e.g. (30)]. Furthermore for the two protonated reference samples, decays were strongly non-exponential and were not well fitted by biexponen- tial decays (data not shown). Such stretched exponential decays have been observed before for surface-exposed sites in the soluble protein human carbonic anhydrase, while monoexponential decays were typical for buried sites (30). Because of the differ- ent decay function for the reference samples compared to the LHCIIb samples, no conclusions can be drawn from comparison of τ2 values between these two groups. We may not exclude that the effect is due to the presence of DMSO in the reference sam- ples that is required to solubilize the free spin label and might thus be associated with it. In any case, Eq. 7 (vide infra) cannot be assumed to apply to these data, so that local proton concentrations computed for the reference samples cannot be trusted. Kapitel III 176 3 Ergebnisse The error in τ2 for the LHCIIb mutants is estimated to be 40 ns from comparison of data obtained on two independently prepared samples of the same mutant. In contrast to the soluble protein human carbonic anhydrase II, where labels at surface-exposed sites have much longer relaxation times than those at buried sites (32), for detergent-solubilized LHCIIb we find only minor variations of τ2 between differ- ent mutation positions in protonated buffer. However, the change in τ2 on deuteration of the buffer in LHCIIb depends strongly on accessibility of the site (Table 1) as it does in carbonic anhydrase II. This variation arises because transversal relaxation of electron spins in the low temperature limit in protonated samples is predominantly due to fluctuations of the hy- perfine field at the electron imposed by the protons. These fluctuations in turn are in- duced by proton spin diffusion. For deuterons, with an about seven times smaller mag- netic moment, the fluctuations are much smaller. The contribution of this mechanism to the relaxation rate is given by (61, 12)  1  0.37µ (gµ )1/ 2 3 / 2 0 B (gnµn ) [I (I +1)] 1/ 4 ∆τ   = C , (7)  2  4πη where C is the number concentration of nuclear spins that induce this relaxation, I their spin quantum number, gn their nuclear g value, g the electron spin g value, µn the nu- clear and µΒ the Bohr magneton. Eq. 7 suggests that the contribution is about 13 times smaller for deuterons than for protons. This still neglects additional slow-down of spin diffusion for quadrupole nuclei such as deuterium due to quadrupolar broadening of their resonance line. The contribution of deuterons can thus be neglected in the differ- ence of relaxation rates between protonated and deuterated media and a local concen- tration of protons can be computed by equating ∆(1/τ2) in Eq. 7 with the experimentally determined rate difference. Note that this approach implicitly assumes that all exchangeable protons are fixed in space. While libration of protons in hydrogen bonds can be neglected on the relevant length scales, hyperfine field fluctuations due to rotation of methyl groups may be relevant. As long as the methyl groups are protonated in both samples, as is the case in experiments with deuterated water, their contribution to transversal relaxation would be expected to cancel in the difference ∆(1/τ2) and could be neglected. However, if this relaxation mechanism dominates, it may be impossible to extract reliable values for ∆(1/τ2) from the data. This may be the case for our two reference samples, where we observe stretched exponential decays. The difference in relaxation rates between protonated and deuterated samples is sensitive to proton concentration on a different length scale than ESEEM modulation depth. Due to its r-6 dependence the modulation depth is strongly biased towards dis- Kapitel III 3 Ergebnisse 177 tances of closest approach, i.e. to water molecules in van-der-Waals contact with the label. Exactly those protons, as well as the hydrogen-bonded protons, are decoupled from the proton spin bath by their hyperfine splitting. Thus there is no proton spin diffu- sion in direct neighborhood to the electron spin (31, 32, 62). Protons are effective in spin-diffusion induced relaxation if their hyperfine coupling is comparable to or smaller than the proton-proton dipole-dipole linewidth of about 35-100 kHz. The dipolar proton hyperfine coupling falls below 100-300 kHz at distances between about 5 to 7 Å from the electron spin. Thus the technique is most sensitive to the concentration of protons in a distance range between approximately 6 and 20 Å, where protons couple both to the electron spin and to the large spin bath of remote protons. Concentrations of exchangeable protons in this distance range, computed ac- cording to Eq. 7, range between 10 nm-3 for mutant S123r and 30 nm-3 for mutant S3r (Figure 7). These values compare to a proton concentration in pure water of 67 nm-3. For mutant V196r no relaxation suppression by deuteration is found within experimen- tal error. In fact, due to experimental error in determination of τ2 we find an apparent slight decrease of the relaxation time on deuteration for this sample. Figure 7: Local concentration of exchangeable protons according to Eq. 6 for different mutation sites in LHCIIb. Pure water has C(Hexch) = 67 nm-3. Although effective longitudinal relaxation times τ1 do not exhibit significant changes on deuteration of the buffer, they vary significantly among the different sites in LHCIIb Kapitel III 178 3 Ergebnisse (Table 1). In general, relaxation times are longer for sites that are known to be exposed to water (reference samples) or have high water accessibility according to ESEEM. At these low temperatures longitudinal relaxation of nitroxides in a glassy matrix is dominated by modulation of the hyperfine field due to libration motion (63). The pro- longed τ1 for both reference samples and for mutant S59r as well as the shortened τ1 at sites S160r and V196r can then be understood by considering restriction of this libra- tional motion by the environment of the spin labels. In an aqueous environment a stiff cage of ordered water molecules is formed around the spin label due to the hydropho- bic effect. This cage hinders small angle motion of the spin label to a larger extent than an alkyl chain solvation shell in a membrane, liposome, or micelle or neighboring pro- tein side groups. This stronger hindrance of motion in turn is reflected in a longer τ1. This hypothesis is in line with lineshape effects in ESE spectra of the different samples that arise from anisotropy of the transversal relaxation time (33, 34, 35). The relaxation anisotropy can be quantified most easily in terms of an anisot- ropy ratio h1/h2 of spectral intensities at two positions in the spectrum that roughly cor- respond to the orientations in the nitroxide molecular frame along the orbital lobes of the nitrogen pz orbital and perpendicular to it (33). The spectral intensity h1 is measured at the local maximum of the absorption lineshape near the low-field edge while h2 is measured in the local minimum between the low-field edge and the central peak (global maximum). By a study on spin probes in ionomers (63) and a detailed study on a broad range of radicals and glassy matrices (35) transversal relaxation anisotropy for nitrox- ides has been related to reordering of the solvent cage. From ESE spectra of our sam- ples (data not shown) we have determined the anisotropy ratios h1/h2. As is seen in Figure 8 longitudinal relaxation and anisotropy ratio are correlated with each other, which indicates that both parameters are related to stiffness of the solvation cage. Figure 8: Anisotropy ratio h1/h2 for transversal relaxation ob- tained from ESE spectra plotted as a function of effective longi- tudinal relaxation time τ1 for different sites in LHCIIb and two reference samples. Kapitel III 3 Ergebnisse 179 The largest error obtained from ESE spectra analysis is assumed to originate from the selection of the position at which h1 is determined. Comparison of h1/h2 values at different spectral positions provides an error estimate of 2%. The ratio h1/h2 is proportional to the product of the square of the libration ampli- tude and the correlation time of the libration (33). Longitudinal relaxation probes the cage stiffness on a picosecond time scale in the case of a direct relaxation process, or is independent on the time scale of the process in the case of a Raman process. Ac- cording to van-Vleck theory of paramagnetic relaxation (64) this independence on the time scale in the Raman process arises since the energy of the electron spin transition needs to match only the difference of the energies of two quanta of lattice vibrations or modes. The typical energies of these modes at 50 K are so much larger than the Zee- man interaction that this interaction can be neglected in the computation of transition probabilities. Measurements of τ1 at W-band frequencies of about 94 GHz for selected mutation positions showed similar relaxation times as at X-band as can be seen from Table 2. Table 2: Effective longitudinal relaxation time (τ1) for different LHCIIb mutants at W-band fre- quencies of about 94 GHz. Mutant τ1 / µs S3r 993 S160r 800 V196r 716 Such behavior is consistent with a Raman process and inconsistent with a direct proc- ess. As differences between different spin-labeled sites are still observed, we assume that they are related to differences in libration amplitude. DISCUSSION Comparative discussion of the various techniques Different methods were presented and tested on LHCIIb mutants that provide informa- tion on the environment of a spin label in a membrane protein in general and its water accessibility in particular. The simultaneous application of well established CW EPR methods and pulse EPR methods significantly increases the amount of available infor- mation. This is, first, because these methods are based on different physical interac- tions and thus are influenced by different properties of the spin label environment be- sides water accessibility. They are also sensitive to different length scales and to dif- ferent water environment types. Second, one of the CW EPR methods can be applied Kapitel III 180 3 Ergebnisse at ambient temperature, in a sample state that is closer to physiological conditions than a shock-frozen state, while the separation of interactions that is feasible with pulse techniques can provide better quantification of water accessibility. Third, solid-state methods allow for studying the kinetics of structural changes with freeze-quench tech- niques. The easiest way to obtain information on water accessibility is the measurement of the CW EPR spectrum of a shock-frozen sample and extraction of the Azz principle component of the hyperfine tensor that is sensitive to solvent polarity. This technique also features high concentration sensitivity, but has the disadvantage that large changes of the dielectric constant induce only small changes in Azz. Furthermore, this parameter can be extracted only with rather low precision due to line broadening by anisotropic interaction, unresolved hyperfine splittings of protons and heterogeneity of the spin label environment. In addition, Azz may be influenced by contributions to the environment other than the presence of water, as for instance charged amino acid side groups in the vi- cinity. Although characterization of water accessibility by that technique works well in less complex systems, such as membranes or micelles (19, 23, 24, 57), it is thus rather inexact for membrane proteins. If complemented by high-field measurement of the principal g tensor component gxx, the technique can distinguish influences due to hy- drogen bonding and changes in dielectric constant of the environment (17, 18). This makes interpretation more clear cut if not unique. However, additional high-field meas- urements imply an experimental effort that may be higher than with the other methods discussed here and lead to decreased sensitivity at a given protein concentration. However, when other accessibility data is available, sensitivity of Azz to charged amino acids in the vicinity of the label can be turned into an advantage, as poor correlation of Azz with other accessibility parameters can provide a hint for their presence. Progressive saturation measurements with CW irradiation provide information on accessibility of a spin label to paramagnetic molecules, called quenchers. This method can be applied at physiological temperatures in the presence of fluid water, which is not the case for any other method described here. Generally we find that the saturation curves can be fitted nicely by the theoretical expression, Eq. 1, and that scatter of the data points is small. Accessibility parameters obtained from such meas- urements thus have a smaller relative error than the polarity-related change in Azz. Water-soluble quenchers, such as [Cr(ox)3]3-, Ni(II) diethylene diamine diacetic acid (NiEDDA), and Ni(II) bis(acetyl acetonate) (NiAA) (62) are used in progressive saturation measurements to characterize water accessibility, or, more precisely the immersion depth of a labeled site in the membrane or micelle. These quenchers are much larger than water molecules. They are thus most suitable to determine whether a residue is in the bulk aqueous phase outside the membrane or micelle, but not whether a residue is in contact with a single water molecule or only a few water molecules that Kapitel III 3 Ergebnisse 181 access through a channel or cavity in the protein. This enhanced sensitivity for strongly water-exposed residues is most prominent with [Cr(ox) 3-3] due to its negative charge, which in the case of LHCIIb leads to repulsion by negatively charged detergent headgroups. This may be advantageous if the water accessibility parameter from pro- gressive saturation measurements is determined together with other water accessibility parameters that are more sensitive to local water at short length scales. Positively charged headgroups or positively charged amino acid side groups may enhance the frequency of collisions of the [Cr(ox) ]3-3 quencher with the label, which is generally an unwanted effect. If progressive saturation measurements are used exclusively, it may be more appropriate to select a neutral water-soluble quencher such as NiEDDA or NiAA. Among those NiAA is characterized by a lower complex stability so that putative coordination sites in the protein might compete with it for the Ni2+ ion, thus leading to erroneous results. Due to the chelate effect NiEDDA is more stable, but unfortunately EDDA appears not to be commercially available. The complementary information on short-length water accessibility can be ob- tained most precisely by ESEEM measurements. This method directly measures the interaction of spin-labeled amino acids with water molecules by detecting deuterium hyperfine coupling. As there is no effect at all in the absence of deuterium nuclei in the vicinity of a spin label and modulation may exceed 20 % of the total echo signal for water-exposed residues (Figures 5, 6), this technique is very sensitive to changes in water accessibility. This improved sensitivity of ESEEM compared to CW techniques was also reported in (24). If modulation depths are obtained by time-domain fitting, or after calibration-depth-preserving Fourier transformation, they can be determined with high precision. Normalization by the square of the deuterium resonance frequency and correction for the blind-spot behavior of three-pulse ESEEM (Eq. 6) ascertain that the accessibility parameter Π(D2O) can be compared for measurements performed in dif- ferent laboratories. This parameter is sensitive to the presence of deuterium nuclei at van-der-Waals contact distances of about 3.5 Å. Problems in interpretation may arise from the fact that this method does not distinguish between deuterium exchange of protons in water and of exchangeable pro- tons in the protein backbone or nearby amino acid side groups. Whether this affects conclusions depends on the specifics of sample preparation and freezing. If exchange of the water by deuterated water is performed after reconstitution and the sample is shock-frozen immediately after preparation, exposed amide backbone and amine pro- tons on the surface may exchange on a time scale of milliseconds to about 100 sec- onds (66), while such protons in buried residues may be protected against deuterium exchange even on time scales of hundreds of minutes (67). In general, exchange of protons is expected to correlate to water accessibility on the time scale of sample preparation. Deuterium exchange before reconstitution should be avoided, as it might Kapitel III 182 3 Ergebnisse lead to significant background modulation from exchanged backbone amide or side- group amine protons. The ESEEM accessibility parameter may also be influenced by contributions from deuterated glycerol. This contribution could be diminished, but not completely excluded, by using glycerol-d3 instead of glycerol-d8. Glycerol may penetrate somewhat more deeply into the membrane than water and may thus lead to a background signal. Quantification of water accessibility at somewhat longer distances than with ESEEM can be obtained from measurements of transversal relaxation rate enhance- ment by protons. Feasibility of this technique for a large membrane protein is demon- strated here for the first time. Quantitative analysis of the difference in the transversal relaxation rate 1/τ2 between non-deuterated and deuterated samples allows for esti- mating the concentration of exchangeable protons at length scales between about 6 and 20 Å. Relative errors may be somewhat larger than for the ESEEM-based accessi- bility parameter Π(D2O) but compare favorably with measurements of changes in Azz. In principle, the same cautionary remarks on exchangeable backbone and side group protons as in the case of ESEEM apply also to transversal relaxation enhance- ment. However, while an exchangeable proton can be accidentally in contact with a spin label, the concentration of such protons in a protein is much smaller than in water. Transversal relaxation rates are thus expected to be less affected by this problem. This is borne out by the fact that no enhancement is detected at position V196r in LHCIIb, while significant deuterium modulation is observed in ESEEM (Figure 6, Table 1, Fig- ure 7). Based on a theoretical expression for protons that are homogeneously distrib- uted in space, according to Eq. 6, quantitative estimates can be derived for proton con- centration near the label. For the most accessible residue in LHCIIb, mutant S3r, we find a value of 30 nm-3 that is about half as large as proton concentration in pure water (67 nm-3). This value is reasonable, although a somewhat larger value might have been expected for the N-terminal domain if it would reside entirely in an aqueous environ- ment. Poorly water-accessible residues have values between 10 and 15 nm-3, while for a non-accessible residue the error bar includes zero concentration. This quantification assumes that exchangeable protons dominate transversal relaxation at low tempera- tures. It failed for reference samples in a solvent that contained a small amount of DMSO. The simultaneous use of ESEEM and transversal relaxation enhancement may be particularly important for localization of residues that are near the membrane water interface, as these positions should be solvent inaccessible on a short length scale, but accessible on long length scales. This effect can however be weakened by the ability of water to penetrate to some extent into the alkyl chain region of lipid bilayers and mi- celles. Kapitel III 3 Ergebnisse 183 The expected effects of the environment on longitudinal relaxation are hard to quantify, but the trends can be understood based on studies of orientational motion of spin labels in non-crystalline media (34, 63, 68). This technique detects effects on spin label libration caused by local rigidity of the environment. These effects appear to be strongly correlated to the formation of a rigid solvation cage for water-exposed spin labels. Line shape analysis of ESE-detected EPR spectra, which is also sensitive to libration, supports this interpretation. The changes in ESE-detected EPR spectra could also derive from collective motion of the solvent matrix (35). Such an interpretation would be consistent with our results and picture of spin label environment, as this type of motion would also be restricted for a stiff, hydrogen-bonded solvation cage. Both techniques thus appear to probe formation of a complete solvent cage, as it is possible only for residues strongly exposed to water. They might be useful for detecting water- filled cavities in a protein near a spin label. If such correlation of τ1 with water accessi- bility is confirmed for other membrane proteins, this technique may even be used as a stand-alone method. The drawback of both techniques is that the error of the meas- urements is relatively large compared to the accessibility-related changes. As a consequence of the domination of longitudinal relaxation rates by solvation effects, relaxation measurements in the solid state cannot differentiate between resi- dues in helix and loop regions. As seen in Figure 8, longitudinal relaxation is slower for the supposedly very mobile backbone near the N-terminus (mutant S3r) than for the supposedly rigid backbone in a helix (mutant V196r). Accessibility parameters and structure of LHCIIb Further insight into the specifics of each method can be obtained by comparing the respective accessibility parameters and discussing their correlation in terms of the structure of LHCIIb. Such a discussion also provides information on the structure of LHCIIb monomers reconstituted into detergent micelles as compared to trimeric, crys- talline LHCIIb. As a reference parameter for the detection of correlations, we use the three-pulse ESEEM accessibility parameter Π(D2O), which is assumed to give the most direct water accessibility information. To relate our results to the crystal structure (38), we also compare them with a theoretical accessibility parameter determined with the Swiss-Pdb Viewer (69). All correlation plots are shown in Figure 9. Kapitel III 184 3 Ergebnisse Figure 9: Correlation of various water accessibility parameters with the three-pulse ESEEM accessibility parameter Π(D2O). A) Maximum hyperfine splitting Azz, B) progressive saturation accessibility parameter Π(CrOx), C) local proton density C(H) from transversal relaxation rate change on deuteration, D) Effective longitudinal relaxation time τ1, E) intensity ratio h1/h2 in ESE-detected EPR spectra, F) surface accessibility predicted by Swiss-Pdb Viewer (69) from the crystal structure (38) for an isolated monomer (filled squares) and within a trimer (open cir- cles). Dashed lines are linear regressions of the data. In C) proportionality of C(H) to Π(CrOx) was assumed in regression analysis. If error bars are not shown, error is assumed to be within the size of data markers. No error range is given for surface accessibility predicted by Swiss- Pdb Viewer is assumed. The accessibility parameters Azz, C(H), τ1, and h1/h2 are all correlated with Π(D2O). The correlation coefficients are 0.97 for Azz, 0.92 for τ1 and -0.91 for h1/h2 (Figure 9A, 9D, 9E). For C(H) such correlation is observed only among the LHCIIb samples (Figure Kapitel III 3 Ergebnisse 185 9C). For the reference samples this analysis fails, as was explained above. If data for the reference samples are left out, the correlation coefficient is R = 0.90. For the other three cases the reference samples correlate as well as the LHCIIb samples and are included in the fits. Such correlation analysis presupposes that the relationship be- tween two accessibility parameters is linear. This is strictly expected only for the rela- tionship between C(H) and Π(D2O), as these two parameters depend linearly on proton concentration at different length scales. Even in that case linear correlation is expected only in the absence of distance dependent heterogeneity of the proton distribution. We find that for LHCIIb C(H) is proportional to Π(D2O), except for mutant V196r and per- haps mutants S160r and S123r (Figure 9C). In the former case the deviation is signifi- cant and corresponds to a situation where the density of exchangeable protons is higher in the immediate vicinity of the label (van-der-Waals contact) than at somewhat longer distances of 6 to 20 Å. As described previously this may be caused by the ex- change of protein protons by deuterium. The reason for the deviation of the S160r mu- tant from the linear behavior can be explained by its interfacial position between the core of the micelle and water. From an analysis of polarity of the neighboring amino acids it is not possible to say whether this loop region should reside in water or in the membrane. The measurements thus suggest that it is situated in an intermediate posi- tion. This observation indicates that combination of ESEEM measurements with meas- urements of the transversal relaxation rate can be used to identify residues near the interface of the lipid bilayer or micelle. In the other cases a linear relationship cannot be predicted from theory. Yet we find that Azz (Figure 9A), τ1 (Figure 9D) and h1/h2 (Figure 9E) scale linearly with Π(D2O) within experimental error. Quality of the correlation suggests that the dependence of Azz on mutation position is dominated by water accessibility. It remains to be seen whether this also applies to membrane proteins reconstituted into liposomes or lipid bilayers. Linear correlation of both h1/h2 and τ1 with Π(D2O) is most easily explained by assuming that the square of the libration amplitude of the spin label decreases linearly with local water concentration. However, our experimental error is too large to actually prove this relationship. Interestingly, correlation of Π(CrOx) with Π(D2O) is poor (Figure 9B). In agree- ment with expectations reference sample 2 exhibits a high [Cr(ox) 3-3] accessibility. High accessibility is also found for mutant S3r near the N terminus that has one of the high- est accessibilities according to all the other methods. However, in strong contrast to the high water accessibility implied by the deuterium modulation depth in ESEEM, the Azz value, transversal relaxation enhancement, slowdown of longitudinal relaxation and the h1/h2 ratio, mutant S59r appears to be only weakly accessible to [Cr(ox)3]3-. Similar be- havior is observed for mutant S52r. Both mutants have only intermediate oxygen ac- cessibility (Figure 4), which would identify them as protein-buried if only the results Kapitel III 186 3 Ergebnisse from progressive saturation measurements were available. Analysis of all the other water accessibility parameters suggests that the residues are in the micelle interface and are at least partially exposed to water. Most likely, [Cr(ox)3]3- accessibility is low- ered due to electrostatic repulsion of charged detergent headgroups or due to the bulkiness of the neutral maltoside detergent headgroups. Which of the two scenarios is the case could be decided by repeating accessibility measurements with a neutral wa- ter-soluble quencher such as NiEDDA. A further possible explanation would be a change of protein conformation during shock-freezing. However, label-to-label distances of spin-labeled double mutants measured under the same conditions correlate quite nicely with simulated distance distributions based on the x-ray structure (A. Volkov, C. Dockter, Ye. Polyhach, G. Jeschke, H. Paulsen, to be published), which makes this explanation rather unlikely. For the relaxation-based parameters an influence of dissolved oxygen might be ex- pected from observations described in (24). However, we explicitly tested for effects of sample degassing on ESEEM and relaxation measurements on both deuterated and non-deuterated samples and did not find significant changes. Degassed samples were prepared for the Reference 2 sample and the S106r mutant. The results for these sam- ples suggest that the labels are solvent accessible in both of them and that an effect of the dissolved oxygen in water on relaxation rates can be safely excluded. The comparison of the τ2 relaxation times between the deuterated and non- deuterated mutants suggests that proton spin diffusion dominates transversal relaxation at 50 K also for sites in the interior of the micelles and that oxygen dissolved in the mi- celle does not have a strong effect. We may not safely exclude the possibility that such oxygen may be the reason for the decreased τ1 relaxation time for the micelle-buried residues. This is however rather unlikely, as the main mechanism for relaxation en- hancement by oxygen in liquid solution depends on diffusional collisions with the spin label. This mechanism is not available in the solid state. Relaxation enhancement by a fast relaxing paramagnetic species (oxygen) in the solid state due to dipole-dipole in- teraction with the observed slowly relaxing species (nitroxide) is relevant for transversal relaxation only in a relatively narrow temperature range (70). For longitudinal relaxation such effects may be relevant in a broader temperature range, but their magnitude de- pends strongly on a matching between the longitudinal relaxation rate of the fast relax- ing species and the Larmor frequency of the slowly relaxing species. As effective longi- tudinal relaxation times τ1 are very similar at two resonance frequencies that differ by an order of magnitude (see Tables 1 and 2), a significant effect of the membrane- dissolved oxygen on τ1 in the solid state is rather unlikely. As we did not observe oxygen-related relaxation enhancement at a temperature of 50 K for some of the mutants and do not expect this effect for the other mutants, all measurements were performed without degassing. This makes the experiments much easier to perform, as the preparations tended to foam strongly during this procedure. Kapitel III 3 Ergebnisse 187 Theoretical accessibility parameters based on the x-ray structure of the LHCIIb trimer (38), considering either only one LHCIIb molecule or all three molecules in the trimer, do not correlate with the ESEEM accessibility parameter Π(D2O) (Figure 9F). In fact, this is expected as Swiss-Pdb Viewer and similar programs predict surface acces- sibility of residues, which for membrane proteins is a sum of lipid and water accessibil- ity. But predictive power of the approach remains poor even if this is taken into ac- count. Mutants V196r and S52r are suggested to be buried sites in the trimer. While this is in agreement with all the water accessibility parameters for V196r measured in this work, it contradicts the high oxygen accessibility of this residue (Figure 4). This apparent contradiction can be traced back to the facts that our measurements are per- formed on LHCIIb monomers and that this residue is situated in the interface between LHCIIb molecules in the trimer, as is apparent from the predicted accessibility of this residue being different in monomers and trimers. All our data combined thus suggest that V196r in our samples is exposed to alkyl chains in the micelle interior. For mutant S52r we find moderate oxygen accessibility and water accessibility similar to the one of mutant S3r, where the residue is clearly water-exposed. This is in stark contradiction to predictions for both, the LHCIIb trimer and the monomer cut out of the trimer. Barring a conformational difference between LHCIIb in crystals and in the detergent micelle, this difference could be explained by the fact that the spin-labeled side groups are larger than the native side groups and may thus protrude more strongly from the protein surface. Furthermore for the labels different rotamers may be preferred than for the native side groups. For these reasons, accessibility modeling should ex- plicitly account for the label and should include a prediction of its conformational distri- bution. However, preliminary simulations based on a rotamer library approach (71) suggest that the few allowed conformers of mutant S52r are also buried (A. Volkov, C. Dockter, Ye. Polyhach, G. Jeschke, H. Paulsen, to be published). Thus, it is likely that the conformation of the N-terminal domain