Bedeutung von KSRP für die Pathogenese von chronisch-inflammatorischen Erkrankungen Rolle von KSRP in Immunzellen Dissertation Zur Erlangung des Grades „Doktor der Naturwissenschaften“ am Fachbereich Biologie der Johannes Gutenberg-Universität Mainz vorgelegt von Dipl. Biol. Rudolf Käfer geb. am 18.12.1985 in Duschanbe Frankfurt, 2019 Dekan: 1. Gutachterin: 2. Gutachter: Tag der Prüfung: ,,In der Wissenschaft gleichen wir alle nur den Kindern, die am Rande des Wissens hie und da einen Kiesel aufheben, während sich der weite Ozean des Unbekannten vor unseren Augen Erstreckt.“ SIR ISAAC NEWTON (1643 - 1772) Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS _______________________________________________________ II Abbildungsverzeichnis ___________________________________________________________ VII Tabellenverzeichnis _____________________________________________________________ XI Abkürzungsverzeichnis __________________________________________________________ XII 1. EINLEITUNG _____________________________________________________________ 1 1.1 Die Regulation der Genexpression _______________________________________________ 1 1.2 Das ‘KH-type splicing regulatory protein’ KSRP ____________________________________ 2 1.2.1 Einfluss von KSRP auf die mRNA Stabilität/posttranskriptionelle Mechanismen __________ 3 1.2.2 RNA-BP und Immunzellfunktionen ______________________________________________ 4 1.3 Immunzellen __________________________________________________________________ 6 1.3.1 Antigen präsentierende Zellen _________________________________________________ 7 1.3.1.1 Dendritische Zellen ______________________________________________________ 7 1.3.1.2 Makrophagen __________________________________________________________ 8 1.3.1.3 B-Zellen ______________________________________________________________ 9 1.3.2 Zytokine _________________________________________________________________ 10 1.3.3 T-Lymphozyten ___________________________________________________________ 11 1.3.4 Neutrophile Granulozyten ___________________________________________________ 13 1.6 Dysregulation vom Immunsystem führt zu Autoimmunerkrankungen & Allergien _______ 14 1.6.1 Rheumatoide Arthritis _______________________________________________________ 16 1.6.2 Allergisches Asthma Bronchiale _______________________________________________ 17 1.6.3 Modelle zur Untersuchung der Pathogenese humaner chronisch-inflammatorischer Erkrankungen _________________________________________________________________ 19 1.6.3.1 Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) __________________________________________ 19 1.6.3.2 Kollagen-Antikörper-induzierte Arthritis (CAIA) ________________________________ 20 1.6.4.3 Allergisches Asthma bronchiale ___________________________________________ 21 2. ZIELSETZUNG DER ARBEIT _________________________________________________ 22 3. MATERIAL UND METHODEN _______________________________________________ 23 II Inhaltsverzeichnis 3.1 Material _____________________________________________________________________ 23 3.1.1 Laborgeräte ______________________________________________________________ 23 3.1.2 Labor- und Verbrauchsmaterial _______________________________________________ 28 3.1.3 Chemikalien und Reagenzien ________________________________________________ 31 3.1.4 Lösungen, Puffer und Kulturmedien ____________________________________________ 33 3.1.4.1 Allgemein verwendete Lösungen und Puffer _________________________________ 34 3.1.4.2 FACS-Lösungen und -Puffer _____________________________________________ 37 3.1.5 Medien und Supplemente für Zellkulturen _______________________________________ 37 3.1.6 Kits _____________________________________________________________________ 40 3.1.7 Analyse Software __________________________________________________________ 41 3.1.8 Antikörper ________________________________________________________________ 42 3.1.8.1 Antikörper zur Absättigung freier Fc-Rezeptoren ______________________________ 42 3.1.8.2 Antikörper zur FACS-Färbung ____________________________________________ 42 3.1.8.3 Isotypkontrollantikörper für die FACS-Färbung ________________________________ 44 3.1.8.4 Reagenzien zur Quantifizierung apoptotischer/nekrotischer Zellen ________________ 44 3.1.8.5. Oligonukleotide _______________________________________________________ 45 3.2. Zellbiologische Methoden _____________________________________________________ 45 3.2.1 Allgemeine Bedingungen ____________________________________________________ 45 3.2.2 Bestimmung der Lebendzellzahl ______________________________________________ 45 3.2.3 Isolation muriner Knochenmark Vorläuferzellen __________________________________ 46 3.2.3.1 Kultivierung und Differenzierung von Knochenmarkszellen zu BM-DC und BM-Mf ___ 47 3.2.4 Isolation muriner PBMC aus dem Blut __________________________________________ 48 3.2.5 Präparation von Milzzellen ___________________________________________________ 48 3.2.5.1 Isolierung von T-Lymphozyten über Nylonwolle-Säulen _________________________ 49 3.2.5.2 Isolierung von T-Lymphozyten durch MACS _________________________________ 50 3.2.6 Stimulation der Immunzellen _________________________________________________ 51 3.2.7 T-Lymphozyten Proliferationsassay ____________________________________________ 52 3.2.7.1 Messung der zellulären 3HTdR-Radioaktivität ________________________________ 52 3.2.8 Untersuchung der Zellvitalität mittels MTT-Assays ________________________________ 53 3.2.9 Transwell Migrations-Assay __________________________________________________ 54 3.3 Fluoreszenz-basierte Methoden _________________________________________________ 54 3.3.1 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting/Scanning) _____________________________ 54 3.3.2 Oberflächen FACS Färbung __________________________________________________ 56 3.3.3 Quantifizierung apoptotischer und nekrotischer Zellen _____________________________ 56 3.3.4 Zytokinmessung mittels Cytometric Bead Array (CBA) _____________________________ 57 3.4. Tierexperimentelle Methoden __________________________________________________ 58 3.4.1 Tierhaltung und Versuchstiere ________________________________________________ 58 3.4.2 Typisierung von Mäusen ____________________________________________________ 59 3.4.3 PCR zur KSRP- Genotypisierung _____________________________________________ 60 III Inhaltsverzeichnis 3.4.4 Kollagen Antikörper induzierte Arthritis (CAIA) ___________________________________ 62 3.4.4.1 Bestimmung des Arthritisindex ____________________________________________ 64 3.4.4.2 Histologische Paraffinschnitte und Übersichtsfärbung __________________________ 66 3.4.5 Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) _____________________________________________ 66 3.4.6 Asthma bronchiale Induktion _________________________________________________ 67 3.4.6.1 Lungenfunktionsmessung ________________________________________________ 68 3.4.6.1.1 Nicht-invasive Messung (Ganzkörperplethysmographie) ______________________ 69 3.4.6.1.2 Invasive Messung mittels BUXCO ________________________________________ 71 3.4.6.1.3 Bronchoalveolar Lavage (BAL) __________________________________________ 73 3.4.6.1.4 Herstellung von Zytospinpräparaten ______________________________________ 74 3.4.6.1.5 Histologische Methoden und Färbungen ___________________________________ 74 3.4.6.1.6 Auswertung der histologischen Schnitte ___________________________________ 75 4. ERGEBNISSE ____________________________________________________________ 76 4.1 Charakterisierung von Immunzellen _____________________________________________ 76 4.1.1 Immunphänotypisierung von Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen _______________ 77 4.1.2 Immunphänotypisierung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes _________________ 85 4.1.3 Immunphänotypisierung von Milzzellen _________________________________________ 89 4.2 Viabilität von Immunzellen _____________________________________________________ 95 4.2.1 Quantifizierung von apoptotischen Knochenmarkszellen ___________________________ 96 4.2.2 Quantifizierung apoptotischer Milzzellen ________________________________________ 98 4.2.3 Quantifizierung apoptotischer PBMC __________________________________________ 100 4.3 Migrationsfähigkeit von Immunzellen ___________________________________________ 104 4.4 Zytokinproduktion von LPS-stimulierten Antigen präsentierenden Zellen _____________ 107 4.4.1 Zytokinmuster-Analysen von Milzzellen ________________________________________ 108 4.4.2 Zytokinmuster-Analysen von BM-DC __________________________________________ 112 4.4.3 Zytokinmuster-Analysen von BM-Mf __________________________________________ 113 4.5 T-Zell-Immunphänotyp _______________________________________________________ 114 4.5.1 Genotypische Unterschiede in der Viabilität der T-Zellen __________________________ 117 4.5.2 Untersuchung der T-Zellproliferation __________________________________________ 119 4.5.3 Zytokinproduktion von polyklonal stimulierten T-Zellen ____________________________ 121 4.6 Charakterisierung von T-Zell-Subpopulationen ___________________________________ 123 4.6.1 Immunphänotypisierung von CD4+ und CD8+ T-Zellen __________________________ 123 4.6.2 T-Zellproliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen _______________________________ 126 4.6.3 Zytokinproduktion von CD4+ und CD8+ T-Zellen _______________________________ 128 IV Inhaltsverzeichnis 4.7 Analysen im experimentellen Tiermodell der Kollagen Antikörper induzierten Arthritis __ 134 4.7.1 Krankheitsverlauf von KSRP-defizienten Mäusen nach CAIA _______________________ 136 4.7.2 Histopathologische Analysen von KSRP-defizienten Mäusen nach CAIA ______________ 137 4.7.3 Immunphänotypisierung von Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäusen an Tag 9 nach CAIA Induktion ____________________________________________________________________ 138 4.7.4 Immunphänotypisierung von Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäusen an Tag 5 nach CAIA Induktion ____________________________________________________________________ 144 4.7.5 Zytokinproduktion von Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäusen nach CAIA ___________ 149 4.7.6 Zytokinproduktion von T-Zellen aus KSRP-defizienten Mäusen nach CAIA ____________ 151 4.8 Analysen im experimentellen Tiermodell des allergischen Asthmas _________________ 155 4.8.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität in KSRP-defizienten Mäusen ________________ 155 4.8.2 Analyse der Immunzellen in der bronchoalveolären Lavage ________________________ 158 4.8.3 Histologische Analysen zur Ermittlung des Entzündungsgrades und der Mukusproduktion in der Lunge ___________________________________________________________________ 160 5. DISKUSSION ___________________________________________________________ 164 5.1 Einfluss von KSRP-KO auf den Krankheitsverlauf von CAIA ________________________ 166 5.1.1 Effekt von Lymphozyten auf die Induktion von CAIA ______________________________ 170 5.2 Einfluss von KSRP-KO auf die Immunzellen _____________________________________ 172 5.2.1 Viabilität von Immunzellen __________________________________________________ 174 5.2.2 Migration von Immunzellen _________________________________________________ 176 5.2.3 Reifungszustand von Immunzellen ___________________________________________ 178 5.2.3.1 Reifungszustand von Immunzellen nach CAIA-Behandlung ____________________ 179 5.3 Einfluss von KSRP-KO auf das Zytokinmuster ___________________________________ 181 5.3.1 TH1-assoziierte Zytokin Produktion ___________________________________________ 182 5.3.2 TH2-assoziierte Zytokin Produktion ___________________________________________ 184 5.3.3 Weitere Leitzytokine _______________________________________________________ 188 5.4 KSRP scheint die TH2-Antwort zu limitieren ______________________________________ 190 5.5 Einfluss von KSRP-KO auf den Krankheitsverlauf von Asthma bronchiale ____________ 191 6. ZUSAMMENFASSUNG ___________________________________________________ 195 7. ABSTRACT _____________________________________________________________ 197 8. ANHANG ______________________________________________________________ 199 V Inhaltsverzeichnis 9. DANKSAGUNG _________________________________________________________ 211 10. ERKLÄRUNG __________________________________________________________ 212 11. LITERATURVERZEICHNIS ________________________________________________ 213 12. PUBLIKATIONEN _______________________________________________________ 231 13. LEBENSLAUF __________________________________________________________ 232 VI Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abb. 1 Standardmuster für die Ohrloch-Nummerierung von Mäusen .................................... 60 Abb. 2: Versuchsschema zur Induktion von „Langzeit“- CAIA in KSRP-/- KO Mäuse ............. 63 Abb. 3: Versuchsschema zur Induktion von „Kurzzeit“- CAIA in KSRP-/- KO Mäuse .............. 64 Abb. 4: Immunisierungsschema zur Asthma Induktion .......................................................... 67 Abb. 5: Aerosol-Kammer ........................................................................................................ 68 Abb. 6: Darstellung von Ganzkörperplethysmographen der Firma BUXCOÒ ........................ 70 Abb. 7: Darstellung der Plethysmographen der Firma BUXCOÒ ........................................... 72 Abb. 8: Gating-Strategie für durchflusszytometrische Analysen von Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen anhand einer Beispielfärbung ................................................................ 77 Abb. 9: Zellfrequenz-Analysen von Knochenmarks-abgeleiteten Vorläuferzellen aus KO und WT Mäusen .................................................................................................................... 79 Abb. 10: Zellfrequenz-Analysen aus Knochenmark differenzierten BM-DCs in WT und KO Mäusen ........................................................................................................................... 80 Abb. 11: Expression von Aktivierungsmarkern auf BM-DC aus KSRP-defizienten und WT Mäusen ........................................................................................................................... 80 Abb. 12: Expression-Analysen von Aktivierungsmarkern auf der Oberfläche von BM-DC aus KO und WT-Mäusen ....................................................................................................... 82 Abb. 13: Zellfrequenz- Analysen aus Knochenmark differenzierten BM-Mf in WT und KO Mäusen ........................................................................................................................... 83 Abb. 14: Expression-Analysen von Aktivierungsmarkern auf der Oberfläche von BM-Mf aus KO und WT-Mäusen ....................................................................................................... 84 Abb. 15: Analyse myeloider Zellen aus PBMC mittels Durchflusszyometrie .......................... 86 Abb. 16: Quantifizierung myeloider Zellen aus PBMC von WT und KO Mäusen ................... 87 Abb. 17: Quantifizierung von B- und T-Zellen aus PBMC von WT und KO Mäusen .............. 88 Abb. 18: Bestimmung von B-Zell und DC-Populationen in der murinen Milz ......................... 89 Abb. 19: Quantifizierung Milzzell-Populationen von WT und KO Mäusen ............................. 91 Abb. 20: Repräsentative FACS-Analysen des kostimulatorischen Molekül CD86 auf Milzzellen ........................................................................................................................................ 92 VII Abbildungsverzeichnis Abb. 21: Analysen zum Reifungszustand von Milzzellen aus WT und KO Mäusen ............... 93 Abb. 22: Repräsentative FACS-Analysen der Viabilität von Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen ................................................................................................................ 96 Abb. 23: Quantifizierung der Viabilitäts-Analysen in Knochenmarks-abgeleiteten Vorläuferzellen ................................................................................................................ 98 Abb. 24: Quantifizierung der Viabilitäts-Analysen von Milzzellen ........................................... 99 Abb. 25: Repräsentative Vitabilitätsmessung myeloider Zellen aus dem peripheren Blut ... 100 Abb. 26: Quantifizierung der Viabilitäts-Analysen von PBMC .............................................. 102 Abb. 27: Quantifizierung der Viabilitäts-Analysen von PBMC .............................................. 103 Abb. 28: Repräsentative Analysen der Migration neutrophiler Granulozyten aus dem Knochenmark ............................................................................................................... 105 Abb. 29: Quantitative Analysen der Migration von neutrophilen Granulozyten aus dem Knochenmark ............................................................................................................... 105 Abb. 30: Quantitative Analyse der Migration von BM-Mf ..................................................... 106 Abb. 31: Zeitkinetik der Zytokinproduktion von Milzzellen aus KO und WT Mäusen ........... 108 Abb. 32: Zytokinmuster-Analysen von Milzzellen aus KO und WT Mäusen ........................ 111 Abb. 33: Zytokinmuster-Analysen von BM-DC aus KO und WT Mäusen ............................ 112 Abb. 34: Zytokinmuster-Analysen von BM-Mf KO und WT Mäusen .................................... 113 Abb. 35: Frequenz-Analyse von T-Lymphozyten aus der Milz ............................................. 115 Abb. 36: Frequenz-Analyse von aktivierten T-Lymphozyten aus der Milz ........................... 116 Abb. 37: Quantitative Viabilitäts-Analysen von CD3+ TZ aus dem peripheren Blut .............. 117 Abb. 38: Quantitative Viabilitäts-Analysen von CD3+ TC aus der Milz ................................. 118 Abb. 39: Proliferation von isolierten T-Zellen aus der Milz von KSRP KO und WT Mäusen nach polyklonaler Stimulation ................................................................................................ 120 Abb. 40: Zytokinmuster-Analysen von T-Zellen aus KO und WT Mäusen ........................... 122 Abb. 41: Frequenz-Analyse von aktivierten CD4+ T-Zellen aus der Milz .............................. 124 Abb. 42: Frequenz-Analyse von aktivierten CD8+ T-Zellen aus der Milz .............................. 125 Abb. 43: Proliferation von isolierten CD4+ und CD8+ T-Zellen ............................................. 126 Abb. 44: Zytokinmuster-Analysen von CD8+ T-Zellen aus KO und WT Mäusen .................. 128 VIII Abbildungsverzeichnis Abb. 45: Zytokinmuster-Analysen von CD4+ T-Zellen aus KO und WT Mäusen .................. 130 Abb. 46: Zeitkinetik der Zytokinproduktion von CD4+ T-Zellen aus KO und WT Mäusen .... 133 Abb. 47: Darstellung des Arthritis-Index für KO und WT Mäusen ........................................ 136 Abb. 48: Histopathologische Darstellung von H&E gefärbten Mauspfoten .......................... 137 Abb. 49: Zellfrequenz-Analysen aus Milzzellen von WT und KO Mäusen Tag 9 nach CAIA Induktion ....................................................................................................................... 141 Abb. 50: Zellfrequenz-Analysen aus Milzzellen von WT und KO Mäusen an Tag 9 nach CAIA Induktion ....................................................................................................................... 142 Abb. 51: Zellfrequenz-Analysen aus Milzzellen von WT und KO Mäusen an Tag 5 nach CAIA Induktion ....................................................................................................................... 145 Abb. 52: Zellfrequenz-Analysen aus Milzzellen von WT und KO Mäusen an Tag 5 nach CAIA Induktion ....................................................................................................................... 147 Abb. 53: Zytokinmuster-Analysen von APC nach CAIA-Behandlung ................................... 150 Abb. 54: Zytokinmuster-Analysen von T-Zellen nach CAIA-Behandlung ............................. 153 Abb. 55: Analysen der AHR nach Sensibilisierung mit OVA in WT und KSRP-defizienten Mäusen ......................................................................................................................... 157 Abb. 56: Analyse der zellulären Infiltration in der BAL nach Sensibilisierung mit OVA in WT und KSRP-defizienten Mäusen .................................................................................... 159 Abb. 57: Bestimmung des Entzündungsgrades in der Lunge nach Sensibilisierung mit OVA in WT und KSRP-defizienten Mäusen .............................................................................. 160 Abb. 58: Bestimmung der Mukusproduktion in der Lunge nach Sensibilisierung mit OVA in WT und KSRP-defizienten Mäusen .................................................................................... 162 Abb. 59: Quantifizierung der Mukusproduktion in der Lunge nach Sensibilisierung mit OVA in WT und KSRP-defizienten Mäusen .............................................................................. 163 Abb. 60: Gating-Strategie für durchflusszytometrische Analysen von BM-DC anhand einer Beispielfärbung ............................................................................................................. 