in LHCIIb monomers reconstituted into de- tergent micelles is different from the one in trimers in LHCIIb crystals, as has already been suggested earlier (14). The opposite difference between theoretically predicted surface accessibility and experimentally observed water accessibilities is found for mutants V90r, S123r, and S160r. According to all experimentally determined parameters accessibilities are low or at best moderate for these sites, but according to predictions they are very high. In all three cases oxygen accessibility is rather high (Figure 4), indicating that these residues are lipid-accessible. This is indeed consistent with the x-ray structure, al- though this structure would also allow for positioning all three residues in the lipid head group layer. Interestingly, mutant S59r near the stromal end of helix A is both predicted and found to be highly water accessible. A closer look at the amino acid sequence shows that most of the amino acids in the direct neighborhood of this site are polar. Our data Kapitel III 188 3 Ergebnisse suggest that, in detergent micelles, the site is water exposed. A larger protrusion length from the membrane on the stromal side was also deduced from the crystal structure (38). Thus our data support previous results that suggest that membrane proteins re- constituted into detergent micelles behave similarly to membrane proteins in lipid bilay- ers (72). For mutant S3r accessibility cannot be predicted, as this residue is situated in the part of the N-terminal domain that is not resolved in crystal structures. This domain is known to be important for the response of the photosynthesis apparatus to changes in light conditions (40). Our results on water accessibility suggest that at least in the monomeric state this residue is not immersed in the micelle (or membrane), but is highly solvent accessible up to the distances of 2 nm. This observation confirms and extends previously obtained information about the N-terminal domain (14, 73). Accessibility for mutant S106r was also tested, but was not as well reproducible as for all the other mutants. For this site high or low solvent accessibilities were ob- tained in analogous measurements on samples prepared in the same way (data not shown). These accessibility changes were found to be correlated with slight changes in CD spectra. This poor reproducibility might be connected to the marginal stability of a short helix near this site. To a lesser extent, we also found variations in accessibility between different preparations of mutant V90r, which is close to the flexible domain that contains the short helix with marginal stability. More detailed investigations are required in order to understand how each of the two states can be prepared in a con- trolled way. CONCLUSION Several EPR parameters that provide complementary information on water accessibility of a spin label in a membrane protein were determined on the different sites in major plant light harvesting complex LHCIIb and compared with each other. Detailed insight in the local environment of spin labels was obtained by simulta- neous determination of the polarity-dependent 14N hyperfine splitting Azz, the dynamics sensitive longitudinal relaxation time and intensity ratio h1/h2 in ESE-detected EPR, and the ESEEM water accessibility parameter Π(D2O) that quantifies the average number of water molecules in van-der-Waals contact with the label. A water accessibility pa- rameter characterizing the average density of exchangeable protons at distances be- tween about 6 and 20 Å from the label was computed from the change ∆(1/τ2) of the relaxation rate on exchange of the water protons by deuterium. Among these parame- ters the normalized ESEEM deuterium accessibility parameter Π(D2O) appears to be the one that can be measured with best precision and is most robust with respect to other changes in the environment of the label. Kapitel III 3 Ergebnisse 189 Strong correlations or negative correlations were found between all these pa- rameters. Thus environment polarity and spin label mobility in detergent-solubilized LHCIIb appear to be dominated by water accessibility. In two reference samples con- sisting of free spin labels, transversal relaxation behavior was found to be qualitatively different which hints at a qualitatively different relaxation mechanism in these samples and shows that the relaxation data should be used with care. The parameter Π(CrOx) determined by progressive saturation measurements in the presence of the paramagnetic quencher [Cr(ox) ]3-3 exhibited surprisingly poor cor- relation with the ESEEM water accessibility parameter Π(D2O), probably due to the negative charge of the quencher, but possibly also due to its bulkiness. This suggests that the presented pulse EPR methods are more exact in determining the local acces- sibility to the small water molecule compared to the saturation measurements, which are more suitable for determining the immersion depth in the membrane or micelle. Experimental water accessibility parameters for LHCIIb were compared with theoretical predictions of surface accessibility using the oxygen accessibility parameter Π(O2) as additional information, confirming earlier findings on structural similarity of LHCIIb monomers reconstituted into detergent micelles with LHCIIb trimers in crystals. The unexpectedly high water accessibility of residue S52 in the N-terminal domain suggests that this domain has a different conformation in detergent-solubilized mono- mers than in trimers in LHCIIb crystals. High water accessibility of residue S3 indicates that the first few residues of the N-terminal domain, which are not resolved by x-ray crystallography, are water-exposed in the monomers in detergent micelles. The techniques presented in this work are applicable to any membrane protein that can be spin-labeled, regardless of its size or degree of structural order. For disor- dered domains of a protein or folding intermediates these techniques can thus provide ensemble-averaged water accessibility parameters. An investigation of the kinetics of protein folding during LHCIIb self-assembly by observation of changes in water acces- sibility is now in progress. ACKNOWLEDGMENT We thank Dr. D. Hinderberger for providing the program RANA for analysis of three- pulse ESEEM spectra, Hans Wolfgang Spiess for providing access to a pulsed EPR spectrometer and Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 625, TP B10) for financing this work. Kapitel III 190 3 Ergebnisse REFERENCES (1) Arora, A., L. K. Tamm. 2001. Biophysical approaches to membrane protein structure deter- mination. Curr. Opin. Struct. Biol. 11:540-547. (2) Lacapere, J. J., E. Pebay-Peyroula, J. M. Neumann, C. Etchebest. 2007. Determining mem- brane protein structures: still a challenge! Trends Biochem. Sci. 32:259-270 (3) Tamm, L. K., B. Liang. 2006. NMR of membrane proteins in solution. Prog. Nucl. 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Kapitel III 3 Ergebnisse 195 3.1.1.2 Wasserzugänglichkeit ausgewählter Aminosäuren der N-terminalen Do- mäne im Vergleich zu membranständigen Aminosäuren des monomeren LHCII Der Vergleich mit konventioneller CW-EPR-Technik zeigt das Potential von Puls-EPR- Experimenten zur Bestimmung der Wasserzugänglichkeit spinmarkierter Membranpro- tein-Domänen. Neben einer sehr guten Reproduzierbarkeit zeichnen sich die verschie- denen Puls-Methoden durch den vielfältigen Informationsgehalt bezüglich der Erfas- sung lokaler Unterschiede der Spinmarker-Umgebung im Umkreis verschiedener Ska- lenlängen aus. Unter den vorgestellten Methoden lieferte ESEEM-EPR durch die direk- te Messung der Deuterium-Hyperfeinkopplung zwischen Spinmarker und Lösungsmittel die präzisesten Informationen bezüglich der nahen Spinmarkerumgebung. Zusätzlich zu den publizierten Werten wurde durch A. Müller eine Reihe N- terminaler Mutanten des LHCII konstruiert, deren Wasserzugänglichkeit erst nach Ab- gabe der Diplomarbeit (Müller, 2008) vermessen werden konnten. Die Darstellung der Messergebnisse monomerer Proben (Abb. 3.3.1) soll an dieser Stelle zur Vervollstän- digung des Datensatzes nachgeholt und mit ESEEM-Daten des trimeren LHCII (Abb. 3.3.4) sowie mit kristallographischen Strukturdaten verglichen werden. Zur Verdeutli- chung der Lage der betreffenden Aminosäuren sind in den Abb. 3.3.2 und 3.3.3 jeweils Seitenansichten eines Monomers des trimeren LHCII aus Standfuss et al. (2005) dar- gestellt, membranständige Proteindomänen sind hellgrau hervorgehoben, die Abgren- zungen der Membran als graue Balken. Zudem werden, wie in allen folgenden Struk- turbildern dieses Kapitels, einzelne Aminosäuren-Seitenreste rot im Kalottenmodell gezeigt, die nativen Ser oder Val wurden jeweils durch Tyr ersetzt, da dies der Größe eines PROXYL-markierten Cys am Nächsten kommt (Jeschke et al., 2007). Die in Abb. 3.3.1 gezeigten Zugänglichkeitsparameter des monomeren LHCII entstammen teilweise der Publikation Volkov et al. (2009; Kap. III, 3.1.1.1) (Mutanten 52, 90, 123, 160 und 196), bei den restlichen Proben handelt es sich um unveröffent- lichte Daten der N-terminale Monomere von A. Müller (Mutanten 3, 4, 10, 11, 12, 14, 22, 34 und 59). Kapitel III 196 3 Ergebnisse Abb. 3.3.1: ESEEM-Wasserzugänglichkeitsparamter π(D2O) für verschiedene Aminosäuren des monomeren LHCII in LM-Mizellen. Die gemessen Werte monomerer Mutanten sind rot dar- gestellt, die der wasserzugänglichen Referenz blau (PROXYL-IA in D2O). Wie in Volkov et al. (2009) beschrieben, sind die Positionen 90, 123, 160 und 196 re- kombinanter Monomere in Detergenz-Mizellen wenig zugänglich für das wässrige Lö- sungsmittel. Dies geht aus dem geringen ESEEM-Wasserzugänglichkeitsparameter π(D2O) zwischen 0,067 (Position 196) und 0,128 (Position 123) hervor und steht im Einklang mit den Kristallstrukturdaten nativer LHCII-Trimere (Abb. 3.3.2). Abb. 3.3.2: Peptidrückgrat eines Monomers des trimeren LHCII (PDB-Eintrag 2BHW) in der Sei- tenansicht zur Verdeutlichung der Wasserzugänglichkeit ein- zelner Aminosäuren. Membran- ständige Domänen sind hellgrau dargestellt. Die Grenzflächen der Membran sind schematisch als graue Balken gezeigt (oben stromale Seite, unten lumenale Seite). Einzelne Aminosäuren sind rot im Kalottenmodell dar- gestellt, die jeweiligen Amino- säuren wurden durch Tyr ausge- tauscht (Rotamer mit der höchs- ten Wahrscheinlichkeit). Die Abbildung wurde mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). Kapitel III 3 Ergebnisse 197 Von allen spektroskopisch vermessenen Positionen liegt Aminosäure 196 (Abb. 3.3.2) am tiefsten innerhalb der hydrophoben Membranschicht und sollte den Kristalldaten zufolge keinerlei Kontakt zum Lösungsmittel haben. Die Aminosäuren 90, 123 und 160 sind dagegen alle im Bereich der Grenzfläche aus hydrophober Membran und wässri- gem Lösungsmittel positioniert und können, je nach Ausrichtung des bevorzugten Ro- tamers, mehr oder weniger stark aus der Membranebene herausragen. Dies bestätigt sich für die Lage der einzelnen Aminosäuren des rekombinanten LHCII in Detergenz- Mizellen. Entsprechende ESEEM-Zugänglichkeitsparameter zeigen (Abb. 3.3.1), dass Position 196 praktisch Wasser-unzugänglich ist, von Position 90 über 160 zu 123 steigt die Zugänglichkeit leicht an, liegt aber stets signifikant niedriger als die aller anderen vermessenen Positionen. Im Gegensatz dazu ragt Aminosäure 59 (Abb. 3.3.3 A), welche den Beginn der transmembranen Helix H1 bildet, nach Kristalldaten auf stromaler Seite weit aus der Membranebene heraus. Dies kann ebenfalls für rekombinanten LHCII in Detergenz- Mizellen bestätigt werden. Mit einem ESEEM-Zugänglichkeitsparameter von 0,293 kommt diese Mutante dem Referenzwert von 0,35, gemessen an Spinmarker in wäss- riger Lösung, recht nahe, was somit für einen außerordentlich guten Zugang zum Lö- sungsmittel spricht. Abb. 3.3.3: Struktur des Peptidrückgrates eines Monomers des trimeren LHCII (PDB-Eintrag 2BHW) in der Seitenansicht (oben stromale Seite, unten lumenale Seite) zur Verdeutlichung der Wasserzugänglichkeit einzelner Aminosäuren der N-terminalen Domäne. (A) und (B) zeigen das gleiche Monomer von zwei Seiten. Membranständige Domänen sind hellgrau dargestellt. Die Grenzflächen der Membran sind schematisch als graue Balken gezeigt. Die Abbildung wur- de mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). Die kristallographisch ermittelte Lage der N-terminalen Aminosäuren 59 bis 10 ist in Abb. 3.3.3 in verschiedenen Seitenansichten gezeigt (hier ist nur ein Monomer aus der Kristallstruktur des trimeren LHCII dargestellt). Während in der Kristallstruktur Helix 1 Kapitel III 198 3 Ergebnisse mit Aminosäure 59 weit außerhalb der Membranebene liegt, bildet die Peptidsequenz von Asp 54 bis Glu 31 eine alternierende Schleifenstruktur aus, die zunächst in die Membranebene eintaucht (Asp 54 bis Phe 40) und dann wieder heraussteht (Glu 39 bis Glu 31). Dies bestätigt sich erneut für rekombinanten LHCII. Während die Amino- säure 59 höchst wasserzugänglich ist, sinkt die Wasserzugänglichkeit zu Position 52 deutlich ab und steigt zu Aminosäure 34 wieder stark an (Abb. 3.3.1). Eine ähnlich alternierende Wasserzugänglichkeit wäre nach Kristalldaten für die Aminosäuren 22 bis 10 zu erwarten (Abb. 3.3.3 B). Position 22, innerhalb der Schleife Glu 31 bis Arg 21 liegend, sollte eine geringe Zugänglichkeit besitzen, zu Position 12 sollten die Werte wieder signifikant steigen, danach wieder leicht fallen (Position 11 und 10). Dies scheint sich für rekombinante Monomere, solubilisiert in Detergenz- Mizellen, nicht exakt zu bestätigen (Abb. 3.3.1). Im Vergleich zu Position 34 nimmt in ESEEM-Messungen die Zugänglichkeit der Position 22 zwar ab, aber weniger deutlich als erwartet. Der Anstieg der Werte bis Aminosäure 12 fällt schwächer aus als vorher- gesagt, dafür besitzt Position 11 eine höhere Zugänglichkeit zum Lösungsmittel als erwartet. Im Unterschied zum kristallinen, trimeren LHCII scheint diese N-terminale Schleifenregion in rekombinanten Monomeren also weniger tief in die hydrophobe Grenzschicht einzutauchen. Die in der Kristallstruktur nicht erfassten Aminosäuren 3 und 4 liegen ebenfalls exponiert zum Lösungsmittel, was im Fall der von Müller herge- stellten Probe 3 nochmals die Reproduzierbarkeit der Methode bestätigt (Volkov et al., 2009). 3.1.1.3 Vergleich der N-terminalen Domäne des monomeren und trimeren LHCII mittels ESEEM-EPR Im Gegensatz zu allen kristallographischen Ansätzen zur Strukturerfassung des LHCII ist die Lage der ersten 10 Aminosäuren des trimeren LHCII mittels ESEEM-EPR er- fassbar (Abb. 3.3.4, schwarze Balken). Die einzeln markierten Positionen 3, 4, 7 und 9 besitzen alle eine ähnlich exponierte Lage zum Lösungsmittel, die in Position 4 im Ver- gleich zu monomerem LHCII deutlich geringer ist. Im Unterschied zu den zuvor be- sprochenen ESEEM-Daten des monomeren LHCII, zeigen die Werte rekombinanter Trimere der Positionen 11 bis 34 exakt die in der Kristallstruktur vorhergesagten Lagen zum wässrigen Lösungsmittel (Abb.3.3.3 B sowie Abb. 3.3.4). Hier steigt, wie in der Kristallstruktur vorhergesagt, die Zugänglichkeit von Position 11 zu 12 leicht an, nimmt dann wieder konstant bis Position 22 durch Eintauchen der Schleifenregion in die Mi- zelle ab, um erneut bis Position 34 anzusteigen. Kapitel III 3 Ergebnisse 199 Abb. 3.3.4: ESEEM-Wasserzugänglichkeitsparamter π(D2O) für verschiedene Aminosäuren des monomeren LHCII (rote Balken) und trimeren LHCII (schwarze Balken), jeweils in LM- Mizellen. Die Werte der wasserzugänglichen Referenz (blauer Balken, PROXYL-IA in D2O) entstammen der Publikation Volkov et al. (2009), die Werte aller dargestellten N-terminalen Mutanten wurden in Proben von A. Müller ermittelt. Trimerdaten sind der Diplomarbeit (Müller, 2008) entnommen. Im Vergleich zu rekombinanten Monomeren zeigen die entsprechenden Trimere der Position 59 eine deutliche Verringerung der Wasserzugänglichkeit und widerspre- chen damit auch den Daten der Kristallstruktur. Da eine signifikante Strukturänderung innerhalb einer rigiden Transmembranhelix (H1) nicht zu erwarten ist, soll dieser Son- derfall ausnahmsweise gleich diskutiert werden. Abb. 3.3.5: Struktur des Peptidrückgrates des nativen, trimeren LHCII (PDB-Eintrag 2BHW) in der stromalen Aufsicht zur Ver- deutlichung der Wasserzugänglichkeit der Aminosäure 59. Die einzelnen Monomere des Trimers sind farblich voneinander abge- grenzt, die betreffende Position 59 ist rot im Kalottenmodell dargestellt, das entspre- chende Monomer ist grau. Reste der Amino- säuren des gegenüberliegenden Monomers (lila), die in räumlicher Nähe zur Position 59 liegen sind ebenfalls im Kalottenmodell dar- gestellt (Gly 30 bis Tyr 34, Thr 48 bis Ser 52). Die Abbildung wurde mit Chimera er- stellt (Pettersen et al., 2004). Wahrscheinlicher ist hier die Verringerung der Zugänglichkeit des Spinmarkers 59 (Abb. 3.3.5, rot im grauen Monomer) durch die Anlagerung des gegenüberliegenden Kapitel III 200 3 Ergebnisse Monomers (lila) in trimeren Komplexen. Die Aminosäuren Glycin (Gly) 30 bis Tyr 34 und Thr 48 bis Ser 52 könnten das PROXYL seitlich zumindest teilweise gegen das wässrige Lösungsmittel abschirmen. Für die Positionen 11 und 22, welche ebenfalls deutliche Unterschiede in den ESEEM-Werten von Monomeren und Trimeren aufweisen, hat solch eine Argumentati- on keine Gültigkeit, da beide Positionen nicht in der Grenzfläche der Monomere, son- dern in der Peripherie des Trimers zu liegen kommen, was später im Zusammenhang mit entsprechenden DEER-Daten diskutiert werden soll. Ein Vergleich monomerer Proben mit Trimeren der Positionen 7, 9 und 52 war bisher nicht möglich. Letzterer Mutante fehlt die Fähigkeit Trimere auszubilden (Storf, 2001). Die beiden ersteren Pro- ben werden derzeit durch C. Dietz präpariert. 3.1.2 Detektion der Proteinstruktur mittels DEER-Abstandsmessungen Im Gegensatz zur vorher beschriebenen ESEEM-Spektroskopie, liefert DEER-EPR eher globale Information zur Struktur von Membranproteinen. Die Messung intramole- kularer Abstände zwischen den Nitroxiden eingeführter Spinmarker-Pärchen im Be- reich von 2-8 nm (Pannier et al., 2004; Jeschke et al., 2007) eignet sich zur Erstellung von „Abstandskarten“ und damit sowohl zur Aufklärung unbekannter Proteinstrukturen (Hilger et al., 2007; Jao et al., 2008) als auch zur Erfassung von Proteindynamik (Jeschke et al., 2005; Altenbach et al., 2008). Auf den Ergebnissen von Jeschke et al. (2005) aufbauend, wurden die DEER-Experimente zur Klärung von Struktur und Dy- namik des monomeren und trimeren LHCII in Lösung fortgeführt. Ein Teil der ermittel- ten Abstandsdaten wurde zusätzlich mit theoretischen Abstandsverteilungen einer Ro- tamer Datenbank-basierten Simulation verglichen. In diesem Zusammenhang sei nochmals explizit erwähnt, dass sämtliche in dieser Dissertationsschrift gezeigten theo- retischen Abstandsverteilungen moderat von den in Volkov (2008) dargestellten Daten abweichen. Dies liegt in der zwischenzeitlichen Optimierung des entsprechenden Si- mulationsprogramms begründet, welches genauere Vorhersagen zur wahrscheinlichen Lage von PROXYL-Markern in der Kristallstruktur nach Standfuss et al. (2005) zulässt (Polyhach, unveröffentlichte Ergebnisse). An dieser Stelle soll vorausgreifend erwähnt werden, dass ein Teil der aufgerei- nigten, monomeren LHCII-Proben unerwartet lange DEER-Abstände zeigte, die nicht mit den simulierten Abstandsdaten vereinbar waren. Die Auswertung der primären DEER-Daten durch Prof. Dr. G. Jeschke und Dr. A. Volkov zeigte, dass Signale solcher Proben einen Anteil enthielten, der den Signalen von Trimeren der beiden entspre- chenden Einzelmutanten ähnlich war, wobei dieser Anteil eine deutlich geringere Mo- dulationstiefe aufwies als in Trimerproben. Durch Anwendung einer experimentellen Hintergrundkorrektur konnten solche Nebenmaxima deutlich reduziert werden (Volkov, 2008), die Hauptmaxima wurden dagegen nicht beeinflusst. In dieser Prozedur können die realen Abstände von den Artefaktabständen unterschieden werden, da letztere Kapitel III 3 Ergebnisse 201 auch in einer Mischung von markierten Einzelmutanten existieren, wobei man anneh- men muss, dass der Trimerisierungsgrad der Doppelmutanten-Probe und der Einzel- mutanten-Probe ähnlich ist (kleine Unterschiede kann die Modulationstiefenskalierung ausgleichen). Nach Vermessung beider Proben hat man einmal das gewünschte Sig- nal zusammen mit Artefaktsignal und einmal nur das Artefaktsignal und kann durch Differenzbildung das gewünschte Signal sauber erhalten. Wegen der nicht ganz repro- duzierbaren Probenpräparation ist die Mathematik etwas komplizierter als einfache Subtraktion und auch mit kompensierender Mathematik verschwindet das Artefaktsig- nal nicht vollständig, aber weitgehend (G. Jeschke, schriftliche Mitteilung). Dieses Er- gebnis muss als starker Hinweis auf eine Verunreinigung monomerer Proben mit trime- risiertem LHCII gewertet werden, was später erneut aufgegriffen werden soll. 3.1.2.1 Intramolekulare Abstandsmessungen in kristallographisch erfassten Domänen des monomeren LHCII Eine erste Abstandsmessreihe wurde an doppelt spinmarkierten Monomeren des re- kombinanten LHCII durchgeführt, die markierten Domänen waren hierbei jeweils kristallographisch erfasst. Diese Messungen dienten insbesondere der Verifizierung der Struktur des rekombinanten LHCII durch Vergleich mit den bekannten Abstandsda- ten des kristallinen LHCII (Standfuss et al., 2005), die Zuverlässigkeit der Methode war bereits in früheren Versuchsreihen bestätigt worden (Jeschke et al., 2005). Allgemein kann gesagt werden, dass DEER-Abstandsmessungen aufgereinigter Monomere des rekombinanten LHCII in Datensätzen mit gutem Signal-Rausch-Verhältnis und ausrei- chender Modulationstiefe resultierten, beispielsweise ersichtlich in den Hintergrund- korrigierten Originaldaten in Abb. 3.3.6 (B). Die dargestellten Primärdaten der ver- schiedenen Doppelmutanten waren zudem wie erwartet signifikant unterschiedlich zu- einander. Wie zuvor bereits beschrieben (Kap. I) zeigt Mutante 106/160, welche den Ab- stand zwischen stromaler und lumenaler Schleife definiert (Abb. 3.3.6, 1A), nach Ti- chonov-Regularisierung eine recht breite Abstandsverteilung (schwarze Linie in 1C). Detektierte Interspin-Distanzen liegen vorwiegend zwischen 3,5 und 5,5 nm mit Maxi- ma bei 4,1 und 4,9 nm. Die kürzeren Abstände stimmen sehr gut mit der Cα-Distanz der entsprechenden Aminosäuren des kristallinen Trimers überein (grauer Balken bei 3,9 nm). Längere Abstände dagegen sind nahezu identisch mit einer theoretischen Abstandsverteilung (graue Linie in 1C; Polyhach, unveröffentlicht), welche anhand der Rotamer-Datenbank von PROXYL-Markern, basierend auf der Kristallstruktur nach Standfuss et al. (2005), simuliert wurde. Lange DEER-Abstände repräsentieren hier also Nitroxidmarker, die voneinander weggerichtet sind, was zu einer Verlängerung der Cα-Distanz von bis zu 1,5 nm führt. Kapitel III 202 3 Ergebnisse Abb. 3.3.6: DEER-Abstandsmessungen zwischen kristallographisch erfassten Domänen des LHCII. Doppelt PROXYL-markierte LHCII-Mutanten 106/160 (1), 90/196 (2) und 123/196 (3) wurden mittels Detergenzwechsel-Rekonstitution gefaltet, via UZ aufgereinigt und spektrosko- pisch charakterisiert. Funktionale Monomere in LM-Mizellen wurden abstandsvermessen. (A) zeigt jeweils das Proteinrückgrat eines Monomers des nativen, trimeren LHCII in der Seitenan- sicht (PDB-Eintrag 2BHW). Die Abbildungen wurden mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). (B) zeigt die Hintergrund-korrigierten Original-DEER-Daten (schwarze Linie) mit bestem Fit (rote Linie). In (C) sind DEER-Abstandsverteilungen dargestellt (schwarze Linie), errechnet aus den Original-Daten mittels Tichonov-Regularisierung. Die graue Linie zeigt die errechnete Abstandsverteilung einer Rotamer Datenbank-basierten Simulation, der graue Balken entspricht dem Abstand der Cα–Atome der markierten Aminosäuren in der Kristallstruktur des trimeren LHCII. Doppelmutante 90/196, markiert an den lumenalen Seiten der transmembranen Helices H1 (Abb. 3.3.6, 2A, Position 90) und H4 (Position 196), zeigt eine deutlich schmalere Abstandsverteilung mit einem Maximum bei 3,85 nm (schwarze Linie in 2A). Zudem können zu einem geringen Anteil kurze Abstände unter 3 nm sowie ein Ne- benmaximum mit Abständen um 5 nm detektiert werden. In dieser Mutante weicht der Großteil der gemessenen DEER-Abstände von der Distanz der entsprechenden Cα- Kapitel III 3 Ergebnisse 203 Atome der Kristallstruktur ab (2,85 nm, grauer Balken in 2C). Andererseits besteht eine hohe Übereinstimmung der DEER-Daten zur theoretischen Abstandsverteilung (graue Linie in 2C). In diesen Markierungspositionen scheinen durch die Lage der gebunde- nen Pigmente (Chl 3, 4 und 12 in Position 196) bzw. der umgebenden Aminosäuren- Seitenreste solche PROXYL-Rotamere bevorzugt zu sein, die voneinander weggerich- tet sind. Das Auftreten sehr langer Abstände von 4,5 bis 5,5 nm kann hierdurch nicht erklärt werden, da diese durchschnittlich über 2 nm von der Distanz der entsprechen- den Cα-Atome abweichen. Unterschiedlich zu den vorherigen LHCII-Proben stimmen in Mutante 123/196 die Distanz der Cα-Atome der Kristallstruktur (2,96 nm; grauer Balken in 3C) und die Abstände theoretisch möglicher Rotamere (2,5 bis 4 nm; graue Linie in 3C) gut über- ein. Ermittelte DEER-Abstände (schwarze Linie in 3C) passen sehr gut zu der Vorher- sage und sind mit vorherrschenden Distanzen zwischen 2,7 und 4 nm etwas breiter verteilt als in Mutante 90/196. Wie vorher bei Mutante 90/196 gesehen (2C), ist auch in 123/196 ein zweites Maximum detektierbar. Mit Abständen um 4,9 nm ähnelt es dem Nebenmaximum der Mutante 90/196 und ist nicht mit möglichen Distanzen der PRO- XYL-Rotamere in der Kristallstruktur vereinbar. Während die in Abb. 3.3.6 dargestellten DEER-Abstände mit Ausnahme einiger unerwarteter Nebenmaxima in guter Übereinstimmung zu theoretischen Abstandsver- teilungen sind, weichen DEER-Daten der Mutanten 59/90 sowie 90/123 (Abb. 3.3.7) leicht von der Vorhersage ab. Für Mutante 59/90, an stromaler und lumenaler Seite der transmembranen Helix H1 markiert (1A), liegt die Cα-Distanz der markierten Aminosäu- ren in der Kristallstruktur bei 4,45 nm (grauer Balken in Abb. 3.3.7, 1C). Die Simulation sagt eine theoretische Abstandsverteilung mit einem Maximum bei 5,4 nm vorher (graue Linie in 1C), gemessene DEER-Abstände sind durchschnittlich etwas kürzer und liegen zwischen 4,3 und 5,5 nm (schwarze Linie in 1C). Zudem treten zu geringem Anteil kurze Abstände zwischen 2 und 4 nm auf. Auch in Mutante 90/123 sind Vorhersage und Messergebnis nicht vollständig identisch. Während die Rotamer-Simulation eine recht hohe Bewegungsfreiheit der PROXYL-Marker mit Abständen zwischen 1,5 und 4 nm und einem Maximum bei 2,7 nm vorhersagt (graue Linie in Abb. 3.3.7, 2C), sind DEER-Abstände zwischen 1,8 und 4,5 nm recht breit verteilt, besitzen jedoch ein signifikantes Maximum bei 3,45 nm (schwarze Linie in 2C). Genau wie zuvor bei Mutante 123/196 (Abb. 3.3.6, 3C) tritt bei 90/123 ein Nebenmaximum mit Abständen um 4,9 nm auf, welches nicht mit möglichen PROXYL-Rotameren in der Kristallstruktur vereinbar ist. Kapitel III 204 3 Ergebnisse Abb. 3.3.7: DEER-Abstandsmessungen zwischen kristallographisch aufgelösten Domänen des LHCII. Doppelt PROXYL-markierte LHCII-Mutanten 59/90 (1) und 90/123 (2) wurden mittels Detergenzwechsel-Rekonstitution gefaltet, via UZ aufgereinigt und spektroskopisch charakteri- siert. Funktionale Monomere in LM-Mizellen wurden abstandsvermessen. (A) zeigt jeweils das Proteinrückgrat eines Monomers des nativen, trimeren LHCII in der Seitenansicht (PDB-Eintrag 2BHW). Die Abbildungen wurden mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). (B) zeigt die Hin- tergrund-korrigierten Original-DEER-Daten (schwarze Linie) mit bestem Fit (rote Linie). In (C) sind DEER-Abstandsverteilungen dargestellt (schwarze Linie), errechnet aus den Original- Daten mittels Tichonov-Regularisierung. Die graue Linie zeigt die errechnete Abstandsvertei- lung einer Rotamer Datenbank-basierten Simulation, der graue Balken entspricht dem Abstand der Cα–Atome der markierten Aminosäuren in der Kristallstruktur des trimeren LHCII. 3.1.2.2 Abstandsmessungen in kristallographisch erfassten Domänen des LHCII in Abhängigkeit der Mizellen-Zusammensetzung Neben seiner Funktion als Lichtsammler spielt LHCII eine entscheidende Rolle im Schutz des Photosynthese-Apparates unter Lichtstress-Bedingungen. Verschiedene Versuchsansätze legen nahe, dass bestimmte Bereiche der lumenalen Schleifendo- mäne, welche in Kontakt zum Lösungsmittel des Thylakoidlumens stehen, auf wech- selnde pH-Bedingungen reagieren und dabei einer Strukturveränderung unterliegen. In Verdacht stehen sowohl verschiedene saure Aminosäuren als auch das antiparallele β- Faltblatt der lumenalen Schleife (Liu et al. 2008; Yang et al., 2008). Auffällig an solchen Mutationsexperimenten ist stets eine Veränderung der Position lumenal gebundener Pigmente, erkennbar an einer signifikant veränderten CD-Absorption. Ähnliche CD- spektroskopische Effekte können auch in Abhängigkeit der Mizellen- Zusammensetzung detektiert werden. Insbesondere der Wechsel von LM- zu α-DM Kapitel III 3 Ergebnisse 205 (Georgakopoulou et al., 2007) oder TX-Mizellen (Boggasch, 2006) resultiert in einer deutlichen Änderung der Soret-Absorption rekombinanter Trimere. Auf den Ergebnissen der zuvor durchgeführten DEER-Messungen an LM- solubilisierten Monomeren aufbauend, sollten in dieser Versuchsreihe monomere und trimere Mutanten des rekombinanten LHCII vergleichend in TX-Mizellen vermessen werden (Abb. 3.3.8). Hierzu sei erwähnt, dass bisher lediglich eine relevante Tri- merprobe (Position 123) produziert werden konnte, andere Proben aber in Bearbeitung sind (Trimere 90 und 106, C. Dietz). Abb. 3.3.8: DEER-Abstandsmessungen zwischen kristallographisch aufgelösten Domänen des LHCII in Abhängigkeit der Mizellen-Zusammensetzung. Doppelt PROXYL-markierte LHCII- Mutanten 59/90 (1), 90/196 (2) und 123/196 (3) wurden mittels Detergenzwechsel- Rekonstitution gefaltet, via UZ in LM- oder TX-haltigen Saccharose-Dichte-gradienten aufgerei- nigt und abstandsvermessen. (A) zeigt jeweils das Proteinrückgrat eines Monomers des nati- ven, trimeren LHCII in der Seitenansicht (PDB-Eintrag 2BHW). Die Abbildungen wurden mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). (B) zeigt die Hintergrund-korrigierten Original-DEER- Daten [schwarze Linie (LM), hellblaue Linie (TX)] mit jeweils bestem Fit (rote bzw. blaue Linie). In (C) sind DEER-Abstandsverteilungen dargestellt [schwarze Linie (LM), hellblaue Linie (TX)], errechnet aus den Original-Daten mittels Tichonov-Regularisierung. Die graue Linie zeigt die errechnete Abstandsverteilung einer Rotamer Datenbank-basierten Simulation. Kapitel III 206 3 Ergebnisse Die entsprechenden Hintergrund-korrigierten DEER-Originaldaten (B) und daraus re- sultierende Abstandsverteilungen (C) der LHCII-Proben in unterschiedlichen Deter- genz-Mizellen sind in den Abb. 3.3.8 und 3.3.9 dargestellt. Während bei Mutante 59/90 (Abb. 3.3.8, 1C) die Abstandsverteilungen in LM und TX praktisch identisch sind, zei- gen andere Mutanten leichte bis signifikante Änderungen der DEER-Signale in Abhän- gigkeit der Mizellen-Zusammensetzung. Die Verteilung der DEER-Abstände der Mut- anten 90/196 (Abb. 3.3.8, 2C) und 123/196 (Abb. 3.3.8, 3C) ist in TX-Mizellen jeweils etwas schmaler als zuvor in LM. Wie aus Abb. 3.3.8 ersichtlich ist, sind in beiden Mut- anten kurze Abstände in LM-Mizellen etwas geringer ausgeprägt, insgesamt sind die Abstandsverteilungen in unterschiedlichen Detergentien einander aber recht ähnlich. Etwas deutlicher fallen die Unterschiede in den Mutanten 90/123 (Abb. 3.3.9, 1C) und 90/106 (2C; Präparation Dietz, 2008) aus. Während 90/123 in TX-Mizellen eine signifikant breitere Abstandsverteilungen mit deutlicher Zunahme kurzer und lan- ger Abstände zeigt, tritt bei Mutante 90/106 der umgekehrte Fall ein. Hier ist in TX- Mizellen eine signifikant schmalere Abstandsverteilung zu sehen als in LM. Unabhän- gig von der Mizellen-Zusammensetzung liegen bei dieser Mutante die gemessenen DEER-Abstände innerhalb der theoretisch vorhergesagten Verteilung, zeigen aber je- weils leicht unterschiedliche Maxima. Während die Rotamer-Simulation Spin-Distanzen von vorwiegend 2 bis 3 nm vorhersagt, liegt das Maximum in LM bei 2,6 und in TX bei 2,8 nm. Die signifikantesten Unterschiede werden in den Abstandverteilungen der trime- ren Mutante 123 deutlich (Abb. 3.3.9, 3C). Während die Verteilung der Abstände in LM sehr breit ist, zeigt die TX-Probe die schmalste Abstandsverteilung aller bisher gemes- senen Proben. Obwohl die Unsicherheit in der Breite der Verteilung bei Beobachtung von weniger als einer vollen Oszillation, wie hier der Fall, recht groß ist, wird doch be- reits in den Zeitbereichsdaten ein hoch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Proben sichtbar. Die durchschnittlichen DEER-Abstände beider Proben sind zudem kürzer als die anhand der Kristalldaten simulierten Abstände. Weiterhin ist auffällig, dass beide trimere Proben im Gegenteil zu monomeren Proben keine Nebenmaxima zeigen, und dass die Abstandsdaten der Trimere sehr gut mit den vorher detektierten langen Abständen um 4,9 nm der monomeren Doppelmutanten 90/123 und 123/196 übereinstimmen. Letzterer Punkt soll später im Zusammenhang mit dem Verdacht auf eine Verunreinigung der monomeren Proben mit trimerem LHCII diskutiert werden. Kapitel III 3 Ergebnisse 207 Abb. 3.3.9: DEER-Abstandsmessungen in monomerem und trimerem LHCII in Abhängigkeit der Mizellen-Zusammensetzung. PROXYL-markierte Monomere 90/123 (1), 90/106 (2, Präpara- tion Dietz, 2008 ) sowie Trimere 123 (3; Präparation Dietz, 2008) wurden mittels Deter- genzwechsel-Rekonstitution gefaltet, via UZ in LM- oder TX-haltigen Saccharose- Dichtegradienten aufgereinigt und abstandsvermessen. (A) zeigt jeweils das Proteinrückgrat des monomeren LHCII in der Seitenansicht (1, 2) bzw. des trimeren LHCII in lumenaler Aufsicht (3, PDB-Eintrag 2BHW). Die Abbildungen wurden mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). (B) zeigt die Hintergrund-korrigierten Original-DEER-Daten [schwarze Linie (LM), hellblaue Linie (TX)] mit jeweils bestem Fit (rote bzw. blaue Linie). In (C) sind DEER- Abstandsverteilungen dargestellt [schwarze Linie (LM), hellblaue Linie (TX)], errechnet aus den Original-Daten mittels Tichonov-Regularisierung. Die graue Linie zeigt die errechnete Ab- standsverteilung einer Rotamer Datenbank-basierten Simulation. 