199 Abb. 61: Zellfrequenz-Analysen aus Knochenmark differenzierten BM-DC und BM-Mf in KO und WT Mäusen ........................................................................................................... 199 Abb. 62: Expression von Aktivierungsmarkern auf BM-Mf aus KSRP-defizienten und WT Mäusen ......................................................................................................................... 200 Abb. 63: Repräsentative FACS-Analysen der Viabilität von Milzzellen ................................ 201 IX Abbildungsverzeichnis Abb. 64: Gating-Strategie für durchflusszytometrische-Analysen mit Beispielfärbung zur Expression des kostimulatorischen Moleküls CD86 auf Milzzellen .............................. 202 Abb. 65: Metabolische Aktivitäts-Analysen von Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen aus WT und KO Mäusen ..................................................................................................... 203 Abb. 66: Metabolische Aktivitäts-Analysen von Milzzellen aus WT und KO Mäusen .......... 204 Abb. 67: Metabolische Aktivitäts-Analysen von BM-Mf aus WT und KO Mäusen ............... 205 Abb. 68: Metabolische Aktivitäts-Analysen von BM-DC aus WT und KO Mäusen .............. 205 Abb. 69: Repräsentative FACS-Analysen der Viabilität von Milzzellen ................................ 206 Abb. 70: Zytokinmuster-Analysen von T-Zellen aus KO und WT Mäusen ........................... 207 Abb. 71: Zellfrequenz-Analysen aus Milzzellen von WT und KO Mäusen nach CAIA Tag 9 ...................................................................................................................................... 207 Abb. 72: Analysen zum Reifungszustand aus Milzzellen von WT und KO Mäusen Tag 9 nach CAIA Induktion .............................................................................................................. 208 Abb. 73: Analysen zum Reifungszustand aus Milzzellen von WT und KO Mäusen Tag 5 nach CAIA Induktion .............................................................................................................. 209 Abb. 74: Zytokinmuster-Analysen von T-Zellen nach CAIA-Behandlung ............................. 210 Abb. 75: Darstellung des Arthritis-Index für KO und WT Mäusen ........................................ 210 X Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Verwendete Laborgeräte und deren Hersteller ..................................................... 23 Tabelle 2: Verwendete Labor- und Verbrauchsmaterialien und deren Hersteller .................. 28 Tabelle 3: Verwendete Chemikalien und Reagenzien mit Angabe der Hersteller .................. 31 Tabelle 4: Zusammensetzung der verwendeten Lösungen und Puffer .................................. 34 Tabelle 5: Zusammensetzung der verwendeten FACS-Lösungen und -Puffer ...................... 37 Tabelle 6: Zusammensetzung/Vertrieb von Medien und Supplemente für Zellkulturen ......... 38 Tabelle 7: Verwendete Kits und deren Hersteller ................................................................... 40 Tabelle 8: Verwendete Analyse Software und deren Hersteller ............................................. 41 Tabelle 9: Verwendete FACS-Antikörper und deren Hersteller .............................................. 42 Tabelle 10: Verwendete Isotypkontrollantikörper und deren Hersteller .................................. 44 Tabelle 11: Verwendete Vitalitätsnachweis-Reagenzien und deren Hersteller ...................... 44 Tabelle 12: Verwendete Primer für die PCR und deren Sequenz .......................................... 45 Tabelle 13: Übersicht eines PCR-Ansatzes zur Genotypisierung und Reaktionsbedingungen ........................................................................................................................................ 61 Tabelle 14: Bestimmung des Arthritisindex ............................................................................ 65 XI Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 5’-Cap 5’-Kappe 7-AAD 7-Aminoactinomycin AHR Atemwegshyperreaktivität AK Antikörper Ag Antigen AK Antikörper AMD ARE-mediated decay (ARE-vermittelter Abbau) AI Arthritisindex APC antigen-presenting cell (Antigen präsentierenden Zellen) APC Allophycocyanin APOBEC-1 ApoB mRNA-editing complex 1 Aqua dest. Aqua destillat AR Atemwegsreaktivität ARE AU-rich elements (AU reiche Elemente) AU adenylate-uridylate AUF-1 ARE/poly(U)-binding factor1 BAL Bronchoalveoläre Lavage BALF BAL-Fluid BM-DC bone marrow derived dendritic cells BZ B-Zellen BZR B-Zellrezeptor BP Bindeprotein CAIA Kollagen Antikörper-induzierte Arthritis (collagen antibody induced arth- ritis) CBA cytometric bead array CC Chemokin XII Abkürzungsverzeichnis CCR2 Chemokinrezeptor 2 CD3 cluster of differentiation -3 CFA complete Freund’s Adjuvant (komplette Freund-Adjuvans) CII collagen type II CIA Kollagen-induzierte Arthritis (collagen-induced arthritis) CIRP cold-inducible RNA-binding protein CK1 casein kinase1 cmp counts per minute CSF colony-stimulating factor (Koloniestimulierender Faktor) c-src cellular-sarcoma (Tyrosinkinase Src) ctbp c-terminal binding protein CTL cytotoxic T lymphocyte Ctrl control (Kontrolle) CXCL1 chemokine (c-x-c motif) ligand 1 Cy Cytochrom DAMPS damage associated molecular patterns DC dendritic cell DMEM Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium DMSO Dimethylsulphoxide DNA deoxyribonucleic acid DPBS Dulbecco’s Phosphate buffered saline DVL dishevelled EAE Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis EDTA Ethylendiamintetraacetat EMEM Eagle‘s Minimum Essentiell Medium FACS Durchflusszytometrie (Fluorescence Activated Cell Sorting) FCR fragment crystallisable receptor FCS fötales Kälberserum XIII Abkürzungsverzeichnis FITC Fluoreszein-Isothiozyanat FSC forward scatter FSTL1 follistatin-like 1 FUSE far upstream sequence element FVD Fixable Viability Dye GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor HBSS hanks’ balanced salt solution HDAC histone-deacetylase HLA human leukocyte antigen HuR human antigen R IFN Interferone Ig Immunoglobulin iNOS induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthetase lnRNAs lange nicht codierende RNAs IL Interleukin i.n. intranasal i.p. intraperitoneal ISS intronic splicing silencers i.v. intravenös IMDM Iscove’s Modified Dilbecco`s Medium JAK/STAT Januskinase/ Signal Transducers and Activators of Transcription KC Keratinocyte chemoattractant KO knockout KSRP KH-type splicing regulatory protein KSRP-/--Maus Mausstamm mit homozygot inaktivierten KSRP-Gen KSRP+/--Maus Mausstamm mit heterozygot inaktivierten KSRP-Gen LPS Lipopolysaccharid LRP5/LRP6 low-density lipoprotein receptor-relatedmproteins 5/6 XIV Abkürzungsverzeichnis Ly6G Lymphocyte antigen 6 complex locus G6D MAPK mitogenaktivierte Proteinkinase MCP-1 Monocyte Chemotactic Protein-1 mDCs myeloide dendritische Zellen MDSC myeloid-derived suppressor cells MHC major histocompatibility complex MCh Methacholin miRNAs micro RNAs mRNA messenger RNA MFI mean fluorescence intensity (mittlere Fluoreszenzintensität) MLR mixed lymphocyte reaction MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid NF-kB nuclear factor kappaB NK natural killer cells (natürliche Killerzellen) OVA Ovalbumin PABP poly(A)-binding protein PAMPS pathogen associated molecular patterns PAS Periodic acid–Schiff reaction PBMC peripheral blood mononuclear cells PCP planare Zellpolarität PCR polymerase chain reaction pDCs plasmazytoide dendritische Zellen PE Phycoerythrin PE-Cy5/Cy7 PE-Cychrom5/Cychrom7 Penh enhanced pause; dimensionsloser Wert der Atemfunktion PG Prostaglandinen PGIA Proteoglykan-induzierten Arthritis Prä-mRNA precursor messenger ribonucleic acid XV Abkürzungsverzeichnis PRR pattern recognition receptor PerCP Peridinin Chlorophyll Protein PS Phosphatidylserin RA rheumatoide Arthritis RI resistance index RIP RNA Immunpräzipitation RNA ribonucleic acid RNA-BP RNA-Bindeprotein ROS reactive, oxygen species RT Raumtemperatur SNAP S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine s.c. subkutan shRNA small hairpin RNA SLE systematischer Lupus Erythematodes s.o. siehe oben SSC side scatter TCF t-cell-factor TCR t cell receptor TGF transforming growth factor TH1 T-Helferzellen vom Typ1 TH2 T-Helferzellen vom Typ2 TNFR2 Tumor Nekrose Faktor-Rezeptor2 TL terminaler loop TLR toll-like receptor TTP Tristetraprolin T-Zellen T-Lymphozyt TZ t cell (T-Zelle) USE upstream sequence element XV I Abkürzungsverzeichnis UTRs untranslated region (untranslatierte Regionen) WT wildtype (Wildtyp) XVII Einleitung 1. Einleitung 1.1 Die Regulation der Genexpression Der menschliche Körper besitzt über hundert Billionen Zellen mit ca. 270 verschiede- nen Zelltypen, die alle ihr eigenes Expressionsmuster aufweisen. Daher ist eine regu- lierte Expression von Genen entscheidend für die spezifische Zelldifferenzierung und wird schon früh in der Entwicklung angelegt. Darüber hinaus muss die Zelle auch auf wechselnde Umweltbedingungen reagieren können und ihre Genexpression entspre- chend anpassen. Vor allem die Zellen des Immunsystems sind darauf angewiesen, schnell auf pathogene Signale reagieren zu können [1, 2]. Eine Dysregulation der Ge- nexpression kann unter anderem zur Entwicklung verschiedener Erkrankungen (Bsp. Autoimmunerkrankung) führen [3-5]. Daher gibt es verschiedene Regulationsmecha- nismen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten in die Prozesse der Proteinbiosynthese eingreifen können. Welcher DNA-Bereich transkribiert werden soll, ist zunächst abhängig von der Chro- matinstruktur. Daher kann die Transkriptionsmaschinerie nur an entsprechende DNA- Abschnitte binden, die nicht in Histonkomplexe verpackt sind [6, 7]. Kommt es zur Ini- tiation der Transkription, so wird diese durch die Bindung von Transkriptionsfaktoren weiter beeinflusst. Die Transkriptionsfaktoren binden an die Promotor-Region des ent- sprechenden Gens und bilden zusammen mit der RNA-Polymerase II einen Präinitia- tionskomplex [8], der abhängig von weiteren Sequenzen (Enhancer oder Silencer-Re- gion) sich positiv oder negativ auf die Regulation des Gens auswirkt. Während der Transkription wird die Erbinformation der chromosomalen DNA in eine messenger RNA (mRNA) umgeschrieben, die dabei entstehende prä-mRNA durchläuft weitere regulatorische Reifungsprozesse (Prozessierung) bevor sie als reife mRNA in das Zy- toplasma transportiert und dort zu einem Protein translatiert wird [9, 10]. Das Entfernen von Introns in der prä-mRNA und das Zusammenführen der verbleibenden Exons in der mRNA wird als Spleißen (splicing) bezeichnet. Dabei können, wenn die Zahl der fusionierten Exons variiert wird (alternatives Splicen), unterschiedlich funktionelle mRNA-Moleküle aus der gleichen prä-mRNA entstehen [11]. Zur Stabilisierung des 1 Einleitung mRNA-Moleküls und der anschließenden Ausschleusung in das Zytoplasma wird eine 7-Methyl-Guanosin-Kappe an das 5’-Ende (5’-cap) des ersten Exons sowie eine Poly- adenylierung (Poly-A-Schwanz) an das 3’-Ende der mRNA angefügt [12]. Das nun prozessierte mRNA-Molekül bestehend aus einem Protein-kodierenden Bereich, wel- cher von zwei untranslatierten Regionen (UTRs) flankiert wird, wird nach dem Trans- port ins Zytoplasma für die Initiation der Translation zur Verfügung gestellt. Diese 5’- und 3’-UTRs sind am Transport der mRNA aus dem Zellkern, an der Regulation der mRNA Stabilität sowie der Translation maßgeblich beteiligt [13, 14]. 1.2 Das ‘KH-type splicing regulatory protein’ KSRP Das KH-type splicing regulatory protein KSRP wurde erstmals 1997 von Min et al. als eine Komponente eines Multiprotein-Komplex beschrieben, dessen Funktion das al- ternative Spleißen (Splicing) der prä-mRNA des c-src Gens reguliert [15]. Die Interak- tion von KSRP findet dabei am intronic splicing silencers (ISS) des c-src Gen statt. Diese prä-mRNA Splicing Funktion ist ein wichtiger Kontrollpunkt in der Regulation der Genexpression [16-18]. KSRP wird in nahezu allen Zellarten exprimiert und ist dort vorranging im Nukleus lokalisiert [19]. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass KSRP an verschiedenen transkriptionellen und posttranskriptionellen Regulationen der Genexpression beteiligt ist. So erhöht KSRP bspw. die Transkription des c-myc Gens durch die Interaktion mit der far up- stream sequence element (FUSE)-Sequenz im Promotor des c-myc Gens [20]. Daher zählt KSRP als FU-BP2 zu den Mitgliedern der (FUSE)-BP Familie, die bestehend aus drei Mitgliedern FU-BP1, FU-BP2 und FU-BP3 die Expression des c-myc Protoonko- gens regulieren. Des Weiteren hemmt KSRP, durch die Bindung an die „USE“-Se- quenz (upstream sequence element) der Prothrombin-RNA, die Prozessierung des 3’- Endes der Prothrombin-RNA und damit die Prothrombin-Expression [21]. Darüber hin- aus ist KSRP als eine wichtige Komponente des ApoB mRNA-editing complex (APO- BEC-1) zentral am „editing“ der apo-mRNA beteiligt [22]. Des Weiteren verstärkt KSRP die Biogenese der miRNA-155, indem es an den terminalen „loop“ (TL) der primären- miRNA bindet und deren Reifung durch die Rekrutierung der Enzyme Drosha und 2 Einleitung Dicer begünstigt [23]. MiRNAs sind nicht kodierende, kurze regulatorische RNAs, die auf post-transkriptioneller Ebene die Expression ihrer Ziel-mRNAs kontrollieren. Es ist bekannt, dass die miRNAs durch die Regulation der mRNA-Translation und Stabilität im Zytoplasma Genexpressionen beeinflussen [24]. Die miRNA-155 scheint ein wich- tiger Regulator während der Immunzellentwicklung zu sein. Weiterhin scheint eine er- höhte Expression der miRNA-155 die Entstehung sowie die Progression der rheumato- iden Arthritis zu begünstigen [25]. Chou et al. konnten zeigen, dass die Abwesenheit von KSRP zu einer reduzierten miRNA-150-Expression führt, wodurch es zu einer Er- höhung von braunen Fettzellen im weißen Fettgewebe kommt [26]. In seinen Untersu- chungen wiesen KSRP-defiziente Mäuse im Vergleich zu Kontroll-Mäusen eine deut- lich reduzierte Adipositas auf. Auch Lin et al. zeigten, dass in KSRP-defizienten Mäu- sen gegenüber den Kontroll-Mäusen ein höherer Fettabbau stattfindet. So konnte in seiner Arbeit demonstriert werden, dass KSRP die Biogenese der miR-145 beeinflusst, die in diesem Zusammenhang als negativer Regulator des Fettabbaus im weißen Fett- gewebe betrachtet wird [27]. Damit scheint KSRP auch ein kritischer Faktor für die Fettstoffwechsel-Balance der Energiespeicherung und des Energieverbrauchs im wei- ßen Fettgewebe zu sein. Eine andere Publikation beschreibt, dass KSRP durch die Interaktion mit langen nicht codierenden RNAs (lncRNAs) an der Kontrolle der Genex- pression beteiligt ist. So bindet KSRP am Anfang der Myogenese direkt an die lncRNA H19 in undifferenzierten C2C12 Zellen und vermittelt dadurch die Destabilisierung der Myogenin-mRNA [28]. KSRP ist somit ein multifunktionelle, an Nukleinsäure bindendes Protein mit diversen Funktionen in der Regulation von mRNAs und miRNAs [29-31]. 1.2.1 Einfluss von KSRP auf die mRNA Stabilität/posttranskriptio- nelle Mechanismen Eine zentrale Rolle übernimmt KSRP in der Regulation der mRNA-Stabilität und Trans- latierbarkeit. Durch die Bindung an die „AU-rich elements“ ARE-Sequenzen in der 3’UTR von mRNAs und die Rekrutierung von mRNA-abbauenden Enzymen (Degra- 3 Einleitung dationsapparaten), konnte die RNA-destabilisierende Beteiligung von KSRP nachge- wiesen werden [32, 33]. KSRP ist ein 75 kDa großes Protein, das vier bindende Regi- onen aus K-homologen Motiven (KH) aufweist. Die KH3- und KH4-Domänen sind da- bei essentiell für die Bindung von KSRP an die mRNA und können auch unabhängig voneinander agieren [34]. Alternativ kann KSRP durch die Bindung an seine Ziel- mRNA zu einer Deadenylierung des Poly-A-Schwanzes führen und allgemein die Translationsrate verringern [35]. Schwerpunkt dieser Arbeit ist den Einfluss von KSRP auf die Immunzellfunktionen und in der Pathogenese von Erkrankungen zu analysie- ren. 1.2.2 RNA-BP und Immunzellfunktionen Während der Transkription können RNA-Bindeproteine neben der Deadenylierung des Poly-A-Schwanzes auch den Abbau der 5’(7-Methyl-guanosin-)Klappe begünstigen und damit den mRNA-Abbau von Zytokinen (s. Kapitel 1.3.2) beschleunigen [36]. Wei- tere RNA-BP rekrutieren das Exosom, ein Proteinkomplex der mit seiner Ribonukle- ase-Aktivität zur Spaltung von Ribonukleinsäuren führt [34]. Darüber hinaus beeinflussen die RNA-BP auch auf posttranskriptioneller Ebene die Regulation von Zytokinen durch die Kontrolle des Kernexports, der Translationsinitia- lisierung und des mRNA-Abbaus [37]. Da die Zytokine wiederum die Funktion von Im- munzellen steuern können, werden auch diese Zellen von den RNA-BP beeinflusst. Die posttranskriptionellen Kontrollmechanismen zielen vor allem auf die Cluster von Adenin- und Uridin-reichen Sequenzen (AU-rich elements, AREs) in der 3’UTR von ihren Ziel-mRNAs. Weiterhin interagieren neben RNA-BP auch microRNAs (miRNAs) mit ARE in diesen UTRs und tragen damit zur posttranskriptionellen Regulation der Genexpression bei [38, 39]. Während bspw. TTP (Tristetraprolin), AUF-1 (ARE/poly(U)-binding factor1) und KSRP (KH-type splicing regulatory protein) zu den destabilisierenden RNA-BP zählen und 4 Einleitung die Expression ihrer Ziel-Gene verringern [40-42], üben HuR und PABP (poly(A)-bin- ding protein) überwiegend stabilisierende Funktionen auf ihre Ziel-mRNAs aus und erhöhen damit die Expression der Ziel-Gene [43, 44]. Unter anderem wird KSRP als zentraler Modulator des ARE-abhängigen mRNA-Ab- baus (AMD) von pro-inflammatorischen Proteinen wie z.B. IL-6, IL-8, iNOS, TNF-a, IFN-a und IFN-b beschrieben [35, 45-50]. Diese solublen Mediatoren beeinflussen Im- munzellen in ihrer Aktivität und sind daher in der Lage die resultierende Immunantwort zu modulieren. Tatsächlich besitzen die meisten pro-inflammatorischen Mediatoren (Zytokine und Chemokine) ARE-Regionen, was die wichtige Funktion der posttran- skriptionellen Genregulation während der Immunantwort verdeutlicht [37, 51]. In vitro stabilisiert das RNA-BP HuR beispielsweise die GATA-3 mRNA was vor allem in einer erhöhten Expression des Transkriptionsfaktor GATA-3 und der TH2-asoziierter (T-Hel- ferzelle 2) (s. Kapitel. 1.4.2) Zytokine wie IL-4 und IL-13 resultiert [52-54]. In diesem Fall spricht man von einer positiven Regulation durch das RNA-BP. Interessanter- und paradoxerweise konnte jedoch in einem konditionellen knockout (KO)-Modell für das RNA-BP HuR in CD4+ T-Zellen eine erhöhte Zytokinproduktion an IL-2, IL-4 und IL-13 nachgewiesen werden [55]. In diesem Zusammenhang wurde in einer TH2-vermittelten Erkrankung (allergisches Asthma, s. K. 1.6.2) versucht, die TH2 polarisierende Eigenschaft von HuR in der Pathogenese in vivo (im Gesamtorganis- mus) zu charakterisieren. Die HuR-defizienten Mäuse zeigten gegenüber Kontroll- Mäusen eine vergleichbare Krankheitssymptomatik, was in Kontrast zu dem erhöhten Anstieg von TH2-vermittelten Zytokinen steht, die in diesen Tieren detektiert wurden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass in vivo komplexe Regulationsmechanismen greifen. Zhou et al. konnte in seiner Publikation die Beteiligung von RNA-BP mit der Entstehung neurogenen Erkrankungen in Verbindung bringen [56]. Der bedeutende Einfluss von RNA-BP für Entzündungsprozesse konnte bereits in verschiedenen Tier- modellen gezeigt werden. So entwickeln z.B. TTP-defiziente Mäuse eine massive Überexpression von pro-inflammatorischen solublen Mediatoren (Tumornekrosefaktor a (TNF-a) und granulocyte macrophage conlony-stimulating factor (GM-CSF)), welche den Reifungszustand von dendritischen Zellen moduliert, was in einem chronisch-ent- zündlichen Phänotyp resultiert [57-60]. Auch der AUF-1 Knockout äußert sich in einer erhöhten pro-inflammatorischen Zytokin-Expression [61]. In einer anderen Publikation 5 Einleitung konnte gezeigt werden, dass AUF-1 die IL-10 Expression in LPS-induzierten Monozy- ten moduliert und somit das angeborene Immunsystem beeinflussen kann [62]. Ein weiteres relativ unbekanntes temperaturabhängiges RNA-BP das CIRP (cold-induci- ble RNA-binding protein) [63], reguliert unter anderem die Expression von TNF-a in Makrophagen und beeinflusst damit hämorrhagischen Schock und Sepsis [64]. So konnte auch schon in isolierten Astrozyten aus KSRP-defizienten Mäusen, eine er- höhte Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen wie TNF-a und IL-1b gezeigt werden [47]. Weitere Hinweise, dass KSRP in der Pathogenese von chronisch-in- flammatorischen Erkrankungen eine Rolle spielen kann, wurden in einem Tiermodell der multiplen Sklerose (experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, EAE) darge- stellt. Die KSRP-defizienten Mäuse exprimieren höhere Mengen an IFN-a und -b, was zu einer Verringerung der Krankheitssymptomatik führt. Diese Überexpression an In- terferonen schützt die KSRP-defizienten Mäuse auch besser gegen Virus-Infektionen [49, 50]. Somit scheint KSRP eine zentrale Funktion bei der Regulation der Expression von pro-inflammatorischen Genen einzunehmen. Hinsichtlich der Bedeutung von KSRP in der Pathogenese chronisch-inflammatorischer Erkrankungen in vivo ist aktu- ell nicht viel bekannt und soll in dieser Arbeit vertiefend untersucht werden. 1.3 Immunzellen Alle Zellen des Immunsystems entstehen aus den pluripotenten Stammzellen des Kno- chenmarks [65-67]. Von ihrem Entstehungsort gelangen sie über das Blut und das lymphatische Gefäßsystem in alle Gewebe des Körpers, sind jedoch überwiegend in den primären und sekundären lymphatischen Organen lokalisiert. Immunzellen sind für die Abwehr gegen eine Vielzahl von pathogenen Erregern wie Viren, Bakterien und Pilzen verantwortlich, ebenso schützen sie den Organismus gegen entartete körperei- gene Zellen (Tumorzellen), aber auch gegen Fremdstoffe. Grundlage für diesen Schutz ist die Fähigkeit, durch allgemeine und spezifische Erkennungsmechanismen zwischen eigenen und körperfremden molekularen Mustern unterscheiden zu können [68]. Die zellulären und humoralen Mechanismen, die von den Immunzellen eingeleitet 6 Einleitung werden, werden als Immunantwort bezeichnet. Abhängig von der Art der unspezifi- schen oder spezifischen Reaktion lassen sich die Immunzellen unter angeborenen bzw. erworbener Immunität klassifizieren [69]. Wie bereits erwähnt, sind diverse RNA-BP in der Regulation von immunmodulierenden Zytokinen (s. Kapitel 1.3.2), die von Immunzellen produziert werden, beteiligt (s. Kapi- tel 1.2.2). Während eines pro-inflammatorischen Prozesses liegt eine Vielzahl von ent- zündlichen Mediatoren vor, deren Anwesenheit Eigengewebe zerstören und transfor- mieren kann. Daher ist es wichtig, schnellstmöglich nach Beseitigung des Erregers die gesteigerten pro-inflammatorischen Mediatoren zu limitieren. Der Abbau der entste- henden Mediator-mRNA scheint eine der effizientesten Varianten zu sein, um die Im- munantwort auszubremsen [70]. 1.3.1 Antigen präsentierende Zellen Für die Aufrechterhaltung von Immunhomöostase kontrollieren Antigen präsentie- rende Zellen (APC) das Gleichgewicht zwischen Toleranz und Immunität. Professio- nelle APC wie z.B. Makrophagen, dendritische Zellen (DC) und B-Lymphozyten (BC) sind dabei von entscheidender Bedeutung für die Erkennung eines eindringenden Er- regers und der Präsentation von Antigenen an die T-Lymphozyten (TC). Essentiell für die Erkennung körperfremder Muster sind PRR (pattern recognition receptors). Diese Mustererkennungsrezeptoren erkennen pathogen-assoziierte molekulare Muster, so- genannte PAMPs (pathogen associated molecular patterns) oder DAMPs (damage associated molecular patterns) [71]. Zu diesen gehören unter anderem Lipopolysac- charide (LPS) oder DNA/RNA von Bakterien bzw. Viren. 1.3.1.1 Dendritische Zellen Dendritische Zellen kommen fast überall im Körper vor, unter anderem in Herz, Niere, Darm, Epidermis, Dermis, Blut und dem afferenten Lymphsystem. Im aktivierten Zu- stand bilden sie „bäumchenartige“ Zytoplasmaausläufer und wurden daher nach ihrem 7 Einleitung morphologischen Erscheinungsbild benannt (dendriticus =verzweigt). Zu den zwei be- kanntesten DC Subpopulationen zählen myeloide DC, die morphologisch dem Mo- nozyten ähneln und die plasmazytoiden DC, die Ähnlichkeit mit den B-Plasmazellen aufweisen [72]. Im Vergleich zu reifen DC besitzen unreife DC wenig Dendriten, zeigen eine starke Endozytoseaktivität und weisen eine geringe Migration auf. Erkennt eine unreife DC ein pathogen-abgeleitetes oder endogenes Gefahrensignal, kommt es zu phänotypischen und funktionalen Veränderungen, bei denen es zu einer Reduktion der Antigenaufnahme und dafür vermehrter Antigen-Präsentation und zur gerichteten Migration zu lymphatischem Gewebe kommt [73]. Neben einer gesteigerten Expres- sion von kostimulatorischen Molekülen wie z.B. CD40, CD80, CD86 und MHC-Mole- külen sowie von Adhäsionsmolekülen kommt es auch zur vermehrten Sekretion pro- inflammatorischer Mediatoren wie IL-12 und TNF-a. Mit der Hilfe dieser Moleküle wird die Anlockung, Aktivierung und Polarisierung von T-Lymphozyten gewährleistet [74]. Abhängig von der Art der Antigenaufnahme werden den naiven T-Zellen die prozes- sierten Antigene entweder über MHCI oder MHCII-Moleküle (major histocompatibility complex) präsentiert. DC werden als Bindeglied zwischen der angeboren und erwor- bener Immunantwort angesehen, da sie sowohl als Wächterzellen agieren, als auch im aktivierten Zustand zu den potentesten antigenpräsentierenden Zellen zählen, mit der größten T-Zell-stimulatorischen Kapazität [75]. 1.3.1.2 Makrophagen Makrophagen sind in der Lage Zellschrott über Phagozytose zu beseitigen, ebenso effektiv ist ihre Phagozytosefähigkeit gegenüber pathogenen Keimen und Mikroorga- nismen. Nach erfolgreichem Verdau werden die pathogenen Bestandteile als Antigene auf der Oberfläche von Makrophagen den T-Lymphozyten präsentiert. Mit Hilfe der Chemotaxis gelangen Makrophagen zum Entzündungsherd, wo vor allem die Aufrechterhaltung einer bereits angelaufenen Immunreaktion unterstützt wird. Makrophagen stehen unter starkem Einfluss des exogenen Zytokinmilleus, so reagie- ren sie auf angeborene und antigenspezifische Immunstimulationen mit vorüberge- henden und auch längerfristigen Veränderungen in ihrer Physiologie [76]. So kann z.B. 8 Einleitung IFN-g, das sowohl von angeborenen Immunzellen (NK) aber auch von antigenspezifi- schen wie den T-Helferzellen vom Typ 1 (TH1-Zellen) (s. Kapitel 1.4.2) sezerniert wird, Makrophagen aktivieren. Diese „klassisch“ aktivierten M1-Makrophagen besitzen pro- inflammatorische Eigenschaften und produzieren bspw. iNOS (induzierte Stickstoff- monoxid-Synthase) um Pathogene zu eliminieren. Sie verstärken die Immunantwort durch Sezernierung weiterer pro-inflammatorischer Zytokine wie IL-1b, IL-6, IL-12 und TNF-a [77]. Befinden sich die Makrophagen in einem TH2-dominierendem Milieu, umgeben von IL- 4, IL-5, IL-13 und IL-10, so kommt es zur Inhibierung der klassischen M1-Aktivierung und zur Entwicklung der M2-Makrophagen [78]. Dieser M2-Subtyp hat anti-inflamma- torische Eigenschaften und ist unter anderem an der Gewebeheilung beteiligt. Auch basophile Granulozyten und Mastzellen sind in der Lage die Differenzierung zu M2- Makrophagen zu begünstigen. Durch Produktion von anti-inflammatorischen Mediato- ren wie IL-10 und transforming growth factor-b (TGF-b) nimmt der M2-Makrophage eine wichtige Rolle beim Abklingen einer Entzündung ein. Somit unterscheiden sich M1- und M2-Makrophagen nicht nur funktionell voneinander, sondern auch phänoty- pisch in der Expression von Rezeptoren und Mediatoren [79]. 1.3.1.3 B-Zellen Die naiven B-Lymphozyten (B-Zellen) zirkulieren überwiegend zwischen dem periphe- ren Blut und den sekundären lympatischen Organen. Neben den T-Lymphozyten, sind die B-Zellen für die adaptive Immunantwort von essentieller Bedeutung, da sie durch Antikörperproduktion für die spezifische humorale Immunantwort verantwortlich sind, wohingegen T-Zellen primär die zellulären Immunantwort regulieren [80]. Trifft die B- Zelle auf ein passendes Antigen, so erfolgt die Antigenbindung über den membrange- bundenen B-Zellrezeptor (BZR). Dies ermöglicht die Endozytose mit anschließender Prozessierung und Präsentation der Peptidfragmente über den MHC-II-Komplex. Die Aktivierung der B-Zelle wird durch zelluläre und lösliche Einflussfaktoren reguliert und kann T-Zell-abhängig oder -unabhängig erfolgen [81, 82]. Im Fall einer T-Zell-abhän- gigen Aktivierung kann die B-Zelle wiederum Einfluss auf die Differenzierung der T- Zellen nehmen. Die Proliferation und Differenzierung der aktivierten B-Zellen findet in 9 Einleitung den Keimzentren von Milz und Lymphknoten statt [83]. Dort entwickeln sich die B- Zellen zu unterschiedlichen Subpopulationen, unter anderem zu Antikörper-sezernie- renden Plasmazellen oder langlebigen Gedächtnis-B-Zellen. Die Antikörper-sekretie- renden Plasmazellen können nach Ausdifferenzierung verschiedene Immunoglobulin- Klassen produzieren, die in unterschiedlichen Regionen des Körpers die zelluläre Im- munabwehr unterstützen. Neben Opsonisierung von Bakterien für die Phagozytose, neutralisieren die von B-Zellen produzierten Antikörper Toxine, vermitteln zelluläre Zy- totoxizität und aktivieren das Komplementsystem [84]. Dabei unterscheidet man zwi- schen vier wichtigen Antikörper-Isotypen Immunoglobulin M (IgM), IgE, IgG und IgA. Neben der Beteiligung der Aktivierungsfaktoren und dem Ig-Klassenwechsel, ent- scheiden auch die sezernierten Zytokine über die funktionelle Rolle der B-Zelle [85]. So existieren B-Zellen, die hohe Mengen an IL-10 und geringere Mengen an IFN-g produzieren [86] und als regulatorische B-Zellen bezeichnet werden. 1.3.2 Zytokine Zytokine sind niedermolekulare Botenstoffe, die vor allem von Immunzellen sezerniert werden um durch pleiotrope oder redundante Effekte unter anderem die Stimulation der Proliferation und Differenzierung von verschiedenen Immunzellen zu beeinflussen. Darüber hinaus können Zytokine autokin, parakrin und endokrin wirken. Sie binden an Oberflächenrezeptoren von Immunzellen, wodurch intrazelluläre Signalkaskaden (z.B. JAK/STAT-Signalweg) aktiviert werden, die eine Änderung der Genexpression verur- sachen. Das bereits mehrfach erwähnte regulatorische anti-inflammatorische Interleu- kin 10 (IL-10) wirkt immunsuppressiv, indem es Entzündungsreaktionen unterdrückt [87]. IL-10 ist in der Lage, die Produktion von IL-8 und Chemokinen zu reduzieren, ebenso kommt es in Anwesenheit von IL-10 zur Verringerung der Expression des MHCII-Komplexes und den Adhäsionsmolekülen zwischen den Effektorzellen. Vor al- lem für stimulierte Monozyten und Makrophagen konnte gezeigt werden, dass IL-10 die Produktion von IL-1, IL-6 und TNF-a reduziert [88]. Bei T-Lymphozyten wird durch IL-10 die TH1-Immunantwort unterdrückt und die TH2-Antwort begünstigt. 10 Einleitung TNF-a ist dagegen ein potentes pro-inflammatorisches Zytokin, welches eine zentrale Rolle in der Pathogenese von chronischen-entzündlichen Erkrankungen einnimmt, wie z.B. der rheumatoiden Arthritis (RA) [89, 90]. Darüber hinaus ist es auch an immun- suppressiven Effekten beteiligt und reguliert unter anderem Apoptose und Zelldifferen- zierung [91]. Aktivierte Monozyten und Makrophagen sind neben den Mastzellen und Lymphozyten die wichtigsten Produzenten dieses Zytokins [92]. Diese Zellen lassen sich wiederum selbst durch TNF-a stimulieren und vermitteln parakrin die Expression zahlreicher Zytokine wie IL-1, IL-6, IL-8, IFN-g und Akut-Phase-Proteine, sowie Prostaglandinen (PG) [93, 94]. Diese Zytokine beeinflussen wiederum den Immunphä- notyp von Zellen und werden durch RNA-BP reguliert [95, 96]. 1.3.3 T-Lymphozyten Während eines immunologisch entzündlichen Prozesses werden, ausgehend von den APC, die T-Lymphozyten angesteuert. Entzündliche Mediatoren, wie TNF-a und IFN- g induzieren vor allem pro-inflammatorische T-Zell-Subpopulationen wie TH1 und TH17, die den weiteren Entzündungsverlauf verstärken. Sobald der Initiator der pro-inflamm- atorischen T-Zell-Antwort beseitigt wurde, wird eine alternativ polarisierende Reaktion eingeleitet, die unterstützend durch die TH2-Antworten die pro-inflammatorische Akti- vität unterdrückt und die Gewebegeneration unterstützt [76]. Dabei nehmen immun- modulierende Zytokine wie IL-10, TGF-b oder TH2 vermitteltes IL-4 eine zentrale Rolle ein [70]. T-Zellen reifen und entwickeln ihren antigenspezifischen T-Zellrezeptor (TCR) im Thy- mus und bilden zusätzlich den CD3-Rezeptor aus. Abhängig von den weiterhin von den Zellen exprimierten Oberflächenmolekülen, werden die T-Zellen in CD4+ bzw. in CD8+ T-Zellen eingeteilt. Während CD8+ T-Zellen (zytotoxischen T-Zellen, CTL) mit lysierenden Substanzen die Apoptose bei ihren Zielzellen initiieren, sind CD4+ T-Zellen in der Lage sich zu unterschiedlichen Effektorzellen zu differenzieren wie T-Helferzel- len (TH) oder auch regulatorische T-Zellen (Treg), die wiederum weitere Immunzellen (z.B. Makrophagen und B-Zellen) mobilisieren und aktivieren können [97]. Damit naive 11 Einleitung T-Zellen aktiviert werden können und über eine klonale Expansion die Differenzierung zur T-Effektorzellen induzieren, müssen sie durch APCs mit dem pathogen-spezifi- schen Antigen in Kontakt getreten sein. Zusätzlich wird für die Aktivierung ein weiteres, das so genannte kostimulatorische Signal benötigt. Dieses wird von kostimulatori- schen Molekülen wie CD40 und CD80/CD86, die von reifen APCs auf ihrer Oberfläche exprimiert werden, vermittelt. Die Erkennung der Antigene erfolgt bei CD8+ T-Zellen über den MHCI- und bei CD4+ T-Zellen über den MHCII-Komplex. Diese CD4- bzw. CD8-Moleküle fungieren als Korezeptoren und stabilisieren die Bindung zwischen T- Zell-Rezeptor (TCR) und dem MHC-Komplex. CD8+ T-Zellen sind auf die Bekämpfung intrazellulärer Krankheitserregern wie Viren und Bakterien oder maligner Zellen spezi- alisiert. Dabei sezernieren sie bevorzugt IFN-g und TNF-a. Grundsätzlich produzieren alle aktivierten T-Zellen IL-2, das als autokriner Zellwachstumsfaktor die Proliferation und die Differenzierung der T-Zelle verstärkt [96, 98]. Die CD4+ T-Zellen lassen sich in weitere unterschiedliche Subpopulationen einteilen, die sich hinsichtlich ihres Phänotyps und ihrer Funktionen unterscheiden. Abhängig von den äußeren Faktoren in der Umgebung, vor allem durch das Zytokinmilieu kön- nen unterschiedliche Transkriptionsfaktoren in den naiven CD4+ T-Zellen aktiviert wer- den, die für die Zelldifferenzierung von den T-Zellsubpopulationen verantwortlich sind [99]. Zu den Hauptgruppen der T-Zellsubpopulationen zählen die klassischen TH1, TH2 und TH17, sowie die TH9 und die Tregs. Die Anwesenheit von IL-12 und IFN-g begünstigt die Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, die wiederum in der Lage sind zytotoxische T-Zellen und Makrophagen zu aktivieren [100, 101]. Ist die naive T- Zelle umgeben von hohen Mengen IL-4, so beeinflusst das Zytokin die TH2- Differen- zierung. Während TH1-Zellen IFN-g und TNF-a sezernieren, produzieren die TH2 Zel- len überwiegend IL-4, IL-5, IL-13, und IL-10 und beeinflussen damit die Antikörperpro- duktion in B-Zellen, die Aktivierung von eosinophilen Granulozyten und inhibieren ver- schiedene Funktionen von Makrophagen [102]. Darüber hinaus beeinflusst die Anwe- senheit von IL-4 und TGF-b die naiven T-Zellen zur TH9-Differenzierung. TH9 Zellen sind dadurch charakterisiert, dass sie IL-9 exprimieren, das diverse pleiotrope Funkti- onen aufweist [103]. In Anwesenheit von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-6 entwickeln sich naive T-Zellen zu TH17 Zellen, die ebenfalls neben IL-17 auch IL-21 und IL-22 sezernieren. TH17 Zellen sind außer an der Entstehung von autoimmunen Erkrankungen auch an Immunreaktionen gegen extrazelluläre Bakterien und Pilzen 12 Einleitung involviert [104]. Als eine besonders wichtige Subpopulation benötigen Treg Zellen zur Differenzierung die Beteiligung von TGF-b und sind wichtig für das Gleichgewicht der immunologischen Toleranz, sowie für die Suppression von pro-inflammatorischen Im- munantworten. Das dabei sezernierte anti-inflammatorische Zytokin IL-10 übernimmt dabei die wichtigste Hauptfunktion. Ein weiteres wichtiges Prinzip der Immunregulation ist die gegenseitige Beeinflussung durch Zytokine, so sind z.B. die TH2 Zellen die di- rekten Gegenspieler von TH1 Zellen [105, 106]. Diese Vorgänge verdeutlichen, dass die T-Zellen auf die solublen Mediatoren angewiesen sind und dass die Expression dieser Zytokine als Ziel-Molekül unter Kontrolle von RNA-BP stehen. 1.3.4 Neutrophile Granulozyten Die neutrophilen Granulozyten entstehen im Knochenmark aus pluripotenten hämato- poetischen Stammzellen, die unter dem Einfluss von CSF über Zwischenstadien der Progenitorzellen und Myeloblasten zu Granulozyten differenzieren. Abhängig von de- ren Morphologie, werden diese in eosinophile, basophile und neutrohile Granulozyten eingeteilt. Die neutrophilen Granulozyten besitzen segmentierte Nuklei und verschie- dene zytoplasmatische Granula, die antimikrobielle Peptide und Enzyme enthalten, welche essentiell für die Beseitigung von Pathogenen genutzt werden [107]. Reife neutrophile Granulozyten besitzen eine geringe Lebensdauer von ca. acht Stunden, dennoch bilden sie den Hauptanteil der im peripheren Blut zirkulierenden Leukozyten- population. Werden die Neutrophilen durch einen Stimulus aktiviert, so verlängert sich deren Lebensdauer auf bis zu zwei Tage. Erhalten sie jedoch keine stimulierenden Signale, so wird die Apoptose induziert [108]. Da die neutrophilen Granulozyten primär an der Phagozytose und der Abtötung von Bakterien und anderen Mikroorganismen beteiligt sind, zählen sie zu einem wichtigen Bestandteil der angeborenen Immunant- wort. Damit die neutrophilen Granulozyten in das entzündete Gewebe gelangen kön- nen, besitzen sie die Fähigkeit zur Migration in Richtung eines ansteigenden Gradien- ten (Chemotaxis) [109]. Grundsätzlich entstehen bei Inflammationen oder Verletzun- gen chemotaktische Stimuli (mikrobielle Moleküle). Des Weiteren sind Neutrophile in 13 Einleitung der Lage, als erste Abwehrzellen den Krankheitsherd zu erreichen, da sie im periphe- ren Blut zirkulieren und zu den schnellsten mobilen Säugerzellen zählen. Ebenso kön- nen auch Immunzellen, wie aktivierte Makrophage, die Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten über die Sekretion bestimmter Zytokine, wie TNF-a, IL-1 und IL-8 ver- stärken. Diese Zytokine sind in der Lage neben der Erhöhung der Migration von Neutrophilen auch die Endothelzellen zu stimulieren und somit deren Expression von Adhäsionsmolekülen (Selektine- und Integrin-Liganden) zu erhöhen. Damit steigt der intensive Kontakt mit dem Endothel, sodass die Neutrophilen über die Endothelzellen „rollen“, adhärieren und über trans- oder parazelluläre Migration (Diapedese) die be- troffenen Areale des Körpers erreichen [110]. Am Zielort angekommen, phagozytieren die neutrophilen Granulozyten Pathogene, die intrazellulär abgebaut werden, oder be- wirken durch die extraphagolysomale Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive, oxygen species, ROS) deren Eliminierung [111]. Der dabei freigesetzte ROS kann dabei auch das eigene Gewebe schädigen. Neutrophile Granulozyten scheinen neben den eosinophilen Granulozyten auch bei der Erkrankung Asthma bronchiale relevant zu sein. So wurden neutrophile Granulozy- ten insbesondere bei schweren Fällen von Asthma als potentielle Effektorzellen be- schrieben, da vorwiegend eine erhöhte Neutrophilenzahl neben den Eosinophilen im Sputum, in der Bronchoalveoläre Lavage (BAL) und im Gewebe der allergisch entzün- deten Lungen nachgewiesen wurde [112-115]. 1.6 Dysregulation vom Immunsystem führt zu Autoimmunerkrankun- gen & Allergien Damit bspw. Krankheitserreger erkannt und bekämpft werden können, müssen Im- munzellen in der Lage sein, durch allgemeine und spezifische Erkennungsmechanis- men zwischen eigenen und körperfremden molekularen Mustern unterscheiden zu können. Dies fasst man unter dem Begriff immunologische Toleranz zusammen. Der Verlust an Toleranz gegenüber Selbst- bzw. harmlosen Umwelt-Antigenen führt zu Fehlregulation des Immunsystems, die zur Schädigung gesunder, körpereigenen Zel- len beitragen z.B. bei Allergien oder Autoimmunerkrankungen [116]. Bereits während 14 Einleitung der Lymphozyten-Reifung im Thymus werden autoreaktive T-Zellen, die mit einer zu hohen Affinität Selbstantigene über MHC-Komplexe erkennen und binden, depletiert. Dadurch sollen nur T-Zellen in die Peripherie gelangen, die eine geringe Affinität ge- genüber Selbst-Peptid:MHC-Komplexe aufweisen und somit die Toleranz gegenüber Selbstantigenen aufrecht erhalten [117, 118]. Überleben dennoch autoreaktive T-Zel- len die thymischen Selektionsprozesse, können diese in der Peripherie durch verschie- dene Toleranzmechanismen (Ignoranz, Anergie und Immunsuppression) unter Kon- trolle gebracht werden [116, 119]. Auch autoreaktive B-Lymphozyten werden bereits im Verlauf ihrer Reifung im Knochenmark selektiert, die jedoch in der Peripherie im Wesentlichen durch die T-Zellen kontrolliert werden [120]. Trotzdem können autore- aktive T-Zellen während einer Inflammation eine adaptive Immunantwort induzieren, sofern ihnen das entsprechende Antigen präsentiert wird und kostimulatorische Sig- nale vorhanden sind. So kommt es bei Autoimmunerkrankungen zu einer überschie- ßenden „Auto-Inflammation“, die durch Hyperaktivität von Immunzellen gegenüber Selbstantigenen getrieben wird. Ähnlich überreaktiv verhält sich das Immunsystem bei einer Allergie. In diesem Fall entwickelt das Immunsystem eine adaptive Überempfind- lichkeitsreaktion gegenüber exogenen harmlosen Antigenen (Bsp. Pollen). Dies wird als schädigende Hypersensitivität bezeichnet [121, 122]. Bei dieser Hypersensitivitäts- reaktion liegt unter anderem eine Dysregulation der T-Zell Balance vor, die auf erhöhte TH2-Aktivität (z.B. Asthma) zurückzuführen ist, während Autoimmunerkrankungen (z.B. rheumatoide Arthritis) von überschießenden TH1-Reaktionen beeinflusst werden. Dadurch entsteht ein Ungleichgewicht und somit eine Dysregulation zwischen anti- inflammatorischen (IL-10) und pro-inflammatorischen (TNF-a) Zytokinen, die zur Ent- stehung einiger Autoimmunerkrankungen und Allergien beitragen [123]. Hierbei sind RNA-BP in der Lage, über Regulation der Expression von immunmodula- torischen Zytokinen, wie TNF-a, einen pro-inflammatorischen Immunphänotyp von Zellen zu erzeugen, was wiederum zu der erwähnten Dysregulation führen kann. 15 Einleitung 1.6.1 Rheumatoide Arthritis Mit einer Prävalenz von ca. 1-2 % der Bevölkerung gehört die rheumatoide Arthritis (RA) zu den häufigsten Autoimmunerkrankungen. Sie betrifft Frauen etwa doppelt so häufig wie Männer und beginnt überwiegend im jüngeren oder mittleren Erwachsenen- alter. Inzwischen ist bekannt, dass RA-Patienten ein um etwa 50 % erhöhtes Risiko einer vorzeitigen Sterblichkeit haben und ihre Lebenserwartung im Vergleich zur All- gemeinbevölkerung um 3 bis 10 Jahren sinkt [124-128]. Bei dieser chronisch-entzündlichen Autoimmunerkrankung führt ein Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren zur unkontrollierten Entzün- dung, die gekennzeichnet ist durch eine immunvermittelte entzündliche Synovitis, bei der es zur Zerstörung des Knorpel- und Knochengewebes kommt [129]. Zu Beginn der Erkrankung sind oft kleine Gelenke der Hände und Füße betroffen und sie ist oft mit Schmerzen, Schwellungen und Beeinträchtigungen der Gelenkfunktion verbunden. Die exakte Ursache für die Entstehung der RA ist noch nicht bekannt, man geht davon aus, dass eine Vielzahl genetischer und nicht-genetischer Faktoren an der Auslösung der Erkrankung beteiligt ist. Es wird unter anderem angenommen, dass ein unbekann- tes Antigen auf APC von autoreaktiven T-Zellen erkannt, jedoch nicht von körpereige- nen Toleranzmechanismen kontrolliert und als fremd angesehen wird und so die Ent- zündung induziert wird. Dabei soll die Expression eines bestimmten human leukocyte antigen (HLA)-DRB1-Allels an der Entstehung der Erkrankung beteiligt sein. Ebenso fördert die Dysregulation von Toleranzmechanismen die Autoimmunerkrankung. Bei manchen RA-Patienten konnten Autoantikörper im Serum nachgewiesen werden, die gegen IgG gerichtet sind und als sog. Rheumafaktoren (RF) zur Auslösung der Symp- tomatik durch Bildung von Immunkomplexen führen. Des Weiteren sollen über virale und auch bakterielle Infektionen Kreuzreaktionen von selbstantigen- und pathogen- spezifischen T-Zellen die Erkrankung verursachen [130-133]. Bei der Pathogenese kommt es zu einer hohen Akkumulation inflammatorischer Im- munzellen (Monozyten, Makrophagen, Neutrophile und Lymphozyten) in der Synovia der Gelenke. Diese Immunzellen aktivieren über soluble Mediatoren (TNF-a, IL-1, IL- 6, IL-17) synoviale Fibroblasten, Chondrozyten und Osteoklasten, die Matrix-Me- 16 Einleitung talloproteasen (MMP) und Kollagenasen ausbilden und damit zur Destruktion der ext- razellulären Matrix (EZM) beitragen. Dies führt über Entzündungsschübe zu Schwel- lung und Schmerzen und zur Entstehung des so genannten Pannusgewebes, durch das letztendlich Knochen- und Knorpelgewebe zerstört wird [134-136]. 