3.1.2.3 DEER-spektroskopische Untersuchung der Konformation des N- Terminus in monomerem LHCII Der N-Terminus des trimeren LHCII ist die einzige Domäne, die kristallographisch nicht komplett erfasst werden konnte (Standfuss et al., 2005). DEER-spektroskopische Un- tersuchungen an N-terminalen Mutanten des monomeren und trimeren LHCII durch Jeschke et al. (2005) offenbarten bereits die flexible Struktur dieser Domäne. Um da- Kapitel III 208 3 Ergebnisse malige Ergebnisse zu stützen und die Modellierung der Domäne zu verbessern, wurde durch den Diplomanden A. Müller (2008) ein „Cys-walk“ durch den kompletten N- Terminus durchgeführt, entsprechende spinmarkierte Monomere und Trimere des LHCII wurden abstandsvermessen. Die DEER-spektroskopischen Ergebnisse sollen an dieser Stelle übersichtshalber erneut dargestellt werden. Zudem war geplant, die ermit- telten DEER-Daten mit theoretischen Abstandsverteilungen der Rotamer-Datenbank zu vergleichen. Dies war aus zeitlichen Gründen nicht mehr umsetzbar, soll aber zeitnah nachgeholt und publiziert werden. Es sei außerdem darauf hingewiesen, dass aus Gründen der Konsistenz die Abstände aus Kristalldaten nicht wie in Müller (2008) zwi- schen den Sufhydryl-Schwefelatomen der markierten Aminosäuren gemessen wurden, sondern zwischen den Cα-Atomen. Um die zuvor angedeutete Verunreinigung der mo- nomeren Proben mit LHCII-Trimeren im Nachhinein überprüfen zu können, sind in den folgenden Abbildungen zusätzlich DEER-Abstandsverteilungen entsprechender Tri- merproben als blaue Linien dargestellt. Wie weiter unten diskutiert, werden solche Tri- mer-Messungen auch für die bisher dargestellten Abstandsmessungen (falls entspre- chende Trimerdaten vorhanden) berücksichtigt werden müssen. In Abb. 3.3.10 sind die DEER-Daten der spinmarkierten Monomere 29/59 und 14/29 sowie der entsprechenden Trimere 29 und 59 bzw. 14 und 29 gezeigt. Beiden monomeren Mutanten ist gemein, dass Cα-Abstände der Kristallstruktur (graue Balken in 1C und 2C) mit 2,3 nm bzw. 1,75 nm sehr kurz sind, gemessene DEER-Abstände dagegen deutlich länger und jeweils breit verteilt sind (schwarze Linien in C). Die Hauptmaxima der DEER-Abstandsverteilung beider Proben liegen um 3,4 bzw. 2,9 nm. Zudem ist auffällig, dass in beiden Proben Nebenmaxima um 4,7 nm (1C) bzw. 4,6 nm (2C) auftreten, sowie dass jeweils ein Anteil kurzer Abstände um die 2,3 nm zu detek- tieren ist. In der monomeren Mutante 29/59 ist die Herkunft der kürzeren und mittleren Abstände mit Rotamerpositionen der Nitroxide vereinbar. Kurze Abstände entsprächen gleichgerichteten, mittlere Abstände voneinander abgewandten Spinmarkern. Der be- trächtliche Anteil langer Abstände ist hierdurch nicht erklärbar. Auffällig ist jedoch, dass die entsprechenden Trimerproben 29 und 59 in DEER-Messungen kurze Abstände (Position 59, dunkelblaue Linie in 1C) bzw. lange Abstände besitzen (Position 29, hell- blaue Linie in 1C), wobei letztere aber durchschnittlich länger sind als die des mono- meren Nebenmaximums. Die Situation in Mutante 14/29 ist annähernd gleich, hier sind die Nebenmaxima allerdings schwächer ausgeprägt als in Mutante 29/59. Kurze und mittlere Abstände sind ebenfalls mit möglichen Rotamerpositionen erklärbar, das Ne- benmaximum 4,6 nm wiederum nicht. Mögliche Trimerkombinationen zeigen hier nur lange Abstände zwischen 3 und 6 nm mit Maxima bei 4,7 nm (Trimer 14) bzw. 5,4 nm (Trimer 29), was dem Nebenmaximum der Monomere recht ähnlich ist. Kapitel III 3 Ergebnisse 209 Abb. 3.3.10: DEER-Abstandsmessungen innerhalb der N-terminalen Domäne des LHCII. PRO- XYL-markierte Monomere 29/59 (1) und 14/29 (2), sowie entsprechende Trimere 14, 29 und 59 wurden mittels Detergenzwechsel-Rekonstitution gefaltet, gegebenenfalls trimerisiert, via UZ aufgereinigt und abstandsvermessen. Die Präparation in LM-Mizellen erfolgte durch Müller (2008). (A) zeigt jeweils das Proteinrückgrat des monomeren LHCII in der stromalen Aufsicht, die N-terminale Domäne ist blau dargestellt (PDB-Eintrag 2BHW). Die Abbildungen wurden mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). (B) zeigt die Hintergrund-korrigierten Original-DEER- Daten (schwarze Linie) mit bestem Fit (rote Linie). In (C) sind DEER-Abstandsverteilungen dar- gestellt (Monomere schwarz, Trimere hell- bzw. dunkelblau), errechnet aus den Original-Daten mittels Tichonov-Regularisierung. Der graue Balken entspricht dem Abstand der Cα–Atome der markierten Aminosäuren in der Kristallstruktur des trimeren LHCII. Verschiedene Doppelmutanten der kristallographisch nicht erfassten N- terminalen Position 3 zeigen sehr breite Abstandsverteilungen (Abb. 3.3.11). In den Proben 3/59 und 3/29 ist jeweils eine breite Verteilung von Abständen zwischen 1,5 und 3,5 nm zu detektieren, zudem ein signifikantes Hauptmaximum um 4,5 nm. Die Abstandsverteilungen der jeweiligen Trimere sind praktisch über den gesamten Mess- bereich verteilt und lassen wenig Interpretationsmöglichkeit. Signifikant ist für beide Doppelmutanten, dass in entsprechenden Trimeren aber längere Abstände bis zu 6 nm auftreten. Mutante 3/14 zeigt ein breites Hauptmaximum um 2,7 nm, zudem ein Ne- benmaximum von 4,6 nm, welches den Trimeren 14 nicht unähnlich ist. Auch in dieser Mutante sind die detektierten Abstände insgesamt kürzer als in Trimeren der Position 3 und 14. Kapitel III 210 3 Ergebnisse Abb. 3.3.11: DEER-Abstandsmessungen innerhalb der N-terminalen Domäne des LHCII. PRO- XYL-markierte Monomere 3/59 (1), 3/29 (2) und 3/14 (3) sowie entsprechende Trimere 3, 14, 29 und 59 wurden mittels Detergenzwechsel-Rekonstitution gefaltet, gegebenenfalls trimerisiert, via UZ aufgereinigt und abstandsvermessen. Die Präparation in LM-Mizellen erfolgte durch Müller (2008). (A) zeigt jeweils das Proteinrückgrat des monomeren LHCII in der stromalen Aufsicht, die N-terminale Domäne ist blau dargestellt (PDB-Eintrag 2BHW). Die Abbildungen wurden mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). (B) zeigt die Hintergrund-korrigierten Origi- nal-DEER-Daten (schwarze Linie) mit bestem Fit (rote Linie). In (C) sind DEER- Abstandsverteilungen dargestellt (Monomere schwarz, Trimere hell- bzw. dunkelblau), errech- net aus den Original-Daten mittels Tichonov-Regularisierung. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass in den monomeren Proben N- terminaler LHCII-Mutanten von A. Müller (2008) neben den prinzipiell möglichen Rota- mer-Abständen zusätzlich unerwartet lange Abstände auftreten, die nicht mit mögli- chen Konformations-Rotameren der Spinmarker vereinbar sind. Inwiefern das Auftre- ten dieser Abstände mit einer Strukturänderung der N-terminalen Domäne oder mit der Kapitel III 3 Ergebnisse 211 Verunreinigung der monomeren Proben durch Trimere zusammenhängt, soll später diskutiert werden. 3.1.2.4 DEER-spektroskopische Untersuchung der N-terminalen Domäne in tri- merem LHCII DEER-spektroskopische Abstandsmessungen zur Untersuchung der Konformation der N-terminalen Domäne des trimeren LHCII wurden ebenfalls durch den Diplomanden A. Müller (2008) durchgeführt. Die angesprochene Optimierung der Software zur Berech- nung theoretischer Abstandsverteilungen sollte auch hier die ermittelten DEER-Daten durch den direkten Vergleich mit Daten der Kristallstruktur weiter aufwerten. Dies konn- te aber bis zum jetzigen Zeitpunkt nicht verwirklicht werden. Übersichtshalber sind in den folgenden Abb. 3.3.12, 3.3.13 und 3.3.14 (hinten angestellt) die DEER-Daten der vermessenen N-terminalen Trimere erneut dargestellt und mit Cα-Abstände aus Kris- talldaten verglichen (graue Balken in 3.3.12 und 3.3.13). Hier sei zudem vorab er- wähnt, dass eine Verunreinigung solcher trimerer Proben mit LHCII-Monomeren deut- lich unwahrscheinlicher ist, als der zuvor angesprochene umgekehrte Fall, da sich LHCII-Trimere durch eine hohe Stabilität auszeichnen und bei entsprechender Behand- lung nicht zu Monomeren zerfallen. Außerdem wären die Monomere hier nur einfach markiert und würden nicht zur Abstandsverteilung beitragen. Die Ergebnisse der Ab- standsmessungen sollen im Folgenden ausgehend von Position 59 bis hin zu Position 3 dargestellt werden. Wie zuvor erwähnt, liegt Position 59 im Beginn der transmembranen Helix H1 (Abb. 3.3.12, 1A). Im Unterschied zu allen bisher vermessenen monomeren Proben zeigt diese Trimerprobe eine sehr enge Verteilung der Abstände mit einem Maximum von 2,1 nm, Nebenmaxima treten praktisch nicht auf (1C). Durch die Lage in einer rigi- den Helix und die zuvor in ESEEM-Versuchen angesprochene Abschirmung dieser Position durch Aminosäurereste des benachbarten Monomers (Abb. 3.3.5) ist die Ab- standverteilung nicht nur sehr eng, sondern auch identisch zu den vorhergesagten Cα- Abständen aus Kristalldaten. Das schlechte Signal-Rausch-Verhältnis (1B) kann in diesem Fall ignoriert werden. Eine eigens hergestellte Präparation der Mutante zeigte bei weniger Rauschen ein identisches Ergebnis (Volkov, 2008), aus Konsistenzgrün- den soll hier aber trotzdem die Probe von Müller (2008) gezeigt werden. Die spinmarkierten Trimere 34 (Abb. 3.3.12, 2) zeigen eine ähnlich schmale Abstandsverteilung mit einem Maximum von 1,85 nm, die Cα-Abstände im kristallinen Trimer liegen bei 2,3 nm (2C). Diese Position wird laut Kristalldaten von zwei Schleifen- regionen umgeben (Ser 52 bis Gly 42 bzw. Gly 30 bis Asp 20), die jeweils in die Memb- ran bzw. Detergenz-Mizelle eintauchen und dort von Pigmenten und Lipiden (Lut2 und Chl4 bzw. Chl9 und PG) stabilisiert werden. Dies führt anscheinend auch zur Stabilisie- rung der Peptidstruktur zwischen Pro 41 und Glu 31, hier repräsentiert durch Position 34. Obwohl diese Position in der Kristallstruktur sterisch nicht durch andere Aminosäu- Kapitel III 212 3 Ergebnisse ren-Seitenreste behindert wird und zudem die ESEEM-Wasserzugänglichkeit (Abb. 3.3.4) sehr hoch ist, scheint eine Rotamer-Konformation zu existieren, die bevorzugt auf die anderen Spinmarker hin ausgerichtet ist. Vergleicht man die DEER-Abstandsdaten der folgenden Trimere, dann wird ersichtlich, dass mit Annäherung an den Beginn der Domäne (also Position 1) die ge- messenen Abstandsverteilungen stetig breiter werden. Auffällig ist auch, dass sich die Daten der folgenden Trimere 29 und 22 (Abb. 3.3.12, 3C und 4C) recht ähnlich sind. Beide zeigen ein Maximum um die 5,5 nm sowie eine Schulter bei etwa 4,5 nm, die in etwa den gemessenen Cα-Abständen des Kristalls entsprechen. Wie vorher bereits angedeutet, taucht hier eine Schleife des N-Terminus in die Membran bzw. Mizelle ein (Gly 30 bis Asp 20), wobei sich Position 29 und 22 in der Schleife direkt gegenüber liegen. Durch die enge Packung von Peptidschleife und Chl9, ist eine sterische Behin- derung nicht auszuschließen. Infolgedessen müssten die PROXYL-Marker in die Peri- pherie des LHCII ragen, was zu einer Verlängerung der Abstände gegenüber der Kris- tallstruktur führt. Die Daten der Trimere 14 und 12 (Abb. 3.3.13, 1C und 2C) sind mit Abständen zwischen 2,5 und 7,5 nm annähernd deckungsgleich und liegen breit verteilt um den erwarteten Kristallabstand. Die Trimere 11 (Abb. 3.3.13, 3C) zeigen eine ähnlich breite Verteilung, hier sind die Abstände aber durchschnittlich kürzer als erwartet. Während der N-Terminus im Kristall des trimeren LHCII durch eine kurze Schleife mit den Ami- nosäuren Trp 16 und Pro 15 die Membrangrenzfläche streift, wird der Rest des N- Terminus (Ser 11 bis Arg 1) anscheinend nicht weiter fixiert. Dies wird auch anhand Position 10 deutlich (Abb. 3.3.13, 4C). Hier besitzen etwa 50 % der N-Termini die er- warteten Abstände zueinander, die andere Hälfte zeigt deutlich kürzere Distanzen, die N-Termini nähern sich also einander an. Die Positionen 9, 7, 4, und 3 (Abb. 3.3.14, 1 bis 4) können nicht mit der Kristall- struktur verglichen werden, dieser Teil der Domäne entzieht sich bisher der kristal- lographischen Strukturanalyse (Standfuss et al., 2005). Trimere 9 und 7 zeigen annä- hernd identische DEER-Abstandsverteilungen. In beiden Fällen breit verteilt, nähern sich die N-Termini durchschnittlich weiter einander an. Das Maximum der Trimere 9 liegt bei 4,3 nm, das der Trimere 7 bei 3,9 nm, schematisch dargestellt als farbige Krei- se in Abb. 3.3.15 A. Auch die Abstände der Trimere 4 und 3 verteilen sich sehr breit, hier zeigen die N-Termini jeweils zwei Vorzugskonformationen mit Abständen von etwa 3,5 bzw. 5,5 nm (schematisch als Kreise in A dargestellt). Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die gemessenen DEER-Daten von Position 59 bis Position 22 sehr gut, bis Position 12 zumindest gut mit den Daten der Kristallstruktur übereinstimmen. Die ersten 11 Aminosäuren scheinen dagegen einen gewissen Grad an Flexibilität zu besitzen, was später diskutiert werden soll. Kapitel III 3 Ergebnisse 213 Abb. 3.3.12: Intermolekulare DEER-Abstandsmessungen zwischen den N-Termini des trimeren LHCII. PROXYL-markierte Trimere 59 (1), 34 (2), 29 (3) und 22 (4) wurden rekonstituiert, trime- risiert, via UZ aufgereinigt und abstandsvermessen. Die Präparation in LM-Mizellen erfolgte durch Müller (2008). (A) zeigt jeweils das Proteinrückgrat des trimeren LHCII in der stromalen Aufsicht (PDB-Eintrag 2BHW). Die Abbildungen wurden mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). (B) zeigt die Hintergrund-korrigierten Original-DEER-Daten (schwarz) mit bestem Fit (rot). In (C) sind DEER-Abstandsverteilungen dargestellt (schwarze Linie). Der graue Balken entspricht dem Abstand der Cα–Atome der markierten Aminosäuren in der Kristallstruktur des trimeren LHCII. Kapitel III 214 3 Ergebnisse Abb. 3.3.13: Intermolekulare DEER-Abstandsmessungen zwischen den N-Termini des trimeren LHCII. PROXYL-markierte Trimere 14 (1), 12 (2), 11 (3) und 10 (4) wurden rekonstituiert, trime- risiert, via UZ aufgereinigt und abstandsvermessen. Die Präparation in LM-Mizellen erfolgte durch Müller (2008). (A) zeigt jeweils das Proteinrückgrat des trimeren LHCII in der stromalen Aufsicht (PDB-Eintrag 2BHW). Die Abbildungen wurden mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). (B) zeigt die Hintergrund-korrigierten Original-DEER-Daten (schwarz) mit bestem Fit (rot). In (C) sind DEER-Abstandsverteilungen dargestellt (schwarze Linie). Der graue Balken entspricht dem Abstand der Cα–Atome der markierten Aminosäuren in der Kristallstruktur des trimeren LHCII. Kapitel III 3 Ergebnisse 215 Abb. 3.3.14: Intermolekulare DEER-Abstandsmessungen zwischen kristallographisch nicht erfassten Resten der N-Termini des trimeren LHCII. PROXYL-markierte Trimere 9 (1), 7 (2), 4 (3) und 3 (4) wurden rekonstituiert, trimerisiert, via UZ aufgereinigt und abstandsvermessen. Die Präparation in LM-Mizellen erfolgte durch Müller (2008). (A) zeigt jeweils das Proteinrückgrat des trimeren LHCII in der stromalen Aufsicht (PDB-Eintrag 2BHW). Die Abbildungen wurden mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). Kreise entsprechen den gemessenen DEER- Abständen höchster Häufigkeit, N-Termini sind blau dargestellt. (B) zeigt die Hintergrund- korrigierten Original-DEER-Daten (schwarz) mit bestem Fit (rot). In (C) sind DEER- Abstandsverteilungen dargestellt (schwarze Linie). Kapitel III 216 3 Ergebnisse 3.2 Detektion von Membranproteinfaltung mittels Puls-EPR Puls-EPR-Messungen an aufgereinigten LHCII-Proben in stationärem Zustand konnten sowohl das Potential von ESEEM-EPR zur lokalen Bestimmung der Wasserzugäng- lichkeit einzelner Aminosäuren als auch das Potential von DEER-EPR zur Detektion von Strukturinformation ganzer Proteindomänen von Membranproteinen zeigen. Das Experimentieren in Lösung bietet zudem die Möglichkeit der Durchführung zeitaufge- löster Messungen der Strukturdynamik. Hierbei ist insbesondere der Faltungsvorgang von Membranproteinen von Interesse. Aufgrund seiner Eigenschaft der spontanen Selbstorganisation in pigmenthaltiger Detergenzlösung eignet sich rekombinanter LHCII sehr gut für solche Faltungsstudien. In vitro wurde die Faltung des LHCII durch Verwendung unterschiedlicher Monitore bereits gründlich untersucht. Zeitaufgelöste Fluoreszenz-Spektroskopie konnte zeigen, dass die Faltung des LHCII abhängig von der Bindung seiner Pigmente ist und dass die Ausbildung des Protein-Pigment- Komplexes in mindestens zwei unterscheidbaren zeitlichen Bereichen innerhalb von Sekunden beziehungsweise Minuten stattfindet (Booth & Paulsen, 1996; Reinsberg et al., 2000). Der schnellere Faltungsschritt wird von der Bindung des Chl a dominiert, während der langsamere ausschließlich der Bindung des Chl b zugeschrieben werden kann (Horn et al., 2007). Zudem konnte mittels zeitaufgelöster CD-Spektroskopie in beiden Faltungsphasen die Ausbildung von α-helikaler Sekundärstruktur nachgewie- sen werden (Horn & Paulsen, 2002). Während erstere Versuche das kinetische Bin- dungsverhalten der Kofaktoren widerspiegeln, detektiert die CD-Spektroskopie lediglich global die Veränderung der Sekundärstruktur. Die zuvor vorgestellten Puls-EPR- Techniken liefern dagegen Strukturinformation über bestimmte Proteindomänen. Aus diesem Grund lag es nahe in zeitaufgelösten ESEEM-Experimenten die lokale Struk- turänderung einzelner Domänen und mittels DEER die Veränderung verschiedener Domänen zueinander zu untersuchen, um ein detaillierteres Bild der Proteinfaltung während der LHCII-Assemblierung in vitro zu erhalten. 3.2.1 Etablierung eines modifizierten Rekonstitutionsprotokolls für zeitaufge- löste EPR-Messungen Um eine für EPR-Versuche erforderliche Spinkonzentration zu erreichen, musste das Rekonstitutionsprotokoll des LHCII für zeitaufgelöste Faltungsexperimente (Booth & Paulsen, 1996; Horn et al., 2007) grundlegend geändert werden. Während gefaltete Protein-Pigment-Komplexe nach Aufreinigung durch Verringerung des Lösemittel- Volumens aufkonzentriert werden konnten, ist dies in zeitaufgelösten Experimenten aufgrund des Schockfrierens zur Unterbrechung des Faltungsvorganges nicht möglich. Daher mussten entsprechende Proben von Beginn an hohe Proteinkonzentrationen besitzen. Nach 20facher Erhöhung der Proteinkonzentration gegenüber dem Stan- dardprotokoll mussten verschiedene Parameter wie Detergenz- und Pigmentkonzentra- Kapitel III 3 Ergebnisse 217 tion angepasst werden, um eine erfolgreiche Rekonstitution des LHCII zu gewährleis- ten. Zunächst war eine Änderung des Protokolls zur Proteinmarkierung notwendig. Um hohe Konzentrationen des spinmarkierten Apoproteins in 1%iger LDS-Lösung voll- ständig zu solubilisieren, musste LHCP nach der Markierungsreaktion mit Trichlores- sigsäure gefällt werden (Kap. I). Mittels Acetonfällung und Ethanolwaschung behandel- tes Protein war dagegen in hohen Konzentrationen nur teilweise löslich (Daten nicht gezeigt). Auch die Herstellung stabiler, hochkonzentrierter Pigmentlösungen erforderte Veränderungen des Standardprotokolls. Um die maximal zulässige Konzentration von 8 % Ethanol in der LHCII-Rekonstitution nicht zu überschreiten, mussten Chlorophylle zu 20 mg/ml in Ethanol gelöst werden. Dies war nur durch Änderung des Pigmentex- traktionsprotokolls möglich. Nach Auslassen der Pigment-Überführung in Diethylether während der Extraktion verblieb ein höherer Anteil an nativen Lipiden im Totalpigment- extrakt. Solche Pigmentextrakte konnten zu höheren Konzentrationen in Ethanol gelöst werden. Das Prinzip der Rekonstitutionsmethode für zeitaufgelöste Faltungsexperimente beruht auf einer Verdünnung des LDS mit einem hohen Überschuss an OG (Booth & Paulsen, 1996). LDS-solubilisiertes Apoprotein wird dadurch in OG-Mizellen gezwun- gen, der Umgebungswechsel mit Zugang zu den Pigmenten resultiert in der spontanen Selbstorganisation zu funktionalen Pigment-Protein-Komplexen. Um den Verdün- nungseffekt bei hohen LDS-Konzentrationen zu gewährleisten, musste die OG- Konzentration ebenfalls erhöht werden. Dies führte zur Aggregation der Chlorophylle innerhalb von Minuten, eine Faltung des Proteins blieb aus. Erst eine Mischung ver- schiedener Detergenzien führte zu einer stabilen Pigmentlösung, die auch nach 45 min Inkubation noch über 80 % an gelöstem Chl aufwies. Neben OG (6 %), TX (1 %) waren insbesondere geringe Konzentrationen des anionischen Deoxycholat (0,02 %) essen- tiell um die Pigmente stabil in Lösung zu halten (Daten nicht gezeigt). Somit war ge- währleistet, dass dem faltenden Protein während der Assemblierung stets gleich hohe Konzentrationen an Cofaktoren zur Verfügung stehen. Die Überprüfung der modifizierten Rekonstitutionsmethode erfolgte durch bio- chemische Charakterisierung einzelner Faltungsproben sowie mittels verschiedener EPR-Monitore. Die Aufreinigung der nach modifiziertem Protokoll rekonstituierten Komplexe resultierte in unauffälligem spektroskopischem Verhalten. Der Energietrans- fer von Chl b auf Chl a war gewährleistet, die CD-Absorption entsprach der des wildty- pischen LHCII-Monomers. Zusätzlich wurde ein Aliquot jeder einzelnen EPR-Probe mittels schwach denaturierender LDS-PAGE auf ihr Faltungsvermögen überprüft. Nur Proben, die eine intensive grüne Bande mit einer Faltungsausbeute von 40 bis 50 % zeigten, wurden weiter vermessen. Nach Überprüfung auf Protein-Aggregation mittels ESE-EPR sowie Versuchen zur instantanen Diffusion (Volkov, 2008) wurden die Fal- Kapitel III 218 3 Ergebnisse tungsprodukte der PROXYL-markierten Mutante mittels Puls-EPR-Techniken vermes- sen. 3.2.2 Änderung der Wasserzugänglichkeit während der Faltung des LHCII: zeitaufgelöste ESEEM-Spektroskopie Zur Detektion lokaler Veränderungen der Proteinstruktur während des Faltungsvorgan- ges, wurde die LHCII-Mutante 196, welche innerhalb der transmembranen Helix H4 spinmarkiert ist, zeitaufgelöst ESEEM vermessen. Im gefalteten LHCII liegt Position 196 innerhalb des hydrophoben Kerns der Detergenz-Mizelle (Abb. 3.3.15 A) und zeichnet sich durch eine sehr geringe Wasserzugänglichkeit aus, charakterisiert durch einen niedrigen ESEEM-Wasserzugänglichkeitsparameter (Abb. 3.3.1). Die geringe Zugänglichkeit lässt sich für Mutante 196, gefaltet nach modifiziertem Protokoll, eben- falls bestätigen. Die Intensität des ermittelten „Deuterium-Peak“ bei 2,1 MHz in Fourier- transformierten ESEEM-Daten (Abb. 3.3.15 B, schwarze Linie), welcher ein direktes Maß für Interaktion mit umgebenden Deuterium-Kernen darstellt, ist in der Probe gefal- tet nach modifiziertem Protokoll identisch niedrig zur aufgereinigten LHCII-Präparat gefaltet nach Standard-Protokoll (Volkov et al., 2009). Abb. 3.3.15: Detektion der Änderung der Wasserzugänglichkeit mittels ESEEM-EPR in Abhän- gigkeit des Faltungszustand des PROXYL-markierten LHCII (Position 196). (A) zeigt die Struk- tur des Peptidrückgrates eines Monomers des nativen, trimeren LHCII (PDB-Eintrag 2BHW) in der Seitenansicht. Membranständige Domänen sind hellgrau dargestellt, Position 196 rot ge- zeigt. Die Abbildung wurde mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). (B) zeigt die Verände- rung der „Deuterium-Peak“-Intensität des ESEEM-Spektrums nach Fourier-Transformation. Die graue Linie zeigt LDS-solubilisiertes Apoprotein, die schwarze Linie gefalteten LHCII (Rekonsti- tution für zeitaufgelöste EPR-Messungen). Im Gegensatz dazu zeigt die LDS-solubilisierte Probe (B, graue Line) eine sehr gute Zugänglichkeit zum Lösungsmittel, die vergleichbar ist mit der Zugänglichkeit aufgerei- Kapitel III 3 Ergebnisse 219 nigter LHCII-Monomere der N-terminalen Mutante an Position 3 (Volkov et al., 2009). Der zentrale „Deuterium-Peak“ erreicht annähernd eine Intensität von 15 und ist damit fast dreimal höher als in der gefalteten Probe. Dieser deutliche Unterschied zwischen denaturierter und gefalteter Probe stellt die Grundvoraussetzung zur Messung der Fal- tungskinetik mittels ESEEM-EPR dar. Zur Erstellung einer ESEEM-Faltungskinetik des LHCII (Position 196) wurden vorbereitete Pigment- und Proteinlösungen gemischt und zu unterschiedlichen Zeit- punkten schockgefroren. Wie in Abb. 3.3.16 A ersichtlich ist, nimmt die Intensität des zentralen „Deuterium-Peak“ während des Faltungsvorganges konstant ab. Nach 32 s Faltungszeit besitzt der Peak bei 2,1 MHz nur noch eine Intensität von etwa 8,8, nach 123 s von 8,5, nach 327 s von 7,6, nach 621 s von 6,7 bis letztendlich bei einem Wert von 5,9 (3000 s) die Faltung beendet ist. Während im denaturierten Zustand Position 196 also sehr gut zugänglich für das wässrige Lösungsmittel ist, wird durch die Ausbil- dung der transmembranen Helix H4 sowie deren Anordnung im Helixkreuz, die PRO- XYL-Sonde aus dem Lösungsmittel in das hydrophobe Innere der Detergenz-Mizelle gezogen. Abb. 3.3.16: Detektion der zeitabhängigen Änderung der Wasserzugänglichkeit während der Faltung der PROXYL-markierten LHCII-Mutante 196 mittels ESEEM-EPR. (A) zeigt die Verän- derung des Fourier-transformierten ESEEM-Spektrums für Faltungszeiten zwischen 32 s und 3000 s (gefaltet). In (B) ist die Veränderung des zentralen „Deuterium-Peak“ bei 2,1 MHz gegen die Faltungszeit aufgetragen (schwarze Punkte). Die graue Linie zeigt den monoexponentiellen Fit. Trägt man die Intensität des zentralen „Deuterium-Peak“ als Funktion der Faltungszeit auf (Abb. 3.3.16 B), kann die Faltungszeitkonstante (k) für Position 196 errechnet wer- den. Sie beträgt etwa 500 s (Volkov, 2008). In Konsistenz zu kinetischen Faltungsex- perimenten mittels DEER-EPR (Kap. III, 3.2.3) wurde in dieser Kinetik darauf verzich- tet, die LDS-solubilisierte Probe mit einzubeziehen, da der Puffer dieser Probe nicht Kapitel III 220 3 Ergebnisse identisch ist zu dem der Faltungsproben. Stattdessen wurde versucht in Faltungs- „Mock“-Versuchen mit Rekonstitutionspuffer, aber ohne Zugabe von Pigment, einen Faltungsnullpunkt zu ermitteln. Messungen zur instantanen Diffussion zeigten, dass in solchen Präparationen der spinmarkierte LHCP sehr stark zur Bildung von Aggregaten neigt (Volkov, 2008). Da die Ausbildung von LHCII-Aggregaten ein irreversibler Pro- zess ist, der auch durch nachträgliche Pigment-Zugabe nicht rückgängig gemacht wer- den kann, ist die Verwendung der Zugänglichkeitsparameter solcher Proben zur Defini- tion eines Faltungsnullpunktes in der Kinetik wenig sinnvoll, was später kurz diskutiert werden soll. Kapitel III 3 Ergebnisse 221 3.2.3 Publikation II. Dockter et al. Refolding of the integral membrane protein light-harvesting complex II monitored by pulse EPR. [Submitted] Refolding of the integral membrane protein light-harvesting complex II monitored by pulse EPR Christoph Dockter*, Aleksei Volkov‡, Christian Bauer‡, Yevhen Polyhach§, Zoé Joly-Lopez¶, Gunnar Jeschke§† and Harald Paulsen*† *Institut für Allgemeine Botanik, Johannes Gutenberg-Universität Mainz, 55099 Mainz, Germany ‡Max-Planck-Institut für Polymerforschung,55021 Mainz, Germany §Laboratorium für Physikalische Chemie, ETH Zürich, 8093 Zürich, Switzerland ¶Department of Biology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Key words: LHCII, DEER, membrane protein, assembly kinetics, EPR Author contributions: C.D., A.V., Y.P., G.J. and H.P. designed research, C.D., A.V., Y.P. and Z.J.