1.6.2 Allergisches Asthma Bronchiale Aktuell leiden schätzungsweise weltweit ca. 235 Millionen Menschen unter Asthma. Diese schwerwiegende chronische Erkrankung des Respirationstraktes zählt zu den häufigsten nichtübertragbaren Erkrankung bei Kindern [137]. Das chronische Asthma bronchiale ist durch eine Empfindlichkeit der Atemwege (Hyperreagibilität) auf nicht immunologische Reize mit einer Verengung zu reagieren charakterisiert, einherge- hend mit einer gesteigerten Verkrampfung der Bronchialmuskulatur und Hypersekre- tion von zähem Schleim [138, 139]. Die pathologischen Veränderungen weisen sich klinisch durch wiederkehrende Atemnotfälle, verursacht durch Verengung der Atem- wege, begleitet von Husten und Giemen auf [140]. Während bei Kindern und Jugend- lichen überwiegend die allergische Form, auch extrinsisches Asthma genannt, auftritt, dominiert im Erwachsenalter das intrinsische (nicht-allergische) Asthma bronchiale. Das intrinsische Asthma kann durch unterschiedliche Stimuli, wie chemische Reiz- stoffe, virale Infektionen, Medikamente oder auch Stress hervorgerufen werden. Be- dingt durch verschiedene Umweltallergene, wie Gräser- und Blüten-Pollen, Schimmel- pilze, Hausstaubmilben und Tierhaare, wird der Anfall beim allergischen Asthma aus- gelöst [141]. Beide Formen weisen gleiche Symptome auf und sind charakterisiert durch verstärkte Infiltration eosinophiler Granulozyten und T-Lymphozyten im Respi- rationstrakt. Dabei kommt es zur erhöhten Sekretion von TH2 assoziierten Zytokinen (wie z.B. IL-4, IL-5, IL-13 und IL-9) und verstärkten Mukusproduktion. Sehr häufig wird daher auch eine Mischform (extrinsisches und intrinsisches Asthma) beobachtet [142, 143]. Bei dem allergischen Asthma findet eine hyperreaktive Immunreaktion gegen harm- lose Substanzen (Antigene) statt, die vom Ablauf in drei Phasen definiert wird und zwar in die Induktions-, Früh- und Spätphase. Während der Induktionsphase werden die 17 Einleitung Antigene (Allergene), die über die Atemwege in den Körper gelangen von APCs pha- gozytiert und über MHC-Moleküle präsentiert. Vor allem in regionalen Lymphknoten treten die APC mit entsprechenden T-Zellen in Kontakt und können in Anwesenheit von IL-4 naive T-Zellen zur TH2-Differenzierung stimulieren. Diese wiederum können durch Produktion von IL-4 und IL-13 in B-Zellen den Immunglobulinklassenwechsel von IgM zu IgG1 und IgE induzieren, was zur Auslösung der Entzündungskaskade führt [144]. Die Sensibilisierungsreaktion verläuft weitgehend symptomfrei und dient primär der Aktivierung von T-Zellen. Nach einem wiederholten Kontakt mit dem selben Allergen, kommt es in der frühen Phase zur IgE-vermittelten, quervernetzen Aktivie- rung von IgE-Rezeptoren (FceRI- und -RII-Rezeptoren) auf Mastzellen, Monozyten und eosinophilen und basophilen Granulozyten, das vor allem bei Mastzellen eine Degranulation verursacht, bei der unterschiedliche Mediatoren wie Histamin über Vesi- kel freigesetzt werden. Weitere Entzündungsmediatoren wie Prostaglandine und Leu- kotriene, werden neben einer Vielzahl von Zytokinen (IL-6, IL-5, IL-9, IL-13, TNF-a, GM-CSF) zur Förderung des inflammatorischen Prozesses, sezerniert. Während die Mastzellen den Übergang von der Früh- zur Spätphase einleiten, dominieren Entzün- dungszellen wie T-Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten, eosinophile und neutro- phile Granulozyten im weiteren Verlauf der allergischen Entzündung [145-147]. Dabei ist die Bildung von TH2 Zellen bei der Ausbildung von allergischem Asthma von ent- scheidender Bedeutung [148]. Die von TH2 Zellen sezernierten asthmaspezifischen Zytokine IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 und IL-17 führen zu einer anhaltenden Immunreaktion [148-150]. Die TH2-Differenzierung wird durch die Anwesenheit von IL-4 aufrechterhal- ten und das dabei produzierte IL-5 dient zur Aktivierung und Proliferation von B-Zellen und eosinophilen Granulozyten. IL-13, das ebenfalls die Pathogenese von Asthma mo- duliert, beeinflusst die Mukusproduktion und kann durch das Vorhandensein von IL-9 verstärkt werden. IL-17 scheint neben der Entwicklung von Asthma durch Aktivierung und Rekrutierung von Neutrophilen auch protektive Effekte auf die Inflammation der Lunge zu haben [151-154]. 18 Einleitung 1.6.3 Modelle zur Untersuchung der Pathogenese humaner chro- nisch-inflammatorischer Erkrankungen Tiermodelle können klinische und histologische Analogien zu menschlichen Autoim- munerkrankungen aufweisen und übernehmen daher eine wichtige Rolle in der Erfor- schung von Autoimmunerkrankungen. Mit Hilfe von in vivo Modellen ist man in der Lage während einer Erkrankung die zugrundeliegenden immunologischen Mechanis- men im Gesamtorganismus zu untersuchen und therapeutische Aspekte zu analysie- ren. Besonders Kleintiere mit einer Lebenserwartung von zwei bis drei Jahren wie Mäuse vermehren sich schnell, verursachen geringe Haltungskosten und besitzen viele Erkrankungen mit ähnlichen genetischen Ursachen. Daher ist kaum ein anderer Säuger-Organismus so gut untersucht wie die Maus [155-157]. 1.6.3.1 Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) Zur Untersuchung der RA eignet sich besonders das klassische und am besten unter- suchte Tiermodell der Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) [158-160]. Wie bereits er- wähnt, steht ein unbekanntes Autoantigen im Verdacht die humane RA auszulösen und die damit verbundene Inflammation der Gelenke, gefolgt von Knorpel- und Kno- chenerosion. Ausgelöst wird die CIA in Mäusen durch eine autoimmune Antwort auf das Kollagen Typ II (CII), was die Hauptkomponente des Gelenkknorpels darstellt [161]. Das CII wird in der extrazellulären Matrix der Knochen und des Knorpels von Chondrozyten synthetisiert. Die Immunisierung der Versuchstiere erfolgt mit CII (Huhn) gelöst in komplettem Freundschen Adjuvans (CFA). CFA besteht aus einer Mineralölfraktion mit hitzegetöteten Mycobakterien, das besonders geeignet ist für die Auslösung einer CIA [162]. Daraus resultiert eine kreuzreaktive autoimmune Antwort gegen das CII im Gelenkknorpel der Maus. Durch die Stimulation von Kollagen-spezi- fischen T- und B-Lymphozyten und die Produktion spezifischer Antikörper, entwickelt sich eine Immunantwort gegen das murine CII [163, 164]. Im Synovium lässt sich, ver- gleichbar mit der humanen RA, eine massive Infiltration von neutrophilen Granulozy- ten, M1-Makrophagen, CD4+ T- und B-Zellen nachweisen. Ab etwa dem 20. Tag nach 19 Einleitung der Immunisierung der Tiere, tritt als Symptom bei den erkrankten Tieren eine Pfoten- schwellung auf (s. K. 3.4.4.1). Des Weiteren spricht man von einer klassische TH1 vermittelten Antwort, da überwiegend TH1 assoziierte Zytokine wie bspw. IFN-g im Ge- gensatz zu TH2-Zytokinen (IL-4, IL-10) von T-Zellen sezerniert werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass eine zusätzliche Gabe von IFN-g oder des TH1-Differenzierungs- faktors IL-12 die Progression als auch den Schweregrad der induzierten Arthritis för- dert, während die Neutralisation von IFN-g die Entstehung der Erkrankung inhibiert [165-167]. Die Relevanz der T-Zellen in der Pathogenese von CIA wird auch in ande- ren Publikationen demonstriert. Es konnte gezeigt werden, dass bei ab-TCR-defizien- ten Mäusen und nach Behandlung mit anti-TCRab monoklonalen Antikörpern die Ent- stehung von CIA reduziert und sogar verhindert werden konnte [168, 169]. Ebenso konnte auch gezeigt werden, dass B-Zell-defiziente Mäuse keine CIA entwickeln [170]. Im murinen CIA Modell wird vor allem der DBA/1 Mausstamme verwendet, da diese Mäuse mit dem MHC-II Haplotypen H-2q eine höhere Suszeptibilität für die Induktion von CIA aufweisen [171-173]. Der genetische Hintergrund der jeweiligen Mausstämme nimmt somit eine entscheidende Rolle bei der Entstehung der CIA ein [174]. 1.6.3.2 Kollagen-Antikörper-induzierte Arthritis (CAIA) Ein weiteres derzeit intensiv genutztes Tiermodell ist die Kollagen Antikörper-indu- zierte Arthritis (CAIA). Dabei kommt es zur Verwendung von einem Gemisch aus meh- reren monoklonalen Antikörpern, die gegen das murine Kollagen Typ II gerichtet sind [175, 176]. Im Vergleich zu CIA können mit CAIA auch Mausstämme auf C57BL/6 Hintergrund, die den MHC-II Haplotypen H-2b tragen und somit nicht anfällig für eine CII-induzierte Arthritis sind, induziert werden und weisen einen schnellen Krankheits- beginn bereits nach drei Tagen auf. Es konnte gezeigt werden, dass bei den Versuchs- tieren die Abwesenheit von T- und/oder B-Lymphozyten in einer höheren Suszeptibili- tät für CAIA resultiert. In diesen Zusammenhang wird die regulatorische Rolle der adaptiven Lymphozyten diskutiert [177]. Dagegen verursacht eine Depletion von neutrophilen Granulozyten einen abgeschwächten Krankheitsverlauf, zusätzliche sol- len Makrophagen als Hauptkomponenten entscheidend am Krankheitsgeschehen be- teiligt sein [178]. Des Weiteren kann die Induktion von CAIA mit der Applikation von 20 Einleitung LPS gesteigert werden. Mit Hilfe beider Modelle können komplexe immunologische Fragestellungen in vivo untersucht werden. Sie eignen sich auch um die Rolle von RNA-BP auf die Immunzellen/Pathogenese der Autoimmunantwort zu untersuchen. 1.6.4.3 Allergisches Asthma bronchiale Vergleichbar wie auch in anderen Krankheitsmodellen variiert die Suszeptibilität für das allergische Asthma bronchiale abhängig vom Stamm bzw. dem genetischen Hin- tergrund der Versuchstiere. Zusätzlich beeinflusst das Geschlecht die Schwere der Erkrankung [179-181]. So scheinen weibliche BALB/c-Mäuse besonders prädestiniert für die Entwicklung von Asthma zu sein. Verantwortlich dafür zeigen sich höhere Mast- zellaktivitäten einhergehend mit erhöhtem TH2 assoziierten Zytokinmilieu (IL-4, IL-5 und IL-13). Da Mäuse nicht in der Lage sind auf natürlicher Weise Asthma bronchiale zu entwickeln, wird über ein Allergen (Ovalbumin, OVA) eine systemische Sensibilisie- rung erzielt, damit eine nachweisbare Atemwegshyperreagibilität erzeugt werden kann. Bei den etablierten Modellen kommt es vor allem zur akuten allergischen Ent- zündungen der Atemwege [182]. Dazu wird das Allergen OVA in der Regel mit einem Adjuvanz (Aluminium-Hydoxid) intraperitoneal appliziert und anschließend in der so genannten Provokationsphase intranasal verabreicht, was eine Aktivierung der TH2- Zellen bewirkt. Die wiederholende Provokation mit OVA verursacht in Anwesenheit von TH2 assoziierten Zytokinen wie IL-5 und IL-13 die Akkumulation von Effektorzellen wie eosinophilen Granulozyten in der Lunge. Obwohl es bekannt ist, dass IL-17 pro- duzierende Zellen durch Aktivierung und Rekrutierung von neutrophilen und eosino- philen Granulozyten entscheidend an der Krankheitsentwicklung beteiligt sind, wurden auch regulatorische Effekte von TH17 Zellen dokumentiert [183-185]. 21 Zielsetzung der Arbeit 2. Zielsetzung der Arbeit Verschiedene RNA-BP nehmen Einfluss auf den Immunphänotyp von Zellen, weshalb eine Dysregulation der Genexpression durch RNA-BP zur Entstehung verschiedener Erkrankungen wie bspw. Autoimmunerkrankungen beitragen könnte. Im Falle des bis- her wenig erforschten Bindeprotein KRSP handelt es sich um ein multifunktionelles und regulatorisches, einzelsträngiges Nukleinsäure bindendes Protein, welches eine zentrale Funktion in der Regulation der Expression pro-inflammatorischer Gene ein- zunehmen scheint. Der aktuelle Forschungsstand zeigt, dass es auf verschiedenen Weisen in die posttranskriptionelle Regulation der pro-inflammatorischen Genexpres- sion eingreift. Des Weiteren konnten einige Untersuchungen an isolierten Zellen zei- gen, dass KSRP in der Lage ist immunologische Prozesse zu beeinflussen, da es die Expression von pro-inflammatorischen Mediatoren reguliert, die wiederum in der Mo- dulation der Immunantwort involviert sind. Zu der genauen Beteiligung von KRSP an der Pathogenese von chronisch-inflammatorischen Erkrankungen in vivo existieren al- lerdings bisher nur wenige Untersuchungen. Um neue Behandlungswege entwickeln zu können, ist diese Erkenntnis jedoch zwingend erforderlich. Daher sollen in etablierten Mausmodellen zur Darstellung von chronisch-inflammato- rischen Erkrankungen, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis, der Einfluss von KSRP auf immunmodulatorische Prozesse im Gesamtorganismus untersucht werden. Hierbei soll unter Berücksichtigung von chronischen Entzündungen die Charakterisie- rung der Wirkung des inaktivierten Gens (KSRP-Knockout-Mäuse) auf die Immunzel- lenfunktion in vivo erfolgen. 22 Material & Methoden 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Laborgeräte Tabelle 1: Verwendete Laborgeräte und deren Hersteller Gerät Modell Hersteller Analytic AC120 S Satorius (0,1mg-121g) Kern 444-35 N Analysenwaage Kern (0,01-400 g) Kern PCB Kern (0,1-4000g) V-150 Systec GmbH Autoklav Laboklav VWR Beta Counter 1205 Betaplate LKB Wallac CB 150, CB 210 Binder Brutschrank Hera Cell 150 Heraeus Digitalwaage Basic Typ 1202 Sartorius Dispenser Multipette® 4780 Eppendorf Dispensette 10 ml Brand 23 Material & Methoden Gerät Modell Hersteller Thermo Fisher Scien- Attune NxT tific BD AcuriiTM C6 BD Biosciences Durchflusszytometer FACSCanto II FACSCalibur BD Biosciences LSRII Elektrophorese GPS 200/400 Pharmacia Dynex MRX TC Revelation Fluorometer/Luminometer Dynex Technologies Microplate Reader Folien-Einschweiß-Gerät Heat Sealer 1295-012 Audion Elektro Siemens Sikafrost Comfort Gefrierschrank -20°C Siemens AG electronic Gefrierschrank -80°C Herafreeze Heraeus Neubauer Improved, Hämazytometer AO Spencer Bright Line, 0,1 mm Liebherr MedLine Kühlschrank + 4°C Liebherr LKv 3910 Hämazytometer Profi line AO Spencer Manual MACS® Separa- QuadroMACSTM Miltenyi Biotec tors IKAMAG®Reo Janke & Kunkel Magnetrührer 24 Material & Methoden Gerät Modell Hersteller Manual MACS® Separa- Big-Squid Ikamag IKA Labor-technik tors Multipette Plus, 12-Kanal-Pi- pette Eppendorf 0,5-10µl Mehrkanalpipetten Finnpipette, 8-Kanal-Pipette Thermo Scientific 30 – 300 µl Finnpipette, 12-Kanal-Pipette Labsystems 50 – 300 µl CK2 Olympus Mikroskope CH2 Labsystems Leitz DMIL Leica 0,5 – 10 µl 1 – 10 µl Thermo Scientific 100 –1000 µl Pipetten 0,5 – 10 µl 1 – 10 µl Eppendorf 100 –1000 µl NanoZoomer 2.0HT Hamamatsu 25 Material & Methoden Gerät Modell Hersteller 20 – 200 µl ErgoOne, Starlab GmbH Pipetten Finnpipette 5 – 40 µl Labsystems Pipetus®A-akku Hirschmann Laborgeräte Pipettierhilfen Pipetboy plus Tecnomara Plethysmograph Modell PLY 3211 Bucxo® Research Systems Präparierbesteck - Hammacher Reagenzglasschüttler Vortex Genie 2TM Bender & Hobein HeraeusLamin Air®HB 2448 Heraeus Sterilwerkbank Herasafe Heraeus Gesellschaft für Labortech- GFL Typ 1012 Wasserbad nik Julabo TW20 Julabo Wasserdeionisierungs- Purelab Classic DI ELGA anlage Zählhilfe Laboratory Counter Becton Dickinson GmbH Harvester Zellerntegerät Tomtec MACH II/SN 453 Zellzählgerät CASY TT Schärfe System GmbH 26 Material & Methoden Gerät Modell Hersteller Avanti J-26 XP Beckman Coulter Multifuge 1 L-R Heraeus (300 g = 1.200 rpm) Megafuge 40R Heraeus Galaxy Mini VWR Zentrifugen MicroStar 17R VWR Biofuge fresco Heraeus Biofuge 12 Heraeus Megafuge 1.0R Heraeus Mikrozentrifuge SIGMA Sigma Cytospin 3 Shandon 27 Material & Methoden 3.1.2 Labor- und Verbrauchsmaterial Tabelle 2: Verwendete Labor- und Verbrauchsmaterialien und deren Hersteller Material Modell Hersteller Alufolie 30u-Qualität Roth Bakteriologische Pet- Æ 94 mm, Höhe 16 mm Greiner Bio-one GmbH rischalen Æ 60 mm, Höhe 15 mm PD-Tips, Dispensiergerätaufsatz Brand GmbH & Co. KG 0,5; 2,5 und 5 ml Einfrierbox Cryo 1 Freezing Container Thermo Fisher Scientific Einfrierröhrchen Nunc cryo Tube™ vials Nunc 0,7 x 30 mm Sterican® Becton Dickinson Einmalkanülen 0,4 x 19 mm Sterican® 0,5 x 16 mm Sterican® B/Braun Omnifix® 1 ml B/Braun Einmalspritzen Omnifix® 5 ml B/Braun 10ml DiscarditTM II Becton Dickinson GmbH Einschweißfolien 102 x 258 mm PerkinElmer Filterpapiere Für Cytospin Shandon Falcon 5 ml Rundboden- FACS-Röhrchen Becton Dickinson GmbH röhrchen Glasfaserfilter 102 x 258 mm PerkinElmer 28 Material & Methoden Material Modell Hersteller Precicolor 5, 10 und 25 ml Hilgenberg GmbH Techcolor 5, 10 und 25 ml Hirschmann Laborgeräte Glaspipetten Silberbrand Eterna Brand GmbH & Co. KG 5, 10 und 25 ml Handschuhe Sempercare® Semperit Kulturflaschen 75 cm2, 25 cm2, 175 cm2 Greiner Bio-one GmbH Cellstar Gewebekulturplatte, 6-well, Flachboden Cellstar Gewebekulturplatte, 24-well, Flachboden Greiner Bio-one GmbH Cellstar Gewebekulturplatte, 48-well, Flachboden Cellstar Gewebekulturplatte, 96-well, Flachboden Kulturplatten CytoOne Gewebekulturplatte, 6-well, Flachboden, unbehandelt CytoOne Starlab International GmbH Gewebekulturplatte, 12-well, Flachboden CytoOne Gewebekulturplatte, 24-well, Flachboden 29 Material & Methoden Material Modell Hersteller Ohrstanzer Typ I ZoonLab Objektträger 76 x 26 cm Mattrand Diagonal GmbH & Co. KG Nylonwolle MKN-100 Nylon Wool Fiber Kisker Biotech Parafilm Parafilm N Nationalcam™ Pasteurpipetten 150 mm VWR GmbH Gelbe Spitzen: bis 200 µl Sarstedt AG Blaue Spitzen: bis 1000 µl Roth Pipettenspitzen Kristallspitzen: Tip one 0,1 – 10 µl Starlab International GmbH Weiße Spitzen: bis 200 µl Cellstar 5, 10, 25 und Plastikpipetten Greiner Bio-one GmbH 50 ml Polypropylenröhrchen 15 ml und 50 ml Greiner Bio-one GmbH (Spitzboden Falcons) Reaktionsgefäße 0,65 ml; 1,5 ml und 2 ml Sarstedt AG Reaktionsgefäße 0,5 ml; 1 ml; 2 ml Eppendorf (“Safe-Lock”) Rundbodenröhrchen 13 ml Greiner Bio-one GmbH Säulen LS Säulen Miltenyi Biotec 0,45 µm Schleicher & Schuell Spritzenvorsatzfilter 0,2 µm Sarstedt AG 30 Material & Methoden Material Modell Hersteller Transferpipette 3,5 ml Sarstedt AG Transwell-Filter 5 µm Porengröße costarÒ Zellschaber 24 cm NeoLabs Zellsieb Cell Strainer: Ø 40 µm Becton Dickinson GmbH Z-Gel Micro Tube 1, 1 ml Sarstedt AG 3.1.3 Chemikalien und Reagenzien Tabelle 3: Verwendete Chemikalien und Reagenzien mit Angabe der Hersteller Substanz Hersteller/Vertrieb Agarose Roth Ammoniumchlorid (NH4Cl) Roth Aluminiumhydroxid, Imject® (Alum) Perbio Collagen Type II (chicken) Sigma-Aldrich CD28 monoklonaler Antikörper eBioscienceTM CD3 monoklonaler Antikörper eBioscienceTM Complete Freund’s Adjuvant (CFA) Otto Nordwald Dimethylsulphoxide (DMSO) Hybri-max® Sigma-Aldrich EntellanÒ Merck Ethanol 96 %, vergällt BD 31 Material & Methoden Substanz Hersteller/Vertrieb Ethyldiamintetraessigsäure, Na2-Salz x 2 Roth H2O (EDTA) Überstand der GM-CSF-produzierenden GM-CSF- Zelllinie X63/GM-CSF Glutamin L(+) (C5H10N2O3) Roth Golgi Plug BD Biosciences Guanidiniumisothiocyanat (GIT) Roth 3H-Thymidin (3HTdR) Amersham Biosciences GmbH Ionomycin Tocris Bioscience Isopropanol (2-Propanol, C3H8O) Hedinger Kaliumchlorid (KCl) Merck Keratinocyte chemoattractant Recom- Peprotech binantes murine KC (CXCL1) Kaliumhydrogencarbonat (KHCO3) Riedel-de Haën Lipopolysaccharid (LPS); E. coli Calbiochem Magnesiumchlorid (MgCl2) Merck Methanol Mallinckrodt-Baker Recombinantes Monocyte Chemotactic Peprotech Protein-1 (MCP-1 (CCL2)) Natriumchlorid (NaCl) Roth Natriumcitrat (C6H5Na3O7) Roth 32 Material & Methoden Substanz Hersteller/Vertrieb Natriumdisulfit (Na2S2O5) Merck Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Roth Natriumhydroxid (NaOH) Roth Huhn Ovalbumin (OVA) Sigma-Aldrich Paraformaldehyd (PFA) Merck S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine Sigma-Aldrich (SnAP) Szintillationsflüssigkeit Roth Terralin® Liquid Schülke & Mayr GmbH Rekombinanter muriner Tumornekrose- ImmunoTools faktor-a (rm TNF-a) Wasser, pyrogenfrei, steril (Aqua B. B/Braun Braun) Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck 3.1.4 Lösungen, Puffer und Kulturmedien Für die Herstellung der Puffer und Lösungen wurde, wenn nicht anders angegeben deionisiertes Wasser aus der hauseigenen Deionisierungsanlage (ELGA) verwendet. Die Kulturmedien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, bei 4°C gelagert. 33 Material & Methoden 3.1.4.1 Allgemein verwendete Lösungen und Puffer Tabelle 4: Zusammensetzung der verwendeten Lösungen und Puffer Lösung/Puffer Zusammensetzung/Vertrieb 12,5 ml 5 N NaOH BASE-Solution, 50 x 1 ml 0,5 M EDTA 36,5 ml PCR-H2O 0,5 ml BASE 50 x BASE-Solution, 1 x 24,5 ml PCR-H2O pH 12 CII-Lsg. 4 mg/ml CII in 0,05 M Essigsäure DNA- H2O mit 0,1 Vol % DEPC, auto- DEPC-Wasser klaviert DPBS (Dulbecco’s Phosphate buffered Gibco saline) 30mM EDTA/ 0,01% NaN3-Puffer in EDTA-Puffer 100 ml PBS Hergestellt aus 96 % Ethanol und entio- Ethanol 70 % nisiertem Wasser 0,25 g KHCO3, 2,07 g Ammoniumchlo- rid und 0,0093 g EDTA wurden in 250 Gey‘scher Lysepuffer ml entionisiertem Wasser gelöst, pH 7,5 eingestellt und sterilfiltriert (0,2 µm) 34 Material & Methoden Lösung/Puffer Zusammensetzung/Vertrieb 4 M GIT 2 mM Natriumcitrat GIT-Puffer 0,5 % Sarcosyl 0,1 M b-Mercaptoethanol in DEPC-H2O HBSS (Hank’s balanced salt solution) Sigma-Aldrich 124 mM TRIS-HCI Laufpuffer 5x 959 mM Glycin 17 mM SDS in H2O pH 7,8 Lymphocyte Separation Medium GE Healthcare (LSM 1077) DPBS/2mM EDTA MACS-Puffer 745 mg EDTA wurden in 1 Liter 1xPBS (pH 7,2) gelöst und anschließend auto- klaviert 15,75 g Tris-HCI NEUTRALISATION-Solution, 50 x 50 ml PCR-H2O 0,5 ml NEUTRALISATION 50 x NEUTRALISATION-Solution, 1 x 24,5 ml PCR-H2O pH 5 35 Material & Methoden Lösung/Puffer Zusammensetzung/Vertrieb 500µg OVA in 0,9% NaCl im Verhältnis 1:1 mischen mit 10 % Alum mit NaOH auf pH 6,5 einstellen, 1 Std. bei RT un- OVA/Alum ter Lichtausschluss inkubieren, für 5 min bei RT zentrifugieren (1500 UpM). Pellet in 10 ml 0,9 % NaCl resuspendie- ren 40,2 g NaCl und 7,8 g Na2HPO4 x 2 H2O wurden in 5 Liter entionisiertem 1xPBS (Phosphate buffered saline) Wasser gelöst, pH 7,2 eingestellt mit 10 M NaOH und die Lösung anschlie- ßend autoklaviert Trypanblau-Stammlösung (0,4 % v/v) Sigma-Aldrich, Steinheim Verdünnung der Trypanblau-Stammlö- Trypanblau-Gebrauchslösung (0,1 % v/v) sung im Verhältnis 1:4 in 1xPBS 36 Material & Methoden 3.1.4.2 FACS-Lösungen und -Puffer Tabelle 5: Zusammensetzung der verwendeten FACS-Lösungen und -Puffer Lösung/Puffer Zusammensetzung 0,7 g PFA wurden bei 56°C in 100 ml FACS-Fixierungslösung (0,7 % PFA) 1xPBS (pH 7,2) gelöst In 1xPBS wurden 2 % (v/v) FCS (Gibco) FACS-Medium verdünnt (filtriert; 0,4 µm) In 1xPBS/2 mM EDTA wurden 2 % (v/v) FACS-Puffer FCS verdünnt (filtriert; 0,4 µm) In 1xPBS/2mM EDTA wurden 0,5 % intrazelluläre FACS-Puffer FACS (Gibco) verdünnt (filtriert; 0,4 µm) 3.1.5 Medien und Supplemente für Zellkulturen Zur Kultivierung der steril aus den Versuchstieren entnommenen Organe bzw. der da- raus gewonnenen Zellen wurden die Puffer, Kultur- und Waschmedien mit fötalem Käl- berserum versetzt, welches als Nährstoffquelle für die Zellen dient und entscheidend für das Wachstum der Zellen ist. Das FCS war mycoplasmenfrei und steril. Zur Lang- zeitaufbewahrung wurde es in Aliquoten bei -20°C und zur kurzzeitigen Verwendung bei 4°C gelagert. 37 Material & Methoden Tabelle 6: Zusammensetzung/Vertrieb von Medien und Supplemente für Zellkulturen Medium/Supplement Zusammensetzung/Vertrieb Gibco Fetales Kälberserum (FCS) PAA Pferdserum (HS) GE Healthcare Supplement in Kulturmedien; Glutamin (200 mM) 5,84 g/L (+)-Glutamin (Roth) wurden in 200 ml 1xPBS gelöst und sterilfiltriert (0,2 µm), 1%ig eingesetzt in Kulturmedium 40 µl β-Mercaptoethanol (Roth) wurden in β-Mercaptoethanol (5 mM) 114 ml IMDM verdünnt und sterilfiltriert (0,2 µm), 1%ig eingesetzt in Kulturmedien Mischung aus 104 IU/ml Penicillin und 104 µg/ml Streptomycin (PAA, Österreich); 1%ig Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) eingesetzt in Kulturmedien und Wasch- medien zum Schutz vor Verkeimung EMEM (Eagle‘s Minimum Essentiell Sigma-Aldrich Medium) IMDM (Iscove’s Modified Dilbecco`s Medium) Sigma-Aldrich DMEM (Dulbecco`s Modified Ea- gle`s Medium) 38 Material & Methoden Medium/Supplement Zusammensetzung/Vertrieb IMDM mit folgenden Supplementen: 5 % (v/v) FCS (Gibco) 1 % (v/v) Pen/Strep Kulturmedium für murine BM-DCs 2 mM L-Glutamin 50 µM β-Mercaptoethanol 5 % (v/v) GM-CSF (Überstand der GM-CSF- produzierenden Zelllinie X63/GM-CSF) IMDM mit folgenden Supplementen: 5 % (v/v) FCS (Gibco) 5 % (v/v) HS Kulturmedium für murine BM-Makro- 1 % (v/v) Pen/Strep phagen 2 mM L-Glutamin 50 µM β-Mercaptoethanol 25ng/ml M-CSF IMDM mit folgenden Supplementen: 5 % (v/v) FCS (PAA) Kulturmedium für murine T-Zellen 1 % (v/v) Pen/Strep (Testmedium) 2 mM L-Glutamin 50 µM β-Mercaptoethanol EMEM mit folgenden Supplementen: Waschmedium 2 % (v/v) FCS (PAA) 1 % (v/v) Pen/Strep 39 Material & Methoden 3.1.6 Kits Tabelle 7: Verwendete Kits und deren Hersteller Kits Hersteller Arthrogen-CIAâ 5-monoclonal Anti- Amsbio body Cocktail Kit Anti-Ly-6G MicroBead Miltenyi Biotec Isolation Kit mouse CD4+ T Cell Isolation Kit mouse Miltenyi Biotec CD8+ T Cell Isolation Kit mouse Miltenyi Biotec IL-1β IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 Mouse Cytokin IL-9 BD Biosciences Flex Set (CBA) IL-10 IL-12 IL-13 IL-17A IFN-g TNF-α 40 Material & Methoden Kits Hersteller CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Technical Bulle- Promega tin BDTM CompBeads Set BD Biosciences Diff-QuickÒ-Färbeset Medion Diagnostics GmbH REDTagReady-Mix Sigma Aldrich 3.1.7 Analyse Software Tabelle 8: Verwendete Analyse Software und deren Hersteller Bezeichnung Hersteller C6 Analysis Software für AccuriTM BD Biosciences BioSystem XA Software Buxco Research Systems CellQuest Software Becton Dickinson FlowJo Analysesoftware Tree Star, Inc. BD FACSDivaTM Software BD Biosciences FCAP ArrayTM Software BD Biosciences Graphpad PRISM Graphpad Software, Inc. NDP.view2 Hamamatsu Photonics SigmaPlot Systat Software 41 Material & Methoden 3.1.8 Antikörper 3.1.8.1 Antikörper zur Absättigung freier Fc-Rezeptoren Um unspezifische Bindungen der FACS-Antikörper an Fc-Rezeptoren der Zellen zu verhindern, wurden die Zellen vor der eigentlichen Antikörperfärbung mit einem FcR- blockierenden Antikörper inkubiert. Bei den murinen Primärzellen wurde der Antikörper 2.4G2 verwendet. Hierbei handelt es sich um einen Ratte-anti-Maus FcɣRII/III (CD16/32) Antikörper des Isotyps Ratte- IgG2b [186], gewonnen aus dem Kulturüberstand des B-Zell-Hybridoms 2.4G2. Ein- gesetzt wurde der Antikörper in einer Konzentration von 67 ng pro Probe. 3.1.8.2 Antikörper zur FACS-Färbung Tabelle 9: Verwendete FACS-Antikörper und deren Hersteller Antikörper Konzentration/ Isotyp Klon Markierung 5 Hersteller gegen 5x10 Zellen Maus Ratte M5/114 APC 0,01 µg/ 5x105 eBioscience MHCII IgG2b Maus Ratte BD GL1 PE-Cy7 0,04 µg/ 5x105 CD86 IgG2a Biosciences Maus Hamster 16-10A1 FITC 0,04 µg/ 5x105 eBioscience CD80 IgG Maus Ratte 1C10 PE 0,1 µg/ 5x105 eBioscience CD40 IgG2a Maus Ratte M1/70 PE-Cy7 0,04 µg/ 5x105 eBioscience CD11b IgG2b 42 Material & Methoden Antikörper Konzentration/ Isotyp Klon Markierung Hersteller gegen 5x105 Zellen Maus Ratte BD 1A8 PE 0,1 µg/ 5x105 Ly6G IgG Bioscience Maus Ratte 1A8 PB 0,2 µg/ 5x105 BioLegend Ly6G IgG2a Maus Ratte BD 1D3 APC-Cy7 0,1 µg/ 5x105 CD19 IgG2a Bioscience Maus Hamster BD 145-2C11 PerCP 0,1 µg/ 5x105 CD3e IgG Bioscience Maus Hamster Thermo Fis- 145-2C11 PE 0,04 µg/ 5x105 CD3e IgG her Scientific Maus Ratte 0,025 µg/ GK1.5 APC 5 eBioscience CD4 IgG2b 5x10 Maus Ratte 0,025 µg/ BD 53-6.7 PE-Cy5 5 CD8a IgG2a 5x10 Bioscience Maus Ratte Thermo Fis- 53-6.7 eFluor450 0,5 µg/ 5x105 CD8a IgG2a her Scientific Maus Ratte BD 7D4 FITC 0,04 µg/ 5x105 CD25 IgG1 Bioscience 43 Material & Methoden 3.1.8.3 Isotypkontrollantikörper für die FACS-Färbung Tabelle 10: Verwendete Isotypkontrollantikörper und deren Hersteller Konzentration/ Antikörper Klon Markierung 5 Firma 5x10 Zellen Hamster IgG eBio299Arm FITC 0,04 µg/ 5x105 eBioscience Ratte IgG2a eBR2a PE 0,1 µg/ 5x105 eBioscience Ratte IgG2a eBR2a PE-Cy7 0,04 µg/ 5x105 eBioscience Ratte IgG2b eB149/10H5 APC 0,01 µg/ 5x105 eBioscience Ratte IgG1 eBRG1 FITC 0,04 µg/ 5x105 eBioscience Maus IgG1 IS5-21F5 PE 0,1 µg/ 5x105 eBioscience 3.1.8.4 Reagenzien zur Quantifizierung apoptotischer/nekrotischer Zellen Tabelle 11: Verwendete Vitalitätsnachweis-Reagenzien und deren Hersteller Reagenzien Verdünnung Hersteller Fixable Viability Dye 1:1000 eBioscience (FVD) eFluor® 450 7-AAD 1:40 Biolegend Alexa Fluor® 647 Annexin 1:350 Biolegend V 44 Material & Methoden 3.1.8.5. Oligonukleotide Tabelle 12: Verwendete Primer für die PCR und deren Sequenz Allel 5’ Primer 3’ Primer KSRP WT GCG GGG AGA ATG TGA AGG GAG GCC CCT GGT TGA AGG KSRP KO CTC CGC CTC CTC AGC TTG 3.2. Zellbiologische Methoden 3.2.1 Allgemeine Bedingungen Um Kontaminationen zu vermeiden, wurden alle Zellkultur-Arbeiten an einer sterilen Werkbank ausgeführt. Alle verwendeten Materialien wurden entweder steril vom Her- steller erworben, autoklaviert oder steril filtriert. Benötigte Reagenzien und Medien wurden vor Benutzung im Wasserbad auf 37°C erwärmt und mit Terralin liquid desin- fiziert. Die Kultivierung von murinen Zellen erfolgte in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre bei 37°C und 10 % CO2. 3.2.2 Bestimmung der Lebendzellzahl Die Zellzahl von isolierten Immunzellen (Millzzellen, T-Zellen, BM-DC usw.) wurde nach deren Inkubation mit Trypanblau mittels einer ’’Neubauer Improved’’-Zählkam- mer lichtmikroskopisch bestimmt. Die Proben der homogenen Zellsuspension wurden in Trypanblau verdünnt (1:2; 1:5 und 1:10 Verdünnungen). Der Farbstoff Trypanblau kann durch die permeabilisierte Membran toter Zellen eindringen, wodurch diese Zel- len blau gefärbt werden und gut von den lebenden Zellen unterschieden werden kön- nen. Für die Zellzahlbestimmung wurden alle Zellen innerhalb der vier Großquadrate, 45 Material & Methoden die sich jeweils in 16 kleinere unterteilen, gezählt. Zellen, die auf den Rändern dieser Kleinquadrate lagen, wurden halb gezählt. Mit Hilfe der folgenden Formel wurde die Lebendgesamtzellzahl (LGZZ) ermittelt: Zellzahl/ml = Anzahl der gezählten Zellen in allen Großquadraten (x) / Anzahl der Großquadrate (4) x Verdünnungsfaktor (x) x Kammerfaktor (104) x Volumen (x ml) 3.2.3 Isolation muriner Knochenmark Vorläuferzellen Die Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen wurden aus isolierten Knochenmarks- zellen der Tibien und Femuren von Mäusen gewonnen. Es wurde das ursprünglich von Scheier et al. [187] publizierte und nach Lutz et al. [188] modifizierte Verfahren ange- wandt. Die 6-14 Wochen alten Tiere wurden durch zervikale Dislokation getötet und die Femuren und Tibien beider Hinterbeine steril heraus präpariert. Mit einem in 70%i- ges Ethanol getränkten Papiertuch wurden Muskelreste vom Knochen entfernt, letz- tere anschließend kurz in 70%igem Ethanol desinfiziert und in kaltem Waschmedium (s. Tabelle 6) aufbewahrt. Um das Knochenmark zu isolieren, wurden die Gelenkköpfe mit einer Schere an beiden Seiten abgeschnitten und das Knochenmark mit 1 ml kalter Waschlösung mit Hilfe einer 0,5 mm Kanüle bei den Tibien bzw. einer 0,7 mm Kanüle bei den Femuren und einer dazugehörigen 1 ml Spritze aus dem Knochen in eine frische Petrischale gespült. Durch mehrmaliges Aufziehen in die Spritze wurden die Zellen vereinzelt. Die Zellsuspension wurde anschließend über ein 40 µm Zellsieb in ein 50 ml Gefäß überführt und für 10 Minuten bei 4°C und 300xg zentrifugiert. An- schließend wurde der Überstand dekantiert und das Zellsediment aufgebrochen. Um die in der Zellsuspension enthaltenen Erythrozyten zu lysieren, wurde 1 ml Gey‘scher Lyse-Puffer (s. Tabelle 4) pro präpariertem Maus-Äquivalent (Knochenmarkszellen aus zwei Tibien und Femuren) zu den Zellen gegeben und für eine Minute unter Schwenken bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zugabe von 40 ml kalten Waschme- diums wurde die Lyse gestoppt. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert (10 min, 4°C, 300xg) und anschließend zwei Mal mit je 20 ml kaltem Waschmedium gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen in 5 ml Testmedium (s. Tabelle 6) je Maus-Äquivalent aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. 46 Material & Methoden 3.2.3.1 Kultivierung und Differenzierung von Knochenmarkszellen zu BM-DC und BM-Mf Knochenmarkszellen, die als Vorläuferzellen-Quelle genutzt und nicht weiter differen- ziert wurden, konnten mit 1x106 Zellen/ml in 24-Loch Gewebekulturplatten oder im 96- Loch Format mit 0,5x106 Zellen/100 µl ausgesät werden. Zur Differenzierung frisch gewonnener muriner Vorläuferzellen zu BM-DC (bone marrow derived dendritic cells) wurden 0,5x106 Zellen in einem Volumen von 2,5 ml BM-DC-Kulturmedium (s. Tabelle 6) in unbeschichtete 6-Loch Gewebekulturplatten ausgesät, alternativ 2x106 Zellen in einem Volumen von 10 ml in bakteriologischen Petrischalen eingesät. Für BM-Mf (bone marrow derived macrophages) Differenzie- rung wurden 3x106 Zellen in einem Volumen von 10 ml in bakteriologischen Petrischa- len eingesät. Die Kultivierung der Zellen erfolgte über 7-9 Tage im Brutschrank bei 37°C und 10% CO2 gesättigter Wasserdampfatmosphäre. An Tag 3 und Tag 6 wurden die Zellen durch Zugabe von 5 ml BM-DC- und/oder BM-Mf-Kulturmedium (s. Tabelle 6) pro Petrischale bzw. 0,5 ml BM-DC-Kulturmedium pro Loch einer 6-Loch Gewebe- kulturplatte gefüttert. Zur Ausreifung immaturer Zellen wurden die nicht adhärenten Zellen der Kultur an Tag 7-9 durch sanftes Spülen mit einer 10 ml Glaspipette geerntet und in ein 50 ml Rektionsgefäß überführt. Die Zellsuspension wurde für 8-10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) und 300xg zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellsediment in frischem, vorgewärmtem Kulturmedium (s. Tabelle 6) resus- pendiert. Anschließend wurde die Zellzahl bestimmt. 47 Material & Methoden 3.2.4 Isolation muriner PBMC aus dem Blut Die PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) sind mononukleäre Zellen, die im peripheren Blut zu finden sind. Die Blutentnahme erfolgte retro-orbital. Dazu wurden Mäuse für wenige Sekunden mit CO2 begast und mit einer Glaskapillare wurde der Venenkomplex hinter dem Auge von der Innenseite des Auges her angestochen und wenige Tropfen Blut gesammelt. Um daraus das Serum zu gewinnen wurde das Blut in 1,1 ml Micro-Z-Gel-Röhrchen aufgenommen, diese bei 10000xg bei RT zentrifugiert und das Serum (flüssiger Überstand über dem Gel) abgenommen und bei -20°C gela- gert. Aus derselben Maus wurden fünf Tropfen Blut in 1 ml EDTA-Puffer (vorgelegt in 1,5 ml Eppis bei RT) aufgefangen und sofort durch Invertieren vermischt. Die Blutpro- ben wurden mit RT warmen 3 ml Waschmedium (s. Tabelle 6) verdünnt und vorsichtig auf 4 ml Lymphozyten-Separationsmedium (s. Tabelle 4) der Dichte 1,077 beschichtet. Des Weiteren erfolgt eine Dichtegradientzentrifugation bei RT mit 1300xg für 20 min ohne Bremse. PBMC, die sich in der Interphase des Gradienten (milchig) befanden wurden vorsichtig mit einer Pasteurpipette abgenommen und in 7,5 ml, 4°C kaltes Waschmedium (vorgelegt in 15 ml Gefäß) überführt und für 10 min bei 4°C mit 400xg abzentrifugiert, um die Proben zu waschen [189]. Nach der Zentrifugation wurden die PBMC für Analysen wie Durchflusszytometrie und Viabilitäts-Assay verwendet. 3.2.5 Präparation von Milzzellen Die Tötung der Mäuse erfolgte mittels zervikaler Dislokation. Vor der Entnahme der Milz wurde die Maus auf ihre rechte Seite gelegt, das Fell mit 70%igem Ethanol des- infiziert und die Maus anschließend mit sterilisiertem Präparierbesteck im Abdominal- bereich longitudinal aufgeschnitten. Nach Öffnung der Bauchdecke wurde die Milz ent- nommen und in einem 50 ml Gefäß, welches mit 5 ml eiskaltem Waschmedium (s. Tabelle 6) gefüllt war, bis zur Verwendung aufbewahrt. Für den Organaufschluss wur- den die Milzen unter sterilen Bedingungen über einem Zellsieb (Porengröße 40 µm) mit dem Stempel einer 1 ml Spritze komplett zerrieben und die Milzzellen im 50 ml 48 Material & Methoden Gefäß aufgenommen. Mit 10 ml 4°C kaltem Waschmedium wurde anschließend Stem- pel und Zellsieb durchgespült. Danach wurde die Zellsuspension für zehn Minuten bei 300xg und 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellsediment durch An- schnicken aufgebrochen. Die anschließende Erythrozytenlyse der Zellsuspension er- folgte durch Zugabe von 1 ml Gey‘schem Lyse-Puffer (s. Tabelle 4) pro Milz und wurde nach einer Minute bei RT durch Zugabe von 30 ml gekühltem Waschmedium abge- stoppt. Es folgten zwei weitere Zentrifugationsschritte (7 min, 4°C, 300xg) mit je 10 ml Waschmedium pro Milz. Anschließend wurde die Zellzahl bestimmt. 3.2.5.1 Isolierung von T-Lymphozyten über Nylonwolle-Säulen Die Aufreinigung der T-Zellen aus einer Milzzellsuspension erfolgte über Nylonwolle- Säulen. Zur Herstellung dieser Nylonwolle-Säulen wurden 0,6 g Nylonwolle pro Säule abgewogen und mit Hilfe von zwei Hakenpinzetten von Knötchen befreit. Die fein ge- zupfte, lockere Nylonwolle wurde anschließend in eine 10 ml Spritze ohne Kolben überführt und diese in ein 50 ml Reaktionsgefäß gegeben und autoklaviert. Da T-Zellen im Vergleich zu Leukozyten, DCs und Makrophagen keine Adhärenz an Nylonwolle aufweisen, können sie hierdurch effizient aus einer heterogenen Milzzellsuspension isoliert werden [190]. Für die Aufreinigung der T-Lymphozyten wurden die Nylonwolle-Säulen zunächst äquilibriert. Dazu wurden jeweils 20 ml Waschmedium auf jede Säule gegeben, mit einer sterilisierten Pinzette vorhandene Luftblasen herausgedrückt und dabei das Vo- lumen der Nylonwolle auf ca. 6 ml reduziert. Die Säulen wurden in verschlossenen 50 ml Reaktionsgefäßen für 45 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert, in neue 50 ml Reaktionsgefäße überführt und mit frischen 20 ml vorgewärmten Waschmedium ge- spült. Die präparierten Milzzellen (siehe Kapitel 3.2.5) wurden vorsichtig mittig auf die Säulen getropft. Pro Säule wurden Zellen von maximal zwei Milzen aufgereinigt. Des Weiteren erfolgte die Zugabe von je 1 ml warmem Waschmedium, um die Zellen nicht austrocknen zu lassen. Außerdem können somit alle Zellen in die Nylonwolle einsi- ckern. Die beladenen Säulen wurden dann für 45 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach der Inkubation konnten die T-Lymphozyten eluiert werden. Dazu wurde jede Nylonwolle-Säule auf eine 0,7 x 30 mm Kanüle gesteckt, die durch einen mit 49 Material & Methoden 70%igem Alkohol desinfizierten Deckel eines frischen 50 ml Reaktionsgefäßes gesto- chen wurde. Anschließend wurden die Zellen mit insgesamt 20 ml warmem Wasch- medium eluiert, indem die Nylonwolle-Säulen mit 5 ml Aliquoten beladen und durch Drehen des Deckels auf eine Durchflussgeschwindigkeit von ungefähr einem Tropfen pro Sekunde eingestellt wurden. Nach der Elution wurde ein neuer Deckel auf das Reaktionsgefäß aufgesetzt und es erfolgte die Sedimentierung der Zellen für zehn Mi- nuten bei 4°C und 300xg. Der Überstand wurde ab dekantiert, das Zellpellet in war- mem, GM-CSF freiem Kulturmedium resuspendiert und die Zellzahl bestimmt. Die T- Zellen wurden auf eine Konzentration von 1x106 Zellen/ml eingestellt. 3.2.5.2 Isolierung von T-Lymphozyten durch MACS Mit Hilfe von MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) ist es möglich aus einem hete- rogenen Zellgemisch bestimmte Zellpopulationen zu isolieren. Dazu werden die Zellen mit spezifischen magnetischen Antikörper (MicroBeads) markiert, die dann beim Pas- sieren der Matrix der MACS-Säulen im Magnetfeld des MACS Separators zurückge- halten und somit von den unmarkierten Zellen getrennt werden. Die Aufreinigung kann mit zwei unterschiedlichen Verfahren durchgeführt werden. Es können in einem hete- rogenen Zellgemisch gezielte Zellpopulation durch die MicroBeads markiert und iso- liert werden, dies wird als Positiv-Selektion bezeichnet. Um Voraktivierungen an Ziel- zellen zu vermeiden, verwendet man die Negativ-Selektion bei der alle anderen Zell- populationen über Microbeads abgefangen werden und nur die gewünscht unmar- kierte Zielpopulation im Durchfluss gewonnen wird. Für unsere Fragestellung in meiner Arbeit wurden naive T-Zellpopulationen benötigt, daher wurde die Negativ-Selektion für die magnetische T-Zell Separation gewählt. Für die T-Zell-Aufreinigung wurden präparierte Milzzellen (s. 3.2.5) verwendet, die nach Bestimmung der Zellzahl in zwei gleiche Teile halbiert wurden. Während der eine Teil für die CD4+ T-Zell Separation und der andere Teil für die CD8+ T-Zell Separation verwendet wurde. In beiden Fällen wurde ein T-Cell Isolations Kit (s. Tabelle 7) ver- wendet, welches ein Cocktail an monoklonalen Antikörpern enthält die gegen CD11b, CD11c, CD19, B220, CD49b, CD105, Anti-MHC-II, Ter-119, TCRg/d und CD8a oder 50 Material & Methoden CD4 gerichtet waren. Mittels Manual MACS® Separator und MACS LS Säulen erfolgte die Isolation in allen Arbeitsschritten nach Angaben des Herstellers. 