-L. performed research; C.B., G.J. and H.P. contributed new reagents/analytic tools; A.V., Y.P. and G.J. analyzed data; C.D., G.J. and H.P. wrote the paper. †To whom correspondence may be addressed. Prof. Dr. H. Paulsen Institut für Allgemeine Botanik Müllerweg 6 55099 Mainz, Germany telephone: +49 (0) 6131-3924633 fax: +49 (0) 6131-3923787 paulsen@uni-mainz.de Kapitel III 222 3 Ergebnisse ABSTRACT The major light-harvesting chlorophyll a/b complex (LHCII) of the photosynthetic appa- ratus in plants self-organizes in vitro. The recombinant apoprotein, denatured in dode- cyl sulfate, spontaneously folds when it is mixed with its pigments, chlorophylls and carotenoids in detergent solution, and assembles into structurally authentic LHCII in the course of several minutes. Pulse EPR techniques, specifically double-electron-electron resonance (DEER), have been used to analyze protein folding during this process. Pairs of nitroxide labels were introduced site-specifically into recombinant LHCII and shown not to affect the stability and function of the pigment-protein complex. Interspin distance distributions were measured at various time points between two spin pairs, one pair located on either end of the second transmembrane helix (helix 3), the other one located near the lumenal ends of the intertwined transmembrane helices 1 and 4. In the dodecyl sulfate-solubilized apoprotein, both distance distributions were consis- tent with a random-coil protein structure. A rapid freeze-quench experiment on the lat- ter spin pair indicated that 1 s after initiating reconstitution the protein structure is virtu- ally unchanged. Subsequently, both distance distributions monitored protein folding in the same time range in which the assembly of chlorophylls into the complex had been observed. The positioning of the spin pair spanning the hydrophobic core of LHCII clearly preceded the juxtaposition of the spin pair on the lumenal side of the complex. This indicates that superhelix formation of helices 1 and 4 is a late step in LHCII as- sembly. Kapitel III 3 Ergebnisse 223 INTRODUCTION The major light-harvesting complex LHCII largely increases the efficiency of the photo- synthesis process by collecting light energy and conducting it to a photosynthetic reac- tion center where light-driven charge separation takes place. The apoprotein of LHCII is one of the most abundant membrane proteins on Earth. An estimated 109 t are pro- duced per year (1) and assembled with the photosynthetic pigments chlorophyll (Chl) a, Chl b, and carotenoids. Although each spring this mass process is easily visible in greening plants, its molecular mechanism is only partially understood. LHCII offers several advantages for studying its folding and assembly in vitro. Its crystal structure is known (2), its apoprotein can be recombinantly expressed in Es- cherichia coli (3), and the protein spontaneously folds and assembles with pigments in detergent solution (3, 4). This spontaneous self-organisation can be triggered by mixing the apoprotein solubilized in the ionic detergent dodecyl sulfate with a non-ionic deter- gent solution of the pigments. The assembly process can then easily be monitored by time-resolved fluorescence spectroscopy using the Chls as built-in fluorescence labels. Such experiments showed that protein folding is dependent on the binding of pigments, and that LHCII formation in vitro occurred in at least two apparent phases, a faster one in the range of some tens of seconds and a slower one taking several minutes (5, 6). The faster step could be assigned to the binding of mostly Chl a whilst the slower one represents Chl b binding exclusively (7, 8). On the other hand, CD spectroscopy showed the formation of α-helical secondary structure during both kinetic phases (9). Both techniques are limited when used in protein folding studies. While time-resolved fluorescence measurements only yield information on Chl assembly into the complex, CD is a good monitor for the folding state of proteins in that it indicates the overall composition of secondary structure, but detailed information about positions of individ- ual protein domains is not accessible. Information about the structural behavior of individual protein domains during the LHCII assembly process can be gathered by various techniques of EPR in combi- nation with site-directed spin labeling (SDSL). Double electron-electron resonance (DEER) spectroscopy allows the measurement of distances between two spin-labeled residues in the range of 2 -6 nm, in favorable cases even 8 nm (10, 11). This technique is especially useful for the prediction of unsolved protein structure (12, 13) as well as structure dynamics (14, 15). Electron spin echo envelope modulation (ESEEM) spec- troscopy, also a pulse EPR technique, yields additional structural information by deter- mining the water accessibility of singly spin-labeled protein domains (16). Continuous- wave (CW) spectroscopy is a widely-used technique to monitor changes in the struc- ture of both membrane proteins and water-soluble proteins (17-19) and additionally in time-resolved studies to analyze the process of protein folding (20). DEER recently provided insight into the pattern of helix movement in rhodopsin due to light activation (14) and has been used to determine intra- and intermolecular Kapitel III 224 3 Ergebnisse distance distributions between individual protein domains in LHCII monomers and trimers, respectively (12). Additional information about the accessibility of single resi- dues in various domains of LHCII monomers were obtained by comparison of conven- tional CW and pulsed EPR measurements (16). In the present work, we employed DEER to obtain information about LHCII as- sembly by monitoring the change of distances between two spin label pairs. Double- labeled mutant versions of lithium dodecyl sulfate (LDS)-denatured LHCII apoprotein were refolded using a modified reconstitution protocol, flash-frozen in liquid nitrogen after certain folding times, and the intramolecular distances were measured. Based on the obtained kinetic data, we compared the folding in vitro of LHCII with that of other membrane proteins. MATERIALS AND METHODS Protein preparation, SDSL and reconstitution of LHCII with pigments. Proteins used in this study were derivatives of the Lhcb1*2 (AB80) gene from pea (Pisum sativum) (21) with its single Cys in position 79 replaced with Ser. In DEER measurements, two different double mutants were used (106/160 and 90/196), each containing two Cys replacing Ser at positions 106, 160 and replacing Val in positions 90, 196. All derivatives have either been described in earlier studies (12) or were con- structed by using the QuikChange mutagenesis kit (Stratagene). Bacterial expression of the Lhcb1 gene derivatives (3) and labeling of the protein with PROXYL spin labels [3-(2-Iodoacetamido)-PROXYL, Aldrich] were performed as described elsewhere (16). For steady-state DEER the spin-labeled complexes were reconstituted using the detergent-exchange procedure (henceforward called “standard reconstitution”) as described in (22) except that 10 mM β-mercaptoethanol (β-Me) was used as a reduc- tant. Purification of LHCII and preparation of EPR samples were performed as de- scribed in (12). For time-resolved DEER measurements, reconstitution was initiated by manu- ally mixing protein and pigment solutions containing high reactant concentrations (“re- constitution for EPR measurements”) or by mixing the solutions in a rapid freeze- quench apparatus and spraying them into a cold brass funnel as described in support- ing information (SI Text). After the reaction times indicated, 40% glycerol was added immediately as a cryoprotectant, and samples were flash-frozen in liquid nitrogen. Each data point in the EPR kinetic measurements represents an independently mixed protein sample exhibiting a final protein concentration of about 40 µM LHCII. EPR-spectroscopy. The X-band (9 GHz) pulse EPR measurements were performed on a Bruker Elexsys EX 580 EPR spectrometer using a Bruker Flexline split-ring resonator ER 4118X_MS3 Kapitel III 3 Ergebnisse 225 overcoupled to Q ~ 100. All pulse measurements were performed at 50 K with liquid helium cooling using an Oxford CF935 cryostat with an Oxford ITC4 temperature con- troller. Four-pulse DEER experiments were performed as described by Jeschke et al. (12) with interpulse delays τ2 between 800 ns and 2500 ns depending on the trans- verse relaxation times, a repetition time of 6 ms and a total measurement time between 8 and 24 h, depending on spin label concentration. Sample quality was checked by electron spin echo (ESE) measurements as described in (16). Data analysis. DEER data were analyzed using the “DeerAnalysis2006” program (23), which can be downloaded at http://www.epr.ethz.ch/software/index. Processing parameters are given in SI Text. Rotamer library simulations. Distance distributions were predicted from the crystal structure (2) with rotamer library modeling of spin label conformations using a modified version of an approach intro- duced in earlier work (11, 13). Details are given in SI Text. RESULTS Functional and structural characterization of spin-labeled LHCII. The folding state of Lhcb1 protein upon or during LHCII assembly was measured by monitoring two different intramolecular distances, one between the lumenal ends of helices H1 and H4 (90/196, Fig. 1), the other one spanning the hydrophobic centre of the complex between the stromal and lumenal loops (106/160). The distances were defined by PROXYL spin labels attached to engineered Cys residues replacing two Val in mutant 90/196 and two Ser residues in mutant 106/160. The chosen sites were fac- ing the peptide surface to avoid structural perturbation due to overpacking of the pro- tein core but, except for 106, were located inside the detergent micelle (16). Kapitel III 226 3 Ergebnisse Fig. 1. Side view of the backbone structure of monomeric LHCII based on the crystal structure (PDB ID code 2BHW). H1, H3, H4 indicate the three transmembrane α- helices [Standfuss et al. (2) nomenclature], numbers indicate the PROXYL-labeled amino-acid residues, dotted traces show the intramolecular distances measured. Light gray colored protein domains reside inside the detergent micelle. The labeled apoproteins were reconsti- tuted with pigments according to the standard procedure, and the complexes were compared to those reconstituted with the non-labeled WT protein. Neither CD spectra in the visible range nor the intramolecular energy transfer from Chl b to Chl a (24) showed any difference between the two, demonstrating that spin labeling did not affect the structure or function of LHCII (SI Text). The spin-labeled isolated LHCII was used to measure distance distributions by pulse EPR as shown in Fig. 2. The original data shown in Fig. 2A (90/196, solid black trace) were obtained by a four pulse DEER experiment monitoring the time evolution of a spin echo intensity (10). To be sure to measure intramolecular distances within the same molecule rather than intermolecular distances between two labeled monomers, a control experiment with a 1:1 mixture of singly spin-labeled mutant 90 and mutant 196 (dots in Fig. 2A) at the same total spin label concentration was performed. In contrast to the doubly spin-labeled mutant no appreciable DEER signal was detected resulting from dipole-dipole interaction between electron spins. Therefore the background- corrected data for the mutant 90/196 in Fig. 2B originate from two electron spins within the same macromolecule. The corrected data were used to calculate via Fourier trans- formation the dipolar spectra shown in Fig. 2C and via Tikhonov regularization the dis- tance distribution (Fig. 2D) between two labels within one protein molecule (11). Kapitel III 3 Ergebnisse 227 Fig. 2. DEER data analysis for LHCII double mutant 90/196. Monomeric LHCII was purified by ultracentrifugation and checked by CD and fluorescence measurements. DEER spectra were scanned with a dipolar evolution time of 2500 ns, the background correction pa- rameter was 224 ns. A original data (solid black trace) and control experiment with a mixture of singly spin-labeled mutants 90 and 196 (gray dots). B data after background correction (gray dots) and best fit (solid black trace), C dipolar spectrum (gray trace) and best fit (black trace). D distance distribution obtained with a regularization parameter α = 100. Protein folding was monitored by measuring distance distributions between spin pairs at different time points. Labeling sites were preferred (i) where PROXYL labels would face the protein surface to avoid their interference with the pigment-protein structure, and (ii) in protein domains of restricted mobility to keep the expected distance distribu- tions narrow and well reproducible. A number of double mutants carrying pairs of spin labels were screened by producing independent preparations of EPR samples for each mutant and testing their reproducibility by superimposing the DEER dipolar spectra for each mutant. Dipolar spectra for LHCII double mutants were generally well reproduci- ble; only modulation depths sometimes varied and the shapes of broad distance distri- butions in some cases were not well reproducible. As shown in Fig. S1 two independ- ent dipolar data sets each of the monomeric 90/196 (panel A) and 106/160 (panel B) mutants were matching very well; therefore, these two mutants were chosen for protein folding kinetics. Kapitel III 228 3 Ergebnisse Fig. S1. Check of the reproducibility of DEER dipolar data of different LHCII double mutants. Monomeric LHCII samples were purified by ultracentrifugation and checked by CD measure- ments. DEER spectra were scanned with a dipolar evolution time of 2500 ns, the background correction starting time for A and B was 224 ns and 320 ns, respectively. A comparison of two separately reconstituted LHCII samples of the double mutant 90/196 (grey and black trace), in B double mutant 106/160 (grey and black trace). Time-dependent changes of EPR signals during LHCII assembly. In a first, stationary DEER experiment both the LDS-denatured apoprotein and the iso- lated pigment-protein complex of mutants 90/196 and 106/160 were measured with a long evolution time of 2500 ns to obtain distance distributions over the entire range of 1.5 to 6.5 nm. Fig. 3. Distance distributions of LDS-denatured apoprotein and upon LHCII-assembly. Data were acquired with a maximum dipolar evolution time of 2500 ns, the background correc- tion time for 106/160 and 90/196 was 632 ns and 396 ns, respectively. Panels A and B: changes in distance distribution for mutants 106/160 and 90/196, respectively. Panel C: the dipolar spectra for 90/196 obtained from data cut off at a dipolar evolution time of 1400 ns and using exponential background correction as in analyzing folding kinetics (vide infra). Gray lines represent the LDS-denatured apoprotein and black lines isolated pigment-protein complexes. The dotted gray traces (A, B) show distance distributions determined from a rotamer library- based simulation. Black arrows (A, B) indicate the distances taken from the crystal structure of trimeric LHCII (2) between the Cα atoms in the labeling positions. The denatured samples of both mutants (Fig. 3A and B, gray trace), expected to adopt a random coiled conformation with some α-helical structure (9), yielded distance distri- butions covering the range of 1.5 to 6 nm. The individual peaks in these distributions may not be significant but rather result from the ill-posedness of converting primary DEER data to distance distributions. While the denatured samples exhibited broad dis- Kapitel III 3 Ergebnisse 229 tributions, the fully folded and pigmented proteins showed significant narrowing of their distance distributions and a change in the mean distance. For the span between the stromal and lumenal loops in 106/160 the obtained broad peak at 4.1 nm is near the distance between the Cα atoms in the crystal structure (3.9 nm, indicated by the black arrow) of trimeric LHCII (2). In contrast, the second peak at 4.9 nm as well as the dis- tances between the labels at the lumenal ends of helices H1 and H4 (3.85 nm) were all larger than the distance measured between Cα atoms in the crystal structure of LHCII trimers (2.8 nm for mutant 90/196). As seen in the distance distributions determined from a rotamer library-based simulation of both mutants, this deviation disappears when the labeled sidegroups point away from one another and the distances are measured between midpoints of the N-O bonds at the sidegroup termini. In kinetic EPR measurements of LHCII protein folding, the protein concentration was reduced by a factor of 7.5 compared to the steady-state measurements described above. Thus it was necessary to shorten the dipolar evolution times from 2500 ns to 1500 ns. This partially suppresses long distances due to imperfect background correc- tion. Therefore, protein folding was monitored by focussing on the distance distribution at short distances, where both spin pairs show differences between the unfolded and folded states. In dipolar spectra this corresponds to the large dipolar frequencies, which can be reliably detected even at short evolution times. DEER measurements of the folded double mutants 106/160 and 90/196 measured with dipolar evolution times of 2500 ns and 1500 ns resulted in virtually identical dipolar spectra (data not shown). Furthermore, unlike computation of distance distributions, the computation of dipolar spectra is not an ill-posed problem, so that the results are less influenced by noise, and the remaining influence of noise can be precisely estimated. Therefore the change in the EPR dipolar spectra was measured during assem- bly of LHCII. The folding process was triggered by manually mixing the protein and pigment solutions. The reaction was quenched by shock freezing after the desired re- action times in the range between 40 s and 15 min. As shown for both mutants in Fig. 4A and B (106/160 and 90/196, respectively), the normalized dipolar spectra exhibit an increase of low-frequency contributions in the center and a decrease of high frequen- cies of approximately ± 1.5 to ± 5 MHz in the flanks corresponding to the narrowing of their distance distributions and the increase in the mean distance as seen before (Fig.3). Kapitel III 230 3 Ergebnisse Fig. 4. Assembly of LHCII as monitored by the change in DEER dipolar spectra for different LHCII mutants (A 106/160 and B 90/196). Spectra were scanned with a dipolar evolu- tion time of 2500 ns. Processing parameters were a 404 ns starting time for background correc- tion and 1400 ns cut off time for mutant 106/160 and a 184 ns starting time for background cor- rection and 1400 ns cut off time for mutant 90/196. Panel A and B: DEER-dipolar spectra at 3 different folding times. The isosbestic points are marked by arrows, frequencies higher than that at the isosbestic point are shaded and the integrated areas hatched. Panel C: time-dependent decrease of the high-frequency integral in dipolar spectra obtained at four different folding times for each mutant (106/160 and 90/196, black and gray line, respectively). Lines are exponential fits of the experimentally determined data points. Upon superimposing the dipolar spectra obtained for different time points, isosbestic points (black arrows in Fig. 4) became visible for both mutants at approximately 1 MHz. The appearance of isosbestic points confirms the expectation that Fourier analysis of the data is a robust approach and indicates that folding can be described as a two- state process. The integral intensity in the dipolar spectra at frequencies higher than the one of the isosbestic point is a measure for the conformations with short distances in the unfolded ensemble that are depopulated during folding. Thus progress of the protein folding process was quantified by plotting the integral area (hatched area in Fig. 4) versus the folding time. The right-hand panel in Fig. 4 (C) shows fits of the kinetic data shown in Fig. 4 (A and B) to be single-exponential. With four data points this can- not be strictly proven. However, apparent first order kinetics is consistent with a two- state process suggested by the occurrence of isosbestic points. Furthermore, single- exponential fits allow for a rough comparison of the time scales of structure generation between the two spin-labeled residues. For mutant 106/160 (Fig. 4C, black line) in which the distance was measured along the transmembrane helix H3, the fit yielded a time constant τH3 of about 54 s. However, this time constant is only an upper limit since within experimental uncertainty the dipolar spectrum already corresponds to the folded state at the second time point of 146 s. The formation of the superhelical structure de- fined by the juxtaposition of the lumenal ends of helices H1 and H4 (90/196) displayed a slower kinetics with a time constant τH1/H4 of about 300 s (Fig. 4C, gray line). Both time constants were in the same range as those seen in time-resolved fluorescence measurements for pigment binding during LHCII assembly (Table S1, ref. 8, 25). Kapitel III 3 Ergebnisse 231 To obtain information within the dead time of about 40 s of the manual mixing procedure, a sample of double mutant 90/196 with a folding time of 1 s was prepared with a rapid freeze-quench apparatus. Due to the unavoidable dead volume of the ap- paratus and losses in transferring the sample from the cold brass funnel into the EPR tube, such experiments require a much larger amount of protein and pigments. Fur- thermore, at the same concentration the protein density in the active volume of the EPR resonator is significantly lower due to voids in packing the small shock-frozen par- ticles. Although the ESE spectrum indicated good sample quality, the sample could thus be measured only with a dipolar evolution time of 800 ns. However, within these 800 ns the modulation-depth scaled primary time-domain data superimpose almost perfectly with both the data for the unfolded double mutant 90/196 and the data measured after 37 s (see Fig. S2). As this indicates no substantial structural changes of the unfolded protein due to the detergent replacement, no further material-intensive experiments were performed with the rapid freeze-quench setup. Fig. S2. Primary DEER EPR data of the LHCII mutant 90/196. The blue line represents the apoprotein in LDS micelles, the red line a sample shock frozen immediately after mixing the protein and pigment solutions (rapid freeze quench), and the black line a sample shock frozen 37 s after mixing (manual freeze quench). Data traces are normalized to the intensity at zero time and vertically scaled to match modulation depths. Modulation depth differences were smaller than 5% of the normalized maximum echo amplitude. DISCUSSION DEER as a monitor in membrane protein-folding analysis. In this work we employed the techniques of SDSL and DEER distance mapping to study apoprotein folding during the assembly of LHCII. SDSL in combination with CW EPR had been used to measure the kinetics of structural changes in membrane and water-soluble proteins (17, 19, 20). Time-resolved studies on LHCII assembly had yielded information about the kinetics of pigment binding by measuring energy transfer between Chls (5), and about the kinetics of global secondary structure formation in the Kapitel III 232 3 Ergebnisse apoprotein by measuring CD spectra in the UV domain (9). By using pulsed EPR com- bined with SDSL in the present study, we were able for the first time to monitor individ- ual LHCII protein domains during the folding process by assessing distances between these domains. Two intramolecular distances were defined by the labeling positions in two dou- ble-labeled LHCII derivatives, one along the axis of the middle transmembrane helix H3 (106/160) and one between the lumenal ends of the two intertwined helices H1/H4 (90/196). The labeled LHCII versions were carefully checked and found to exhibit the same stability as native LHCII. Recombinant LHCII forms 2D crystals very similar to those from native LHCII (26). DEER (12) and ESEEM (16) measurements of spin-labeled LHCII mutants indi- cated a similar structure for monomeric LHCII, solubilized in detergent micelles, permit- ting us to compare intramolecular distances measured by EPR with those predicted from the crystal structure. The distance distribution measured for the 106/160 label pair in isolated labeled LHCII was rather broad with peaks at 4.1 and 4.9 nm (Fig. 3). The distance between Cα atoms taken from the crystal structure (2) is 3.9 nm. PROXYL spin labels modelled into the crystal structure by using a rotamer library predicted a distance distribution between 3 and 5 nm, in agreement with the measured distribution. In the rotamer model the PROXYL label in position 106 has a substantial amount of motional freedom whereas the one in position 160 is partially restricted in its mobility by its close vicinity to Chl 11. This notion is supported by recent ESEEM measurements, indicating that the label in position 160 is buried in the micellar phase (16).The distance peaks at 4.1 and 4.9 nm are consistent with preferred label orientations parallel to or away from another, respectively. The DEER-measured distance distribution in the 90/196 derivative is remarkably narrow, peaking at 3.85 nm. This is in good agreement with the distance range between 3.6 and 4.2 nm predicted by a rotamer library ap- proach. Both label positions are crowded by protein side chains (position 90) or pig- ments (Chls 3, 4, and 12 in position 196), forcing the labels to point away from each other. This explains both the narrow distance distribution and its deviation from the distance between Cα atoms taken from the crystal structure (2.8 nm). In LDS-denatured LHCII apoprotein, DEER-measured distance distributions were broad and quite different from those in the isolated pigment-protein complex (Fig. 3), making DEER a useful monitor for protein folding. The distance distribution for the 90/196 spin pair has a somewhat shorter mean distance compared to the one of the 106/160 pair while the opposite may be expected in a random coil because of the lar- ger separation of the 90/196 pair in the primary protein sequence. Most likely, the as- sumption of a random coil structure is an over-simplification since hydrophobic stretches of the protein presumably are expected to be sequestered in the hydrophobic interior of detergent micelles (27). Moreover, it is known that dodecyl sulfate-dissolved LHCII apoprotein exhibits about half of the α-helical structure seen in the fully folded Kapitel III 3 Ergebnisse 233 protein (9). The same has been observed in other proteins such as bacteriorhodopsin, leading to the proposal that dodecyl sulfate stabilizes a folding intermediate of mem- brane proteins (28). It should be noted, however, that LHCII protein can also be re- folded from a guanidinium hydrochloride (Gnd) solution in which no α-helical structure is seen; the latter therefore is no prerequisite for successfully folding this protein (29). In this work, we chose the dodecyl sulfate solution of the protein as a starting condition since folding yields are considerably higher compared to experiments starting from the Gnd-solubilized protein. Events during the first 30 s of LHCII apoprotein folding. In mock reconstitution experiments that involved the same detergent exchange as dur- ing proper reconstitution in the absence of pigments very short Τ2 (spin-spin) relaxation times were observed. This effect could be traced back to protein aggregation, with high local spin concentrations of such aggregates being verified by instantaneous diffusion measurements and distortions in the line shape of the ESE spectrum (Fig. S3). How- ever, these aggregates formed in the absence of pigments clearly constitute a kinetic trap, since subsequent addition of pigments never induced any detectable protein fold- ing. For double mutant 90/196 a refolding experiment under standard conditions with rapid freeze quench after about 1 s, led to an undistorted ESE spectrum and to a DEER decay function that matched both the decay function of LDS-denatured apopro- tein and the one observed after 37 s of folding within the first 800 ns where data were observable with the rapid freeze-quenching technique. This virtual coincidence of all three data sets is consistent with the folding time constant of 300 s observed for this mutant. The data indicate that mere detergent exchange, which is expected to be faster than 1 s, does not cause significant changes in the random coil ensemble of unfolded LHCII protein. In the presence of pigments, folding is induced and changes occur on the time scales observed with manual freeze quench. In the absence of pigments, un- folded apoprotein is not well solubilized by the detergent mixture used for reconstitution and aggregates, probably on a time scale comparable to the folding time scale. LHCII protein folds in two apparent phases in the range of less than 1 min and several min. Following the dead time of manual freeze-quench experiments of about 30 s, the fold- ing of the LHCII apoprotein was traced by DEER measurements at various time points. While at optimum spin concentrations (Fig. 3) the ill-posed problem of Tikhonov regu- larization can be minimized (and thus reliable distance distributions obtained), under the non-ideal conditions of refolding experiments (Fig. 4) the dipolar evolution time had to be shortened, resulting in suppression of longer distances. In LHCII this problem is not serious as maximum distances measured in the denatured state and the compact intermediate were shorter than 6 nm. As a consequence of the low signal-to-noise ratio Kapitel III 234 3 Ergebnisse in such samples, now the ill-posedness complicates the computation of reliable dis- tance distributions. This problem is not encountered in computing dipolar spectra from the primary data, because here the influence of noise can be estimated precisely. The integrated area under dipolar spectra at high frequencies declined during LHCII as- sembly, reflecting the diminishment of very short distances in the distance distribution. These integrals were used as a monitor for assessing the kinetics of LHCII protein fold- ing (Fig. 4). The two spin label pairs yielded distinctly different kinetics. The distance distri- bution between positions 106/160, spanning the length of the middle helix (H3), changed between time points 40 s and 150 s and remained unchanged thereafter, de- fining a maximum for the apparent time constant of 54 s (Fig. 4). The data points for the distance distribution between positions 90/196 (H1/H4), describing the distance between the two intertwined transmembrane helices, could be fitted with a single expo- nential yielding an apparent time constant of 294 s. These two time windows corre- spond to the ones seen in time-resolved fluorescence measurements of LHCII assem- bly, monitoring the assembly of Chls into the complex. Under the reaction conditions used for the EPR measurements, apparent time constants were obtained of (26 ± 11) and (178 ± 114) s (SI Text, Fig. S4 and Table S1). Earlier experiments had shown that the faster phase represents the binding mostly of Chl a, whereas the slower one re- flects the binding of Chl b exclusively. The former phase leads to an instable intermedi- ate that dissociates upon dilution while the slower Chl b binding coincides with the final stabilization of the complex (7). We cannot at this point prove that the similar kinetic phases detected by EPR and fluorescence reflect the same molecular events. How- ever, it would be conceivable if the slow juxtaposition of the two intertwined helices is connected with Chl b binding and the stabilization of the LHCII structure (Fig. 5). The faster positioning of the labels on either end of helix H3 then coincides with the faster binding step in which the Chl a binding sites are filled. The distance between these two labels (106/160) is probably defined by the formation (or completion) of helix H3. Ear- lier CD measurements had revealed that α-helix formation in LHCII apoprotein (beyond the helical structure pre-formed in dodecyl sulfate solution) is dependent on pigment binding (22) and that most but not all of it happens during the faster reaction phase in the range of 10 s to 1 min. The helix formation positioning labels 106/160 is not likely to be triggered by Chls binding locally to this helical domain, since these are all Chl b binding sites whose occupation takes place during the slower kinetic phase of several min. The nearest Chl a binding site is that of Chl 6. Although its central Mg2+ binds to Gly 78 in H1, Chl 6 is also close to a short β-sheet and the short amphiphilic helix H2 in the lumenal loop. This interaction could trigger the formation of secondary and tertiary structure in the lumenal loop and, thus, promote the completion of helix H3. The juxtaposition of the intertwined helices during the slower phase of LHCII formation corresponds to stage 2, the positioning of transmembrane helices, in the 2- Kapitel III 3 Ergebnisse 235 stage model proposed by Popot and Engelman (30) as a general folding scheme of α- helical membrane proteins. Stage 1 in this model is the faster formation of α-helices. In the case of LHCII protein folding, α-helix formation extends to later stages; this may be attributed to the unusually large number of more than 15 pigments as cofactors (31, 32) which make up roughly one third of the total mass of the final LHCII structure and clearly play a pivotal role in its formation. Folding analysis by DEER gives a view on the structural behavior of individual protein domains and thus opens up the possibility to analyze how individual groups of pigments modulate the folding procedure. In combina- tion with time-resolved ESEEM measurements of singly spin-labeled domains as well as reconstitution studies using various pigment stoichiometries, DEER has the capabil- ity to resolve the assembly process of LHCII in vitro in a detailed manner. Furthermore, if spin label positions and measurement conditions are carefully chosen, the analysis of structural changes by DEER may become sensitive enough as to study the folding of LHCII protein or other proteins in an environment more similar to their native ones such as lipid vesicles, the thylakoid, or other biological membranes. Fig. 5. Proposed folding model for LHCII in vitro. After mixing the LDS-denatured spin- labeled Lhcb1 with pigments, DEER revealed a folding process with two apparent phases in the range of less than 1 min and several min. Formation of secondary and tertiary structure are assigned to the first and second phase, respectively, both triggered by cofactor binding. ACKNOWLEDGEMENT We thank Hans Wolfgang Spiess for providing access to a pulsed EPR spectrometer and Götz Grundmann for performing time-resolved fluorescence measurements. This work was supported by Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 625/TP B10 (to G.J. and H.P.) and by SNF grant 200021_121579 (to Y.P.). Kapitel III 236 3 Ergebnisse REFERENCES 1. Matile P, Hörtensteiner S, Thomas H, Kräutler B (1996) Chlorophyll breakdown in senescent leaves. Plant Physiol 112:1403-1409. 2. Standfuss J, Terwisscha van Scheltinga AC, Lamborghini M, Kühlbrandt W (2005) Mecha- nisms of photoprotection and nonphotochemical quenching in pea light-harvesting complex at 2.5 Å resolution. EMBO J 24:919-928. 3. Paulsen H, Rümler U, Rüdiger W (1990) Reconstitution of pigment-containing complexes from light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein overexpressed in Escherichia coli. Planta 181:204-211. 4. Plumley, FG, Schmidt GW (1987) Reconstitution of chlorophyll a/b light-harvesting com- plexes: Xanthophyll-dependent assembly and energy transfer. Proc Natl Acad Sci USA 84:146- 150. 