3.2.6 Stimulation der Immunzellen Durch die Stimulierung wurden die Immunzellen in vitro maturiert. Das ist notwendig um das intrinsische Potenzial der Immunantwort und der damit produzierende und se- zernierende Zytokinmuster, der jeweiligen Immunzellen zu provozieren. Abhängig von der benötigten Menge der Zellen, wurden Knochenmarkszellen, Milzzel- len sowie immature BM-DC und BM-Mf geerntet und im 6-, 12-, 24- bzw. 96-Loch Format stimuliert. Zur Ausreifung wurden die Zellkulturen mit zwei Stimulanzien (Lipo- polysaccharid (LPS) & Tumornekrosefaktor-a (TNF-a)) in optimaler (100 & 20 ng/ml) und suboptimaler Konzentration (10 & 5 ng/ml) stimuliert, und für weitere 1, 3, 6 und 24 Stunden im Brutschrank bei 37°C und 10 % CO2 inkubiert. T-Zellen, die entweder über MACS oder Nylonwolle isoliert wurden, wurden in 24-Loch aber auch im 96-Loch Format kultiviert und polyklonal stimuliert. Dazu wurden unbe- schichtete Gewebekulturplatten verwendet, die vorher mit 5 µg/ml anti-CD3 Antikörper (s. Tabelle 3) beladen wurden und für mindestens zwei Stunden bei 37°C inkubierten. Vor Zugabe der Zellen wurde der überschüssige, nicht an dem Plattenboden adhä- rierte Antikörper abgenommen und zweimal mit 100 µl sterilem PBS leicht ausgewa- schen. Anschließend wurden die T-Zellen mit 1x106 Zellen/ml ausgesät und den Ko- stimulus anti-CD28 (s. Tabelle 3) in einer Konzertration von 2µg/ml dazugegeben. Diese T-Zellen inkubierten für 90 Stunden im Brutschrank bei 37°C und 10 % CO2. Spezifische T-Zellpopulationen (CD4+ und CD8+ T-Zellen), die über MACS aufgerei- nigt wurden, wurden in weiteren Untersuchungen ebenfalls zur Zeitkinetik-Studien her- angezogen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten (1, 3, 6, 24, 48, 72 Stunden) po- lyklonal stimuliert. 51 Material & Methoden 3.2.7 T-Lymphozyten Proliferationsassay Durch den Einbau von Tritium-markiertem Thymidin (3HTdR) in die DNA der sich tei- lenden Zellen kann deren Proliferation bestimmt werden. Dabei steht die resultierende Radioaktivität der Probe in direkter Relation zur Anzahl der proliferierten Zellen. Für diesen Versuch wurden die isolierten T-Zellen wie unter Kapitel 3.2.5.1 und 3.2.5.2 beschrieben im Testmedium auf eine Zellzahl von 5x105 Zellen/ml eingestellt und mit 5x104/100 µl als höchste Konzentration im 96-Loch Format ausgesät. Die polyklonal stimulierten T-Zellen (s. 3.2.6) wurden in Triplikatansätzen über drei Stufen in einer 96-well-Flachboden-Platte seriell 1:2 (je 100 µl) verdünnt. Die anfängliche Zellzahl be- trug dabei pro Loch 5x104 Zellen/100 µl. Ein weiteres Triplikat wurde nur mit T-Zellen angelegt, um deren basale Proliferation im unstimulierten Zustand zu messen. Alle in 96-Loch-Platten durchgeführten Proliferationen wurden für 72 Stunden bei 37°C und 10 % CO2 im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden in jede Vertiefung 0,5 µCi 3HTdR zugegeben und die Platten für weitere 16-18 Stunden inkubiert. Nur sich replizierende T-Zellen bauen das Methyl-(3H)-Thymidin in ihre DNA ein. Zum Beenden der Proliferation wurden die Platten bei -20°C eingefroren oder direkt geerntet (s. 3.2.7.1). 3.2.7.1 Messung der zellulären 3HTdR-Radioaktivität Mit Hilfe eines Zellerntegerätes (s. Tabelle 1) wurden die Zellen aus den 96-Loch-Plat- ten mittels destillierten Wassers auf eine Glasfaser-Filtermembran transferiert. Dabei werden die Zellen lysiert und die DNA wird an der Filtermembran festgehalten. Über- schüssiges 3HTdR und mögliche Zellreste wurden durch Ausspülen mit destilliertem Wasser entfernt. Die DNA auf der Filtermembran wurde anschließend in der Mikro- welle immobilisiert und mit 10 ml Szintillationsflüssigkeit in einer Plastikfolie einge- schweißt. Die in der DNA gebundene Radioaktivität wurde als emittierende β-Strah- lung im Szintillationszähler als „counts per minute“ (cpm) quantifiziert. 52 Material & Methoden 3.2.8 Untersuchung der Zellvitalität mittels MTT-Assays Der MTT-Assay diente zur Untersuchung der metabolischen Aktivität zwischen Im- munzellen von KSPR -/- (KO) und KSRP+/+ (WT) Tieren. Das als MTT bezeichnete Tetrazoliumsalz (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl- Tetrazoliumbromid) ist ein gelber, wasserlöslicher Farbstoff, der von vitalen Zellen durch Dehydrogenasen zum blauen Formazan reduziert wird [191]. Somit kann die Substanz nur von vitalen Zellen verstoffwechselt werden und den Farbwechsel her- vorrufen. Der Zellvitalitätstest wurde in 96-well-Gewebekulturplatten mit 2,5x105 BM- DC, BM-Mf und Milzzellen und bei Messungen mit Vorläuferzellen aus dem Knochen- mark mit 5x105 Zellen in 100 µl Kulturmedium pro Loch angesetzt, wobei jeweils Vier- fachansätze durchgeführt wurden. Die Immunzellen wurden 24 Stunden vor dem MMT-Assay ausgesät, damit sie am Boden der Gewebekulturplatten adhärieren konn- ten. Als negative Kontrolle dienten unbehandelte Zellen und für die Positivkontrolle wurde Wasserstoffperoxid verwendet. Nach 24 Stunden Inkubationszeit mit den Sub- stanzen erfolgte die Nachweisreaktion. Die eingesetzten Konzentrationen betrugen: DMSO: 1 %, 2%, 3%, 5% und 10%; SNAP: 100 µM, 250 µM, 500 µM; Ionomycin: 100 nM, 250 nM, 500 nM; LPS: 100ng/ml; Die Durchführung des MTT-Assays erfolgte mit dem CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Technical Bulletin Kit von Promega. Gearbeitet wurde nach dem Protokoll des Herstellers. Die Quantifizierung erfolgte mit dem Dynex MRX TC Revelation Microplate Reader. Die Daten wurden mittels Microsoft Office Excel 2010 ausgewertet. 53 Material & Methoden 3.2.9 Transwell Migrations-Assay Mit dem Migrations-Assay soll die Motilität von BM-Mf und neutrophilen Zellen in vitro quantifiziert werden. Es kam zur Verwendung von Transwell-Filtern mit einer Poren- größe von 5 µm für 24-Loch-Kulturplatten. Für die Untersuchung der Makrophagen Migration wurde in Triplikaten gearbeitet und in die Vertiefungen von 24-Loch-Platten jeweils 600 µl Mf-Medium vorgelegt, sowie zusätzlich 100 ng/ml Monocyte Chemotac- tic Protein-1 (MCP-1) dazu gegeben. Um die basale Migration ohne Einfluss des spe- zifischen Lockstoffs zu analysieren, wurde jeweils ein Duplikat ohne MCP-1 angelegt. Zu allen Vertiefungen wurden die Transwell-Filter eingesetzt und die 9 Tage alten Mak- rophagen (s. 3.2.3) in einer Konzentration von 5x106 Zellen in einem Volumen von 100 µl zugegeben. Für die Analysen des Migrationsverhaltens von neutrophilen Zellen wurde als Immunzell-Quelle das Knochenmark verwendet. Diese Zellen wurden in glei- cher Konzentration (5x106 Zellen/100µl) im Testmedium gehalten und mit 250 ng/ml Keratinocyte chemoattractant (KC) stimuliert. Für beide Immunzell-Populationen er- folgte die Migration für 4 Stunden bei 37°C und 10 % CO2 im Brutschrank. Anschlie- ßend wurden die Zellen auf der Oberseite zusammen mit dem Transwell-Filter entfernt und die migrierten Zellen in der Vertiefung geerntet und am selben Tag mittels fluores- zenzbasierter Durchflusszytometrie analysiert. 3.3 Fluoreszenz-basierte Methoden 3.3.1 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting/Scanning) Zellen exprimieren Proteine, deren Nachweis zur Identifizierung des Zelltyps sowie zur Feststellung ihres Aktivierungsgrades genutzt werden kann. Mittels durchflusszyto- metrischer Analysen kann die Intensität der Proteinexpression einzelner Zellen be- stimmt werden. Bei der FACS-Analyse, handelt es sich um eine Antigen-Antikörper- 54 Material & Methoden Reaktion, bei der ein antigenspezifischer Antikörper bspw. an einen Zelloberflächen- marker bindet, um das nachzuweisende Molekül zu markieren. Primäre Antikörper können entweder direkt mit einem Fluorochrom markiert sein, aber auch ohne Fluo- reszenzkopplung eingesetzt werden. Im letzteren Falle wird ein Fluoreszenzfarbstoff- markierter, sekundärer Antikörper benötigt, der an dem Primärantikörper bindet. Im Rahmen der FACS-Analyse können auch die Zellgröße und die Binnenstruktur der Zellen bestimmt werden, um damit Aussagen über den morphologischen Zustand von Zellpopulationen treffen zu können [192]. Zur Analyse werden die Zellen einer Einzelzellsuspension durch eine Kapillare ge- saugt und die Zellen einzeln sequentiell durch das fokussierte Licht von Lasern ge- lenkt. Dadurch werden die Zellen angeregt und die daraus resultierende Lichtstreuung, sowie die emittierte Fluoreszenz der Antikörper-gekoppelten Fluorophore mittels De- tektoren nachgewiesen. Abhängig von der Größe und Komplexität einer Zelle variiert die Menge des gestreuten Lichtes. Die im Vorwärtsstreulicht (forward scatter (FSC)) bestimmte Absorption des Lichtes lässt auf die Zellgröße schließen. Das im 90° Winkel zum einfallenden Lichtstrahl gestreute Licht (side scatter (SSC)) hängt von der Zell- dichte und der Granularität der Zelle ab. Im Rahmen der Doktorarbeit wurden folgende Fluoreszenzfarbstoffe verwendet: Allo- phycocyanin (APC), Fluoreszein-Isothiozyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), PE- Cychrom5 (PE-Cy5), PE-Cychrom7 (PE-Cy7), Peridinin-chlorophyll protein (PerCP), Peridinin-chlorophyll protein-Cychrom5.5 (PerCP-Cy5.5) und Pacific blue (PB). Dadurch konnten auch Mehrfachfärbungen durchgeführt werden. Die Daten wurden entweder als Dot Plot oder als Histogramm aufgetragen und mit der BD FACS DivaTM Software und der FlowJo Analysesoftware ausgewertet. 55 Material & Methoden 3.3.2 Oberflächen FACS Färbung Zur Durchführung wurden die Zellen (3.2.3, 3.2.4, 3.2.5 und 3.2.9) nach dem Ernten direkt in FACS-Röhrchen überführt (1x106-0,5x106 Zellen/Röhrchen), bei 4°C und 300xg 10 Minuten lang sedimentiert und der Überstand mittels einer Absaugvorrich- tung entfernt. Zur Absättigung der Fc-Rezeptoren wurden die Zellen mit 25 µl des 2.4G2 (2,5µg/ml in FACS-Medium) Antikörpers (s. Kapitel 3.1.8.1) pro Röhrchen für 10 min bei 4°C inkubiert. Nach dieser Inkubation erfolgte eine weitere Inkubation mit 25 µl des entsprechenden Antikörpers bzw. der Isotypkontrolle in entsprechender Ver- dünnung (s. 3.1.8.3) für 20 Minuten bei 4°C im Dunkeln. Um die Lebensfähigkeit der Immunzellen zu überprüfen wurde zusätzlich eine zweite separate Färbung der Pro- ben mit den Reagenzien Annexin V und 7-AAD durchgeführt (3.1.8.4). Während der Inkubation wurden die Proben einmal gemischt. Der überschüssige Antikörper wurde mit 1 ml FACS-Puffer ausgewaschen, erneut zentrifugiert (10 min, 4°C, 300xg), der Überstand abgesaugt und die Zellen in 350 µl 1xPBS/0,7% PFA fixiert. Bis zur Mes- sung am FACS-Gerät wurden die Proben bei 4°C im Dunkeln gelagert. 3.3.3 Quantifizierung apoptotischer und nekrotischer Zellen Während der frühen Phase des Zelltodes stülpen die Zellen Phosphatidylserin (PS), das in viablen Zellen nur in der inneren Zellmembran lokalisiert ist, an die Membranau- ßenseite. Annexin V bindet Ca2+-abhängig mit einer hohen Affinität für Phosphatidylse- rin (PS) und wird daher für den Nachweis für apoptotischer Zellen verwendet. Für die Detektion mittels FACS wurde fluorochromgekoppeltes Annexin V, verwendet [193, 194]. Mit Hilfe des Farbstoffes 7-AAD (7-Aminoactinomycin) lassen sich tote Zellen bzw. spätnekrotische Zellen färben. 7-AAD hat die Eigenschaft in die DNA von Zellen zu interkalieren. Es dringt nur in Zellen ein, die keine intakte Zellmembran besitzen und dient somit als „Vitalfarbstoff“. Auf der gleichen Weise wirkt auch Fixable Viability Dye eFluorTM 450 (FVD) als Vitalitätsfarbstoff, jedoch lassen sich die Proben mit diesem Reagenz fixieren und müssen nicht direkt wie bei Verwendung von 7-AAD innerhalb 56 Material & Methoden von 60 min gemessen werden. Die Analysen mit diesem Reagenz wurden nach dem Standardprotokoll des Herstellers durchgeführt. Alle Apoptose-/Nekrosefärbungen wurden parallel mit der extrazellulären FACS-Fär- bung (3.3.2) mit Annexin/7-AAD entsprechend der Verdünnung (3.1.8.4) durchgeführt. Nach Behandlung der unterschiedlichen Immunzell-Populationen mit den Farbstoffen wurden die Proben 15 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte die Zugabe von 300µl HBSS-Puffer (s. Tabelle 4) je Probe. Die Proben wurden möglichst im Dunkeln gehalten und bis zur Messung auf Eis gestellt. Nach Anweisungen des Herstellers wurden die Proben innerhalb von 60 Minuten gemessen. 3.3.4 Zytokinmessung mittels Cytometric Bead Array (CBA) Mit Hilfe des Cytometric Bead Array (CBA) von BDTM lassen sich mehrere Zytokine gleichzeitig in einer Probe quantifizieren. Es handelt sich um eine durchflusszytomet- rische Anwendung, bei der Partikel (Beads) mit spezifischen Antikörpern gegen be- stimmte Zytokine gekoppelt werden [195]. An diese Zytokine bindet auch ein Sekun- därantikörper, der mit dem Fluoreszenzfarbstoff Phycoerythrin (PE) markiert ist. Die Fluoreszensintensität steigt proportional mit gebundenen Zytokinmenge an; daher kann durch einen Standard auf die Zytokin-Konzentration in der Probe zurückge- schlossen werden. Die Fluoreszenzintensitäten zeigen zytokinabhängig unterschied- lich starke Fluoreszenzintensitäten bei APC und APC-Cy7. Im Dot Plot lassen sich die zu messenden Zytokine in unterschiedlichen, klar voneinander abgetrennten Bead- Populationen darstellen, da jede Bead-Art eine individuelle Kombination aus zwei Flu- oreszenzfarbstoffen in unterschiedlichen Konzentrationen besitzt. Für die Zytokinmessung wurde das CBA Flex Set der Firma BD Biosciences (s. Tabelle 7) verwendet und nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Zur Messung wur- den Überstände von isolierten Milzzellen (3.2.5), ausdifferenzierten BM-DC und BM- Mf nach 1, 3, 6 und 24 Stunden Stimulierung (3.2.6) und Überstände von polyklonal stimulierten T-Zellen (3.2.5.1 und 3.2.5.2) nach 1, 3, 6, 24, 48, 96 Stunden Inkubati- onsdauer verwendet. In den Überständen von Antigen präsentierenden Zellen wurden 57 Material & Methoden IL-1β, IL-10, IL-12, IL-6 und TNF-α nachgewiesen und in den T-Zell-Überständen IFN- γ, TNF-a, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 und IL17A. Alle Zellüberstände wurden bei -20°C eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt für die Zytokinanalyse aufgetaut. Die Messung der Proben erfolgte am FACS Canto II und LSR II der Firma BD und wurde mit Hilfe von FCAP ArrayTM Software ausgewertet. 3.4. Tierexperimentelle Methoden 3.4.1 Tierhaltung und Versuchstiere Für die verschiedenen Experimente wurden im Rahmen dieser Arbeit Mäuse mit inak- tiviertem KSRP-Gen (KSRP-/-) des Inzuchtstammes C57BL/6 verwendet. Diese wur- den anfangs aus der Arbeitsgruppe Chen bezogen, wo sie auch generiert wurden [49]. Durch Verpaarung von heterozygoten Tieren (KSRP+/-), wurde die Zucht aufrechterhal- ten und somit die Gewinnung von experimentalen KSRP-/- (KO) und KSRP+/+ (WT) Tieren garantiert. Die Versuchstiere wurden von der zentralen Versuchstiereinrichtung der Universität Mainz (TARC) bezogen und unter kontrollierten pathogenfreien Bedin- gungen in einem 12 Stunden Tag/Nacht-Rhythmus mit Wasser und Futter ad libitum gehalten. Die Tierversuche wurden vom ethischen Gremium genehmigt und nach dem deutschen Tierschutzgesetz und den Richtlinien für die Verwendung von Versuchstie- ren gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Natio- nalen Gesundheitsinstitute durchgeführt. Abhängig von dem Mäusestamm variiert auch der genetische Hintergrund dieser Mäuse, daher wurde auch der DBA/1 Mäusestamm für die Zucht verwendet. Die Mäuse auf dem DBA/1 Hintergrund exprimieren überwiegend den Haplotyp H-2q auf ihrem MHC-II Komplex. Das macht die Mäuse anfälliger für das sehr häufig genutzte und etablierte Krankheitsmodell der Kollagen induzierten Arthritis (CIA) [172, 196, 197]. Da Mäuse mit dem C57BL/6 Hintergrund einen anderen Haplotypen (H-2b) auf dem MHC-II Komplex exprimieren, kann bei ihnen kaum oder nur sehr schwer eine Kollagen induzierte Arthritis durch spezifische autoreaktive T-Zellen ausgelöst werden 58 Material & Methoden [198]. Um zu gewährleisten, dass die C57BL/6 KSRP-/- (KO) Mäuse sich effektiv mit dem autoimmunen Krankheitsmodell (CIA) induzieren lassen, wurden die KSPR+/- he- terozygoten Tieren mit dem DBA/1 Stamm verpaart. Die Rückkreuzung wurde nach dem Schema von Kikawadka et al [199] bis zur zehnten Generation durchgeführt, be- vor die Tiere für die jeweiligen Experimente herangezogen wurden. 3.4.2 Typisierung von Mäusen Damit der genetische Hintergrund von unseren Zuchttieren bestimmt werden konnte, wurden die entwöhnten Jungtiere ab der 3-4 Woche typisiert und damit gleichzeitig markiert, auf diese Weise können mehre Tiere im gleichen Käfig gehalten und unter- schieden werden. Mit einem Ohrstanzer werden die Mäuse im Käfig markiert, dazu erhält die erste Maus im Käfig eine R Markierung (1 Loch im rechten Ohr), die zweite Maus wird L (1 Loch in linkem Ohr), die dritte RL (rechts und links im Ohr jeweils ein Loch), die vierte RR (2 Löcher im rechten Ohr) und die fünfte Maus mit LL (2 Löcher im linken Ohr) markiert (siehe Abb. 1) 59 Material & Methoden A Abb. 1 Standardmuster für die Ohrloch-Nummerie- rung von Mäusen Teilabbildung A zeigt eine Original- aufnahme einer rechts markierten C57BL/6 Maus. Im Hintergrund ist das Werkzeug, der Ohrstanzer zu sehen, mit dem die Maus markiert wurde. In Teilabbildung B ist eine schematische Darstellung von Ohr- lochnungen bei Mäusen dargestellt. B R L R L RR LL Die erhaltenen Ohrstanzen, dienen weiterhin als Quelle für die Gewinnung genomi- scher DNA und werden in 0,2 ml PCR-Tubes gesammelt. Um die genomische DNA aus den Ohrstanzen zu präparieren wurde 50 µl BASE-Lösung (s. Tabelle 4) zum Tube dazugegeben und 30 min bei 95°C inkubiert und dann auf 10 °C abkühlen gelassen. Danach wurden 50 µl NEUTRALISATION-Lösung dazugegeben und das Ganze 10 sekundenlang intensiv gemischt. Die enthaltene isolierte DNA in der Lösung konnte direkt für die PCR eingesetzt werden. 3.4.3 PCR zur KSRP- Genotypisierung Die aus den Ohrstanzen gewonnene DNA wurde mittels PCR und anschließender Agarose-Gelelektrophorese auf den Genotyp hin untersucht. Die verwendeten Primer (s. Tabelle 12) und die Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 13 aufgeführt. 60 Material & Methoden Tabelle 13: Übersicht eines PCR-Ansatzes zur Genotypisierung und Reaktionsbedingungen KSRP Genotypisierung KSRP Bedingungen REDTagReady- 12,5 µl 94°C 3 min Mix 10 µM 5’ Primer 1,5 µl 35 x WT 10 µM 5’ Primer 1,5 µl 94 °C 30 sec KO 10 µM 3’ Primer 3 µl 60 °C 1 min PCR-H2O 3,5 µl 72 °C 1 min Nach der PCR wurden die kompletten Proben auf 2%igen Agarosegelen aufgetragen und bei 120 V gelelektrophoretisch nach ihrer Ladung und Größe aufgetrennt. Bei Tie- ren mit heterozygoten Hintergrund erwartet man zwei Banden mit einer Größe von 300 und 250 Basenpaare (bp) und homozygote Tiere zeigen entweder eine Bande bei 300 bp (WT) oder 250 bp (KO). 61 Material & Methoden 3.4.4 Kollagen Antikörper induzierte Arthritis (CAIA) Da C57BL/6 Mäuse mit inaktiviertem KSRP-Gen nahezu resistent gegen die klassi- sche Induktion einer Arthritis durch Kollagen Typ II sind, wurde die Kollagen-Antikör- per-induzierte Arthritis (CAIA) als ein angemessenes autoimmunes Krankheits-Maus- modell gewählt (s. Kapitel 1.6.3.2) [171, 200]. CAIA wurde in C57BL/6 Mäuse mit ei- nem Gemisch von 5 spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen Kollagen Typ II (s. Tabelle 7) induziert. Appliziert wurden 2,54 mg des monoklonalen Antikörper-Gemi- sches intravenös (i.v.) in die Schwanzvene der Tiere. Tiere, die als Kontrolle dienen sollten, wurden ebenfalls i.v. mit PBS gespritzt (s. Abb. 2). An Tag drei wurde die mit CAIA behandelte Gruppe mit 50 µg LPS behandelt („geboostet“) um die Entwicklung der Erkrankung zu unterstützen und die Kontroll-Gruppe erhielt 0,9% NaCl intraperi- toneal (i.p.) appliziert. Laut Protokoll des Herstellers sollten ab dem vierten Tag patho- logisch phänotypische Veränderung sichtbar werden, daher wurde bereits nach der LPS-Behandlung, bis zum neunten Tag, an dem die Tiere getötet wurden, täglich der Arthritisindex (s. 3.4.4.1) bestimmt. Der Krankheitsverlauf zwischen den Wildtypen (WT) und KSRP-/- (KO) Mäusen wurde verglichen und dokumentiert. 62 Material & Methoden Abb. 2: Versuchsschema zur Induktion von „Langzeit“- CAIA in KSRP-/- KO Mäuse Bei diesem CAIA-Modell (Kollagen-Antikörper induzierte Arthritis) handelt es sich um ein Mausmodell für rheumatoide Arthritis bei dem ein Gemisch von 5 monoklonalen Antikörpern verwendet wird, die gegen Kollagen Typ II gerichtet sind. Die Applikation erfolgt über i.v. Injektion der Schwanzvene, dadurch kommt es ab dem 2-4 Tag zur Entwicklung von Arthritis. Die Versuchstiere wurden in zwei verschiedene Behandlungsgruppen eingeteilt: Während den Tieren aus der 1. Gruppe an Tag 0 2,5 mg/Maus AK-Gemisch gespritzt und an Tag 3 50µg/Maus LPS („boost“) appliziert wurde, erhielt die Kontroll-Gruppe (Ctrl) statt den AK PBS und statt LPS 0,9 % NaCl. Weiterhin wurde ab dem dritten Tag bis zum Tötungstag Tag 9 der Arthritisindex von allen behandelten Tieren bestimmt. Am Versuchsende kam es zur Entnahme von Blut, Organen, Milzzellen und Pfoten, die für folgende Analysen weiter aufgearbeitet wurden. Am Ende des Experiments (Tag 9) wurde den Tieren Blut, Organe, Pfoten und Immun- zellen entnommen. Die Pfoten wurden in 4% Formalin eingelegt und für die histologi- sche Präparation an die Pathologie der Uniklinik Mainz weitergegeben. Das Blut wurde genutzt um daraus die PBMC zu isolieren und die Unterschiede der Inflammation an- hand des Zytokinmusters zu bestimmen. Organe, wie Lymphknoten, Leber und ein Teil der Milz wurden bei -80 °C weggefroren, um aus diesen Geweben in weiteren Experimenten mRNA-Expressions-Analysen durchführen zu können. Ansonsten wurde die Milz neben der T-Lymphozyten Isolierung auch für die Charakterisierung der Antigen präsentierenden Zellen (APC) genutzt. In weiteren Experimenten wurde der Versuch wiederholt und am fünften Tag beendet, mit dem Hintergrund Unterschiede auf Immunzellebenen zwischen den Genotypen be- reits vor der pathologisch, phänotypischen Ausprägung zu detektieren (s. Versuchs- aufbau Abb. 3). 63 Material & Methoden Abb. 3: Versuchsschema zur Induktion von „Kurzzeit“- CAIA in KSRP-/- KO Mäuse Bei diesem CAIA-Modell (Kollagen-Antikörper induzierte Arthritis) handelt es sich um ein Mausmodell für rheumatoide Arthritis bei dem ein Gemisch von 5 monoklonalen Antikörpern verwendet wird, die gegen Kollagen Typ II gerichtet sind. Die Applikation erfolgt über i.v. Injektion der Schwanzvene, dadurch kommt es ab dem 2-4 Tag zur Entwicklung von Arthritis. Die Versuchstiere wurden in zwei verschiedene Behandlungsgruppen eingeteilt: Während den Tieren aus der 1. Gruppe an Tag 0 2,5 mg/Maus AK-Gemisch gespritzt und an Tag 3 50µg/Maus LPS („boost“) appliziert wurde, erhielt die Kontroll-Gruppe (Ctrl) statt den AK PBS und statt LPS 0,9 % NaCl. Weiterhin wurde ab dem dritten Tag bis zum Tötungstag Tag 5 der Arthritisindex von allen behandelten Tieren bestimmt. Am Versuchsende kam es zur Entnahme von Blut, Organen, Milzzellen und Pfoten, die für folgende Analysen weiter aufgearbeitet wurden. 3.4.4.1 Bestimmung des Arthritisindex Die Schwere der Arthritis wurde optisch am Grad der Pfotenschwellung bestimmt. Wie- sen die Pfoten keine erkennbaren Schwellungen auf, erhielt die Maus einen Arthritis- index (AI) von 0. Mit Zunahme der Schwellung (wie in Tab. 14 beschrieben) im Bereich der Knöchel und Gelenke wurde der Index jeder Pfote pro Maus addiert, so dass der maximal zu erreichende AI für jedes Tier bei 16 sein konnte. Innerhalb der Versuchs- gruppen wurde der Arthritisindex durch die Bildung der Mittelwerte aller Tiere jeder Versuchsgruppe bestimmt. Die Bestimmung des AI wurde verblindet durchgeführt. 64 Material & Methoden Tabelle 14: Bestimmung des Arthritisindex Index Pfoten Merkmale Normal / 0 Keine Schwellung an Ze- hen oder Gelenken 1 Schwellung an einem Zeh Schwellung von 2 -3 Ze- 2 hen oder nur des Knö- chelbereichs Schwellung des Knöchel- 3 bereichs und des Meta- tarsus/-carpus Extensive Schwellung der 4 gesamten Pfote, einge- schränkte Beweglichkeit 65 Material & Methoden 3.4.4.2 Histologische Paraffinschnitte und Übersichtsfärbung Die histologischen Paraffinschnitte der Pfoten wurden in Kooperation mit dem Institut für Allgemeine Pathologie in der Universitätsmedizin Mainz unter Leitung der Medizin technischen Assistentin (MTA) Silke Mitschke angefertigt. Dazu wurden die Pfoten zu- erst in 4% Formalin für 24 Stunden fixiert, sowie für 3-4 Wochen in Ethylendiamintet- raessigsäure (EDTA) Lösung dehydriert und anschließend in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden mit 5 µm Dicke angefertigt und unter standardisierter Methode im Leica ST 4040 Autostainer mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Die H&E-Fär- bung ist die klassische Methode für histologische Übersichtspräparate bei der das Hä- matoxylin die Kerne und das Eosin überwiegend die interzelluläre Substanz anfärbt [201, 202]. 3.4.5 Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) Zur Induktion des klassischen tierexperimentellen Modells, der Kollagen-induzierten Arthritis (Collagen Induced Arthritis) wurden Tiere aus dem DBA/1 x C57BL/6 KSRP+/- Stamm verwendet (s. Kapitel 1.6.3.1) [200]. Die Tiere wurden in zwei Haupt- mit jeweils zwei Untergruppen eingeteilt. Den WT- und KSRP KO-Tieren aus der Kontrollgruppe wurden jeweils 50 µl PBS appliziert. Die zweite CIA-Gruppe, die ebenfalls aus WT- und KO-Tieren bestand, wurde mit 100 µg Hühner-Kollagen II (CII) immunisiert (s. Ta- belle 3). Dazu wurde eine Emulsion aus gleichen Teilen einer wässrigen CII-Lsg. (4 mg/ml in 0,05 M Essigsäure) und Complete Freund’s Adjuvant (CFA) homogenisiert, das aus einer Mineralölfraktion und hitzeinaktivierten Mykobakterien besteht. Es wurde solange unter Kühlung homogenisiert bis eine milchige Emulsion entstand. Von dieser wurden jeder Maus aus der CIA-Gruppe 50 µl im Schwanzansatz intradermal injiziert. An Tag 21 und 31 wurde die Immunisierung (boost) auf gleicher Weise wiederholt. Ab der zweiten Applikation konnten pathologische Veränderungen bei den CIA-Mäusen beobachtet werden, die wie in Kapitel 3.4.4.1 beschrieben über den AI dokumentiert wurden. 66 Material & Methoden 3.4.6 Asthma bronchiale Induktion Akutes Provokationsmodell Abb. 4: Immunisierungsschema zur Asthma Induktion Bei diesem akuten Provokationsmodell werden die behandelten Tiere an Tag 0 und Tag 7 mit 20 µg OVA/Alum i.p. immunisiert, während die Kontroll-Tiere einen PBS/Alum-Mix erhalten. Die Provokation verläuft bei beiden Gruppen gleich. Die Mäuse werden an Tag 14, 15 und 16 mit einer 1%igen OVA-Lösung für 30 min in einer Aerosol-Kammer vernebelt. An Tag 17 werden die Mäusen einer nicht-invasiven und an Tag 18 einer invasive Lungenfunktionsmessung unterzogen. Als ein weiteres murines Krankheitsmodell wurde ein klassisches allergisches Atem- wegsentzündungs-Modell, das Akute Provokationsmodell, gewählt (s. Abb. 4) [203- 205]. Die Mäuse wurden in Kontroll-(Ctrl) und Behandlungs-Gruppen (OVA) eingeteilt. An Tag 0 und 7 wurde eine Sensibilisierung gegenüber dem Modellallergen Ovalbumin (OVA) durchgeführt. Dazu wurden die Mäuse intraperitoneal mit 100 µl OVA/Alumini- umkaliumsulfatlösung-Komplex gespritzt, das einer Menge von 20 µg OVA entspricht. Eine Woche nach der letzten Sensibilisierung wurden die Tiere mit einer 1%igen OVA- Lösung für 30 Minuten in einer Aerosol-Kammer exponiert (s. Abb. 5). Diese Provoka- tion der sensibilisierten Mäuse erfolgte an drei hintereinander folgenden Tagen (Tag 14, 15 u. 16). Anschließend wurde die Lungenfunktion gemessen, dazu erfolgte die nicht-invasive Lungenfunktions-Messung (3.4.6.1.1) an Tag 17 und die invasive Mes- sung des Atemwegswiderstands (3.4.6.1.2) an Tag 18. Im Anschluss wurde die Bron- choalveolar Lavage (BAL) (s. 3.4.6.1.3) durchgeführt und die Lunge entnommen, um auftretende Entzündungsreaktionen mit Hilfe von histologischen Lungenschnitten (s. 3.4.6.1.5) analysieren zu können. 67 Material & Methoden Abb. 5: Aerosol-Kammer In dieser Aerosol-Kammer wurden bis zu fünf Tiere gleichzeitig mit einer 1%igen OVA-Lösung für 30 Minuten vernebelt. Diese OVA-Provokation wurde an drei hintereinanderfolgenden Tagen (Tag 14, 15 und 16) durchgeführt. 3.4.6.1 Lungenfunktionsmessung Der bronchoalveoläre Strömungswiderstand sowie die Atemwegsreaktivität (AR) ste- hen in direktem Zusammenhang mit Größe und Alter eines Individuums. Als Schutz- mechanismus vor zu tiefer Inhalation schädlicher Substanzen, ist die Lunge in der Lage auf einen unspezifischen Stimulus hin die Atemwege zunehmend zu verengen. Beim allergischen Asthma kommt es zu einer unphysiologisch starken Verengung der Atemwege und einem erhöhten Atemwegswiderstand, das als Atemwegshyperreakti- vität (AHR) bezeichnet wird [206, 207]. In der vorliegenden Arbeit wurde Metacholin (MCh) als unspezifisch inhalativer Stimulus verabreicht um die folgenden Auswirkun- gen auf den Strömungswiderstand mit einer nicht-invasiven und einer invasiven Lun- genfunktionsmessung zu analysieren. Diese Messungen erfolgten in Zusammenarbeit mit der Asthma Core Facility des For- schungszentrums für Immuntherapie. 68 Material & Methoden 3.4.6.1.1 Nicht-invasive Messung (Ganzkörperplethysmographie) 24 Stunden nach der letzten Aerosol-Provokation wurden die Versuchstiere für die nicht-invasive Messung in die Kammern des Ganzkörperplethysmographen der Firma BUXCOÒ gesetzt [208]. Die Kammern wurden zuvor nach Herstellerprotokoll kalib- riert. In diesen Kammern, die mit Druckmesser, Luftfeuchtigkeitsmesser, Pneumotachogra- phen und Aerosolkopf verbunden sind, konnten die Mäuse sich frei bewegen, daher wurde den Mäusen vor der eigentlichen Messung eine Ruhephase von 5 min gegeben. Anschließend wurde während der Normalatmung der Maus der Kammerdruck gemes- sen, zur Software weitergeleitet und dort als Diagramm dargestellt. Druckveränderun- gen in den Kammern, die durch Inspiration und Expiration der Versuchstiere zustande kamen, stehen in direkter Relation zum Atemwiderstand. Zu Beginn der Messung wurde die Ruheatmung der Versuchstiere für 5 min gemessen und die Werte gemittelt. Der erhaltene Wert wurde als Ruhewert (baseline) definiert. Über einen Vernebler wurde in ansteigender Dosierung (6,25; 12,5; 25 und 50 mg/ml und 7min/Dosierung) in einem ca. 3-minütigen Intervall aerolisiertes Methacholin in die Kammern eingeleitet. Nach jeder Methacholindosis erfolgte eine Pause von 7 Minuten. Die Änderung des Drucks in der Kammer bzw. die Änderung des Atemwiderstandes wurde gemessen und der Mittelwert berechnet. Aus den resultierenden Druckände- rungen, bedingt durch die Inspiration und Expiration der Tiere, errechnet sich ein di- mensionsloser Parameter, der sogenannte PenH-(pause enhanced) Wert. Dieser steigt proportional zum zunehmenden Atemwiderstand an [209]. 69 Material & Methoden Abb. 6: Darstellung von Ganzkörperplethysmographen der Firma BUXCOÒ An dem Ganzkörperplethysmographen-System befinden sich vier separate Kammern, so dass parallel 4 Mäuse gleichzeitig gemessen werden konnten. Nach der, über die Ruheatmung, definierten Erfassung der Ruhephase (baseline) wurden anstei- gende MCh-Dosen (6,25; 12; 25; 50mg/ml) in 5-minütigen Intervallen gemessen. Im Anschluss daran erfolgte eine 7-minütige Ruhepause. Die Veränderung des Atemwiderstandes der Mäuse wurde als PenH an dem mit dem System verbundenen Com- puter dargestellt. 70 Material & Methoden 3.4.6.1.2 Invasive Messung mittels BUXCO Mit dem invasiven System der Firma BUXCOÒ wurde die Atemwegshyperreaktivität an den Versuchstieren gemessen, die zuletzt vor 48 Stunden mit aerosolisiertem OVA provoziert wurden [210]. Dazu wurden die Tiere mit Pentobarbital 90 mg/kg i.p betäubt, das Fell und die Haut oberhalb des Cervix entfernt und mit zwei Pinzetten sowie einem Skalpell der Ösophagus und die Trachea freigelegt. Mit einem kleinen vertikalen Schnitt wurde die Trachea geöffnet, ein 16 mm Tubus vorsichtig eingeführt und mit einem medizinischen Faden in dieser Position fixiert. Die anästhesierten und tracheo- tomierten Tiere wurden in die Kammern eines Plethysmographen gelegt und mecha- nisch ventiliert. Beim Verschließen der Kammer wurde ein weiterer Schlauch in den Oesophagus intubiert, der mit einem Druck-Messfühler (Transducer) verbunden ist. Gemäß Protokoll wurden die Kammern vor jeder Messung kalibriert. Für die Lungen- funktionsmessung wurde zunächst die Grundreaktivität der Atemwege bestimmt, dazu wurde eine Minute lang die Baseline aufgezeichnet. Im zweiten Schritt wurden für 30 Sekunden mit der geringsten Dosis beginnend (6,25 mg/ml) eine Methacholinlösung über den Tubus direkt in die Lunge aerosolisiert und die Änderung des Atemwider- stands für 5 Minuten aufgezeichnet. Die weiteren Methacholin-Dosen (12,5; 25; und 50 mg/ml) wurden mit aufsteigender Konzentration aerosolisiert und die Schritte mehr- mals wiederholt. Die aufgezeichnete Druckdifferenz wurde mit einer speziellen Soft- ware (BioSystem XA) des Herstellers und Excel ausgewertet. Der Atemwegswider- stand wird als Resistance (RI (cm H2O x sek/ml) angegeben und die Daten als Mittel- werte (MW ± SEM) dargestellt. 71 Material & Methoden Abb. 7: Darstellung der Plethysmographen der Firma BUXCOÒ Die anästhesierten und tracheotomierten Mäuse wurden in den Kammern mechanisch ventiliert. Ein Tubus, der in den Oeso- phagus eingeführt wurde, dokumentierte die Atemaktivität, während über einen zweiten Tubus in der Lunge die MCh-Dosen (6,25; 12,5; 25 und 50 mg/ml) in aufsteigender Konzentration appliziert wurden. Durch die Veränderungen des Ein- und Aus- atemdrucks bezogen auf ein Volumen und dem Druck in der Kammer, berechnet eine spezielle Software die Atemwegsresis- tenz. 72 Material & Methoden 3.4.6.1.3 Bronchoalveolar Lavage (BAL) Um pathologische Veränderungen im bronchialen Sputum analysieren zu können, wurden mit Hilfe der Lungenspülung zelluläre und nicht zelluläre Bestandteile aus den Bronchiolen und Alveolen gewonnen. Dazu wurde die Lavage (wie von Maxeiner et al beschrieben, [211]) direkt nach der invasiven Messung durchgeführt. Es wurden 1000 µl eiskalte, physiologische Kochsalzlösung mit einer 1 ml Spritze über den bereits für die Lungenfunktionsmessung gesetzten Tubus in die Lunge injiziert und unter leichtem Massieren des Brustraumes wieder herausgezogen. Das wiedergewonnene Material wurde in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt und abzentrifugiert (10 min, 4 °C, 300xg). Der zellfreie Überstand, der sogenannte BAL-Fluid (BALF), wurde bis zum Zeitpunkt der Zytokinbestimmung bei – 20 °C gelagert. Das Zellsediment wurde aufgebrochen und die Zellen in 200 µl kaltem 1xPBS resuspendiert und bis zur Bestimmung der Zell- zahl auf Eis gelagert. Die gewonnenen Zellen wurden zur Herstellung von Zytospin- präparaten (s. K. 3.4.6.1.4) verwendet, um später die einzelnen Immunzell-Populatio- nen in der BAL näher zu charakterisieren. Nach der BAL wurde der Thorax der Mäuse geöffnet, indem Rippen lateral des Sternums durchtrennt wurden. Der rechte Lungen- flügel wurde mit einem medizinischem Faden von dem linken Lungenflügel getrennt und für weitere mRNA-Expressions-Analysen in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei – 80°C gelagert. Der linke Lungenflügel wurde über den bereits gelegten Tubus mit 4%iger Formalinlösung gefüllt und in ein 15 ml Polypropylenröhrchen, welches ebenfalls mit 3 ml 4%iger Formalinlösung befüllt war, überführt und fixiert. Diese Pro- ben wurden zur histologischen und immunhistologischen Aufbereitung an die Histolo- gie Core Facility der Universitätsmedizin Mainz übergeben. 73 Material & Methoden 3.4.6.1.4 Herstellung von Zytospinpräparaten Die aus der BAL gewonnenen Zellen wurden mit Hilfe des CASYÒ-Zellzählgerätes ausgezählt. Es wurden 100 µl je Probe für einen Spin zugegeben und die Zellen in einer Cytospinzentrifuge bei mittlerer Beschleunigung für 5 min bei 500 UpM auf einen Objektträger zentrifugiert. Die so erhaltenen Dünnschichtpräparate wurden luftgetrock- net und nach Angaben des Herstellers mit dem Diff-QuickÒ-Färbesets (s Tabelle 7) gefärbt und fixiert. Anschließend wurden die Präparate erneut luftgetrocknet und mit Hilfe von EntellanÒ (s. Tabelle 3) mit Deckgläschen eingedeckt. Nach der Färbung der Präparate erfolgte die morphologische Analyse der Immunzel- len in der BAL. Dabei unterschied man zwischen neutrophilen und eosinophilen Gra- nulozyten, Lymphozyten und alveolären Makrophagen. 3.4.6.1.5 Histologische Methoden und Färbungen Das in 4%iger Formalinlösung fixierte Lungengewebe wurde unter Leitung von Frau Claudia Braun in der histologischen Core Facility der Universitätsmedizin Mainz auf- bereitet. Die fixierten Lungenstücke wurden nach Einbettung in Paraffin mit Hilfe eines Mikrotomes in ca. 5 µm dünne Scheiben geschnitten und auf Objektträger aufgebracht, die im Standardverfahren gefärbt wurden. Als Übersichtsfärbung wurde die Hämatoxilin-Eosin-Färbung gewählt, damit man Aussagen über die Gewebestrukturen treffen kann und die dadurch sichtbaren Unter- schiede zwischen gesunden, entzündeten und pathogenen Strukturen erkennt [212]. Als weitere Färbemethode wurde die Periodic acid–Schiff reaction (PAS-Färbung) ge- wählt, da durch diese Färbung neutrale Mukopolysaccaride, Muko- und Glykoproteine, Glykolipide und Phospholipide sichtbar gemacht werden [213]. Dadurch lassen sich die schleimbildenden Becherzellen in der Lunge darstellen [214]. 74 Material & Methoden 3.4.6.1.6 Auswertung der histologischen Schnitte Die unter Kapitel 3.4.4.1 und 3.4.6.1.5 beschriebenen, histologisch gefärbten Paraffin- schnitte wurden mit Unterstützung der Gewebe-Biobank in der Pathologie in Mainz, mit Hilfe des Nano Zoomer Scanner bis auf 20-fache Vergrößerung digitalisiert. Die Auswertung und Darstellung der histologischen Schnitte erfolgte mit dem Programm NDP.view2. Die Auswertung der Hämatoxilin-Eosin-Färbung erfolgte, indem ein standardisierter inflammatorischer Index („score“) zugrunde gelegt wurde und anhand dessen der Ent- zündungsgrad der einzelnen Proben ermittelt wurde. Bei der PAS-Färbung wird die Anzahl der mukusproduzierenden Becherzellen ermit- telt. Die Anzahl der positiven Becherzellen, diese sind in der Färbung als purpurviolett Zellen sichtbar, per Atemweg (Bronchiole) wird ermittelt und prozentual zu der Ge- samtzahl der Epithelzellen der Basalmembran gesetzt. Mehrere Bronchien pro Tier und mehrere Mäuse pro Gruppe werden in einem Mittelwert zusammengefasst. 75 Ergebnisse 4. Ergebnisse 4.1 Charakterisierung von Immunzellen Aktuell ist noch nicht genau bekannt, wie vielfältig der Einfluss des RNA-BP KSRP auf die Immunzellfunktionen ist. Li et al. [47] konnte zeigen, dass in Astrozyten von Mäu- sen mit inaktiviertem KSRP-Gen die Produktion von TNF-a und IL-1b vergleichsweise höher ist, als in Wildtyp-Tieren. Ebenfalls konnte schon gezeigt werden, dass nach Stimulation von adhärente Monozyten und Makrophagen aus dem Peritoneum von KSRP-defizienten (KSRP KO) Mäusen die mRNA-Expression von TNF-a, iNOS und CXCL1 signifikant erhöht ist im Vergleich zu Wildtyp-Tieren (WT) [46, 215]. Diese so- lublen Mediatoren sind im Stande sowohl den Immunphänotyp als auch die daraus resultierenden Immunantworten zu beeinflussen. Daher sollen im Folgenden die Im- munzellen unter Berücksichtigung der Abwesenheit von KSRP genauer untersucht werden. In den folgenden FACS-Analysen wurden unterschiedliche Immunzell-Populationen aus KSRP KO Mäusen unter basalen Bedingungen untersucht und mit Immunzellen aus WT Mäusen verglichen. Ebenso wurde untersucht wie sich der Immunphänotyp und die Immunzellfrequenz der einzelnen Immunzell-Populationen nach 24 Std. LPS- Stimulation der isolierten Zellen verändert. Mit Hilfe von lineage marker (Zelltypmar- kern), die an spezifische Oberflächenantigene von Immunzellen binden, lassen sich die verschiedenen Zelltypen voneinander unterscheiden und charakterisieren [216]. Des Weiteren lassen sich mit Aktivierungsmarkern kostimulatorische Moleküle an den Immunzelloberflächen nachweisen, sodass Aussagen zum Aktivierungszustand bzw. zum Reifungszustand der Immunzellen getroffen werden können. 76 Ergebnisse 4.1.1 Immunphänotypisierung von Knochenmark-abgeleiteten Vor- läuferzellen Da die Hämatopoese im Knochenmark stattfindet und auch die Immunzellen ihren Ur- sprung aus hämatopoetischen Stammzellen haben, wurde das Knochenmark als erste Quelle für die Immunzell-Isolierung gewählt [217]. Röhrenknochen wie Beinknochen enthalten Knochenholräume aus denen sich das Knochenmark samt Vorläuferzellen leicht isolieren lässt. Ein weiterer Vorteil, neben der Generierung von BM-DC und BM- Mf, ist die hohe Frequenz an neutrophilen Granulozyten im Knochenmark. Abb. 8: Gating-Strategie für durchflusszytomet- rische Analysen von Knochenmark-abgeleite- ten Vorläuferzellen anhand einer Beispielfär- bung Zu sehen ist eine repräsentative Darstellung der Gating-Strate- gie einer Wildtyp Maus zur Identifizierung von Knochenmark- abgeleiteten Vorläuferzellen. Die Auswertung der Daten er- folgte mit FlowJo. Zuerst wurden die gesamten Lymphozyten eingegrenzt um Zellen vom Zellschrott zu separieren. Die Zellen wurden nach den angegebenen Achsen-Parametern aufge- trennt. Die eingegrenzte Population mit dem Pfeil erscheint je- weils im folgenden Diagramm. Im zweiten Schritt wurden die Dubletten „ausgegatet“, damit es nicht zur Verfälschung der Da- ten kommt. Im dritten Schritt wurden die PE-Cy7 gekoppelten CD11b+ Zellen (myeloide Zell-Oberflächenmarker) gegen die PE gekoppelten Ly6G+ Zellen (neutrophile Zell-Oberflächen- marker) aufgetrennt und mit Hilfe der Quadranten der prozentu- ale Anteil der Zellen dargestellt. 77 Ergebnisse Eine dieser hämatopoetischen Zellreihen sind die myeloischen Vorläuferzellen, aus denen sich überwiegend Immunzellen (Mastzellen, mDC, Makrophagen, und neutro- phile, eosinophile und basophile Granulozyten) differenzieren, die primär an der un- spezifischen, angeborenen Immunabwehr beteiligt sind. Im ersten Schritt sollte die Charakterisierung dieser überwiegend myeloiden Immunzellen aus dem Knochenmark stattfinden. In den danach folgenden Experimenten wurden Immunzellen aus der Pe- ripherie (Kapitel. 4.1.2 PBMC und Kapitel 4.1.3 Milz) untersucht. In Abb. 8 sieht man repräsentativ primäre FACS-Daten der Gating-Strategie, die zur Charakterisierung von Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen angewandt wurde. Im dritten und letzten Schritt der Gating-Strategie ist der prozentuale Anteil von CD11b+ und Ly6G+ Zellen (ca. 41 %) der repräsentativen Wildtyp-Maus nach 24 stün- diger Stimulation mit LPS zu erkennen (Abb. 8). Um die Veränderungen des prozentualen Anteiles der Immunzellen besser beurteilen zu können, wurden die erhalten Daten der unterschiedlichen Genotypen nebeneinan- der innerhalb der Gruppen grafisch dargestellt (Abb. 9). In Teilabbildung 9A ist zu er- kennen, dass unter basalen Bedingungen der prozentuale Anteil der neutrophilen Gra- nulozyten zwischen WT und KO-Tieren kaum einen Unterschied aufweist. Es zeigt sich eine 59 % Anteil an neutrophilen Zellen im Knochenmark von Wildtyp-Tieren, wo- bei kein Unterschied zu den KO-Tieren mit 58 % neutrophiler Zellen besteht. Nach 24- stündiger LPS Stimulation weisen die Zellen unabhängig vom Genotyp eine rund 24 % verminderte CD11b+Ly6G+ Expression im Vergleich zu unstimulierten Zellen auf. Das Expressionsniveau der Oberflächenmarker liegt hier Genotyp unspezifisch zwi- schen 43-45 % ± 10 %. In Teilabbildung 9B ist gezeigt, dass unter basalen Bedingun- gen im Knochenmark der beiden Genotypen ca. 6 % ± 1 % an myeloide Zellen nach- gewiesen wurden. Auch nach Behandlung mit LPS zeigt sich genotypisch, unspezi- fisch eine Verringerung der Immunzell-Frequenz um ca. 1 %. Auch der etwas größere Standardfehler in Teilabb. 