5. Booth PJ, Paulsen H (1996) Assembly of light-harvesting chlorophyll a/b complex in vitro. 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The spin label used in SDSL was PROXYL, which we found advantageous compared to TEMPO used earlier (1). Besides their smaller size with lower internal dynamics, their chemical stability was higher, particularly towards low pH and reductants. TEMPO spin labels reacted quite sensitive towards chemicals such as trichloroacetic acid, DTT or β-mercaptoethanol (β-Me). The latter are thought to reduce the paramagnetic ni- troxyl group to the nonparamagnetic hydroxylamine form (2-4). As reductants are an essential component in the reconstitution of Lhcb1, the use of PROXYL was preferable, yielding an acceptable signal-to-noise ratio at lower protein concentrations. The efficiency of spin labeling was quantified by subsequent fluorescence label- ing with a 50-fold molar excess of BODIPY 507/545 IA [N-(4,4-difluoro-1,3,5,7- tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-2-yl)iodoacetamide] as described previ- ously (1) and found to be higher than 90% for mutants containing a singular Cys, indi- cating that more than 80% of the mutants used for distance measurements carried two labels (not shown). An Lhcb1 mutant possessing no Cys did not give any EPR signal after the spin labeling reaction (not shown) indicating that labels were specifically at- tached to sulfhydryl groups. The labeled apoproteins were reconstituted with pigments according to the standard procedure as described in (5) with the exception that 10 mM β-Me was used as reductant. Purification of LHCII and preparation of EPR samples are described in (1). Purified complexes were compared to those reconstituted with the non-labeled WT protein. Neither CD spectra in the visible range nor the intramolecular energy transfer from chlorophyll (Chl) b to Chl a (6) showed any difference between the two, demon- strating that spin labeling did not affect the structure or function of LHCII (not shown). Folding and characterisation of recombinant spin-labeled LHCII using a modified reconstitution protocol for EPR kinetic measurements. For measuring the kinetics of Lhcb1 folding by time-resolved EPR measurements (mu- tants 106/160 and 90/196) we used the well-established reconstitution in vitro of LHCII from its protein and pigment compounds. However, in order to meet the demands of required spin label concentrations for a good signal-to-noise ratio in EPR (7), the re- constitution procedure had to be modified substantially, raising protein and pigment concentrations by a factor of 20 as compared to earlier time-resolved fluorescence measurements of LHCII assembly (8). A ternary mixture of detergents was necessary to avoid Chl aggregation during the experiments. Pigments were extracted as described in (9) except that the extraction step with diethyl ether was omitted. Freeze-dried pigments [threefold molar excess of total Chl Kapitel III 3 Ergebnisse 239 over protein] were dissolved in ethanol (20 mg/ml) and mixed by vortex with reconstitu- tion buffer 1 containing 100 mM lithium borate (pH 8.1), 12.5% (w/v) sucrose, 6% (w/v) n-octyl-ß-D-glucoside (OG), 1% (v/v) Triton X-100 (Tx-100), 0.26% (w/v) 1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol (PG), 0.02% (w/v) deoxycholic acid and 10 mM β-Me. The protein solution contained 160 µM spin-labeled Lhcb1 and 1% (w/v) lithium dodecyl sulfate (LDS) in reconstitution buffer 2 [10 mM β-Me, 100 mM lithium borate (pH 8.1) and 12.5% (w/v) sucrose]. Reconstitution was initiated by manually mixing the protein and pigment solutions at a ratio of 1:1 in a 1.5 ml reaction tube by using a vortex mixer at room temperature (“re- constitution for EPR measurements”). After the reaction times given the samples were mixed at a 1:1 volume ratio with 80% glycerol as a cryoprotectant immediately before loading them to EPR tubes and were flash-frozen in liquid nitrogen. This manual freeze-quench procedure took (10±1) s. Each data point in the EPR-kinetic measure- ments represents an independently mixed protein sample exhibiting a final protein con- centration of about 40 µM LHCII. To check that all labeled versions of the various Lhcb1 mutants had folded into a functional structure, 50 µl of the EPR sample of each mutant were diluted with 100 mM lithium borate (pH 8.1, 100 µl) lacking sucrose and concentrated at 3000 g in a 30 kDa Centricon filter unit (Millipore) at 4°C. After repeat- ing this step twice, samples were purified via ultracentrifugation as reported before (1) to compare them with complexes reconstituted by standard reconstitution procedure that have lower protein and pigment concentrations. Fluorescence emission spectros- copy (6) and CD spectroscopy in the visible domain (10) were performed as described elsewhere. As shown for spin-labeled mutant 106/160 in Fig. S5 the complexes folded via the modified method exhibited the expected separation into free pigment (FP), folded protein-pigment complexes (LHCII) and aggregated Chls (aChls). Fig. S5. Purification of reconstituted LHCII mutant 106/160 via sucrose gradient ultracentrifugation. After centrifugation in a Beckman SW 60 Ti rotor for 17h at 230000 x g and at 4°C, three bands were distinguished. FP is free pigment, aChl are aggregated Chls and LHCII is reconstituted and spin-labeled LHCII. The isolated monomeric LHCII complexes were checked for their functionality measuring the molecular energy transfer from Chl b to Chl a and for their correct assembly using CD spectroscopy in the visible range (Fig. S6, trace b). The CD showed the charac- teristic “fingerprint” signals of native LHCII or recombinant LHCII containing the WT protein sequence reconstituted according to the standard protocol (Fig. S6, trace a) indicating the pigments to be correctly arranged in the complexes. Kapitel III 240 3 Ergebnisse Fig. S6. CD spectra of LHCII after purification via sucrose gradient ultracentrifugation, (a) non- labeled LHCII apoprotein (WT protein sequence) reconstituted by standard reconstitution and (b) spin-labeled mutant 106/160 reconstituted for kinetic measurements (reconstitution for EPR measurements). Spin-labeled LHCII was further characterized by comparing the DEER dipolar spectra (Fig. S4) of isolated monomeric complexes reconstituted by the standard method with non-isolated complexes folded by the new, modified method for EPR measurements. As shown for the mutants 106/160 (Fig. S4A) and 90/196 (Fig. S4B), the different reconstitution procedures yield identical folding products. Fig. S4. Comparison of DEER dipolar spectra of the spin-labeled LHCII mutants 106/160 (A) and 90/196 (B) reconstituted by different protocols. Gray traces are monomeric LHCII samples reconstituted by the standard procedure and purified by ultracentrifugation, black traces are monomeric LHCII samples reconstituted by the protocol for EPR measurements without purifi- cation (approximately 930 s folding time). Spectra were scanned with a dipolar evolution time of 2500 ns, the background correction time for A and B was 320 ns and 224 ns, respectively. Kapitel III 3 Ergebnisse 241 Time-resolved fluorescence measurements using the modified reconstitution protocol for EPR measurements. Although the modified reconstitution procedure for EPR measurements yields the same complexes, the kinetics of complex formation by the new and the standard reconstitu- tion procedure still had to be compared. In this experiment an acceptor fluorophore (DY731, Dyomics) was covalently attached to a single Cys in the stromal loop domain in LHCII (mutant 160, single Ser replaced by Cys) and time-resolved fluorescence measurements were performed according to Horn et al. (9) using excitation and emis- sion wavelengths of 470 nm and 759 nm, respectively. Purified dye-labeled LHCII exhibited a high Förster-type energy transfer effi- ciency showing that both Chl a and b are energy donors to the attached fluorophore. Measurements of the energy transfer during LHCII assembly resulted in an increase of the acceptor dye’s fluorescence emission due to Chl binding in dependency on the folding time. The data revealed two apparent kinetic phases for the binding of the pig- ments (Table S1, standard reconstitution), a faster one (τ1) in the range of seconds to 1 min and a slower one (τ2) in the range of several minutes. This experiment was re- peated (Fig. S7) by using the reconstitution protocol for EPR measurements with high protein and pigment concentrations. Fig. S7. Folding of LHCII as monitored by the rise of Chl-stimulated acceptor dye (DY731) fluorescence at 759 nm. Reconstitution was performed by using the EPR reconstitution proce- dure. The white line in the trace represents the biexponential fit in Table S1 (EPR reconstitu- tion). Residuals, i.e. kinetic trace minus fitted curve, are given in the lower panel. Kapitel III 242 3 Ergebnisse The analysis of this kinetic trace yielded two time constants of about 26 s (τ1) and 178 s (τ2) as shown in Table S1. Both apparent reaction phases are somewhat faster than seen in the earlier measurements, as is expected because of the higher concentrations of reactants (11). This shows that the modified reconstitution procedure does not sub- stantially alter the kinetics of LHCII assembly as compared to the standard procedure. Table S1. Kinetic data extracted from time-resolved fluorescence measurements of LHCII assembly. Standard reconstitution is described in (9). τ1 τ2 Experiments Conc.a (s) ± SDb (s) ± SD A1/A2 ± SD standard reconstitution 3.9 µM 41 ± 9 260 ± 53 0.9 ± 0.08 EPR reconstitution 78 µM 26 ± 11 178 ± 114 3.1 ± 1.84 a Protein concentration after reconstitution. b SD, standard deviation. Rapid freeze-quench of samples for DEER experiments. Samples were prepared by a two-step mixing of LDS-denatured apoprotein first with the pigment solution and then with 80% glycerol as a cryoprotectant. An Update In- strument System 1000 rapid mixer (Update Instruments Inc, Wisconsin, MA, USA) with four independent syringe shafts was used for this purpose. Three syringes were filled with apoprotein solution, pigment solution, and 80% glycerol as a cryoprotectant. The protein and pigment solutions were combined in a first grid mixer and this mixture was then combined with glycerol in a second grid mixer. All tubes connecting the syringe outlets and grid mixers were kept as short as possible to avoid unnecessary dead vol- ume. From the output of the second mixer the solution was sprayed onto a brass funnel cooled with liquid nitrogen. A dry nitrogen gas stream was directed to the funnel paral- lel to the mixture to stop recoiling sample droplets and lead them back to the funnel. This stream also minimized water condensation on the funnel and the sample particles. Sample particles were transferred to the sample tube by manually scraping them from the brass surface into an EPR tube attached to the lower end of the funnel. In a control experiment, the protein/pigment mixture was extracted from the outlet of the first mixer before glycerol addition, was allowed to fold for 30 min in the dark, and the extent of folding was checked by denaturing LDS-PAGE (vide infra). Kapitel III 3 Ergebnisse 243 Check of samples for correct protein folding using partially denaturing LDS- PAGE, ESE EPR and T2 relaxation measurements. Kinetic EPR experiments with shorter folding times yielded only partially assembled LHCII. To verify that all these samples had the same competence for folding and re- sulted in the same fraction of unfolded protein, an aliquot was taken from each EPR sample at the end of the reaction time, before adding glycerol, and folding was com- pleted for 30 min at room temperature. The aliquots were then run on a partially dena- turing LDS-PAGE (12). Only samples that exhibited a strong green band of folded complex (Fig. S8A) and that displayed around 50% of folded LHCII after Coomassie Brilliant Blue-staining (Fig. S8B) were used for evaluating the EPR data. Hence, un- folded protein adds a constant offset to the high-frequency integral used in evaluating folding kinetics, so that the time-dependence is not influenced. Fig. S8. PAGE analysis of reconstituted LHCII (reconstitution for EPR measurements). Par- tially denaturing LDS-PAGE on 10% polyacrylamide gel at 4°C and 80 V, (A) unstained, (B) Coomassie Brilliant Blue-stained. (1) Spin-labeled double mutant 106/160, (2) spin-labeled dou- ble mutant 90/196. Samples that passed this first check were subjected to ESE EPR and T2 relaxa- tion measurements (13). EPR spectra were measured with field-swept echo detected EPR using a Hahn echo sequence π/2-τ-π-τ-echo and a 15 mT field sweep. The inter- pulse delay time τ was 200 ns and the pulse lengths were 16 ns for π/2 pulse and 32 ns for π pulse and the integration gate length was 200 ns. The effect of short distances in unfolded or partially folded LHCII on transverse relaxation time T2 was estimated by instantaneous diffusion measurements using a two-pulse ESE sequence. The flip angle β of the second pulse was varied by reducing microwave power with the main attenuator, and phase memory times Tm(β) were ob- tained by fitting exponentials to the ESE decays measured as a function of the inter- pulse delay. The slope of linear fits to plots of 1/Tm as a function of sin2(β/2) is a meas- ure for local spin concentration. A significant increase of 1/T with sin2m (β/2) thus indi- Kapitel III 244 3 Ergebnisse cates either aggregation of spin-labeled molecules or a high prevalence of short in- tramolecular distances in a broad conformational ensemble of structures. As shown in Fig. S3, aggregated Lhcb1 apoprotein (90/196) folded in mock re- constitutions lacking pigments (gray line), resulted in a characteristic ESE spectra showing only slight differences in the intensity of the major peak at 329 mT and the side peaks at 326 mT and at 332 mT. In comparison, LHCII folded by the reconstitution procedure for EPR measurements resulted in characteristic ESE spectra with a distinct major peak at 329 mT indicating that no protein aggregates were formed (Fig. S3, black line). At the same time such samples displayed relaxation times T2 longer than 2000 ns (not shown) also indicating the absence of protein aggregates. Only samples that passed these criteria were used for time-resolved DEER measurements. Fig. S3. ESE EPR spectra of two samples of the LHCII mutant 90/196. The black line repre- sents folded complexes (reconstitution for EPR measurements); the gray line represents aggre- gated Lhcb1 apoprotein obtained by a mock reconstitution containing no pigments. Spectra are B0 field-shifted and normalized on the intensity of the central peak. Processing parameters in DEER data analysis. For measurements with τ2= 1500 ns, data after a maximum evolution time of 1400 ns were cut off. This cut-off time was set to 2400 ns for τ2= 2500 ns and to 800 ns for the kinetic measurements with the unfolded protein in buffer 1. A background function was fitted to the data at dipolar evolution times t>tb. Starting time tb was determined automatically as described in Jeschke et al. (14) and is given explicitly in the results section. For measurements with unfolded and completely folded samples experimental background functions were determined from data of mix- tures of the two corresponding singly spin-labeled proteins by fitting a 5th order poly- nomial. For measurements with partially folded samples an exponential decay function corresponding to a three-dimensional homogeneous distribution of spins was used. Kapitel III 3 Ergebnisse 245 After background correction of the data the distance distribution was determined by Tikhonov regularization with a regularization parameter α=1000, except for the folded double mutant 90/196, where α=1000 lead to overdamping and α=100 was used. Dipo- lar spectra were normalized to their integral. SI REFERENCES 1. Jeschke G, et al. (2005) Localization of the N-terminal domain in light-harvesting chlorophyll a/b protein by EPR measurements. 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In der NMR-Spektroskopie stellt entweder die wegen der mit einzubeziehenden Detergenzhülle meist erhebliche Größe von solubili- sierten Membranproteinen oder die benötigte Proteinmenge ein Problem dar. Die eng verwandte EPR-Spektroskopie stellt eine alternative Technik zur Untersuchung von Proteinstrukturen in Lösung dar. Hauptvorteil der Methode gegenüber der NMR- Spektroskopie ist die höhere Empfindlichkeit und das geringe erforderliche Probenvo- lumen (Jeschke et al., 2007). Die Methode des „site-directed spin labeling“ (SDSL), die das grundlegende Einbringen von Spinmarkern in diamagnetische Proteine gewährleis- tet, ist seit über 30 Jahren etabliert (Berliner, 1976; Altenbach et al., 1989; Hubbell et al., 1998) und konnte erfolgreich auf den rekombinanten LHCII übertragen werden (Bender, 2004). Durch Verbesserung der Mutagenese- und Markierungstechnik konnte eine große Zahl funktionaler, spinmarkierter Mutanten des monomeren und trimeren LHCII hergestellt (Kap. I) und EPR-spektroskopisch untersucht werden. Der Vergleich der etablierten CW-EPR-Technik mit verschiedenen Puls-EPR- Techniken zur Bestimmung der Lösungsmittel-Zugänglichkeit einzelner Aminosäuren- Seitenreste von Membranproteinen wurde bereits ausführlich in Volkov et al. (2009) dargestellt und diskutiert. Identische Ergebnisse aus CW- und Puls-EPR-Messungen verifizierten insbesondere das enorme Potential von ESEEM-EPR zur Detektion lokaler Strukturinformation in Membranproteinen. Mit Ausnahme der lumenalen Mutante 106 und einiger N-terminaler Mutanten (Müller, 2008) besaßen alle vermessenen Amino- säuren-Seitenreste des monomeren LHCII, solubilisiert in LM-Mizellen, die aus Kristall- daten erwartete Zugänglichkeit zum Lösungsmittel. Die in Barros & Kühlbrandt (2009) diskutierte rigide Struktur des LHCII-Kernbereichs ist gemäß diesen ESEEM-Daten auch für rekombinanten LHCII in Detergenzlösung gültig. Durch Erstellung einer „Abstandskarte“ mittels DEER-EPR sollte dieses Ergeb- nis weiter untermauert werden. Das große Potential dieser Methode hinsichtlich der Aufklärung von Proteinstruktur konnte bereits vielfach verifiziert werden (Jeschke et al., 2005; Altenbach et al., 2008; Klein et al., 2008, Jao et al., 2008; Hilger et al., 2009). Um zuvor ermittelte Abstandsdaten des rekombinanten LHCII in Lösung (Jeschke et al., 2005) zu erweitern, wurden zunächst kristallographisch erfasste Domänen des mo- Kapitel III 4 Diskussion 247 nomeren LHCII in Detergenzlösung abstandsvermessen und mit einer optimierten, Kristallstruktur-basierten Rotamer-Datenbank verglichen (Polyhach, unveröffentlicht). Auch diese Messungen zeigten in rekombinanten Monomeren, solubilisiert in Deter- genz, für den Kernbereich eine identische Struktur mit der in kristallinen Trimeren. Be- denkt man die extrem hohe Dichte an gebundenen Kofaktoren, peripher eingerahmt durch 3 transmembrane Helices, ist dies kaum anders zu erwarten. Laut Barros & Kühlbrandt (2009) ist dies aus dem Vergleich ermittelter Kristalldaten des LHCII aus Erbse (Standfuss et al., 2005) mit denen aus Spinat (Liu et al., 2004) ersichtlich. Die Überlagerung zeigt, dass beide Strukturmodelle für Position 14 bis 220 praktisch de- ckungsgleich sind, die „root mean square (rms) deviation“ liegt lediglich bei 0,4 Å, der größte detektierte Unterschied zwischen zwei identischen Atomen bei 1,2 Å. Insbeson- dere die zentralen Bereiche des LHCII, also die transmembranen Helices sowie die gebundenen Pigmente, zeigen in beiden Analysen identische Strukturen. Signifikante Abweichungen sind lediglich in membranoberflächen-exponierten Schleifenregionen zu finden. Gleiches gilt für die Berechnung des B-Faktors. Dieser kristallographische Temperatur-Faktor definiert die interne Flexibilität eines Proteins. Auch hier sind zent- rale Bereiche des LHCII rigide, Schleifenregionen, die ins umliegende Lösungsmittel ragen, etwas flexibler. Neben diesem Ergebnis zeigte der Vergleich der DEER-Daten mit Abstandsver- teilungen der Kristallstruktur-basierten Rotamer-Datenbank zudem das Auftreten von Abstandsartefakten, die nicht mit der Kristallstruktur zu vereinbaren sind. Dass es sich bei den meist deutlich zu kurzen oder deutlich zu langen Abständen um eine Struktur- änderungen innerhalb des Kernbereichs handelt, ist wie zuvor diskutiert eher unwahr- scheinlich. Die Auswertung der primären DEER-Daten durch Prof. Dr. G. Jeschke und Dr. A. Volkov zeigte, dass solche LHCII-Proben bei Verringerung der Modulationstiefe ähnliche Modulationen wie Trimere entsprechender Einzelmutanten besitzen. Zudem war es möglich, durch Anwendung einer experimentellen Hintergrundkorrektur, solche Nebenmaxima deutlich zu reduzieren, während Hauptmaxima wenig beeinflusst wur- den (Volkov, 2008). Auffällig war zudem die verstärkte Detektion solcher Nebenmaxi- ma in „monomeren“ LHCII-Proben, trimere Proben zeigten dieses Problem nicht. Diese Befunde müssen als starker Hinweis auf eine Verunreinigung monomerer Proben mit nachträglich trimerisiertem LHCII gewertet werden. Untersuchungen von Bender (2004) zeigten, dass aufgereinigte, monomere LHCII-Proben während der Aufkon- zentration in Filtereinheiten zu geschätzten 5 bis 10 % trimerisieren können (was 1,65 % bis 3,3 % an Trimeren entspricht). Dieses Ergebnis konnte durch CD- spektroskopische Untersuchung einzelner Proben zu Beginn der Dissertation zunächst nicht bestätigt werden. Wie in Bender zudem argumentiert wurde, wäre das durch die geringe Zahl der Trimere entstehende Signal vernachlässigbar klein und würde dem- nach im Hintergrund-Rauschen verloren gehen. Kapitel III 248 4 Diskussion Dass diese Argumentation allerdings nicht allgemein gültig ist, soll am Beispiel der Mutante 90/123 gezeigt werden. Die entsprechende „monomere“ Probe zeigt in der DEER-Abstandsverteilung (Abb. 3.3.7) neben dem erwarteten Hauptmaximum um 3,45 nm noch ein Nebenmaximum um 5 nm. Letzteres Maximum ist identisch zu DEER- Daten der Trimere 123 und somit ein recht sicheres Indiz für eine Trimer- Verunreinigung. Insgesamt können in einer angenommenen Mischprobe aus zweifach markierten Monomeren und homogen sechsfach markierten Trimeren der Mutante 90/123 fünf unterschiedliche Abstandskombinationen erwartet werden. Neben dem intramolekularen Abstand von 3,45 nm, sind intermolekulare Cα-Abständen von ca. 4 und 5 sowie zweimal 6 nm möglich. Diese „Artefakt“-Abstände wären also nicht breit verteilt, sondern würden zu einem Nebenmaximum langer Abstände addiert werden, was an folgendem Rechenbeispiel kurz dargelegt werden soll. Man nehme eine voll- ständig spinmarkierte Probe an, die 3,3 % Trimere enthält (was umgekehrt 96,7 % Mo- nomerabstände bedeutet, da sowohl Monomere als auch Trimere den intramolekularen Abstand zeigen). Diese intramolekularen Abstände ergeben eine Modulationstiefe von 0,967*0,4 (entspricht 0,387), wobei 0,4 die Modulationstiefe für einen benachbarten Spin ist. Im Trimer sieht der Spinmarker nicht einen Nachbarn, sondern fünf. Die Modu- lationstiefe ist dann 1-(1-0.4)5, was einem Wert von 0,92 entspricht. Wenn alle Abstän- de im beobachtbaren Bereich zwischen 2 und 6 nm liegen, ergibt dies einen Beitrag von 0,033*0,92 (entspricht 0,0304) zur Modulationstiefe. Damit stammen 92,7 % des Signals aus dem Monomer, 7,3 % aus dem Trimer (G. Jeschke, schriftliche Mitteilung). Sind die intermolekularen Abstände wie im gewählten Beispiel (Mutante 90/123) ein- ander ähnlich, ist also die Entstehung signifikanter Nebenmaxima möglich. Die Detektion solcher Störsignale bestätigt auf der einen Seite die hohe Emp- findlichkeit der Methode, andererseits wird die Wertigkeit der ermittelten DEER-Daten von LHCII-Monomeren verringert, da im Nachhinein nicht mehr geprüft werden kann, wie stark der Grad der Verunreinigung einzelner Proben war. Dies gilt insbesondere für kristallographisch nicht erfasste Markierungspositionen, wie später diskutiert werden soll. Zwar ist es bis zu einem gewissen Grad möglich mittels experimenteller Hinter- grund-Korrektur Artefakt-Abstände von realen Abstandsdaten zu trennen (Volkov, 2008), in Zukunft sollte aber versucht werden, die nachträgliche Trimerisierung in der Proben-Präparation von Beginn an zu vermeiden. Hierzu sollte untersucht werden, ob das Phospholipid PG, welches im nativen Totalpigmentextrakt in der Rekonstitution zu variierenden Konzentrationen enthalten ist, Einfluss auf den Grad der Trimerbildung hat. Ein guter Ansatz wäre sicherlich die Rekonstitution mit lipidfreien Einzelpigmenten, wegen des hohen Pigmentverbrauchs in EPR-Präparationen stellt dies auf Dauer auf- grund des erheblichen Arbeitsaufwandes keine Lösung dar. Weniger arbeitsintensiv wäre der Verdau des PG in der Rekonstitutionslösung durch Inkubation mit Phospholi- pase A2 (Nussberger et al., 1993) mit nachfolgender Aufreinigung durch Saccharose- Dichtegradienten-Zentrifugation. Kapitel III 4 Diskussion 249 Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die vorgestellten Puls-EPR- Methoden sich hervorragend zur Untersuchung der Struktur von Membranproteinen in Lösung eignen. Während die Stärke der ESEEM-Spektroskopie in der Detektion der lokalen Wasserzugänglichkeit liegt, ermöglicht DEER-EPR die Erstellung von Domä- nen- „Abstandskarten“. Monomere LHCII-Proben in Detergenzlösung zeigen in Puls- EPR-Messreihen, dass der membranständige Kernbereich der transmembranen Heli- ces identisch zur Kristallstruktur nativer Trimere ist. Durch die tertiäre Struktur des He- lixkreuzes und durch die Bindung zahlreicher Kofaktoren in diesem Bereich war dies zu erwarten (Barros & Kühlbrandt, 2009). In weiterführenden Versuchsreihen sollte die ungewollte Trimerisierung in monomeren Proben verhindert werden. So kann das Po- tential der DEER-Spektroskopie, welche durch ihre hohe Empfindlichkeit selbst Präpa- rationsartefakte detektiert, besser genutzt und ermittelte Daten bezüglich der LHCII- Struktur verifiziert werden. In diesem Zusammenhang wären zudem Versuche mit he- terogen markierten Trimeren (Kap. II) sinnvoll, um zum einen den direkten Vergleich zwischen Monomer und Trimer in Detergenz-Mizelle und zum anderen zu kristallinen Trimeren anstellen zu können. 4.2 Strukturdynamik der lumenalen Schleifenregion in rekombinantem LHCII Puls-EPR-spetroskopische Messungen belegen, dass rekombinanter LHCII im Kernbe- reich eine identische Struktur zu kristallinem LHCII besitzt. Inwiefern dieser Kernbe- reich des LHCII Strukturdynamik zeigen kann, ist umstritten und wird derzeit kontrovers diskutiert (Liu et al., 2004; Standfuss et al., 2005; Ruban et al., 2007; Barros & Kühlbrandt, 2009). Da der zentrale Bereich von den transmembranen Helices gebildet und äußerst dicht mit Pigmenten besetzt ist, bleibt hier eine Strukturflexibilität fraglich. Wahrscheinlicher wäre eine Strukturänderung des Proteinrückgrates in Schleifenregio- nen, wie aus dem Vergleich der Kristallstrukturen hervorgeht (Barros & Kühlbrandt, 2009). Abschnitte stromaler oder lumenaler Schleifenregionen ragen zudem in das Lösungsmittel (Liu et al., 2004), wodurch sie zugänglich sind für physiologische Vor- gänge wie beispielsweise die Veränderung des pH-Wertes (Yang et al., 2008). Ein di- rekter Nachweis einer Strukturänderung existiert bis dato jedoch nicht. Einen möglichen Hinweis auf Strukturdynamik im LHCII bietet die CD- Spektroskopie in der Soret-Region. Während rekombinante Trimere, solubilisiert in LM, ein signifikantes Minimum bei 473 nm zeigen, ist dies in rekombinantem Monomer (in LM) nicht ausgeprägt (Hobe et al., 1994). Ähnliche Effekte können auch durch Variati- on des Neoxanthin-Gehalts (Hobe et al., 2006), durch Veränderungen im Peptidrück- grat zwischen Position 106 und 123 (Christian, 2008; Dietz, 2008; Liu et al., 2008) so- wie durch Wechsel des Detergenz zu α-DM (Georgakopoulou et al., 2007) oder TX (Boggasch, 2006) detektiert werden. Letzterem Anhaltspunkt folgend wurden spinmar- Kapitel III 250 4 Diskussion kierte Monomere und Trimere des rekombinanten LHCII in den Detergenzien LM oder TX solubilisiert und mittels DEER-EPR abstandsvermessen. Der Vergleich der Abstandsdaten des LHCII in unterschiedlichen Detergenz- Mizellen lieferte innerhalb des Kernbereichs keine signifikanten Strukturunterschiede, auch in TX-Mizellen scheint der Kernbereich des monomeren LHCII baugleich zu dem der kristallinen Trimere (Kap. III, 4.1) zu sein. Wie zuvor diskutiert, sind auch in TX ne- ben den erwarteten Hauptmaxima teilweise deutliche Nebenmaxima zu detektieren. Diese sind in einzelnen Proben unterschiedlich stark ausgeprägt, zeigen aber stets identische Abstände zu LM-Proben und deuten auf die Verunreinigung mit nachgebil- deten Trimeren hin. Dieses Problem erschwert erneut die Interpretation der Ergebnis- se. Ohne das Wissen über den Grad der Verunreinigung erhält die nachfolgende Dis- kussion spekulativen Charakter, eine gesicherte Interpretation ist nur durch weitere Versuchsreihen möglich. Auffällig ist zweifellos die variable Intensität der detektierten Nebenmaxima unabhängig vom verwendeten Detergenz, was gegen eine bevorzugte Oligomerisierung in einem der Detergentien spricht. In TX-solubilisierter Mutante 90/123 (Abb. 3.3.9 A) beispielsweise nehmen die Intensitäten der Nebenmaxima im Vergleich zum Hauptmaximum (3,45 nm) deutlich zu, was mit einer Erhöhung des Oli- gomerisierungsgrades gleichzusetzen ist. Umgekehrt bestätigt dies die Annahme, dass es sich bei den Abständen um 3,45 nm, die in ihrer Häufigkeit nicht zunehmen, um die intramolekulare Spin-Spin-Distanz handelt. Insbesondere diese lumenale Mutante liefert weitere interessante Erkenntnisse. Wie zuvor angesprochen, zeigt Mutante 90/123 eine deutliche Abweichung der gemes- senen zu theoretisch erwarteten Abständen. Ähnliches kann für die Trimere der Positi- on 123 detektiert werden. Die ermittelten Abstände sind signifikant kürzer als in der Rotamer-Simulation erwartet, in LM sind Abstände zudem breit verteilt, in TX dagegen ausgesprochen schmal. Dies deutet auf eine gewisse Variabilität der Position 123 hin, wie in Abb. 3.4.1 schematisch dargestellt ist. Die lumenale LHCII-Aufsicht zeigt die Positionen 90, 123 und 196 eines Monomers sowie alle Positionen 123 des Trimers rot markiert. Der orange-farbene Kreis stellt schematisch das Hauptmaximum der DEER- Abstandverteilung der Trimere 123 dar, der Kreisradius wurde entsprechend aus der Abstandsverteilung berechnet (Triangulation). Unterschiedlich zu den Markierungsposi- tionen in der Kristallstruktur müssen in rekombinantem LHCII die drei Spinmarkierun- gen auf dieser Kreisbahn (symmetrisch verteilt) liegen. Die Abstandsdaten der Mono- mere 90/123 (blauer Halbkreis ausgehend von Position 90) sind etwas länger als er- wartet, die der Monomere 123/196 (grüner Halbkreis ausgehend von Position 196) entsprechen der theoretischen Erwartung. Grundvoraussetzung für diese Art der Dar- stellung ist die rigide Lage der Positionen 90 und 196, was durch die schmale Ab- standsverteilung der entsprechenden Doppelmutante anzunehmen (Abb. 3.3.6) und durch den schwarzen Balken gekennzeichnet ist. Weiterhin gilt zu beachten, dass es sich lediglich um eine schematische, zweidimensionale Abbildung handelt. Zwar liegen Kapitel III 4 Diskussion 251 alle Spinmarker etwa in gleicher Ebene (196 liegt etwas tiefer innerhalb der Membran; Standfuss et al., 2005), eine sphärische Abbildung oder Modellierung wäre aber in je- dem Fall genauer. Abb. 3.4.1: DEER-spektroskopische Analyse der lumenalen Schleifenregion. Das Peptidrück- grat ist grau in lumenaler Aufsicht dargestellt (PDB-Eintrag 2BHW), die Positionen der Amino- säure 123 im Trimer sowie 90 und 196 im Monomer sind dunkelrot hervorgehoben. Die Abbil- dung wurde mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). Der orange-farbene Kreis markiert das Maximum der DEER-Abstandsverteilung im Trimer 123, der schwarze Balken das Maximum der signifikant schmalen Abstandsverteilung 90/196. Der Radius des blauen Halbkreises entspricht dem Hauptmaximum der Abstandsverteilung 90/123 mit Position 90 als Mittelpunkt, der grüne Halbkreis entsprechend 123/196 mit 196 als Mittelpunkt. Trotz der vereinfachten Darstellung ist ersichtlich, dass die Lage des Nitroxidmarkers der Detergenz-solubilisierten Probe gegenüber der Kristallstruktur in Richtung des C- Terminus des gegenüberliegenden Monomers versetzt liegen muss (Schnittpunkt der Kreisbahnen) und damit auf eine Strukturänderung hindeutet. Tatsache ist zudem, dass ausgerechnet diese Region in der Überlagerung der bekannten Kristalldaten in ihrer Struktur leicht voneinander abweicht, gekennzeichnet durch eine entsprechend höhere „rms deviation“ (Barros & Kühlbrandt, 2009). Wichtig ist hierbei zu erwähnen, dass der leichte Strukturunterschied in den Kristallen aber in der Bindung des periphe- ren DGDG in Liu et al. (2004) begründet sein kann. Außerdem gilt zu bedenken, dass beide Strukturmodelle (Liu et al., 2004; Standfuss et al., 2005) anhand nativer LHCII- Proben erstellt wurden. Wie zuvor beschrieben, sind native LHCII-Trimere heterogen aus den Genprodukten Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3 aufgebaut, welche in ihrer Aminosäu- resequenz, insbesondere innerhalb der lumenalen Schleife, voneinander abweichen und dadurch eine höhere „rms deviation“ bewirken können. Inwiefern der hier detektier- Kapitel III 252 4 Diskussion te Unterschied der Strukturdaten des rekombinanten zu kristallinem LHCII Grundlage einer physiologischen Reaktion sein kann oder ob es sich hierbei um ein Artefakt der Probenpräparation handelt, darüber kann im Folgenden lediglich spekuliert werden. Mögliche physiologische Strukturänderungen des LHCII werden derzeit vor al- lem im Zusammenhang mit dem Prozess des „non photochemical quenching“ (NPQ) genannt. Einer Hypothese von Pascal et al. (2005) zufolge ist die Bildung von Chl- Dimeren innerhalb des monomeren LHCII ein Möglichkeit, Energie effizient als Wärme zu dissipieren. Bezogen auf seiner Sterik zählt das Chl b-Pärchen Chl10 und Chl13 (Abb. 3.4.2) zu möglichen Kandidaten für diesen Prozess, der zur Wahrung einer effi- zienten Photosynthese physiologisch genau reguliert sein muss. Diese beiden Chl b- Moleküle eignen sich energetisch zwar weniger gut zur Energie-Dissipation als Chl a- Moleküle, zeichnen sich aber durch ihre Lage aus. In der trimeren Kristallstruktur sind sie in räumlicher Nähe zur lumenalen Schleife H2 des Monomer A sowie zum C- Terminus des Monomer B positioniert und werden zudem von DGDG und Neoxanthin (nicht dargestellt) eingerahmt. Wie für effizientes NPQ gefordert, liegen beide Chloro- phylle dicht zusammen (Novoderezhkin et al., 2005), die Distanz zwischen der For- mylgruppe des Chl13 zum Tetrapyrrol des Chl10 in der Kristallstruktur des Erbsen- LHCII (3,8 Å; Standfuss et al., 2005) ist aber länger als die des Spinat-LHCII (3,4 Å; Liu et al., 2004) und deutet auf eine variierende Position hin. Abb. 3.4.2: Ausschnitt aus der Kris- tallstruktur des LHCII-Trimers (PDB- Eintrag 2BHW) zur Verdeutlichung der Bindung von DGDG (rot) und dem Chl b-Dimer aus Chl10 (hell- grün) und Chl13 (dunkelgrün) als lumenale Aufsicht. Das Peptidrück- grat der lumenalen Schleifenregion des Monomer A und der C-Terminus des Monomer B sind grau darge- stellt, das β-Faltblatt der lumenalen Schleife ist blau und die Position der Aminosäure 123 dunkelrot hervorge- hoben. Die Abbildung wurde mit Chimera erstellt (Pettersen et al., 2004). Die unterschiedliche Lage dieser Chlorophylle in den Kristallstrukturen in Verbindung mit der in dieser Arbeit ermittelten veränderten Lage des Nitroxidmarkers an Position 123, wirft die Frage auf, ob eine Strukturänderung der lumenalen Schleife, beispielwei- se innerhalb des β-Faltblattes (Abb. 3.4.2, blau hervorgehoben) in Abhängigkeit vom pH-Wert (Yang et al., 2008), den Abstand zwischen diesem Chl-Dimer steuern kann, um so NPQ zum Schutz der Photosysteme zu regulieren. Diese Überlegung bleibt rein Kapitel III 4 Diskussion 253 hypothetisch, da die in dieser Versuchreihe durchgeführte Änderung der Mizellen- Zusammensetzung physiologisch keine Relevanz hat, sondern lediglich einen präpara- tionsbedingten Kompromiss darstellt, um Hinweise auf flexible Regionen des LHCII zu finden. Einen physiologischen Zustand wie die Senkung des lumenalen pH-Wertes in vitro zu simulieren, ist derzeit in EPR-Versuchen noch nicht möglich. Einen weiteren hypothetischen Diskussionsansatz bietet die zuvor angespro- chene Belegung der DGDG-Bindestelle in rekombinanten LHCII-Trimeren (Kap. II). Viele der genannten Modifikationen, die zu einer Änderung der CD-Absorption führen, sollten durch ihre räumliche Nähe einen Eingriff in die Umgebung des Chl-Dimers 10/13 darstellen. Dies betrifft sowohl Aminosäure-Austausche innerhalb der lumenalen Schleife, LHCII-Proben mit variierendem Neoxanthin-Gehalt, als auch die Lage des C- Terminus des gegenüberliegenden Monomers (in Abb. 3.4.2 Monomer B) sowie die Belegung der DGDG-Bindestelle. Wie zuvor spekuliert (Kap. II), könnte durch eine Nichtbesetzung dieser Bindestelle oder durch die Belegung mit Detergenz die Konfor- mation des C-Terminus B im rekombinanten Trimer von den Kristalldaten abweichen. Dadurch könnte die sterische Umgebung der Position 123 verändert werden und es könnten, ohne das sich die Struktur der Schleifenregion A ändert, andere Nitroxid- Rotamere bevorzugt werden als aus Kristalldaten vorhergesagt. Dies gilt ebenfalls für LHCII-Monomere, da hier die Interaktion mit einem benachbarten Monomer gänzlich fehlt. Dieser Ansatz ist wie ersterer spekulativ, kann aber unter moderatem Arbeitsauf- wand weiter untersucht werden. In diesem Zusammenhang wäre es sicherlich interessant, das spektroskopische Verhalten trimerer Mutanten der existierenden Klone 90, 106, 123, 223 (Werwie, 2009) und 229 (Huschenbett, 2001) in Abhängigkeit der DGDG-Bindung weiter zu analysie- ren. Bei letzteren beiden Klonen, die mit guter Ausbeute trimerisieren und mit Cα- Abständen von 3,4 (Position 223) und 2 nm (Position 229) DEER-spektroskopisch gut erfassbar sein sollten, muss zuvor jedoch die Lage des „His6 tag“ kritisch geprüft wer- den. Während Klon 223 einen C-terminalen „His6 tag“ trägt, welcher theoretisch die Lage der C-terminalen Domäne beeinflussen kann, besitzt Klon 229 einen „His6 tag“ innerhalb der Sequenz des N-Terminus. Hier wäre zu überlegen auf Basis des von C. Dietz (unveröffentlicht) konstruierten Cys-Nullklons hnC79S mit N-terminalem „His6 tag“ (also vor Position 1 liegend) neue Mutanten herzustellen, um Messreihen unter glei- chen Ausgangsbedingungen und ohne potentielle Störung der Sterik durchführen zu können. Entsprechende EPR- und CD-spektroskopische Experimente mit Komplexen, welche mit einem Überschuss an nativem DGDG trimerisiert wurden, könnten weiter Aufschluss über die Struktur von lumenaler Schleife und gegenüberliegendem C- Terminus liefern. Die hypothetische Besetzung der DGDG-Bindetasche durch Deter- gentien könnte mittels ESEEM-EPR unter Verwendung deuterierter Detergentien nachgewiesen werden. Die Bindung des kommerziell erhältlichen LM (mit deuterierter Kapitel III 254 4 Diskussion Kopfgruppe) in die Bindetasche A des DGDG könnte durch die spinmarkierte Mutante 229 (Monomer B) demonstriert werden. Bevor eine mögliche Strukturänderung des LHCII als Folge des NPQ nachge- wiesen werden kann, sollte die strukturelle Ausgangsposition der lumenalen Schleifen- region in Detergenz-Mizellen jedoch weiter verifiziert werden. Um sich physiologischen Bedingungen weiter anzunähern, sollte zudem versucht werden, spinmarkierten LHCII mit der zuvor vorgeschlagenen Methode (Kap. II) gerichtet in Liposomen zu inserieren. Durch den zu erwartenden deutlichen Verlust an Signalintensität, müssten diese Ver- suchsreihe mit einer Erhöhung der EPR-Empfindlichkeit beispielsweise durch Wechsel vom X- ins Q-Band kombiniert werden. Bei Erfüllung dieser Bedingungen wären Expe- rimente mit unterschiedlichem pH-Wert oder unter variierendem Xanthophyll-Angebot vorstellbar. 4.3 Lokalisierung der N-terminalen Domäne des LHCII in Detergenzlö- sung Die EPR-Ergebnisse zur Untersuchung der Positionierung der N-terminalen Domäne wurden bereits in Müller (2008) gründlich diskutiert. Dortige Schlussfolgerung der er- mittelten DEER-Distanzen in rekombinanten Monomeren war eine unterschiedliche Konformation der N-terminalen Domäne in monomerem und trimerem LHCII, was kon- form ist zu vorherigen Ergebnissen von Jeschke et al. (2005). Da auch bei Müller (2008) aufgrund der identischen Probenpräparation eine Verunreinigung monomerer Proben durch nachträglich trimerisierten LHCII nicht ausgeschlossen werden kann, sollte diese Schlussfolgerung anhand der neuen Erkenntnisse überdacht werden. Im Unterschied zu allen vorangegangen Messungen (ausgenommen Position 123), kön- nen den N-terminalen Monomer-Proben von Müller DEER-Abstandsdaten entspre- chender Trimere gegenüber gestellt werden. Diesem Vergleich zufolge sollte man die Nebenmaxima der Mutanten 29/59, 14/29 und 3/14 sicherlich kritisch betrachten, hier kann zum jetzigen Zeitpunkt ein Hintergrundsignal durch Trimere nicht ausgeschlossen werden. Dieser Argumentation folgend ist eine konkrete Aussage zur Lage der N- terminalen Aminosäuren 29 bis 59 in rekombinanten Monomeren schwierig. Sicher ist lediglich, dass Position 34 wie in rekombinanten Trimeren und wie in der Kristallstruktur gezeigt weit in das Lösungsmittel ragt. Starkes Argument für die Interpretation von Müller (2008) sind dagegen die sehr breiten Abstandsverteilungen der monomeren Mutanten 3/59 und 3/29 in Verbindung mit den deutlichen höheren ESEEM-Zugänglichkeitsparametern der monomeren Mut- anten 22, 11 und 4 im Vergleich zu entsprechenden Trimeren. Dies sind eindeutige Indizien für eine deutlich höhere Flexibilität der N-terminalen Domäne in monomerem LHCII, wenn auch bisher nur für den Bereich der ersten 29 Aminosäuren. Wie zuvor angedeutet, taucht in kristallinen Trimeren die N-terminale Domäne im Bereich der Aminosäuren Gly 30 bis Asp 20 in Form einer Peptid-Schleife in die Membranebene Kapitel III 4 Diskussion 255 hinein. Hier liegt auch die Bindestelle des Chl9 (an Tyr 24) sowie das zur Trimerisie- rung essentielle Lipid PG (Hobe et al., 1995), welche die Schleife in Trimeren höchst- wahrscheinlich in ihrer Position fixieren. Deutlich wird dies beispielsweise in der gerin- gen „rms deviation“ bei Überlagerung der Kristallstrukturen von Erbse und Spinat. Während die N-Termini an sich einen eher niedrigen Grad an Ähnlichkeit aufweisen, überlappt dieser Bereich fast perfekt (Barros & Kühlbrandt, 2009). Inwiefern rekombi- nante Monomere dieses Lipid gebunden haben, konnte bisher nicht quantifiziert wer- den (Bender, 2004). Sicher ist aber, dass PG im Totalpigmentextrakt in der Rekonstitu- tion vorhanden ist und auch zu LHCII-Monomeren eine hohe Affinität besitzt (Nussber- ger et al., 1993). Tatsache ist zudem, dass PG als „molekularer Kleber“ in den Zwi- schenraum zweier Monomere bindet, wodurch in Trimeren die transmembrane Helix H3 in direkte räumliche Nachbarschaft zu der angesprochenen Schleifenregion rückt (Standfuss et al., 2005). Im Monomer hingegen fällt diese „sterische Behinderung“ durch die gegenüberliegende Helix H3 weg, wodurch der N-Terminus offensichtlich flexibel wird und vom Helixkreuz in die Peripherie wandern kann. Dies ist konform mit früheren DEER-Messungen in Jeschke et al. (2005). Um diese Ergebnisse weiter zu verifizieren, werden derzeit die Mutanten 3/34, 7/34, 11/34, 7/59 und 11/59 durch C. Dietz hergestellt. In Verbindung mit der zuvor diskutierten Verbesserung der Proben- präparation sollte durch Erstellung einer DEER-„Abstandskarte“ die Lage des N- Terminus in monomerem LHCII in naher Zukunft sehr genau modelliert werden kön- nen. Im Gegensatz hierzu sind die Puls-EPR-Daten N-terminaler Trimere eindeutig und wurden im Ergebnisteil schon eingehend mit den Daten der Kristallstruktur vergli- chen sowie in Müller (2008) gründlich diskutiert. Sowohl ESEEM- als auch DEER- Daten legen nahe, dass der N-Terminus des rekombinanten LHCII von Position 12 bis 59 eine Struktur identisch der Kristallstruktur nativer Trimere besitzt. Die kristal- lographisch nicht aufgelösten ersten 9 Aminosäuren besitzen eine äußerst hohe Flexi- bilität, ihre Lage kann aber bereits, konform zu Jeschke et al. (2005), auf den Bereich oberhalb des Helixkreuzes eingeschränkt werden (Kreisbahnen in Abb. 3.3.14). Durch weitere DEER-Abstandsmessungen mit heterogen markierten Trimeren (Kap. II) ver- schiedener N-terminaler Doppelmutanten, sollte die Lage der N-terminalen Domäne in rekombinanten LHCII-Trimeren ebenfalls sehr genau modelliert werden können. Ent- sprechende Präparationen sind derzeit in Vorbereitung (C. Dietz). Insbesondere der EPR-Datensatz der N-terminalen Trimere illustriert noch ein- mal sehr deutlich die Vorteile der Puls-EPR-Spektroskopie gegenüber kristallographi- schen Methoden zur Klärung von Proteinstrukturen. Die Vermutung von Standfuss et al. (2005), dass die ersten 9 Aminosäuren der N-terminalen Domäne aufgrund von Strukturdynamik kristallographisch schwer erfassbar sind, bestätigt sich. Da die Her- stellung von Membranprotein-Kristallen im Allgemeinen eine schwierige und langwieri- ge Prozedur darstellt, ist das Potential der Puls-EPR-Spektroskopie zur Aufklärung Kapitel III 256 4 Diskussion unbekannter Membran-Proteinstrukturen enorm und kann in naher Zukunft mit großer Sicherheit dazu beitragen, physiologische Strukturänderungen, falls überhaupt existie- rend, in LHCII nachzuweisen. Inwiefern die hier ermittelten unterschiedlichen Konformationen der N- terminalen Domäne des monomeren und trimeren LHCII solchen physiologischen Zu- ständen entsprechen, darüber kann zum jetzigen Zeitpunkt nur spekuliert werden. Ne- ben der Tatsache, dass dem N-Terminus eine entscheidende Rolle in der Oligomerisie- rung zufällt (Hobe et al., 1995), werden dieser Domäne Funktionen in der Ausbildung der Grana-Stapel sowie im Prozess der „state transitions“ nach Phosphorylierung zu- gesprochen (Allen & Forsberg, 2001). Die Nachahmung physiologischer Bedingungen in vitro in Verbindung mit DEER-EPR brachten hierzu bisher keine Erkenntnisse. In Anlehnung an die von Bender (2004) durchgeführten Experimente zur Auslösung einer Konformationsänderung des N-Terminus durch Belichtung (Paulsen et al., 1993; Zer et al., 1999; Ohad et al., 2001) scheiterten bereits im Versuchsaufbau (Daten nicht ge- zeigt). Auch die von Müller (2008) untersuchte Imitierung der N-terminalen Phosphory- lierung durch Austausch des Thr 5 durch Glu zeigte weder in monomerem noch in tri- merem LHCII eine Änderung der N-terminalen Struktur, eine Interpretation der Daten war folglich nicht möglich. Um physiologische Strukturänderung nachzuweisen, wäre es, wie zuvor diskutiert, sinnvoll, DEER-Abstandsmessungen des LHCII in Liposomen zu etablieren, sowie eine geeignete Kinase zur Phosphorylierung des LHCII in quanti- tativem Maßstab zu finden (Gorleku, 2007; Schneider, 2008). Unter diesen Vorausset- zungen wäre der Nachweis von Strukturdynamik, induziert durch Phosphorylierung und detektiert durch DEER-EPR, von höchstem Interesse. 4.4 Zeitaufgelöste Messung der LHCII-Faltung mittels Puls-EPR- Spektroskopie Puls-EPR-Daten zur zeitaufgelösten Detektion der LHCII-Faltung wurden bereits in Dockter et al. (Kap. III, 3.2.3; eingereichtes Manuskript) gründlich diskutiert. In Ergän- zung soll hier das Potential von ESEEM-EPR in zeitaufgelösten Messungen separat kurz angesprochen werden (Publikation in Bearbeitung). Wie zuvor diskutiert, geschah die Herstellung von LHCII-Proben für zeitaufgelöste EPR-Messungen größtenteils durch manuelles Mischen mit einer präparationsbedingten „Totzeit“ von über 30 s. Kür- zere Faltungszeiten in DEER-Experimenten (1 s Faltung) konnten durch den Einsatz einer „freeze-quench“-Apparatur erreicht werden. Hierbei zeigten die DEER-Daten der 1 s-Probe der Mutante 90/196 aber weder signifikante Unterschiede zu den Primärda- ten der LDS-solubilisierten Probe, noch zu einer Probe mit 37 s Faltungszeit. Daraus wurde der Schluss gezogen, dass durch den Detergenzwechsel die „random coil“- Struktur des ungefalteten Proteins zunächst wenig verändert wird oder mittels DEER- EPR eine Änderung nicht detektierbar ist. Aufgrund des hohen Aufwands der Proben- präparation mittels „freeze-quench“-Apparatur (hoher Protein- und Pigmentverlust Kapitel III 4 Diskussion 257 durch große „Totvolumina“) wurden daher keine weiteren DEER-Proben mit kurzen Faltungszeiten gemischt. In Konsistenz zu den DEER-Daten sowie aus zeitlichen Gründen wurde im Zuge dieser Dissertationsschrift darauf verzichtet, ESEEM-Proben mit kürzeren Faltungszeiten zu mischen oder Faltungskinetiken anderer LHCII- Mutanten mittels ESEEM-EPR zu erstellen. Interessant in den ESEEM-Faltungsdaten ist aber, dass im Unterschied zu den zeitaufgelösten DEER-Messungen auch zu Beginn des Faltungsprozesses (zumindest im Falle der Mutante 196) eine deutliche Strukturänderung detektierbar ist. Dies wird aus der beachtlichen Abnahme der Wasserzugänglichkeit innerhalb der ersten 40 s des Assemblierungsprozesses deutlich und ist sicherlich weitere Untersuchungen wert. Außerdem kann allgemein spekuliert werden, dass ESEEM-EPR in der Erstellung von Faltungkinetiken von Membranproteinen einen Vorteil gegenüber DEER haben könnte. Der in vielen Proteinen vermutete hydrophobe Kollaps zu Beginn des Faltungsprozes- ses (Fink, 1995) kann in zeitaufgelösten DEER-Messungen zu dem Problem führen, dass sich die beiden Spinmarker räumlich sehr nahe kommen. Dies würde, analog zu Aggregationsversuchen des LHCII (Kap. III, 3.2.3; eingereichtes Manuskript), in einer effizienten, intramolekularen Spin-Spin-Relaxation mit sehr kurzen T2- Relaxationszeiten resultieren, welche eine Auswertung der DEER-Daten unmöglich macht. Durch die einfache Spin-Markierung in ESEEM-Experimenten sollte dieser Kol- laps prinzipiell kein Problem darstellen, da durch das Vorhandensein lediglich eines Spinmarkers, eine T2-Relaxation zwischen Elektronenspins nicht möglich ist (einen ausreichenden Abstand zwischen den Proteinen vorausgesetzt). Dies sollte es folglich ermöglichen, verschiedene Phasen der Assemblierung rekombinanter Proteine in vitro mittels ESEEM-EPR auch in frühen Faltungsstadien verfolgen zu können. Zur Durchführung weiterer ESEEM-Faltungskinetiken des rekombinanten LHCII ist es wichtig, zwei grundlegende Voraussetzungen zu beachten. Zum einen müssen sich, wie anhand Mutante 196 vorgeführt (Abb. 3.3.15), denaturierte und gefaltete Pro- ben des LHCII in ihrer Wasserzugänglichkeit deutlich unterscheiden. Da Position 196 die bisher am wenigsten zugängliche Mutante stellt, müssten für eine Faltungsanalyse des LHCII mittels ESEEM-EPR zunächst weitere Mutanten mit ähnlich geringem Was- serzugänglichkeits-Parameter gesucht werden, welche sich am ehesten an Positionen innerhalb der Membran finden lassen. Der zweite wichtige Punkt betrifft die Lage der spinmarkierten Aminosäure bezüglich einer engen Packung des Proteins beispielswei- se während und nach einem prinzipiell möglichen hydrophoben Kollaps. Sollte zum Beispiel eine sehr gut wasserzugängliche Position durch den Kollaps sofort in das hyd- rophobe Innere des kollabierten Proteins gezogen werden, sinkt die Wasserzugäng- lichkeit rapide, was ebenfalls zu einer „blinden“, wenig interpretierbaren Phase in der Kinetik der Proteinfaltung führen würde. Andererseits könnten solche Markierungsposi- tionen, sofern sie nach einem hydrophoben Kollaps wieder ins wässrige Milieu eintau- chen, sehr detaillierte Informationen bezüglich intermediärer Faltungszustände liefern. Kapitel III 258 5 Schlussfolgerungen Werden zudem Positionen wie 196 in unterschiedlichen Domänen gefunden, die gleichmäßig an Wasserzugänglichkeit verlieren, besitzt ESEEM-EPR ein hohes Poten- tial zur zeitaufgelösten Detektion von Membranprotein-Faltung. In diesem Zusammen- hang wären Faltungsexperimente mit variierendem Pigmentangebot oder mit Chloro- phyll-Bindungsmutanten denkbar, um die Assemblierung des LHCII und deren Abhän- gigkeit von der Pigmentbindung weiter zu verstehen. 5 Schlussfolgerungen Primäre Ziele dieses Kapitels waren die Weiterentwicklung der EPR-Messmethodik sowie deren Anwendung zur Untersuchung der Struktur und Funktion des LHCII. Durch Anwendung standardisierter CW-EPR-Techniken, im Vergleich zu Puls-EPR- Experimenten, konnten verschiedene hochempfindliche Methoden verifiziert werden, um lokale Aminosäure-Umgebungen in Membranproteinen zu untersuchen. Gleichzei- tig konnte mit der etablierten DEER-Spektroskopie eine umfassende „Abstandskarte“ des LHCII in Lösung erstellt werden und mit aktuellen Daten der Kristallstruktur vergli- chen werden. Diese hochempfindlichen Puls-EPR-Methoden konnten in einem zweiten Schritt angewendet werden, um Strukturdynamik in Detergenz-solubilisiertem LHCII zu ermitteln. Während die Flexibilität der lumenalen Schleife bzw. der C-terminalen Do- mäne unbedingt erst durch weitere Versuchsreihen noch verifiziert werden muss, konn- ten eindeutige Unterschiede in der Struktur der N-terminalen Domäne des monomeren LHCII zu trimerem LHCII nachgewiesen werden. Des Weiteren war es möglich neue Strukturinformationen zur Konformation der kristallographisch teilweise überhaupt nicht erfassten N-terminale Domäne in LHCII-Trimeren zu ermitteln. Beide Ergebnisse bes- tätigen frühere Messreihen und erlauben in naher Zukunft eine detailliertere Modellie- rung der N-terminalen Domäne in monomerem und trimerem LHCII. Durch Modifizie- rung des Rekonstitutionsprotokolls des LHCII konnte in einem abschließenden Schritt die Strukturdynamik des LHCII-Apoproteins während des Faltungsprozesses mittels verschiedener zeitaufgelöster Puls-EPR-Monitore nachgewiesen werden. Die ermittel- ten Daten geben zum ersten Mal detaillierten Einblick in die Entstehung von Sekundär- und Tertiärstruktur während der Faltung des rekombinanten LHCII. Kapitel IV Experimente zur Insertion nativer LHCII-Trimere in arti- fizielle Vesikel aus Diblockcopolymeren. 1 Einleitung 1.1 Amphiphile Diblockcopolymere: Aufbau und spontane Selbstor- ganisation Der Begriff Diblockcopolymere bezeichnet in den chemischen Wissenschaften artifiziell hergestellte Polymere, die aus zwei unterschiedlichen Polymerblöcken zusammenge- setzt sind. Jeder der beiden Blöcke besteht seinerseits aus einer variablen Anzahl von Einheiten eines hydrophilen oder hydrophoben Monomers. Durch Verbindung eines hydrophilen Teilblocks, beispielsweise bestehend aus Polyethylenoxid (PEO), mit ei- nem hydrophoben Teilblock, beispielsweise bestehend aus Polybutadien (PB), entste- hen amphiphile Diblockcopolymere mit charakteristischem Löslichkeitsverhalten. Je nach chemischer Zusammensetzung der verwendeten Monomere und deren Löslich- keiten in unterschiedlichen Lösungsmitteln, dem relativen Verhältnis der Blocklängen zueinander und der daraus resultierenden Molmasse sind amphiphile Diblockcopoly- mere in der Lage, sich in Lösung spontan selbst zu supramolekularen Strukturen zu organisieren. Neben sphärischen oder wurmartigen Mizellen können sich in Abhängig- keit vom Lösungsmittel auch sogenannte Polymersomen bilden (Discher & Eisenberg, 2002). In solchen Vesikeln, bestehend aus einer Doppelschicht des Diblockcopoly- mers, zeigen in wässriger Lösung (analog zu Phospholipiden in Liposomen) die pola- ren Teilpolymere zum Lösungsmittel, die unpolaren Teilpolymere bilden dagegen nach Innen eine hydrophobe Doppelschicht. Insbesondere solche artifiziellen Vesikelstrukturen bieten in den Biowissen- schaften interessante Möglichkeiten, da sie eine Art „Biomembran-Mimikry“ darstellen und durch ihre hohe chemische Stabilität auch unter in vivo-Versuchsbedingungen lange stabil bestehen bleiben. Zudem zeigen viele Arten von Polymersomen eine gute Kompatibilität mit biologisch aktiven Molekülen und sind außerdem, beispielsweise nach der Beladung mit Medikamenten oder Botenstoffen, als Transportcontainer ein- setzbar. Auch die leichte chemische Modifizierbarkeit der Polymere zur Produktion oberflächen-funktionalisierter Vesikel ist zu beachten (Mecke et al., 2006). Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Diblockcopolymer, handelt es sich um das amphiphile Polybutadien-b-polyethylenoxid (PB130-b-PEO66-COOK), welches sich aus einem 130 Einheiten umfassenden, hydrophoben Poly-(1,2) Butadien-Block (Abb. 4.1.1 A, rot) und einem 66 Einheiten umfassenden hydrophilen Poly-Ethylenoxid-Block zusammensetzt (Abb. 4.1.1 A, blau). Die durchschnittlichen Faden-Enden-Abstände für Kapitel IV 260 1 Einleitung ungestörte Knäuel des hydrophoben Homopolymer-Blocks liegen bei ca. 7 nm, die des hydrophilen bei ca. 4 nm (Abb. 4.1.1 B). Abb. 4.1.1: Chemische Struktur des Diblockcopolymers PBx-b-PEOy-COOK und Selbstorgani- sation in unterschiedlichen Lösungsmitteln. (A) Strukturformel des amphiphilen PBx-b-PEOy- COOK. Das in diesem Experiment verwendete Polymer besitzt 130 Wiederholungseinheiten des hydrophoben Poly-(1,2) Butadien-Blocks (rot) und 66 Wiederholungseinheiten des hydrophilen Poly-Ethylenoxid-Blocks (blau) bei einer durchschnittlichen molaren Masse von 11000 g/mol. (B) zeigt die Selbstorganisation des PB130-b-PEO66-COOK in Abhängigkeit des Lösungsmittels zu sphärischen Mizellen (in Methanol) oder doppelschichtigen Vesikeln (in Wasser). In (C) ist die PB130-b-PEO66-COOK-Vesikelstruktur schematisch dargestellt, der Aus- schnitt rechts verdeutlicht den durchschnittlichen Durchmesser der einzelnen Schichten (abge- ändert nach Müller, 2006). Abhängig vom verwendeten Lösungsmittel ordnen sich die PB130-b-PEO66-COOK- Polymere durch Selbstorganisation zu unterschiedlichen Strukturen zusammen. In Me- thanol gelöst, formen sich sphärische Mizellen mit Polybutadien-Kern (B, rot) und äu- ßerer Polyethylenoxid-Hülle (B, blau). In wässriger Lösung dagegen bilden sich stabile Kapitel IV 1 Einleitung 261 Vesikel aus Copolymer-Doppelschichten, wobei die durch Transmissionselektronen- mikroskopie ermittelte Dicke der einzelnen Schichten bei jeweils 4 nm für die äußeren PEO-Einzelschichten und ca. 15 nm für die innere PB-Doppelschicht liegt (C). Ein wei- terer Vorteil dieser Polymersomen besteht in der Möglichkeit den Radius der Vesikel mittels Extrusion in Abhängigkeit der Blocklängen auf eine gewünschte Größe zu trim- men (Müller, 2006). 1.2 Insertion von Membranproteinen in artifizielle Polymersomen Neben ihrer Anwendbarkeit als Transportcontainer (Kataoka et al., 2001; Borchert et al., 2006; Müller et al., 2009), sind artifizielle Polymersomen interessant hinsichtlich ihrer Nutzbarkeit als Nanoreaktoren. Wie in biologischen Systemen in vivo, können mit Hilfe der Polymersomen in vitro stabile Räume geschaffen werden, in denen einzelne Reaktionen in einem unterschiedlichen Milieu zum Außenmedium ablaufen können. Hierfür ist es vorteilhaft, die künstliche Polymerschicht durch Insertion von speziellen Membranproteinen selektiv permeabel zu gestalten. Diese könnten wie in vivo in ihren Funktionen als beispielsweise Carrier oder Kanalproteine den Ein- oder Ausfluss von Reaktanden in die Polymersomen gezielt regulieren. Weiterhin könnte durch die hohe Stabilität der Polymersomen, im Vergleich zu natürlichen Lipidmembranen, die Le- bensdauer instabiler Membranproteine verlängert werden, was wiederum die Präpara- tion von Proben beispielsweise für die Kristallographie vereinfachen würde (Mecke et al., 2006). Ein Problem für die Insertion von Membranproteinen stellt bisher der Durch- messer der Diblockcopolymer-Doppelschicht dar. Während Membranproteine in vivo mittels α-helikalen Strukturen oder β-Faltblättern hydrophobe Membranbereiche von 3 bis 4 nm durchspannen, müssen in Polymersomen 10 oder mehr Nanometer über- brückt werden. Versuche mit OmpF (Meier et al., 2000) oder Bacteriorhodopsin (Ho et al., 2004) zeigten, dass es möglich ist, sogenannte Triblockcopolymere, bestehend aus zwei äußeren hydrophilen und einem inneren hydrophoben Teilblock bei einer lipophi- len Schichtdicke von bis zu 10 nm, zu durchspannen, ohne die Proteinstruktur zu be- einflussen. Dies ist dann möglich, wenn das Protein es schafft, die flexible, hydrophobe Mittelschicht auf einen Dicke von ca. 4 nm zu stauchen (Abb. 4.1.2). Kapitel IV 262 1 Einleitung Abb. 4.1.2: Schematische Darstellung der Insertion von Membranproteinen in artifizielle Copo- lymerschichten mit einem Durchmesser über 4 nm. Das Membranprotein (eiförmige Struktur) staucht den flexiblen, hydrophoben Kern (hellgrau) der Polymerschicht von schätzungsweise 10 nm auf 4 nm Dicke und wird dadurch stabil inseriert. In Aufsicht entstehen dadurch trichterför- mige Vertiefungen in der Polymeroberfläche (abgeändert nach Mecke et al., 2006). Ob solch eine Insertion von Membranproteinen auch in Doppelschichten aus amphiphi- len Diblockcopolymeren möglich ist, sollte im folgenden Versuchansatz, der Insertion des nativen, trimeren LHCII in Polymersomen bestehend aus PB130-b-PEO66-COOK, untersucht werden. Nativer LHCII erschien hierfür ein geeignetes Modell-Protein zu sein, da der Pigment-Protein-Komplex mit wenig Aufwand in größeren Mengen gewon- nen und aufgereinigt werden kann und zudem in hohem Maße in Lipiddoppelschichten rück-inseriert werden kann. Außerdem besitzt trimerer LHCII unter geeigneten Ver- suchsbedingungen (ohne direkten Licht- oder Hitzeeinfluss) sowohl in Detergenzien als auch in Doppelmembranen eine recht hohe Stabilität. In wässriger Lösung dagegen aggregiert das Protein in Anwesenheit von Salzen oder es denaturiert und zerfällt in seine Bestandteile. Durch die Bindung von 14 Chlorophyllen und 4 Carotinoiden ist der Komplex spektroskopisch sehr gut charakterisierbar, so dass der Zustand des Proteins leicht hinsichtlich Funktionalität und Oligomerisierungsgrad überprüft werden kann. Nicht zuletzt ist es von proteinbiochemischer und Anwendungs-technischer Seite inte- ressant, ob eine Insertion des LHCII in artifizielle Polymersomen dessen Stabilität ge- genüber Hitze, Starklicht oder extremen pH-Werten erhöht, bzw. ob durch chemische Modifizierung der Polymere eine Funktionalisierung des LHCII beispielsweise an Ober- flächen möglich ist. Kapitel IV 2 Material und Methode 263 2 Material und Methode 2.1 Aufreinigung des trimeren LHCII aus Erbse durch sukzessive Fäl- lung (nach Krupa et al., 1987; modifiziert nach Rühle & Paulsen, 2004) Erbsenpflanzen, welche 10 Tage unter Standard-Bedingungen (16 h Belichtung/Tag) angezogen wurden, wurden geerntet und das Blattmaterial (junge Blätter, 1 kg) in 3 l eiskaltem Homogenisierungspuffer im „Waring Blender“ zerkleinert. Nach der Filtration durch 4 Lagen Baumwoll-Gaze, wurde der Durchfluss 5 min bei 7000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 600 ml Waschpuffer resuspendiert und erneut zentrifugiert (10 min, 10000 g). Die pelletierten Thylakoide wurden in kaltem Aqua dest. (100 ml) vereinigt, mittels Photometrie die Chl-Konzentration ermittelt (Verdünnung eines 5 µl Pigment- Aliquots in 80 % Aceton, siehe Kap. I, 2.7.1.3) und durch weitere Aqua dest.-Zugabe auf eine Gesamtchlorophyll-Konzentration von 0,8 mg/ml eingestellt. Zur Dokumentati- on der Aufreinigung wurde zudem ein Aliquot (A1) auf Eis aufbewahrt. Durch Zugabe von TX (Endkonzentration 0,67 %) wurden die Photosynthese- Komplexe aus der Thylakoidmembran gelöst und für 30 min bei Raumtemperatur ab- gedunkelt gerührt. Die solubilisierten Komplexe wurden bei 4 °C und 30000 g für 40 min zentrifugiert und das Pellet entsorgt. Die im Überstand befindlichen Pigment- Protein-Komplexe wurden sukzessive durch schrittweise Salzzugabe (100 mmol/l KCl und 20 mmol/l MgCl2) 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln unter langsamem Rüh- ren gefällt. Jeweils 10 ml der gefällten Suspension wurden auf je 30 ml einer Saccha- roselösung (0,5 mol/l) geschichtet und in einem Festwinkelrotor bei 4 °C 10 min bei 10000 g zentrifugiert. Die pelletierten Komplexe wurden in Resuspensionspuffer re- suspendiert und wie zuvor photometrisch auf eine Chl-Konzentration von 0,8 mg/ml eingestellt. Nach erneuter Solubilisierung in TX (10fach molarer Detergenzüberschuss über Chl; 116 µl 5 % TX pro 1 ml Suspension) bei Raumtemperatur (10 min, dunkel, lang- sam gerührt), wurden die Komplexe wie zuvor durch Zugabe von Salz gefällt und er- neut mittels Zentrifugation durch eine Saccharoselösung pelletiert. Das Pellet wurde in einem kleinen Volumen Resupensionspuffer aufgenommen und mittels Photometrie das molare Chl a zu Chl b- Verhältnis bestimmt. Lag dies oberhalb des Wertes 1,4 wurden erneut Komplexe in TX resuspendiert und mit Salz gefällt. Bei niedrigerem Wert wurde die Suspension wieder auf eine Chlorophyll-Konzentration von 0,8 mg/ml eingestellt, ein Aliquot (A2) abgenommen und die Komplexe ohne vorherige Deter- genz-Solubilisierung mittels Salzzugabe gefällt und in Saccharose zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 2 ml Aqua dest. resuspendiert und sofort bei 4 °C für 3 min Kapitel IV 264 2 Material und Methode bei 5000 g zentrifugiert. Zur vollständigen Entfernung von Detergenz und Salz wurde der letzte Schritt wiederholt. Das gereinigte Pellet wurde in einer geringen Menge Aqua dest. aufgenommen, photometrisch die Konzentration bestimmt, auf eine Gesamtchlo- rophyll-Konzentration von 0,8 mg/ml eingestellt und wieder ein Aliquot (A3) zur Analyse aufgehoben. Die restlichen Komplexe wurden portioniert und bei -20 °C eingefroren. Zur Kontrolle der Isolierung wurden die Aliquots einzelner Aufreinigungsschritte auf einer 15%igen denaturierenden SDS-PAGE (Kap. I, 2.8.1.1) analysiert (je ein 10 µl Aliquot mit 1x Sparmix denaturiert), sowie ein Aliquot der aufgereinigten Trimere in 0,1 % LM auf Eis gelöst und CD-spektroskopisch (Kap. I, 2.8.2.3) ohne weitere Aufreini- gung untersucht. Material: Pisum sativum var. Lisa Vermiculit (Härte 4, Firma Klein Dämmstoffe, Zellertal) Homogenisierungspuffer: 50 mmol/l Tricine/NaOH (pH 7,8) 0,4 mol/l Sorbitol Waschpuffer: 5 mmol/l EDTA/NaOH (pH 7,8) 50 mmol/l Sorbitol 5 % TX 1 mol/l KCl 1mol/l MgCl2 0,5 mol/l Saccharose Resuspensionspuffer: 50 mmol/l Tricine/NaOH (pH 7,8) 100 mmol/l Sorbitol 2.2 Synthese des amphiphilen Diblockcopolymers Polybutadien-b- polyethylenoxid und spontane Selbstorganisation zu Vesikeln Die Synthese der amphiphilen Diblockcopolymere geschah durch Dr. Michael Maskos, die Präparation der Polymersomen durch W. Müller (AK HD Dr. M. Maskos, Institut für Physikalische Chemie, Universität Mainz). Amphiphile Diblockcopolymere, wie das in diesem Experiment verwendete Po- lybutadien-b-polyethylenoxid (PBx-b-PEOy-COOK), bestehen aus einem hydrophoben Poly-(1,2) Butadien-Block (PB) und einem hydrophilen Poly-Ethylenoxid-Block (PEO). Die Länge der einzelnen Blöcke ist variabel und kann beispielweise für PB (x in Abb. 4.1.1 A) zwischen 32 und 130 Einheiten bestehen, bei PEO (y in Abb. 4.1.1 A) zwi- schen 29 und 177. Die Bildung von stabilen Vesikeln in wässriger Lösung ist hierbei stark von der Länge der einzelnen Blöcke abhängig und konnte für das Copolymer PB130-b-PEO66-COOK, welches auf Seiten des PB durch ein Cumyl-Anion initiiert und auf Seiten des PEO durch eine Carbonsäuregruppe terminiert wird, gezeigt werden Kapitel IV 2 Material und Methode 265 (Maskos, 2006). Dieses Blockcopolymer mit durchschnittlich 130 Wiederholungseinhei- ten des PB und 66 Wiederholungseinheiten des PEO wird nach anionischer Polymeri- sation des Polybutadien-Blocks und direkter Weiterpolymerisation des Polyethylenoxid- Blocks erhalten (Abb. 4.1.1 in Klammern). Der mittels MALDI-TOF Massenspektro- metrie ermittelte Poly-Dispersitäts-Index (PDI) von 1,05 bestätigte eine enge Verteilung der Kettenlängen. Das Molekulargewicht des Copolymers lag bei 11000 g/mol bei ei- nem PEO-Anteil von 29 % (w/w). Die Herstellung entsprechender PB130-b-PEO66-COOK-Vesikel erfolgte wie in Müller et al. (2009) beschrieben. Hierzu wurden zu 10 mg PB130-b-PEO66-COOK, ge- löst in 2,1 ml Tetrahydrofuran (THF, dest.), unter ständigem Rühren 10 ml Aqua dest. (reinst; Waters MilliQ-system) zugetropft (9,9 ml/h). Bei einem THF-Gehalt von etwa 17 % wurde die Wasserzugabe gestoppt und das restliche THF in einem Zeitraum von 2 bis 3 Tagen evaporiert. Durch das langsame Abdampfen des organischen Lösungsmit- tels kommt es durch die Zunahme der Hydrophilie der Lösung zur spontanen Selbstor- ganisation der Copolymere zu kleinen Vesikeln mit einer engen Größenverteilung. Die Dicke der hydrophoben PB-Doppelschicht betrug hierbei 15 bis16 nm, die der hydrophilen PEO-Einzelschichten jeweils 3,5 bis 4 nm (Müller, 2006). Fertige Vesikel- lösungen wurden vor Verwendung durch Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm filt- riert und bis zur eigentlichen Insertion nativer LHCII-Komplexe dunkel bei Raumtempe- ratur in Aqua reinst mit einer Konzentration von 1 g/l gelagert. Die Bestimmung von Form und Größe der Blockcopolymer-Vesikel geschah mittels dynamischer Lichtstreu- ung und Transmissionselektronenmikroskopie wie in Müller (2006) beschrieben. Material: Polybutadien-b-polyethylenoxid (PB130-b-PEO66-COOK) THF (destabilisiert durch Destillation) Aqua dest. (reinst) 2.3 Ansatz zur Insertion von nativen LHCII-Trimeren in PB130-b-PEO66- COOK-Vesikel Der Ansatz zur Insertion des nativen LHCII in PB130-b-PEO66-COOK-Vesikel basierte auf der Methode von Boggasch (2006) zur Insertion des trimeren LHCII in Liposomen. Nach diesem Prinzip werden die ausgefällten nativen Komplexe in den Detergenzien TX oder LM solubilisiert und mit Liposomen gemischt. Durch langsamen Entzug des Detergenz durch Behandlung mit „Bio Beads“ werden die Komplexe „gezwungen“ in die Doppelmembran der Vesikel zu inserieren. Im folgenden Versuchsansatz wurden statt der Liposomen, bestehend aus den Lipiden DGDG, PG und SQDG, artifizielle Vesikel aus PB130-b-PEO66-COOK-Polymeren (Kap. IV, 2.2) mit einem gemittelten Ra- dius von 31 bis 35 nm verwendet. Im Unterschied zu Boggasch (2006) wurde zudem eine höhere Konzentration an LHCII eingesetzt. Für einen Ansatz mit 1800 µl Endvo- Kapitel IV 266 2 Material und Methode lumen, wurde nativer LHCII in einfachem Liposomenpuffer (Endkonzentration 4,16 µmol/l), mit Detergenz (jeweils ein Ansatz mit 0,05 % TX, bzw. ein Ansatz mit 0,1 % LM) versetzt und 30 min dunkel auf Eis solubilisiert. Hierbei gingen die zuvor pelletier- baren Aggregate in Lösung, kurzes Zentrifugieren zeigte keine Komplex- Sedimentation. Die gelösten Komplexe wurden langsam mit PB130-b-PEO66-COOK- Vesikeln (Endkonzentration 54.5 µmol/l; entspricht etwa 15 PB130-b-PEO66-COOK- Polymeren pro LHCII) in einfachem Liposomenpuffer, 0,1 % Detergenz (TX bzw. LM) und 10 mM DTT versetzt, auf Eis gemischt und für 3 h dunkel inkubiert. Nach Zugabe von 36 mg entgasten „Bio Beads“ (siehe Boggasch, 2006; Punkt 2.3.11.4), wurden die Lösungen über Nacht bei 4 °C auf dem Drehrad zur Entfernung des Detergenz inku- biert und die „Bio Beads“ am darauffolgenden Tag dreimal gewechselt (je 2-3 h Inkuba- tion). Die letztendlich eingesetzte „Bio Beads“-Menge war ausreichend, um etwa die 20fache Menge an Detergenz zu adsorbieren. Neben den beiden beschriebenen Ansätzen zur Insertion des LHCII, wurden verschiedene Referenz-Ansätze gemischt. Zum einen wurde, wie in den beiden Haupt- ansätzen, 4,16 µmol/l LHCII jeweils einmal in TX bzw. einmal in LM solubilisiert, dann aber in Liposomenpuffer (versetzt mit Detergenz und DTT) ohne Polymersomen über- führt und mit „Bio Beads“ behandelt. Außerdem wurde in einem weiteren Ansatz (ent- sprechend dem Hauptansatz mit TX) anstatt 4,16 µmol/l nativem LHCII das molare Äquivalent an Totalpigmentextrakt (Kap. I, 2.7.1.2) eingesetzt. Letztlich wurde noch ein Ansatz ohne LHCII und ohne Pigment gemischt, um das Verhalten der Blockcopolyme- re nach Detergenz- und „Bio Beads“-Behandlung zu dokumentieren. Die einzelnen Ansätze wurden sowohl spektroskopisch [Absorption (Kap. IV, 2.4), CD (Kap. I, 2.8.2.3 und Kap. IV, 2.4), als auch biochemisch (Kap. I, 2.8.1.1) charakterisiert. Material: Liposomenpuffer (1x): 10 mmol/l Tris/HCl (pH 7,5) 0,1 mmol/l EDTA 50 mmol/l NaCl 10 % LM 10 % TX 1 mol/l DTT ddH2O PB130-b-PEO66-COOK entgaste „Bio Beads“ 2.4 Spektroskopische Charakterisierung des LHCII nach Insertions- versuch Alle Ansätze zur Insertion nativer LHCII-Trimere in PB130-b-PEO66-COOK-Vesikel wur- den spektroskopisch untersucht. Absorptionsmessungen fanden an einem Shimadzu Kapitel IV 2 Material und Methode 267 MPS-2000 statt, da in dieser alten Baureihe die Küvette unmittelbar vor dem Detektor sitzt und so Effekte der Lichtstreuung minimiert werden. Alle Proben wurden im Wellen- längenbereich von 250 bis 750 nm in 1 mm Quarz-Küvetten vermessen. Die Messung der Basislinie erfolgte in leeren Küvetten, als Proben-Referenz diente Liposomenpuffer (1x) ohne „Bio Bead“-Behandlung. Die Messung der Fluoreszenz-Emission (Kap. I, 2.8.2.2) und der CD-Absorption (Kap. I, 2.8.2.3) erfolgte wie zuvor beschrieben. CD- Stabilitätsmessungen orientierten sich an der Versuchvorschrift von Yang et al. (2006) und wurden genau wie Standardmessungen an einem Jasco J-810 CD-Spektrometer unter folgenden Einstellungen durchgeführt: data pitch: 1 nm response time: 2 s band width: 2 nm scanning speed 500 nm/min. Proben wurden in 1 mm Küvetten gefüllt und einem Temperaturgradienten von 20 bis 85 °C (1 °C/min) ausgesetzt. Während des Temperaturanstiegs wurde permanent die CD-Absorption der Trimere bei 473 nm in einem Zeitintervall von 0,2 s gemessen. Bei jeweils 5 °C Temperaturerhöhung wurde ein CD-Spektrum im Wellenlängenbereich von 400 bis 750 nm aufgenommen, was zur Unterbrechung des Gradienten für ca. 45 s führte. Die erhaltenen Daten wurden mit dem Programm „Table Curve 2D 4.0“ (SPSS Inc, Chicago, USA) gefittet. 2.5 Dynamische Lichtstreuung Die Versuche zur dynamischen Lichtstreuung der einzelnen Versuchsansätze wurden durch W. Müller (AK HD Dr. M. Maskos, Institut für Physikalische Chemie, Universität Mainz) vor und nach Insertion des LHCII durchgeführt. Eine genaue Beschreibung der Methode und der verwendeten Materialien findet sich in Müller (2006). Bei Insertionsansätzen, die Aggregationsverhalten zeigten, wurde durch Extru- sion der Lösung, analog zur Präparation von Liposomen (Boggasch, 2006), versucht den Durchmesser der Vesikel wieder zu vereinheitlichen. Hierzu wurde 1 ml Vesikellö- sung in eine gasdichte Glasspritze des Extruders [Avestin (Kanada), Liposo Fast Pneumatic Actuator] geladen und unter konstantem Stickstoff-Druck mehrmals durch eine Polycarbonat-Membran definierter Porengröße gepresst. Durch die entstehenden Scherkräfte werden Vesikel, welche größer als der Porendurchmesser sind, aufgebro- chen, die entstehenden Bruchstücke bilden neue, entsprechend kleinere Vesikel (Mül- ler, 2006). Kapitel IV 268 2 Material und Methode 2.6 Atomare Kraftmikroskopie zur Erstellung eines Höhenprofils von PB130-b-PEO66-COOK-Vesikeln Alle Untersuchungen zur Oberflächencharakterisierung mittels Atomarer Kraftmikro- skopie („atomic force microscopy“, AFM) wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeits- gruppe von Prof. Dr. A. Janshoff (Institut für Physikalische Chemie, Universität Mainz) durch Dr. M. Janke durchgeführt. Die kraftmikroskopischen Experimente sollten Auf- schluss über den Erfolg der Insertion von LHCII-Trimeren bzw. über deren Anordnung in den artifiziellen PB130-b-PEO66-COOK-Vesikeln geben. Hierzu wurden die Vesikel ohne Zugabe von CaCl2 auf ein frisch gespaltenes Stück Glimmer gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur dunkel inkubiert. Die gespreiteten Vesikel wurden an- schließend kräftig mit Liposomenpuffer B (1x, ohne EDTA) gespült, hierbei konnte der Spülstrahl sogar direkt auf die Probe gehalten werden. Anschließend wurden die Pro- ben im „tapping mode“ bei 0,8 bis 1Hz an einem MFP 3D (Asylum Research) mit den „cantilevers“ Olympus PSA 400 oder Mini-Biolever kraftmikroskopisch untersucht. Zur Bestimmung der Schichtdicke wurden mit Hilfe des „cantilever“ Löcher in die PB130-b- PEO66-COOK Oberfläche gekratzt. Mit entsprechenden Programmen der AK Janshoff konnten durch Linienanalysen die Höhenprofile verschiedener Insertionsansätze unter- sucht werden. Material: Liposomenpuffer B (1x): 10 mmol/l Tris/HCl (pH 7,5) 50 mmol/l NaCl 2.7 Fluoreszenz-Mikroskopie Die Präparation der Probe für die Fluoreszenz-Mikroskopie erfolgte aus messtechni- schen Gründen erst ca. 3 Monate nach den Insertionsversuchen. Zwischenzeitlich wurde die Probe dunkel bei 4 °C in Liposomenpuffer gelagert, ein Aliquot der Probe wurde am Versuchstag fluoreszenz- (Kap. I, 2.8.2.2) und CD-spektroskopisch (Kap. I, 2.8.2.3) untersucht, wie zuvor beschrieben auf Glimmer gespreitet (Kap. IV, 2.6) und kraftmikroskopisch untersucht. Die auf Glimmer gespreiteten Proben wurden nachfol- gend mittels Fluoreszenz-Mikroskopie unter Verwendung des Tetramethyl Rhodamine Iso-Thiocyanate (TRITC)-Filtersets charakterisiert. Die gewählten Filter erlauben eine Anregung mit Licht der Wellenlänge 545 nm und die Detektion emittierten Lichts der Wellenlänge 620 nm. Alle Photographien erfolgten mit einer hochempfindlichen Schwarz/Weiß-Kamera mit Belichtungszeiten von 5 bzw. 10 s. Alle Fotographien wur- den nachträglich eingefärbt. 2.8 Verdau von Insertionansätzen mit der Protease Thermolysin Thermolysin ist eine hitzestabile Metallopeptidase, die aus dem grampositiven Bakteri- um Bacillus thermoproteolyticus isoliert werden konnte. Das Enzym baut als Peptidase Kapitel IV 2 Material und Methode 269 Proteine, von der N-terminalen Seite ausgehend, durch Hydrolyse ab. Die Spaltungen erfolgen nach großen, hydrophoben Aminosäuren wie Phenylalanin oder Isoleucin. Der N-Terminus des gefalteten LHCII wird je nach Oligomerisierungsgrad unterschiedlich stark verdaut, der ungefaltete Lhcb1 wird komplett verdaut (Kuttkatt et al., 1995). Zum Verdau unterschiedlicher Insertionsansätze des LHCII wurde eine 20 µl Proteinprobe mit 2,5 µl 10x Thermolysinpuffer und 2,5 µl Thermolysin versetzt, 30 min bei 30 °C im Wasserbad inkubiert, danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 3,5 µl EDTA (100 mmol/l) gestoppt. Ein Probenvolumen von 20 µl wurde in Sparmix (1x) für 2 min bei 100 °C denaturiert und dann via SDS-PAGE (Kap. I, 2.8.1.1) analysiert. Material: 1 mg/ml Thermolysin in 1x Thermolysinpuffer (Sigma Aldrich) 100 mmol/l EDTA 10x Thermolysinpuffer: 100 mmol/l Hepes-KOH (pH 8) 5 mmol/l CaCl2 Kapitel IV 270 3 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Isolierung nativer LHCII-Trimere aus Erbse durch sukzessive Fäl- lung mit Salz Die für das Insertionsexperiment erforderlichen trimeren LHCII-Komplexe wurden nach dem Protokoll von Krupa et al. (1987), modifiziert von Rühle & Paulsen (2004), durch sukzessives Solubilisieren und Fällen aus frischen Erbsenblättern isoliert. Die während der Isolierung durchgeführten Absorptionsbestimmungen zeigten die erwartete Ab- nahme des Verhältnisses von Chl a zu Chl b von ca. 3,2 nach Isolierung der Thylakoi- de auf 1,35 nach dem dritten und letzten Fällschritt durch die erfolgreiche Anreicherung des nativen LHCII. Dieses Ergebnis konnte durch die SDS-PAGE (Abb. 4.3.1) bestätigt werden. Abb. 4.3.1: Denaturierendes Polyacrylamid-Gel (15 %) zur Überprüfung der Aufreinigung und der Masse der isolierten nativen LHCII-Komplexe nach Coomassie- Blau-Färbung. In den Spuren M1 und M2 wurden je- weils 3 µl bzw. 5 µl SDS7-Marker aufgetragen, auf die mittleren Spuren isolierte Thylakoide (A1), Protein- Pigment-Komplexe nach zweimaligem Fällen (A2), sowie Komplexe nach dem letzten Fällen (A3). Während die isolierten Thylakoide (A1) in Abb. 4.3.1 neben der Bande des LHCII bei 25 kDa noch zahlreiche Banden weiterer Proteine des Photosyntheseapparates aufweisen, zeigt sich in den Spuren A2 nach zweimaligem Fällen und A3 nach dreimaligem Fällen ein deutli- cher Aufreinigungs- und Anreicherungseffekt (Rühle & Paulsen, 2004). In beiden Spu- ren überwiegt der LHCII deutlich die Überreste einzelner verschleppter Thylakoid- Proteine. Hierbei ist zwischen A2 und A3 kein sichtbarer Unterschied erkenntlich, der dritte Fällungsschritt wurde im Unterschied zu den vorherigen Fällungen ohne die So- lubilisierung der Komplexe in TX durchgeführt, wodurch auch keine zusätzlichen kon- taminierenden Komplexe in Lösung gehen konnten. Dieser letzte Waschschritt diente vielmehr der Detergenzentfernung zur Lagerung der Komplexe. Zusätzlich zur denaturierenden PAGE wurde ein LHCII-Aliquot in 0,1 % LM so- lubilisiert und, ohne weitere Aufreinigung, CD-spektroskopisch untersucht (Abb. 4.3.2). Kapitel IV 3 Ergebnisse 271 Abb. 4.3.2: CD-spektroskopische Charakterisierung nativer, solubilisierter (0,1 % LM) LHCII- Komplexe nach Isolierung mittels sukzessiver Salzfällung. Wie erwartet zeigen die isolierten Komplexe das wildtypische CD-Absorptionsspektrum des trimeren LHCII. Neben den für monomeren LHCII charakteristischen Minima bei 491, 650 und 678, tauchen zusätzlich das prominente Minimum bei 473 nm und die Schulter bei 642 nm auf, die die Probe eindeutig als reine LHCII-Trimere charakterisie- ren (Hobe et al., 1994; Rühle & Paulsen, 2004). 3.2 Photometrische Untersuchung zur Entfernung des Detergenz TX aus Insertionsansätzen durch die Behandlung mit „Bio Beads“ Eine grundlegende Voraussetzung für eine erfolgreiche Insertion von trimeren LHCII- Komplexen in Vesikel, ist die quantitative Entfernung des Detergenz. Erst wenn die Konzentration des Detergenz unter die jeweils spezifische kritische Mizellen- Konzentration sinkt, inserieren die Komplexe in Lipiddoppelschichten (Boggasch, 2006). Misslingt diese Insertion, können sich mehrere Komplexe, ein entsprechender Salzgehalt vorausgesetzt, zu großen Aggregaten verbünden, um ihre hydrophoben Protein-Domänen gegenseitig zu schützen. Dabei fallen sie aus der Lösung aus. Fehlt das Salz dagegen, werden die Komplexe innerhalb kürzester Zeit instabil und zerfallen (Hobe, 1995). Eine Möglichkeit, die Entfernung des Detergenz TX nachzuweisen, bietet die spektrale Untersuchung im UV-Bereich. TX absorbiert aufgrund seiner Phenylgruppe bei 275 nm, wie bei der Probe mit 0,05 % TX in Abb. 4.3.3 (linke Seite, dunkelgrüne Line) deutlich ersichtlich ist. Nach dreimaliger Behandlung mit „Bio Beads“ ändert sich das Absorptionsverhalten (linke Seite, hellgrüne Linie) drastisch, statt der erwarteten Verringerung der Absorption im UV-Bereich, wird sogar eine stark ‚negative’ Absorption Kapitel IV 272 3 Ergebnisse detektiert. Da als Referenz unbehandelter Liposomenpuffer eingesetzt wurde, kann dies nur heißen, dass es durch die „Bio Beads“ Behandlung neben der Detergenzent- fernung weitere absorbierende Substanzen entfernt oder in ihrem Absorptionsverhalten verändert wurden. Hierbei fällt der Verdacht auf die Blockcopolymere, die eine absor- bierende Phenylgruppe besitzen und zu einem geringen Teil durch „Bio Bead“- Behandlung verloren gingen. Die maximale Absorption des Benzolringes liegt bei 184 und 200 nm, zudem tritt ein schwächerer „peak“ zwischen 230 und 260 nm auf. Unklar bleibt allerdings, warum die Absorptionsunterschiede so drastisch sind und warum die Absorption letztendlich negativ wird. Läge es nur an der leichten Adsorption von Block- copolymeren, so hätte bei einer Probe ohne „Bio Bead“-Behandlung und mit Liposo- menpuffer als Referenz, ein zusätzliches deutliches Maximum bei 250 nm erscheinen müssen, welcher dann nach „Bio Beads“-Behandlung an Intensität verloren hätte. Es bleibt festzuhalten, dass dieses Ergebnis die Methode deutlich abwertet. In den entscheidenden Proben lässt sie aber dennoch ausreichende Schlüsse zu. Ver- gleicht man die Absorptionsspektren der beiden eigentlichen Insertionsansätze vor „Bio Beads“-Behandlung (Abb. 4.3.3, rechte Seite; TX Ansatz schwarz, LM-Ansatz blau), so ist ein deutlicher Unterschied in der Absorption bei 275 nm sichtbar. Abb. 4.3.3 : Photometrische Untersuchung der Entfernung des Detergenz durch Behandlung mit „Bio Beads“ aus PB130-b-PEO66-COOK-Vesikellösungen. Die linke Seite zeigt den Kontroll- ansatz mit Vesikeln, TX (0,05 %), aber ohne LHCII, vor (dunkelgrüne Linie) und nach „Bio Beads“-Behandlung (hellgrüne Linie). Die rechte Seite zeigt die beiden Hauptansätze mit TX- solubisiertem (schwarze Linie) und LM-solubilisiertem LHCII (dunkelblaue Linie) vor Behand- lung mit „Bio Beads“ und nach dreimaliger Behandlung mit „Bio Beads“ (TX-solubilisiert grau, LM-solubilisiert petrol) im Wellenlängenbereich von 250 bis 750 nm. Die Messung erfolgte in 1 mm Quarz-Küvetten, als Basislinie wurden beide Küvetten leer gemessen, als Referenz diente Liposomenpuffer (1x) ohne „Bio Bead“-Behandlung. Die Spektren sind nicht normiert. Während beide Proben im sichtbaren Bereich das wildtypische Raumtemperatur- Spektrum für native LHCII-Trimere zeigen (Rühle & Paulsen, 2004), ist in der TX-Probe Kapitel IV 3 Ergebnisse 273 (schwarz) ein deutliches Absorptionsmaximum bei 275 nm sichtbar. Das im LM-Ansatz verwendete Detergenz absorbiert dagegen fast gar nicht im UV-Bereich (Quelle: Pier- ce), entsprechend niedriger fällt die Absorption in diesem Bereich aus. Nach Behand- lung mit „Bio Beads“ zeigen beide Proben, wie zuvor gesehen, die nicht erklärbare Ab- nahme der UV-Absorption bis zu negativen Werten. Die entscheidende Beobachtung ist allerdings, dass das Absorptionsspektrum beider Proben nach Behandlung mit „Bio Beads“ absolut identisch ist. Bei unvollständiger Entfernung des TX wären im UV- Bereich voneinander abweichende Spektren erwartet worden. Neben dieser Beobachtung fällt auf, dass nach „Bio Beads“ Behandlung die Absorption durch LHCII im sichtbaren Bereich deutlich nachgelassen hat. Zudem war bei LHCII-haltigen Proben (sowohl Ansätze mit als auch ohne Vesikellösung, unab- hängig vom verwendeten Detergenz) nach „Bio Bead“-Behandlung eine deutlich Trü- bung der Proben wahrnehmbar, während Proben mit Vesikeln, Detergenz und Pigment oder nur Vesikeln und Detergenz klar blieben. Um die durch die Trübung entstandene Lichtstreuung zu minimieren, wurden die UV-Küvetten in allen Messungen direkt vor dem Detektor des Photometers platziert. Bei den Referenzproben mit LHCII aber ohne Vesikellösung, war mit der Entfernung der Detergenzien TX oder LM eine sehr starke Abnahme der Absorption im sichtbaren Bereich wahrnehmbar (Daten nicht gezeigt). In Ansätzen mit freien Chlorophyllen und Vesikellösung aggregierte der Großteil der Pig- mente, ein geringer Anteil war aber auch nach Entfernung des Detergenz in Lösung stabilisiert (Daten nicht gezeigt). 3.3 Spektroskopische Charakterisierung des LHCII nach Insertions- versuchen Die spektroskopische Charakterisierung des LHCII mittels Detektion der Fluoreszenz- Emission nach selektiver Chl b-Anregung zeigte, dass beide Insertionsansätze mit LHCII (solubilisiert in TX oder LM) sowohl vor als auch nach Entfernung des Detergenz intakte LHCII-Komplexe enthielten. Alle Proben zeigen ein Fluoreszenzmaximum des Chl a bei 680 nm und damit den erwarteten Energietransfer intakter Komplexe (Abb. 4.3.4 linke Seite; Spektren normiert auf Emissionsmaximum). Die gleichen Spektren unnormiert (Abb. 4.3.4, rechte Seite) zeigen ein leichtes „Quenchen“ der Chlorophyll- Fluoreszenz in TX-solubilisierten LHCII-Trimeren (schwarze Linie) gegenüber LM- solubilisierten (blaue Linie). Obwohl die LHCII-Konzentration beider Proben identisch ist (Abb. 4.3.3), zeigt die TX-Probe eine leicht schwächere Emission. Kapitel IV 274 3 Ergebnisse Abb. 4.3.4: Unterschiede in der Fluoreszenz-Emission („front face“-Messungen) des LHCII in PB-PEO-Vesikellösungen vor und nach Detergenzentzug. Dargestellt sind der Vesikel-Ansatz mit TX-solubilisiertem LHCII vor (schwarze Linie) und nach (graue Linie) Detergenzentzug, so- wie der Vesikel-Ansatz mit LM-solubilisiertem LHCII vor (dunkelblaue Linie) und nach (petrol) Detergenzentzug. In allen Proben wurde selektiv Chl b bei 470 nm angeregt, Spektren links wurden auf die maximale Emission normiert, die Spektren rechts sind nicht normiert. Durch Entfernung des Detergenz sinkt die Fluoreszenz-Emission beider Proben, wie zuvor in der Absorption beobachtet (Abb. 4.3.3), deutlich ab. Ob dieser Effekt alleine in einer Abnahme intakter Komplexe oder in der zusätzlichen Entstehung von Aggregaten mit entsprechendem „Quench“-Verhalten begründet liegt, kann durch die bei Raum- temperatur aufgenommenen Spektren nicht unterschieden werden. Hierzu hätten Tief- temperaturspektren gemessen werden müssen, die bei Aggregation des LHCII eine deutliche Fluoreszenz bei 700 nm aufweisen (Vasilev et al., 1997; Barros et al., 2009). Die Referenz-Ansätze mit LHCII ohne Vesikellösung zeigten mit Entfernung des Deter- genz eine deutliche stärkere Abnahme der Fluoreszenz. Nach dreimaligem Wechsel der „Bio Beads“ war praktisch keine Fluoreszenz des LHCII mehr detektierbar, die schwach grünen Lösungen zeigten lediglich Fluoreszenzmaxima bei 675 nm, typisch für aggregierte Chlorophylle. Reine PB-PEO-Lösungen zeigten dagegen gar keine Flu- oreszenz (Daten nicht gezeigt). CD-Absorptionsmessungen der Insertionsansätze zeigten deutliche Abwei- chungen zu den Standard-Spektren des LM-solubilisierten trimeren LHCII. Diese Probe besitzt, wie zuvor beschrieben, charakteristische Minima bei 473, 491, 650 und 678 nm, sowie eine Schulter bei 642 nm (Abb. 4.3.2). Die LM-solubilisierten LHCII-Trimere in PB130-b-PEO66-COOK-Vesikellösung zeigen ebenfalls dieses Absorptionsmuster, was für eine normale Solubilisierung spricht (Abb. 4.3.5, blaue Kurve). Wird das Deter- genz entfernt, ändert sich die Intensität einzelner „peaks“ drastisch (hellblaue Kurve). Während die Absorption im roten Wellenlängen-Bereich wenig beeinflusst wird, ändern Kapitel IV 3 Ergebnisse 275 sich im Soret-Absorptionsbereich die Intensitäten einzelner Minima und ähneln in ihrer Absorption rekombinanten Trimeren aus TX-Saccharose-Gradienten (Boggasch, 2006), beziehungsweise Trimeren in Liposomen (Boggasch, 2006; Yang et al., 2006) oder Thylakoidmembranen (Dobrikova et al., 2003). Insbesondere das Minimum bei 491 nm geht deutlich zurück, die Minima bei 471, 457 und 434 nm verändern sich we- nig. Insgesamt nimmt die Absorption durch die „Bio Beads“- Behandlung wie vorher schon beobachtet ab. Abb. 4.3.5: Unterschiede in der CD-Absorption des LHCII in Detergenz- und PB130-b-PEO66- COOK -Vesikellösungen vor und nach Detergenzentzug durch dreimalige „Bio Beads“- Behand- lung. Dargestellt sind der Vesikel-Ansatz mit TX-solubilisiertem LHCII vor (schwarze Linie) und nach (graue Linie) Detergenzentzug, der Vesikel-Ansatz mit LM-solubilisiertem LHCII vor (blaue Linie) und nach (petrol) Detergenzentzug, sowie der Ansatz ohne Vesikellösung mit TX- solubilisiertem LHCII vor (lila Linie) und nach (rosa Linie) Detergenzentzug. Die Spektren sind nicht normiert. Werden die nativen Trimere dagegen in TX gelöst (schwarze Linie), zeigen sie von Beginn an das eben beschriebene Absorptionsverhalten und sind identisch zu LHCII in PB130-b-PEO66-COOK-Vesikellösung, denen LM entzogen wurde (hellblaue Linie). Wird das TX entfernt, ändert sich das Absorptionsverhalten nicht, lediglich die Intensität nimmt ab. LHCII, solubilisiert in TX ohne Vesikel (lila Kurve), absorbiert ebenfalls iden- tisch, durch Entzug des Detergenz nimmt die Intensität der Absorption drastisch ab, was auf einen Rückgang intakter Komplexe zurückgeführt werden kann. Wie zuvor zeigen Kontroll-Ansätze mit Pigment sowohl vor als auch nach Detergenzentfernung eine schwache Absorption, reine Vesikel-Ansätze dagegen kein Signal (Daten nicht gezeigt). Kapitel IV 276 3 Ergebnisse 3.4 Messung der Hitzestabilität des LHCII in PB-PEO-Vesikellösung mittels CD-Absorption Die Messung der Stabilität des LHCII in PB130-b-PEO66-COOK -Vesikellösung erfolgte, wie in Yang et al. (2006) für Liposomen- und Detergenz-solubilisierten LHCII beschrie- ben, durch Messung der CD-Absorption im Temperaturgradienten. Entsprechende Messungen zeigten, dass auch LHCII-Trimere in PB130-b-PEO66-COOK -Vesikellösung mit ansteigender Temperatur instabil werden und zerfallen. Wie in Abb. 4.3.6 A deutlich erkennbar ist, verlieren die zuvor beschriebenen Absorptionsminima des LHCII-Trimers mit steigender Temperatur an Intensität und sind bei 80 °C komplett verschwunden. Der permanente Intensitätsverlust des prominenten Minimum bei 473 nm ist in Abb. 4.3.6 B in Abhängigkeit zum Temperaturanstieg dargstellt. Bei einer Temperatur von 71,5 °C besitzt das Minimum nur noch halbe Intensität (Tm), die Hälfte der trimeren Komplexe ist denaturiert. Abb. 4.3.6: Charakterisierung der Stabilität des LHCII in PB130-b-PEO66-COOK-Vesikellösung durch Messung der CD-Absorption im Temperaturgradienten. (A) zeigt die Änderung der CD- Absorption einer LHCII-PB130-b-PEO66-COOK-Vesikellösung nach Entfernung des TX in Ab- hängigkeit zu Temperaturerhöhungen um jeweils 5 °C. Die permanente Änderung des Mini- mums bei 473 nm (Pfeil in A) wird in (B) dargestellt. Die markierte Temperatur Tm (Pfeil in B) stellt die Temperatur dar, bei der die Hälfte der Komplexe zerfallen ist. In (C) werden die Tm- Werte verschiedener Ansätze von Yang et al. (2006) mit dem Tm des LHCII in PB130-b-PEO66- COOK-Vesikeln (2 Messreihen) verglichen. L/P meint Lipid/ Protein-Verhältnis. Kapitel IV 3 Ergebnisse 277 Vergleicht man in Abb. 4.3.6 C den aus zwei unabhängigen Messungen ermittelten Tm des trimeren LHCII in PB130-b-PEO66-COOK -Vesikellösung mit Vergleichswerten aus der Literatur (Yang et al., 2006), so besitzt die Probe eine deutlich höhere Hitzestabili- tät als der Detergenz-solubilisierte LHCII in LM und eine leicht höhere Stabilität als LHCII in Liposomen mit einem niedrigen Lipid/Protein-Verhältnis (L/P 34). Hierbei gilt zu beachten, dass die Werte aus Yang et al. (2006) aus 3 bis 7 Einzelmessungen ge- mittelt wurden und dadurch besser gesichert sind. 3.5 Dynamische Lichtstreuung Mit Hilfe der Methode der dynamischen Lichtstreuung (DLS) kann, durch Analyse des Streulichts eines auf die Lösung gerichteten Lasers, der gemittelte hydrodynamische Radius (Rh) von Polymeren in verdünnter Lösung, sowie ein Maß für die Radien- Polydispersität (µ2) der Polymere bestimmt werden (Schmidt, 1993). So erhält man im Falle einer Vesikelsuspension Auskunft über den mittleren Durchmesser der Vesikel und die Breite der Vesikel-Größenverteilung. Einzelne Präparationen von PB130-b- PEO66-COOK-Vesikeln (Tab. 4.3.1: Vesikellösung I, II, III) wurden mittels DLS charak- terisiert. Die Vesikel der einzelnen Präparationen in Wasser zeigen sehr einheitliche Radien von 31 (Lösung II) bzw. 35 nm (Lösung I und III). Wie die niedrigen µ2-Werte unterhalb 0,1 zeigen, sind die Vesikelgrößen zudem sehr eng verteilt. Die Behandlung der Vesikel mit den Detergenz-adsorbierenden „Bio Beads“ beeinflusste weder den Vesikelradius, noch die Größenverteilung. Im Gegensatz zu den Detergenzien TX oder LM wird nur eine geringe Menge der Blockcopolymere adsorbiert, der ermittelte Kon- zentrationsverlust liegt bei ca. 5 % je „Bio Bead“-Behandlung (Daten nicht gezeigt). Wie aus Tab. 4.3.1 (oberer Block) ersichtlich wird, hat weder eine Änderung des Lö- sungsmittels, noch die gleichzeitige Zugabe des Reduktionsmittels DTT einen Einfluss auf Größe oder Größenverteilung der Vesikel. Durch die Zugabe des Detergenz TX verändert sich die Größe der Vesikel deutlich, der mittlere Radius wird annähernd ver- doppelt und die Größenverteilung der Vesikel wird recht breit. Durch Entfernung des Detergenz mittels „Bio Beads“-Behandlung ist der beobachtete Effekt nicht rückgängig zu machen. Noch drastischer ist der Effekt bei den Insertionsversuchen mit LHCII (mitt- lerer und unterer Block). Kapitel IV 278 3 Ergebnisse Tabelle 4.3.1: Mittels dynamischer Lichtstreuung ermittelte Größe und Größenverteilung von PB130-b-PEO66-COOK-Vesikeln in Abhängigkeit von Lösungsmitteln, von Chemikalien, sowie nach Insertion von nativem LHCII. Rh ist der gemittelte hydrodynamische Radius und wurde mittels biexponentiellem Fit ausgewertet (Extrapolation: q=0). µ2 ist ein Maß für die Radien- Polydispersität und wurde mittels Cumulant-Fit bei 90° ausgewertet (für eng verteilte Proben gilt 0,05<µ2<0,1). Alle Proben wurden vor Messung durch einen Filter mit einer Porengröße von 450 nm filtriert, eine Probe der LHCII-Insertion zunächst nur durch einen Filter der Porengröße von 5 µm (Filter B). Werte in eckigen Klammern sind aufgrund der geringen Güte des Fit ledig- lich als Richtwerte einzustufen. Die Vesikellösungen I (Müller PV47), II (Müller PV36) und III (Müller PV50) stammen jeweils aus einzelnen Präparationen. Die Probe LHCII_PB- PEO_TX_3xBB ist der Insertionsansatz des TX-solubilisierten LHCII nach dreimaliger „Bio Beads“- Behandlung. Unabhängig vom verwendeten Detergenz zeigen alle LHCII-Vesikel-Proben nach Ent- fernung des Detergenz sehr große Vesikelradien gepaart mit einer beträchtlichen Grö- ßenverteilung. Aufgrund der Verteilungsbreite und der damit verbundenen schlechten Fit-Güte sind die Ergebnisse für Rh und µ2 nur als Richtwerte anzusehen und daher in Klammern gesetzt. Verwendet man in der Präparation für die DLS Filter mit größeren Porenweiten, tritt der Effekt noch deutlicher auf. Werden die Lösungen extrudiert, so entstehen bei 100 nm Porengröße Partikel mit einem Rh von 100 nm und breiter Vertei- lung. 50 nm Poren dagegen verstopfen, es bleibt eine farblose, klare Lösung. Letztend- lich bleibt festzuhalten, dass sowohl die Behandlung mit TX, aber noch mehr die gleichzeitige Zugabe des LHCII, zur Auflösung der definierten Vesikelstrukturen führen und die mittels DLS detektierten Partikel zudem zur Aggregation neigen. 3.6 Erstellung eines Höhenprofils von PB130-b-PEO66-COOK-Vesikeln mittels AFM Die Ansätze zur Insertion des LHCII in PB130-b-PEO66-COOK-Vesikeln wurden durch Dr. M. Janke (AK Janshoff, Mainz) kraftmikroskospisch untersucht. Ziel war es festzu- stellen, ob LHCII-Trimere, welche in vivo die Thylakoidmembran mit 3 bis 4 nm Durch- messer durchspannen, in artifizielle Vesikel mit deutlich größerer lipophiler Schichtdi- cke (~15 nm) inseriert werden können und dabei, wie in Abb. 4.1.2 dargestellt, trichter- förmige Oberflächenstrukturen ausgebildet werden. Außerdem war von Interesse, ob Kapitel IV 3 Ergebnisse 279 inserierte Komplexe gleichmäßig über das Vesikel verteilt vorliegen oder als Aggregate größere Protein-Cluster bilden. Hierzu wurden verschiedene Vesikel-Ansätze auf Glimmer-Oberflächen gespreitet, kräftig mit Pufferlösung gespült und in Lösemittel durch eine AFM-Tastfeder („cantilever“, Abb. 4.3.7) im „tapping mode“ abgerastert Hierbei handelt es sich um einen dynamische Modus, bei der der „cantilever“ in seiner Resonanzfrequenz zur Schwingung angeregt wird und die zu untersuchende Oberfläche periodisch mit kon- stanter Amplitude abtastet. Erhebungen in der Oberfläche, werden durch einen Laser detektiert, welcher, auf den „cantilever“ gerichtet, je nach Ausrichtung der Tastfeder in unterschiedlichem Winkel reflektiert wird (Abb. 4.3.7). Abb. 4.3.7: Schematische Darstellung der Erstellung eines Höhenprofils mittels AFM. Die „can- tilever“-Spitze (gelb) tastet eine Oberfläche eines Vesikels, bestückt mit unterschiedlichen Parti- keln (lila) und gespreitet auf einer Glimmeroberfläche (grau) ab. Je nach Höhe und Härte der Partikel ändert sich der Auslenkungswinkel der Spitze (schwarz 1 und 2), woraufhin ein auf den „cantilever“ gerichteter Laserstrahl unterschiedlich reflektiert wird (blau 1 und 2). Mit entspre- chender Computer Software des AK Janshoff wird die Änderung in ein zweidimensionales Hö- henprofil umgerechnet. Aus Boggasch (2006). Die reine Vesikellösung in Liposomenpuffer lässt sich sehr gut auf Glimmer spreiten, ein Zusatz von CaCl2, notwendig zum Spreiten von LHCII beladenen Liposomen (Bog- gasch, 2006), ist nicht notwendig. Nach der Lagerung über Nacht bei Raumtemperatur und mehrmaligem, kräftigen Spülen mit Puffer erhält man einen Vesikelfilm, welcher, mit Ausnahme weniger defekter Stellen (Abb. 4.3.8 A, helle Fläche unten links), einen gleichmäßigen Film bildet. Abb. 4.3.8 A zeigt die Aufsicht auf eine mit Vesikel belegte Glimmerfläche von 16 µm². Die Fläche ist, bis auf wenige Ausnahmen, gleichmäßig gefärbt, was für eine Fläche ohne Unebenheiten spricht. Dies ist auch im „line scan“ und dem entsprechenden Höhenprofil ersichtlich (Abb. 4.3.8 B). Kratzt man mit dem Cantilever auf der Oberfläche (schwarzes Rechteck), wird der Glimmer freigelegt und Kapitel IV 280 3 Ergebnisse es entsteht ein Loch einer Tiefe von ca. 12 nm. Die erwartete Schichtdicke für den hyd- rophoben Kern des Polymerfilms liegt bei ca. 15 nm, was im Toleranzbereich dieser Kratzmethode liegt. Die hydrophile Schicht aus PEO ist mittels AFM nicht darstellbar. Da die Messung in wässriger Lösung erfolgt, bleibt diese Schicht gequollen und damit zu flexibel für eine Detektion mittels AFM. Abb. 4.3.8: (A) zeigt eine AFM- Aufnahme der gespreiteten Vesikel- lösung auf Glimmer sowie die Dar- stellung des Höhenprofils (B) zum „line scan“. Die obere Aufnahme (Fläche: 4 x 4 µm) stellt eine Auf- sicht dar, Bereiche, die aus der Ebene herausstehen, werden farb- lich heller, Bereiche, die in die Ebe- ne einsinken, dunkler wiedergege- ben. Bei dem ca. 0,7 x 0,7 µm gro- ßen dunklen Bereich handelt es sich um eine ausgekratzte Vesi- kelfläche, die weiße Linie oberhalb der Bildmitte zeigt den Weg des „line scan“. Als Probe wurde Vesi- kellösung ohne LHCII in Liposo- menpuffer B gespreitet. Das untere Diagramm (B) stellt das seitliche Höhenprofil des „line scan“ dar. Auch die Blockcopolymere des LHCII- PB130-b-PEO66-COOK- Insertionsansatzes (Abb. 4.3.9 A und C) lassen sich ohne weitere Probleme auf Glimmer spreiten. Die gemessene Schichtdicke des Polymerfilms beträgt je nach Messort zwischen 8 und 12 nm, die Be- schichtung des Glimmers ist durchgehend und gleichmäßig. Im Unterschied zur LHCII- freien Probe ist hier aber eine Vielzahl von Partikeln erkennbar, die aus dem Polymer- film ca. 4 bis 5 nm herausstehen. Die Partikel, bei denen es sich um den LHCII handelt (siehe folgendes Kap. IV, 3.7), bilden in Abb. 4.3.9 A und C unterschiedlich große „Cluster“, welche über die Fläche verteilt vorliegen. Die „Cluster“ in Abb. 4.3.9 A sind zum überwiegenden Anteil deutlich kleiner als in Abb. 4.3.9 C, übertreffen aber deutlich die erwartete Breite von LHCII-Trimeren. Interessanterweise kann in A auch ein „Cluster“ mit geringerer Höhe und sehr homogener Oberfläche detektiert werden (linke Seite des „line scan“). Einzelne Partikel, die deutlich höher aus der Ebene hervorste- hen, konnten teilweise durch erneutes Spülen entfernt werden. Kapitel IV 3 Ergebnisse 281 Abb. 4.3.9: AFM-Aufnahmen (A, C) der gespreiteten Vesikellösung mit LHCII auf Glimmer sowie Darstel- lung der Höhenprofile der „line scans“ (B, D). Die Aufnahmen (A) und (C) (Fläche je 25 µm²) stellen Aufsichten dar, Bereiche, die aus der Ebene herausstehen, werden farblich heller, Bereiche, die in die Ebene Einsinken, dunkler darge- stellt. Bei den ca. 0,7 x 0,7 µm gro- ßen dunklen Bereichen handelt es sich um ausgekratzte Vesikelflä- chen, die weißen Linien oberhalb der Bildmitte (A) beziehungsweise in der Bildmitte (C) zeigen die Wege der „line scans“. Als Probe wurden Vesikellösung mit LHCII (LHCII_PB- PEO_TX_3xBB) in Liposomenpuffer B gespreitet. Die Diagramme (B) und (D) stellen die seitlichen Hö- henprofile der jeweiligen „line scans“ dar. (A) und (C) zeigen Aus- schnitte derselben Präparation, aufgenommen an verschiedenen Glimmer-Stellen. Aufnahme (C) wurde 24 h nach Aufnahme (A) gemessen. Bei der in Abb. 4.3.9 C darge- stellten Probe handelt es sich um die gleiche Probe wie in A, allerdings wurde die Probe nach der ersten Messung weitere 24 h inkubiert und an anderer Stelle neu vermessen. Die hier detek- tierten „Cluster“ sind deutlich größer, es kann aber nicht ge- sagt werden, ob der Grund für dieses Ergebnis in der verlän- gerten Inkubationsdauer oder dem gewechselten Messort liegt. Genaue Angaben zur flächen- mäßigen Ausdehnung solcher „Cluster“ sind nicht machbar, da es in AFM-Aufnahmen aufgrund der Spitzengeometrie und des Kapitel IV 282 3 Ergebnisse Abtastvorgangs zur Verfälschung der Messbreite kommt. Wie schon zuvor bemerkt, zeigten Filtrationsversuche aber, dass die Proben ohne weiteres durch Poren eines Durchmessers von 100 nm filtriert werden können. 50 nm Poren wurden dagegen durch die „Cluster“ verstopft. 3.7 Charakterisierung der Partikel in gespreiteten Polymerschichten mittels Fluoreszenz-Mikroskopie Die Fluoreszenz-Mikroskopie bietet einen Ansatz die mittels AFM detektierten Partikel in gespreiteten Polymerschichten zu charakterisieren. Das in Insertionsversuchen ver- wendete Membranprotein LHCII bindet als Monomer 14 Chlorophylle als Cofaktoren, die durch Licht angeregt werden können und je nach Belichtungsintensität und Oligo- merisierungsgrad Energie in Form von Fluoreszenzlicht wieder abgeben können. Der in der Fluoreszenzspektroskopie (Kap. IV, 3.3) gewählte Versuchsaufbau erlaubt es beispielsweise spezifisch Chl b bei 470 nm anzuregen und die Fluoreszenzintensität zwischen 600 und 750 nm zu messen. Das in der Fluoreszenz-Mikroskopie verfügbare TRITC-Filterset mit einer Anregungswellenlänge von 545 nm und einem Emissions- Bandpassfilter von 620 nm stellt lediglich einem Kompromiss dar. Wie in Abb. 4.3.3 ersichtlich, absorbiert der LHCII bei 545 nm im Verhältnis zum blauen oder roten Wel- lenlängenbereich des Lichts vergleichsweise schwach. Lediglich die gebundenen Xan- thophylle absorbieren noch ein wenig. Zudem sind die Fluoreszenzen von Chl a und b bei 620 nm ebenfalls nur schwach ausgeprägt. Die zur Verfügung stehenden Möglich- keiten sollten aber ausreichen, um die in der AFM detektierten Partikel als fluoreszie- rende LHCII-Komplexe zu identifizieren. Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen der gespreiteten Vesikellösung ohne LHCII zeigen, wie zuvor in der spektralen Untersu- chung, keinerlei Fluoreszenz. Auch längere Belichtungszeiten führten zu keinerlei Emission bei 620 nm (Daten nicht gezeigt), so dass eine Emission durch Blockcopoly- mere ausgeschlossen werden kann. Gespreitete Insertionsansätze mit LHCII zeigten dagegen bei längeren Belichtungszeiten von 5 und 10 s eine deutliche Emission, dar- gestellt in Abb. 4.3.10 als rot-fluoreszierende Punkte unterschiedlicher Größe. Wie schon zuvor im AFM gesehen, sind auch die fluoreszierenden LHCII-Komplexe über die ganze Fläche in Form unterschiedlich großer „Cluster“ verteilt, der homogen verteil- te Polymerfilm entspricht hierbei dem dunklen Hintergrund. Wegen der geringen Auflö- sung des Mikroskops und der diffusen Emission ist eine exakte laterale Ausmessung der Partikel nicht möglich. Kapitel IV 3 Ergebnisse 283 Abb. 4.3.10: Charakterisierung der Partikel in gespreiteten Polymerschichten mittels Fluores- zenz-Mikroskopie. Die zuvor mittels AFM untersuchten Glimmerstücke mit gespreiteten Poly- merschichten aus Insertionsansätzen mit LHCII wurden mit Licht der Wellenlänge 545 nm ange- regt und die Emission bei 620 nm mit einer hochempfindlichen Schwarz/Weiß-Kamera fotogra- fiert. Die linke Abbildung wurde 5 s belichtet, rechts ist eine Vergrößerung mit einer Belich- tungszeit von 10 s dargestellt. Beide Abbildungen wurden nachträglich eingefärbt. 3.8 Verdau von Insertionsansätzen mit der Protease Thermolysin Eine Möglichkeit, die Intaktheit und das Insertionsverhalten des LHCII in Vesikel weiter zu charakterisieren, bietet der Verdau des Proteins mit der Endopeptidase Thermoly- sin, welche den gefalteten LHCII nur am N-Terminus, den ungefalteten dagegen kom- plett hydrolysieren kann. Wird nur der N-Terminus verdaut, wird die Masse des mono- meren Proteins von ca. 25,5 kDa auf 24 kDa verringert (Kuttkatt et al., 1995). Bei Zu- gabe des Thermolysin zu einer Suspension von intakten Vesikeln mit inserierten Membranproteinen kann man annehmen, dass für die Protease lediglich die N-Termini von Proteinen zugänglich sind, die aus dem Vesikel in das umgebende Lösungsmittel schauen. Befindet sich ein Protein innerhalb des Vesikellumens oder ist es so inseriert, dass der N-Terminus in das Vesikellumen zeigt, sollte kein Verdau stattfinden. In Abb. 4.3.11 ist das Laufverhalten im SDS-Gel verschiedener Insertionsansät- ze und deren Kontrollen nach Thermolysin-Verdau dargestellt. Während das unverdau- te native Protein (Spur 1 und 8) erwartungsgemäß eine Bande von ca. 25 kDa, leicht oberhalb der 24 kDaMarkerbande (Spur 2 und 7), besitzt, laufen die verdauten Proben der Insertionsansätze in Spur 3 (LHCII_PB-PEO_TX_3xBB) und 4 (LHCII_PB- PEO_LM_3xBB) minimal weiter bis ca. 24 kDa (*). Eine zweite Bande auf Höhe des unverdauten LHCII ist nicht erkennbar. Kapitel IV 284 3 Ergebnisse Abb. 4.3.11: Denaturierende SDS-PAGE nach Coomassie-Blau-Färbung zur Analyse des Ver- daus verschiedener Insertionsansätze durch die Endopeptidase Thermolysin. Auf Spur 1 und 8 wurden jeweils 2 µg des unverdauten maturen Lhcb1 aufgetragen, auf Spur 2 und 7 jeweils 5 µl des SDS7-Marker, auf Spur 3 und 4 jeweils 20 µl der verdauten Insertionsansätze mit LHCII und Vesikeln nach Detergenzentzug (Spur 3 LHCII_PB-PEO_TX_3xBB, Spur 4 LHCII_PB- PEO_LM_3xBB), auf Spur 5 und 6 die entsprechenden, verdauten Kontrollansätze ohne Vesi- kel nach Detergenzentzug (Spur 5 LHCII_TX_3xBB, Spur 6 LHCII_LM_3xBB). In den Spuren 5 (LHCII_TX_3xBB) und 6 (LHCII_LM_3xBB) der Kontrollansätze ohne Polymere ist der LHCII komplett verdaut. Alle verdauten Proben (Spur 3 bis 6) zeigen zudem die Bande des Thermolysin bei 34 kDa. Die in allen Ansätzen vorkommende leichte Bande bei 20 kDa kennzeichnet die Lauffront. Kapitel IV 4 Diskussion 285 4 Diskussion 4.1 Überprüfung der Ausgangsbedingungen für Insertionsversuche Eine grundlegende Voraussetzung für die Durchführung des Insertionsexperiments von LHCII in Polymersomen sind optimale Ausgangsbedingungen, beziehungsweise die optimale Beschaffenheit der entsprechenden Materialien. Die Isolierung und Aufreini- gung der nativen Trimere des LHCII aus Erbse nach Standardprotokoll (Rühle & Paul- sen, 2004) brachte den erwarteten Erfolg. Sowohl die gelelektrophoretische, wie auch die spektroskopische Charakterisierung mittels Absorptions- und CD-Spektroskopie oder Energietransfer bei Raumtemperatur sind identisch zu den publizierten Daten. Die Herstellung der Polymersomen mit dem Diblockcopolymer PB130-b-PEO66- COOK als Grundbaustein erfolgte ebenfalls nach standardisierten Methoden (Müller et al., 2009), der gewünschte Durchmesser und die enge Größenverteilung der Vesikel konnte mittels dynamischer Lichtstreuung durch W. Müller bestätigt werden. Auch eine Spreitung der Vesikellösung auf Glimmer, analog zu früheren Versuchen mit Liposo- men (Boggasch, 2006), funktionierte problemlos. Das Abtasten der Vesikeloberfläche mittels Kraftmikroskopie durch Dr. M. Janke bestätigte die erwartete Schichtdicke der hydrophoben PB-Doppelschicht (Müller, 2006). Hiermit waren auch die Vorbedingun- gen in Bezug der Polymersomen-Qualität erfüllt. 4.2 Entfernung der Detergenzien aus den Insertionsansätzen Der Versuch der Insertion des LHCII in die artifiziellen Polymersomen erfolgte analog dem standardisierten Protokoll der Insertion des LHCII in Liposomen (Boggasch, 2006). Der dort erbrachte direkte spektroskopische Nachweis der Detergenzentfernung mittels UV-Absorptionsspektren wurde in diesem Insertionsexperiment erschwert durch die starke Trübung der Lösung infolge der Bildung von Polymersomen- und Protein- Aggregaten. Die dadurch entstehende Lichtstreuung in den Absorptionsmessungen konnte durch die Wahl eines Photometers, in welchem Probe und Detektor räumlich nahe angeordnet sind, minimiert werden. Ein zweites auftretendes Problem, die Existenz eines störenden negativen Ab- sorptionssignals nach „Bio Beads“- Behandlung, konnte nicht geklärt werden. Die Tat- sache allerdings, dass die Absorptionsspektren der Insertionsansätze mit TX bezie- hungsweise mit LM im UV-Bereich deutlich unterschiedlich sind, nach Detergenzent- zug aber einander identisch sind, spricht für die erfolgreiche Entfernung des TX. Die Entfernung des LM aus dem LM-Ansatz konnte bereits durch die charakteristische Än- derung des CD-Signals belegt werden. Weiter kann argumentiert werden, dass die „Bio Beads“ nur gering zur Adsorption des PB130-b-PEO66-COOK tendieren, also nicht durch Kapitel IV 286 4 Diskussion eine ungewollte Adsorption belegt sind, und zudem die eingesetzte Menge laut Herstel- ler zur Entfernung der 20fachen Menge an Detergenz ausreichend sein sollte. Dass die Entfernung der Detergenzien an sich gut funktioniert, wurde an den LHCII- Kontrollansätzen ohne Polymersomen ersichtlich Hier zerfallen die Komplexe in der wässrigen Lösung, verlieren ihre spektralen Eigenschaften und werden, wie für unge- falteten LHCII erwartet (Kuttkatt et al., 1995), durch Thermolysin hydrolysiert. Es kann also festgehalten werden, dass im durchgeführten Experiment, analog zur Insertion in Liposomen, dem Detergenz-solubilisierten LHCII mittels „Bio Beads“ das Detergenz langsam entzogen werden kann und somit, durch Zunahme der Polari- tät der Umgebung, der LHCII gezwungen wird, eine neue hydrophobe Umgebung zum Schutz der transmembranen Domänen aufzusuchen. 4.3 Stabile Einlagerung des LHCII in die hydrophile PEO-Schicht von Polymersomen unter Ausbildung von Protein-Aggregaten Anders als im Liposomenexperiment (Boggasch, 2006), führte die Zugabe von LHCII mit nachfolgendem Detergenzentzug zu einer deutlichen Trübung der Polymersomen- lösung und ähnelte der LHCII-Aggregatbildung in Fällungsversuchen. Ursache der Trübung scheint, neben einer tatsächlich detektierten Ausbildung von Protein- „Clustern“, vor allem auch die Aufhebung der geordneten Vesikelstrukturen zu sein. Aus einheitlich verteilten Polymersomen eines gleichen Durchmessers werden Vesikel oder Membranbruchstücke unterschiedlichster Größen, die auch durch mehrmalige Extrusion nicht mehr auf einheitliche Größe gebracht werden können. Dass die dop- pelschichtigen Membranen nicht komplett aufgelöst werden und beispielsweise zu Mi- zellenstrukturen übergehen, beweist die unveränderte Schichtdicke der hydrophoben PB-Doppelschicht in AFM-Aufnahmen. Auch die Tatsache, dass das Protein in der AFM-Probenpräparation nicht von der Polymerschicht abwaschbar ist, spricht für die Interaktion mit den Polymersomen, genau wie die Stabilisierung der Proteine nach Entfernung des Detergenz. Der voll- ständige Verdau der N-Termini aller LHCII-Proteine spricht für die gute Zugänglichkeit des N-Terminus zur wässrigen Umgebung. Entgegen der erwünschten Insertion des Proteins in die hydrophobe Doppelschicht aus Poly-Butadien, zeigen die AFM- Auf- nahmen lediglich eine Interaktion des LHCII mit der hydrophilen Poly-Ethylenoxid- Schicht. Im AFM-Höhenprofil liegt der LHCII flach auf der PB-Schicht auf und führt nicht, wie erhofft, durch Insertion zum Zusammenstauchen der PB-Schicht und den dadurch erwarteten trichterförmigen Oberflächenstrukturen (Abb. 4.1.2; Mecke et al., 2006). Ein Grund für die fehlgeschlagene Insertion könnte im chemischen Aufbau der eingesetzten Copolymere liegen (Abb. 4.4.1 B). Genau wie bei dem verwendeten De- tergenz TX (Abb. 4.4.1 A) besteht der hydrophile Teilblock des Copolymers aus Poly- Ethylenoxid, lediglich die Zahl der Wiederholungseinheiten ist in den Polymersomen mit 66 Einheiten deutlich häufiger als im TX (9 bis 10 Einheiten). In TX lässt sich LHCII Kapitel IV 4 Diskussion 287 sehr gut solubilisieren. Mit hoher Wahrscheinlichkeit schirmt die unpolare Kopfgruppe des TX die hydrophoben Bereiche des Membranproteins ab, während der hydrophile Polyethylen-Schwanz ins wässrige Medium ragt. Im Beisein der Blockcopolymere wird der LHCII zumindest teilsweise stabilisiert, tendiert aber dazu zu aggregieren, da die Diblockcopolymere statt einer hydrophoben Kopfgruppe den Proteinen die hydrophile COOK-Gruppe entgegenstrecken. Durch Aggregation können die Proteine gegenseitig ihre transmembranen Domänen mittels Protein-Protein-Interaktion vor der wässrigen Lösung abschirmen (Vasilev et al., 1997). Die PEO-Schicht muss hierbei aber stabili- sierend wirken, sonst würden die Proteine wie in der Vesikel-freien Lösung zerfallen. Interessanterweise scheint durch diese Interaktion mit Poly-Ethylenoxid das charakteristische CD-Spektrum des TX-solubilisierten LHCII im Soret-Bereich durch leichte Änderungen der Chl-Dipolmomente zu entstehen (Boggasch, 2006). Sicherlich könnte argumentiert werden, dass durch unzureichende „Bio Beads“- Behandlung Res- te des TX in der Probe verblieben sind. Dies würde aber nicht erklären, warum der LM- solubilisierte Komplex nach Entfernung des LM auch dieses spezifische TX-Spektrum zeigt. Hierfür kann nur die Interaktion des LHCII mit dem Poly-Ethylenoxid des Copo- lymers verantwortlich sein. Abb. 4.4.1: Strukturformel des Detergenz TX (A), des Diblockcopolymers PB130-b-PEO66-COOK (B, abgeändert nach Maskos, 2006) und ein Ausschnitt des Polymers Poly(2-methyloxazoline) (C) mit 6 Wiederholungseinheiten. Diese Feststellung erklärt allerdings nicht das eigentliche Problem der fehlgeschlage- nen Insertion in die hydrophobe PB-Schicht. In Insertionsversuchen der Membranpro- teine OmpF (Meier et al., 2000) oder des TX-solubilisierten Bacteriorhodopsin (Ho et al., 2004) in unilamellare Triblockcopolymere wurde als hydrophiler Teilblock stets das, gegenüber PEO, deutlich polarere Polymer Poly(2-methyloxazoline) verwendet (Abb. 4.4.1 C). Durch die Vielzahl an Oxogruppen in diesem Polymer können Membranprote- Kapitel IV 288 5 Schlussfolgerung ine in solchen Schichten nicht stabilisiert werden und werden dadurch in die hydropho- be Phase der Schicht „gezwungen“. Im Falle der PB130-b-PEO66-COOK Diblockcopo- lymere ist die Polarität des PEO wahrscheinlich nicht ausreichend, um den LHCII in die lipophile Schicht zu zwingen. Stattdessen verbleiben die Proteine in der PEO-Schicht und aggregieren. Der Grund für die Tendenz des LHCII „Cluster“ zu bilden wird der energetisch günstige Zustand dieses Oligomerisierungsgrads in Bedingungen der un- zureichenden Lipid- bzw. Detergenz-Versorgung sein. Von Insertionsversuchen in Li- posomen ist bekannt, dass LHCII dort ebenfalls in niedrigen Lipid-zu- Proteinverhältnissen dazu tendiert „Cluster“-artige Strukturen auszubilden (Boggasch, 2006). Nebeneffekt der Aggregatbildung des LHCII in der PEO-Schicht der Polymers- omen ist die deutliche Erhöhung der thermischen Stabilität gegenüber dem detergenz- solubilisierten LHCII, sowie eine leicht erhöhte Stabilität gegenüber dem trimeren LHCII in Liposomen (Yang et al., 2006). Hierbei muss aber darauf hingewiesen werden, dass dieses Ergebnis durch lediglich zwei Messreihen statistisch nicht abgesichert ist und daher nur einen Trend darstellt. Zudem konnte nicht gezeigt werden, ob diese Eigen- schaft in der hohen lokalen LHCII-Konzentration innerhalb der „Cluster“ oder in den chemischen Eigenschaften der Polymersomen begründet liegt. 5 Schlussfolgerung Der Versuch native LHCII-Trimere aus Erbse in die lipophile Doppelschicht artifizieller Polymersomen, bestehend aus Diblockcopolymeren des Typs PB130-b-PEO66-COOK, zu inserieren schlug fehl. Stattdessen lagerten sich LHCII-Aggregate stabil in die hydrophile Polyethylenoxid-Schicht der Polymersomen ein und waren unter Standard- bedingungen dauerhaft haltbar. Die Interaktion mit der hydrophilen PEO-Schicht be- wirkte zudem eine Änderung in spektralen Eigenschaften der CD-Absorption, identisch zu denen, die aus der Interaktion mit dem Tensid TX bekannt sind. Nebeneffekte der ungewollten Einlagerung in die hydrophile PEO-Schicht waren eine starke Tendenz des Proteins zur Aggregation und damit verbunden eine erhöhte thermische Stabilität des LHCII gegenüber Detergenz-solubilisiertem LHCII. In zukünftigen Insertionsversu- chen in artifizielle Polymersomen sollte der hydrophile Teilblock der Copolymere deut- lich polarer sein, um den „hydrophoben Druck“ auf den LHCII und damit die Chance auf eine Insertion in den lipophilen Bereich der Doppelschicht zu erhöhen. Weiterhin sollte eine deutliche Erniedrigung der Proteinkonzentration in Erwägung gezogen wer- den, um der Entstehung von Protein-Aggregaten vorzubeugen. III Zusammenfassung Der Haupt-Lichtsammelkomplex (LHCII) des Photosyntheseapparates höherer Pflan- zen gehört zu den häufigsten Membranproteinen der Erde. Seine Kristallstruktur ist bekannt. Das Apoprotein kann rekombinant in Escherichia coli überexprimiert und so- mit molekularbiologisch vielfältig verändert werden. In Detergenzlösung besitzt das denaturierte Protein die erstaunliche Fähigkeit, sich spontan zu funktionalen Protein- Pigment-Komplexen zu organisieren, welche strukturell nahezu identisch sind mit nati- vem LHCII. Der Faltungsprozess findet in vitro im Zeitbereich von Sekunden bis Minu- ten statt und ist abhängig von der Bindung der Cofaktoren Chlorophyll a und b sowie verschiedenen Carotinoiden. Diese Eigenschaften machen LHCII besonders geeignet für Strukturuntersu- chungen mittels der elektronenparamagnetischen Resonanz (EPR)-Spektrokopie. Die- se setzt eine punktspezifische Spinmarkierung des LHCII voraus, die in dieser Arbeit zunächst optimiert wurde. Einschließlich der Beiträge Anderer stand eine breite Aus- wahl von über 40 spinmarkierten Mutanten des LHCII bereit, einen N-terminalen „Cys- walk“ eingeschlossen. Weder der hierfür notwendige Austausch einzelner Aminosäu- ren noch die Anknüpfung des Spinmarkers beeinträchtigten die Funktion des LHCII. Zudem konnte ein Protokoll zur Präparation heterogen spinmarkierter LHCII-Trimere entwickelt werden, also von Trimeren, die jeweils nur ein Monomer mit einer Spinmar- kierung enthalten. Spinmarkierte Proben des Detergenz-solubilisierten LHCII wurden unter Ver- wendung verschiedener EPR-Techniken strukturell analysiert. Als besonders aussage- kräftig erwies sich die Messung der Wasserzugänglichkeit einzelner Aminosäurepositi- onen anhand der Electron Spin Echo Envelope Modulation (ESEEM). In Kombination mit der etablierten Double Electron-Electron Resonance (DEER)-Technik zur Detektion von Abständen zwischen zwei Spinmarkern wurde der membranständige Kernbereich des LHCII in Lösung eingehend untersucht und strukturell der Kristallstruktur für sehr ähnlich befunden. Die Vermessung kristallographisch nicht erfasster Bereiche nahe dem N-Terminus offenbarte die schon früher detektierte Strukturdynamik der Domäne in Abhängigkeit des Oligomerisierungsgrades. Der neue, noch zu vervollständigende Datensatz aus Abstandsverteilungen und ESEEM-Wasserzugänglichkeiten monomerer wie trimerer Proben sollte in naher Zukunft die sehr genaue Modellierung der N- terminalen Domäne des LHCII ermöglichen. In einem weiteren Abschnitt der Arbeit wurde die Faltung des LHCII- Apoproteins bei der LHCII-Assemblierung in vitro untersucht. Vorausgegangene fluo- reszenzspektroskopische Arbeiten hatten gezeigt, dass die Bindung von Chlorophyll a und b in aufeinanderfolgenden Schritten im Zeitbereich von weniger als einer Minute bzw. mehreren Minuten erfolgten. Sowohl die Wasserzugänglichkeit einzelner Amino- säurepositionen als auch Spin-Spin-Abstände änderten sich in ähnlichen Zeitberei- chen. Die Daten deuten darauf hin, dass die Ausbildung der mittleren Transmembran- Helix mit der schnelleren Chlorophyll-a-Bindung einhergeht, während sich die Superhe- lix aus den beiden anderen Transmembranhelices erst im langsameren Schritt, zu- sammen mit der Chlorophyll-b-Bindung, ausbildet. 290 290 IV Literaturverzeichnis Allen, J. F., Forsberg, J. (2001) Molecular recognition in thylakoid structure and function. Trends Plant Sci., 6, 317-326. Allen, J. F. (2003) State transitions – a question of balance. Science, 299, 1530-1532. Altenbach, C., Flitsch, S. L., Khorana, H. G., Hubbel, W. L. (1989) Structural studies on transmembrane proteins. 2. Spin labeling of bacteriorhodopsin mutants at unique cys- teines. Biochemistry, 28, 7806-7812. Altenbach, C., Klein-Seetharaman, J., Cai, K., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. 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TGT TGT TGT TGT TGT TGC TGT S3C A4C K7C V9C A10C S11C S12C 46 CCA TGG TAC GGA CCA GAC CGT GTT AAG TAC TTA GGC CCA TTC TCC 15 P W Y G P D R V K Y L G P F S . TGT V22C 91 GGT GAG TCT CCA TCC TAC TTG ACT GGA GAG TTC CCC GGT GAC TAC 30 G E S P S Y L T G E F P G D Y . TGC TGC S34C F40C 136 GGT TGG GAC ACT GCC GGA CTC TCT GCT GAC CCA GAG ACA TTC TCC 45 G W D T A G L S A D P E T F S . TGC TGT A49C S52C 181 AAG AAC CGT GAG CTT GAA GTC ATC CAC TCC AGA TGG GCT ATG TTG 60 K N R E L E V I H S R W A M L . 226 GGT GCT TTG GGA TGT GTC TTC CCA GAG CTT TTG TCT CGC AAC GGT 75 G A L G C V F P E L L S R N G . TCT C79S 271 GTT AAA TTC GGC GAA GCT GTG TGG TTC AAG GCA GGA TCT CAA ATC 90 V K F G E A V W F K A G S Q I . TGT V90C V Anhang 302 1 Sequenzen 316 TTT AGT GAG GGT GGA CTT GAT TAC TTG GGC AAC CCA AGC TTG GTC 105 F S E G G L D Y L G N P S L V . TGT S106C 361 CAT GCT CAA AGC ATC CTT GCC ATA TGG GCC ACT CAG GTT ATC TTG 120 H A Q S I L A I W A T Q V I L . TGC S123C 406 ATG GGA GCT GTC GAA GGT TAC CGT ATT GCC GGT GGG CCT CTC GGT 135 M G A V E G Y R I A G G P L G . 451 GAG GTG GTT GAT CCA CTT TAC CCA GGT GGA AGC TTT GAT CCA TTG 150 E V V D P L Y P G G S F D P L . TGC S160C 496 GGC TTA GCT GAT GAT CCA GAA GCA TTC GCA GAA TTG AAG GTG AAG 165 G L A D D P E A F A E L K V K . 541 GAA CTC AAG AAC GGT AGA TTA GCC ATG TTC TCA ATG TTT GGA TTC 180 E L K N G R L A M F S M F G F . 586 TTC GTT CAA GCT ATT GTA ACT GGA AAG GGT CCT TTG GAG AAC CTT 195 F V Q A I V T G K G P L E N L . TGT V196C 631 GCT GAT CAT CTT GCA GAC CCA GTC AAC AAC AAT GCA TGG TCA TAT 210 A D H L A D P V N N N A W S Y . 676 GCC ACC AAC TTT GTT CCC GGA AAA CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAA 225 A T N F V P G K H H H H H H Stop 1.2 Klone mit N-terminalem „Strep tag“ Reihe 1: N-terminale Nukleotid-Sequenz der Klone stC79Sh und st106/160h, die Se- quenz des „Strep tag“ ist unterstrichen, das ursprüngliche Start-Codon des LHCII dun- kelgrau hinterlegt. Die restliche Sequenz ist in V.1.1 dargestellt. Reihe 2: Primärstruktur des Apoproteins (grau hinterlegt), das „Strep tag“-Motiv ist un- terstrichen. 1 ATG TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GCC ATG CGT AAA TCT GCT 1 Start W S H P Q F E K A M R K S A . V Anhang 2 Abkürzungsverzeichnis 303 2 Abkürzungsverzeichnis A280 Absorption bei 280 nm Abb. Abbildung AFM atomare Kraftmikroskopie/„atomic force microscopy“ AG Arbeitsgruppe AK Arbeitskreis Ala Alanin Amp Ampicillin APS Ammoniumpersulfat Arg Arginin Asp Asparagin ATP Adenosin-Triphosphat BODIPY-IA N-(4,4-difluoro- 1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3,4-diaza-s-indacene- 2-yl) iodoacetamide] bp Basenpaar BSA bovines Serum-Albumin bzw. beziehungsweise CAB Chl a/b-bindende Proteine CD Circular-Dichroismus Chl Chlorophyll CP Chlorophyll-Bindungsprotein CrOx Kalium-tris(oxalato)chromat CW “continuous wave” Cys Cystein Da Dalton DEER “double electron-electron resonance” dest. destilliert DGDG Digalaktosyldiacylglycerin DLS dynamischen Lichtstreuung DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DNA 2’-Desoxyribonukleinsäure dNTP 2’-Desoxnukleotid DTT 1,4-Dithiotreitol DY731-Mal/DY731 DY731-Maleimide V Anhang 304 2 Abkürzungsverzeichnis E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiaminintetraacetat ELIPs “early light-inducible proteins“ EPR Elektronenparamagnetische Resonanz ESEEM „electron spin echo envelope modulation” ESR Elektronenspinresonanz et al. und Andere Gln Glutamin Glu Glutaminsäure Gly Glycin HABA 4-Hydroxy-Azobenzen-2-Carbonylsäure His Histidin “His6 tag” Hexahistidyl-Rest HPLC „high performance liquid chromatography” IA Iodacetamid IB Einschlusskörperchen/„inclusion body“ IBs Einschlusskörperchen/„inclusion bodies” IDA Iminodiessigsäure/„iminodiacetic acid“ Ile Isoleucin I-PCR Insertions-Polymerase-Kettenreaktion IPTG Isopropyl-β-thiogalaktosid K Kelvin Kap. Kapitel kb Kilo-Basenpaar kDa Kilo-Dalton LB Luria-Bertani LDS Lithiumdodecylsulfat Leu Leucin LHC Lichtsammelkomplex/„light harvesting complex“ LHCII Lichtsammelkomplex II/„light harvesting complex II“ LHCIIb LHCII LHCP Apoprotein des LHCII LM n-Dodecyl-β-D-Maltosid V Anhang 2 Abkürzungsverzeichnis 305 L/P Lipid/Protein-Verhältnis Lut Lutein Lys Lysin max. maximal MCS “multiple cloning site” β-Me β-Mercaptoethanol MGDG Monogalaktosyldiacylglycerol NADP+ Nicotinamid-Adenindinucleotid-Phospat NEB New England Biolabs Neo Neoxanthin Ni Nickel NMR Kernspinresonanz NOE “nuclear Overhauser effect” NPQ „non-photochemical quenching“ Nt Nukleotide NTA Nitriloessigsäure OD Optische Dichte OG n-Octyl-β-D-Glucopyranosid p.A. per Analysis PA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PB Polybutadien PCR Polymerase-Kettenreaktion PDI Poly-Dispersitäts-Index PEO Polyethylenoxid PG Dipalmitoyl-Phosphatidylglycerin Phe Phenylalanin Pro Prolin PROXYL-IA 3-(2-Iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, free radical PS Photosystem PSI Photosystem I PSII Photosystem II PSM punktspezifische Mutagenese V Anhang 306 2 Abkürzungsverzeichnis Rh gemittelter hydrodynamischer Radius R+L Restriktion und Ligation rms „root mean square“ RP-HPLC „reversed phase high performance liquid chromatography” SDS Natriumdodecylsulfat/“sodium dodecylsulfate” SDSL punktspezifische Spinmarkierung/“site-directed spin labeling” Ser Serin SH Sulhydrylrest SN2 Nucleophile Substitution zweiten Grades SQDG Sulfoquinovosyldiacylglycerol SV Säulenvolumen TCA Trichloressigsäure TCP Tris-(2-cyanoethyl)phosphin TEMED N,N,N,N-tetramethylethylendiamin TEMPO-IA (2-Iodoacetamido)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy, free radical THF Tetrahydrofuran Thr Threonin Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethan TX Triton X-100 Tyr Tyrosin Upm Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett UZ Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation Val Valin Vio Violaxanthin v/v Volumenprozent („volume per volume“) WT Wildtyp w/v Gewichtsprozent („weight per volume“) V Anhang 3 Erklärung 307 3 Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig angefertigt und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen in der Arbeit verwen- det habe. Mainz, ____________________ Christoph Dockter