9B trägt dazu bei, dass kein Genotyp-spezifischer Unter- schied zu erkennen ist. 78 Ergebnisse myeloide ZelBleMn-Neutrophile A WT Abb. 9: Zellfrequenz-Analysen 8 80 von Knochenmarks-abgeleite-KO ten Vorläuferzellen aus KO und WT Mäusen 6 60 In Teilabb. A ist der prozentuale Anteil der CD11b+Ly6G+ Zellen (BM-Neutro- phile) ohne Stimulus (-) und nach 24- 4 40 stündiger Inkubation mit 100 ng/ml LPS dargestellt. Teilabb. B zeigt den prozen- tualen Anteil der CD11b+Ly6G- Zellen 20 (myeloide Zellen) ohne Stimulus (-) und 2 nach 24-stündiger Inkubation mit 100 ng/ml LPS. Die Expressionen der Ober- 0 flächenmarker wurde mittels Durch-0 - myeloide ZellenLPS flusszytometrie analysiert. Die Immun-- LPS zell-Frequenzen aus KSRP+/+ (WT) Mäu- WT sen werden als weiße Balken abgebildet, B während schwarze Balken den KSRP-/- 8 KO (KO) Mäusen zuzuordnen sind. Die Da- ten repräsentieren den Mittelwert als % + SEM von 3-4 individuellen Mäusen pro 6 Gruppe und Genotyp. 4 2 0 - LPS Wie in Kapitel 3.2.3.1 beschrieben wurden die isolierten Knochenmarkzellen mit CSF zu BM-DCs und BM-Mf differenziert. Diese ausdifferenzierten Immunzellen wurden mit einer definierten Zellzahl von 5x105 Zellen pro Maus am FACS-Gerät analysiert, daher lässt sich keine Aussage über die Immunzellfrequenz zwischen den Genotypen treffen (s. Anhang: Abb. 61). Aus diesem Grund wurde bei den analysierten Immunzellen die mittlere Fluoreszenzin- tensität (MFI) zwischen den Genotypen vergleichen. Dadurch konnte bei einer knapp 100 prozentigen reinen Population dennoch die genotypische Expression der Oberflä- chenmarker CD11c (BM-DC) und F480 (BM-Mf) zwischen KSRP KO und WT-Mäusen verglichen werden. In Abb. 10 ist gezeigt, dass unter basalen Bedingungen die relative CD11c Expression in den WT-Tieren bei 1573 liegt, im Vergleich dazu liegt die MFI in KO-Tieren ohne signifikanten Unterschied bei 1377. Nach 24-stündiger Stimulation mit LPS verringert sich sowohl in WT- als auch in KO-Tieren die CD11c Expression um ca. 30% bezogen auf unstimulierte BM-DC und liegt somit bei ca. 1100. 79 CD11b+ Ly6G- Zellen [%] CD11b+ Ly6G- Zellen CD11b+ Ly6G+ Zellen [%] [%] Ergebnisse Abb. 10: Zellfrequenz-Analysen 2000 ns WT aus Knochenmark differenzier- KO ten BM-DCs in WT und KO Mäu-sen 1500 Dargestellt ist die Mittlere Fluoreszenzin- tensität (MFI) von CD11c+ (DC-Oberflä- chen-Marker) Zellen ohne Stimulus (-) und 1000 nach 24-stündiger Inkubation mit 100 ng/ml LPS. Die Analysen der Oberflächenmarke- rexpression wurden mittels Durchflusszyto- 500 metrie durchgeführt. Die MFIs von KSRP +/+ (WT) Mäusen werden als weiße Balken ab- gebildet, während schwarze Balken den KSRP-/- (KO) Mäusen zuzuordnen sind. Die 0 Daten repräsentieren den Mittelwert + SEM - LPS von 3-4 individuellen Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Statistik: ns = nicht signifi- kant; T-Test. In Abb. 11 wird der Aktivierungszustand und somit der Reifungszustand von BM-DC aus KSRP KO- und WT-Tieren verglichen. Zu sehen sind repräsentative FACS-Daten, die deutlich die höhere Intensität von Aktivierungsmarkern (CD40, CD86, CD80 und MHCII) nach Behandlung mit LPS (Stimulation) gegenüber von ungefärbten und un- stimulierten aus Knochenmark differenzierten BM-DCs erkennen lassen (Abb. 11). Abb. 11: Expression von Aktivierungsmar- kern auf BM-DC aus KSRP-defizienten und WT Mäusen Dargestellt sind primäre FACS-Daten eines repräsentativen Durchgangs von jeweils drei durchgeführten Messungen. Die Histogramme zeigen Fluoreszenzintensitäten von verwende- ten Aktivierungsmarkern CD40, CD86, CD80 und MHCII. Die grau ausgefüllte Kurve stellt die ungefärbte Kontrolle (Ctrl) dar, während die gestrichelte Line, die stimulierte und die durchgängige schwarze Line, die unstimulierte Probe darstel- len. 80 Relative CD11c Expression [MFI] Ergebnisse Betrachtet man sich den MFI-Wert der beiden Gruppen (- & LPS) (Teilabb. 12A, B, C und D) so wird deutlich, dass die Inkubation der BM-DC mit LPS eine deutliche Aufre- gulierung der Aktivierungsmarker verursacht. Das Expressionsniveau von CD40 (Teil- abb. 12A) liegt bei immaturen BM-DC Genotyp unspezifisch bei ca. 2300. Nach Sti- mulation mit LPS steigt der MFI-Wert von WT BM-DC auf 8630, ähnlich erhöht bei 9758 liegt der MFI-Wert in KO BM-DC. Ähnlich sieht es für die Expression von CD80 (Teilabb. 12B) und CD86 (Teilabb. 12C) bei unstimulierten BM-DC aus. Im ersten Fall liegt der MFI-Wert Genotyp unspezifisch bei ca. 5000 und im zweiten Fall bei ca. 7000. Nach LPS-Stimulation erhöht sich die CD80-Expression in WT BM-DC um das 3,6- fache und in KO BM-DC um das 4,2-fache, dieser Unterschied zwischen den Genoty- pen ist durch den erhöhten Standardfehler nicht signifikant. Die CD86-Expression liegt ebenfalls Genotyp-unabhängig nach LPS-Zugabe 3,3-fach höher, als im Vergleich zu unstimulierten BM-DC. Vergleicht man die Expression der kostimulatorischen Mole- küle mit der Expression des antigenpräsentierenden MHC-II-Komplex (Teilabb. 12D), so wird deutlich, dass dieser bereits unter basalen Bedingungen ein höheres Expres- sionsniveau von 11366 im WT und 10449 in KO BM-DCs aufweist. In diesem Fall be- wirkt die Inkubation mit LPS nur eine moderate Aufregulation von 29 % bei WT DCs und 24 % bei KO DCs gegenüber den unbehandelten Zellen. 81 Ergebnisse BMMA A B 15000 25000 150 WT 20000 10000 KO 15000 100 10000 5000 50 5000 0 0 - LPS - LPS 0 - LPS C 30000 D 20000 15000 20000 10000 10000 5000 0 0 - LPS - LPS Abb. 12: Expression-Analysen von Aktivierungsmarkern auf der Oberfläche von BM-DC aus KO und WT-Mäusen Dargestellt ist die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der kostimulatorischen Moleküle CD40 (A), CD80 (B), CD86 (C) und des antigenpräsentierenden MHC-II-Komplexes (D) auf der Oberfläche von unreifen (-) und reifen (LPS) BM-DC. Es werden un- behandelte (-) und 24 h mit LPS behandelte(LPS) BM-DC verglichen. Die Expression der Aktivierungsmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die MFI von KSRP+/+ (WT) Mäusen werden als weiße Balken abgebildet, während schwarze Balken den KSRP-/- (KO) Mäusen zuzuordnen sind. Die Daten repräsentieren den Mittelwert + SEM von 3-4 individuellen Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Als nächstes wurden aus dem Knochenmark differenzierte BM-Mf mit Hilfe des Ober- flächenmarkers F480 untersucht. Abb. 13 zeigt eine MFI von 43566 für die relative Expression von F480 in den WT-Tieren unter basalen Bedingungen, vergleichsweise liegt die MFI in KO Tieren bei ca. 40000. Nach 24-stündiger Stimulation mit LPS ver- ringerte sich sowohl in WT- als auch in KO-Tieren die F480 Expression um ca. 10% ± 2 % im Vergleich zu unstimulierten BM-Mf. 82 F480+ Zellen [% of parental] Relative CD86 Expression Relative CD40 Expression [MFI CD11c+ Zellen] [MFI CD11c+ Zellen] Relative MHCII Expression Relative CD80 Expression [MFI CD11c+ Zellen] [MFI CD11c+ Zellen] Ergebnisse Abb. 13: Zellfrequenz- Analy- sen aus Knochenmark diffe- WT renzierten BM-Mf in WT und 50000 KO Mäusen KO Dargestellt ist die mittlere Fluores- zenzintensität (MFI) F480+ (Mf-Oberflä- 40000 chenmarker) Zellen ohne Stimulus (-) und nach 24-stündiger Inkubation mit 100 ng/ml LPS. Die Expression der 30000 Oberflächenmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die MFI von KSRP+/+ (WT) Mäusen werden 20000 als weiße Balken abgebildet, während schwarze Balken den KSRP-/- (KO) Mäu- 10000 sen zuzuordnen sind. Die Daten reprä-sentieren den Mittelwert + SEM von 3-4 individuellen Mäusen pro Gruppe und 0 Genotyp. - LPS In Abb. 14 wird der Reifungszustand von BM-Mf aus KSRP KO- und WT-Tieren dar- gestellt. Vergleicht man die MFI-Werte von unbehandelten mit LPS-behandelten BM- Mf (Teilabb. 14A, B und C), so erkennt man eine deutliche Aufregulation der kostimu- latorischen Moleküle (CD40, CD80 u. CD86). Unbehandelte BM-Mf (Teilabb. 14A) zeigen mit einer MFI von ca. 7200 keine Unterschiede zwischen den Genotypen in der CD40-Expression. Die Behandlung mit LPS erhöht die MFI von CD40 in beiden Geno- typen auf ca. 16500. Auch das Expressionsniveau von CD80 unterscheidet sich unter basalen Bedingungen nicht zwischen den Genotypen und liegt bei ca. 1250 (Teilabb. 14B). Nach 24-stündiger LPS-Behandlung kommt es zur Erhöhung der CD80-Expres- sion mit einem MFI-Wert von 16933 in WT-Mf und 15466 in KO-Mf . Ähnlich zeigt der Aktivierungsmarker CD86 keinen Unterschied in der Expression zwischen unbehan- delten KO und WT BM-Mf (Teilabb. 14C). Die MFI für CD86-Expression liegt bei sti- mulierten WT BM-Mf bei 31333 und 28300 bei KO BM-Mf. Der MHC-II-Komplex zeigt bei immaturen BM-Mf Genotyp-unspezifisch ein höheres Expressionsniveau von ca. 6700. Die Inkubation mit LPS verringert die Expression des MHC-II-Komplexes um ca. 20 % in beiden Genotypen im Vergleich zu unbehandelten Makrophagen. 83 Relative F480 Expression [MFI] Ergebnisse BMMA A B 25000 20000 150 20000 WT KO 15000 100 15000 10000 10000 50 50005000 0 0 0 - LPS - LPS - LPS C D 40000 8000 30000 6000 20000 4000 10000 2000 0 0 - LPS - LPS Abb. 14: Expression-Analysen von Aktivierungsmarkern auf der Oberfläche von BM-Mf aus KO und WT-Mäusen Dargestellt ist die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der kostimulatorischen Moleküle CD40 (A), CD80 (B), CD86 (C) und des antigenpräsentierenden MHC-II-Komplexes (D) auf der Oberfläche von unreifen (-) und reifen (LPS) BM- Mf. Es werden un- behandelte (-) und 24 h mit LPS behandelte (LPS) BM- Mf verglichen. Die Expression der Aktivierungsmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die MFI von KSRP+/+ (WT) Mäusen werden als weiße Balken abgebildet, während schwarze Balken den KSRP-/- (KO) Mäusen zuzuordnen sind. Die Daten repräsentieren den Mittelwert + SEM von 3-4 individuellen Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Nach der Hämatopoese wandern die ausdifferenzierten Zellen aus dem Knochenmark in die Peripherie, daher wurden weitere Immunzellpopulation einerseits im Blut (Kapitel 4.1.2) und in der Milz (Kapitel 4.1.3) untersucht [218, 219]. 84 F480+ Zellen [% of parental] Relative CD86 Expression Relative CD40 Expression [MFI F480+ Zellen] [MFI F480+ Zellen] Relative MHCII Expression Relative CD80 Expression [MFI F480+ Zellen] [MFI F480+ Zellen] Ergebnisse 4.1.2 Immunphänotypisierung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes Als eine weitere Immunzell-Quelle wurde das periphere Blut von KSRP-KO und WT Mäusen untersucht. In dem peripheren Blut sind mononukleäre Zellen, die sogenann- ten PBMC (peripheral blood mononuclear cells) enthalten, darunter zählen Lymphozy- ten, Monozyten und Dendritische Zellen. Ähnlich wie im humanen Blut verteilt, variie- ren diese Immunzell-Population im murinen Blut abhängig von Geschlecht, Stamm und unterschiedlichen weiteren Faktoren [220-222]. Allgemein erwartet man in PBMC zwi- schen 70-80 % Lymphozyten, bestehend aus 50-70 % T-Zellen, 10-20 % B-Zellen und 10-20 % Natürliche Killer Zellen (NK-Zellen), 10-20 % Monozyten und 1-2 % DCs. Wie in Kapitel 3.2.4 beschrieben, wurden die PBMC isoliert und anschließend deren Iden- tität mittels Durchflusszytometrie bestimmt, indem die Immunzell-Frequenz zwischen den Genotypen analysiert wurde. In Abb. 15 sieht man repräsentativ primäre FACS-Daten von myeloiden Zellen aus Blutproben von jeweils einer WT und KSRP KO Maus, die mit der Software FlowJo ausgewertet wurden. In der KO Maus ist ein deutlich geringerer prozentualer Anteil an CD11b+ (myeloide Oberflächenmarker) (ca. 10 %) sowie auch an Ly6G+ (neutrophile Oberflächenmarker) Zellen (ca. 5 %) im Vergleich zur WT Maus zu sehen (Abb. 15). 85 Ergebnisse A Abb. 15: Analyse myeloi- der Zellen aus PBMC mit- tels Durchflusszyometrie Dargestellt sind primäre FACS- Daten von repräsentativen Blut- proben aus jeweils einer WT und KO Maus von insgesamt 6-15 durchgeführten Messungen. In Teilabb. A sind fluoreszenz-ge- koppelte CD11b+ und in Teilabb. B Ly6G+ Zellen gegen FSC-A aufge- trennt, man erkennt den prozentu- alen Anteil einer aus WT (links) und KO Maus (rechts) eingegrenz- ten CD11b bzw. Ly6G Population. Die Auswertung der Daten erfolgte mit FlowJo [241]. . B In Teilabb. 16A ist gezeigt, dass isolierte und unbehandelte PBMC aus KSRP-defizi- enten Mäusen eine hoch-signifikant verringerte Frequenz an CD11b+ Zellen aufweisen im Vergleich zu WT Mäusen. Nach der festgestellten Frequenzabnahme von CD11b positiven Zellen wurde im kleineren Umfang geschaut, ob diese Zellen zu den neutro- philen Granulozyten gehören. Daher wurde mit Ly6G gefärbt und auch diese Popula- tion verringerte sich signifikant im peripheren Blut von KSPR-defizienten Mäusen. 86 Ergebnisse A 1.5 Abb. 16: Quantifizierung myeloider *** Zellen aus PBMC von WT und KO Mäusen Dargestellt ist der prozentuale Anteil von 1.0 CD11b + (myeloide Zell-Oberflächenmarker) Zellen in Teilabb. A und von Ly6G+ (neutrophile Zell-Oberflächenmarker) Zellen in Teilabb. B aus dem peripheren Blut von WT und KO Mäu- 0.5 sen. Die jeweiligen Daten wurden auf die Ex-pression in WT PBMC normiert. Die Expression des Oberflächenmarkers wurde mittels Durch- flusszytometrie analysiert. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert gebildet 0.0 und + Standardfehler von jeweils 6-15 individu- WT KO ellen Mäusen pro Genotyp bestimmt. Statistik: ***p < 0,001; T-Test [241]. B 1.5 *** 1.0 0.5 0.0 WT KO Abb. 17 zeigt weitere Frequenz-Analysen von Lymphozyten aus dem peripheren Blut von WT und KSRP KO Mäusen. Die normierten Daten in Teilabb. 17A zeigen, dass im Blut von KSRP-defizienten Mäusen die B-Zell Frequenz vergleichbar mit den B-Zellen in WT Mäusen ist. Auch in Teilabb. 17B erkennt man, dass es keinen Genotyp-spezi- fischen Unterschied in der allgemeinen T-Zell Verteilung gibt. In einem etwas kleine- rem Umfang mit vier Tieren pro Genotyp wurde auch nochmal spezifischer nach den größeren TZ-Subpopulationen geschaut. In Teilabb. 17C wird die Frequenz von CD3+CD4+ und in Teilabb 17D von CD3+CD8+ doppelt positiven T-Zellen verglichen. In beiden Fällen ist kein Unterschied zwischen den Genotypen zu erkennen, jedoch variiert das Verhältnis der TZ-Subpopulation zueinander deutlich. Von den gesamten analysierten T-Zellen aus dem Blut exprimieren ca. 60 % CD4 und nur ca. 25 % CD8 auf ihrer Oberfläche. 87 Ly6G+ Zellen CD11b+ Zellen [x-fach WT] [x-fach WT] Ergebnisse A B 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 WT KO WT KO C D 80 30 60 20 40 10 20 0 0 WT KO WT KO Abb. 17: Quantifizierung von B- und T-Zellen aus PBMC von WT und KO Mäusen Dargestellt ist der prozentuale Anteil von CD19+ (B-Zell-Oberflächenmarker) Zellen in Teilabb. A und von CD3+ (T-Zell-Ober- flächenmarker) Zellen (Teilabb. B) aus dem peripheren Blut von WT und KO Mäusen, normiert auf die Expression in WT PBMC. Teilabb. C zeigt den prozentualen Anteil der CD4+ und Teilabb. D der CD8+ TZ-Subpopulation. Die Expression der Oberflächenmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert und + Standard- fehler von Messungen aus jeweils 6-15 individuellen Mäusen pro Genotyp. Weitere Immunzellpopulationen wie Makrophagen und DCs waren in einer zu gering Menge im Blut vorhanden und konnten daher nicht quantifiziert werden. 88 CD4+ Zellen CD19+ Zellen [% der CD3+ Zellen] [x-fach WT] CD8+ Zellen CD3+ Zellen [% der CD3+ Zellen] [x-fach WT] Ergebnisse 4.1.3 Immunphänotypisierung von Milzzellen Die murine Milz ist anatomisch und funktionell vergleichbar mit der humanen Milz [223]. Als größtes Organ des lymphatischen Systems filtert die Milz effektiv das Blut nach möglichen pathogenen Erregern, ebenso trägt sie zur Entwicklung und Produk- tion von maturierten Immunzellen bei [224-226]. Diese befinden sich überwiegend in der weißen Pulpa und sind wie folgt verteilt: ~60 % B-Zellen, ~20 %T-Zellen und die weiteren ~ 20 % sind Monozyten, Makrophagen und DCs. A Abb. 18: Bestimmung von B-Zell und DC-Populatio- nen in der murinen Milz Dargestellt sind primäre FACS- Daten von einer repräsentativen WT und KO Maus von jeweils 25- 31 durchgeführten Messungen. In Teilabb. A sind Fluoreszenz-ge- koppelte CD11c+ (DC Oberflä- chenmarker) und in Teilabb. B CD19+ Zellen (B-Zell Oberflächen- marker) gegen CD11b (myeloide Oberflächenmarker) aufgetrennt. Der prozentuale Anteil aus WT (links) und KO Maus (rechts) wird mit Hilfe von Quadranten darge- stellt. Die Auswertung der Daten erfolgte mit FlowJo. B 89 Ergebnisse In Abb. 18 sieht man primäre FACS-Daten von Milzzellen aus jeweils einer WT und KSRP KO Maus repräsentativ für 25-31 durchgeführte Messungen, die mit der Soft- ware FlowJo ausgewertet wurden. Zu sehen ist ein deutlich höherer prozentualer An- teil an CD11b-CD19+ (B-Zell-Oberflächenmarker) Zellen in der KO Maus gegenüber der WT Maus. Auch der prozentuale Anteil an CD11b+CD11c+ (DC-Oberflächenmar- ker) Zellen ist in der KO Maus gegenüber der WT Maus erhöht (Abb. 18). In der auf den WT bezogenen quantitativen Auswertung wurden unterschiedliche Milz- zellpopulationen ex vivo untersucht (s. Abb. 19), die ohne (-) oder 24 Std. mit Stimulus (LPS) inkubiert wurden. Die Frequenz von immaturen und maturierten myeloiden Milz- zellen zeigt keine Unterschiede zwischen den beiden Genotypen (Teilabb. 19A). Auch die Makrophagen-Population zeigt unabhängig von der Stimulierung keine unter- schiedliche Verteilung in der Milz. Teilabb. 19C zeigt eine signifikant höhere Frequenz plasmazytoide DC in unstimulierten KO Milzzellen im Vergleich zu unstimulierten WT Milzzellen. Deutlicher wird der genotypische Unterschied nach 24-stündiger Stimula- tion mit LPS. Vergleichsweise zeigen myeloide DC eine nicht signifikant, moderat er- höhte Frequenz in unbehandelten KO Milzzellen gegenüber den WT Milzzellen (Teil- abb. 19D), nach 24-stündiger Stimulation mit LPS ist der beschriebene Unterschied nicht mehr zu sehen. Unbehandelte B-Zellen, die CD19 ohne CD11b auf ihrer Ober- fläche exprimieren, zeigen in KO Milzzellen keine Veränderung ihrer Frequenz gegen- über wildtypischen Milzzellen (Teilabb. 19E). Nur reife B-Zellen weisen eine signifikant höhere Anzahl in KO Milzzellen im Vergleich zu wildtypischen Milzzellen auf. Eine wei- tere B-Zell-Population in der Milz, die zusammen mit CD19 auch CD11b Moleküle auf ihrer Oberfläche exprimiert, zeigt mit und ohne Stimulation keine signifikanten Fre- quenz-Unterschiede zwischen den beiden Genotypen (Teilabb. 19F). 90 ErgebnisBsMeM A 150 A B 1.5 WT 1.5 KO 100 1.0 1.0 50 0.5 0.5 0 - LPS 0.0 0.0 - LPS - LPS C D 1.5 * ** 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 - LPS - LPS E F 1.5 1.5 ** 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 - LPS - LPS Abb. 19: Quantifizierung Milzzell-Populationen von WT und KO Mäusen Dargestellt ist der prozentuale Anteil von CD11b+CD68- (myeloide Zellen) (A), CD11b+CD68+ (Makrophagen) (B), CD11b- CD11c+ (pDCs) (C), CD11b+CD11c+ (mDCs) (D), CD11b-CD19+ (BZ) (E) und CD11b+CD19- (BZ) (F) aus der Milz von WT und KO Mäusen. Die Daten sind in der jeweiligen Gruppe auf die Expression in WT Milzzellen normiert. In den jeweiligen Diagram- men sind links (-) die unstimulierten und rechts (LPS) die 24 Stunden mit LPS (100ng/ml) behandelten Milzzellen dargestellt. Die Expression dieser Oberflächenmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert gebildet und + Standardfehler von jeweils 25-31 Mäusen pro Gruppe und Genotyp bestimmt. Statistik: *p < 0,05; **p < 0,01; T-Test. 91 F480+ Zellen [% of parental] CD11b- CD19+ Zellen CD11b- CD11c+ Zellen CD11b+ CD68- Zellen [x-fach WT] [x-fach WT] [x-fach WT] CD11b+ CD19+ Zellen CD11b+ CD11c+ Zellen CD11b+ CD68+ Zellen [x-fach WT] [x-fach WT] [x-fach WT] Ergebnisse In Abb. 20 sind primäre FACS-Daten von unstimulierten und mit LPS stimulierten Milz- zellen zu sehen. Gezeigt ist eine höhere Fluoreszenzintensität des kostimulatorischen Moleküls CD86 auf LPS-stimulierten KO Milzzellen, gegenüber Milzzellen aus WT Mäusen. Eine Darstellung der Gating-Strategie befindet sich im Anhang (Abb. 64). Abb. 20: Repräsentative FACS-Analysen des kostimulatorischen Molekül CD86 auf Milzzellen Dargestellt ist die Expression von CD86 auf unstimulierte und für 24 h mit LPS (100 ng/ml) stimulierten Milzzellen als primäre FACS-Daten eines repräsentativen Durchgangs von jeweils 20-25 individuellen Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Die Histo- gramme zeigen die Fluoreszenzintensität des kostimulatorischen Molekül CD86 aus KO und WT Milzzellen gegenüber einer ungefärbten Probe. Die grau ausgefüllte Kurve stellt die ungefärbte Kontrolle (Ctrl) dar, während die rote Line die KO und die schwarze Line die WT Probe darstellt. Die Auswertung dieser Daten erfolgte mit FlowJo. Um diese Tendenz näher zu untersuchen, wurden die erhaltenen Daten quantifiziert und sind in Abb. 21 dargestellt. Diese Abb. 21 zeigt sehr deutlich, dass die LPS-Sti- mulation bei allen untersuchten Milzzellpopulationen zu einer höheren CD86-Expres- sion geführt hat und dient somit als Nachweis über den Aktivierungszustand dieser Zellen. Während die CD86-Expression bei unbehandelten Milzzellen von WT und KO Tieren niedrig ist, steigt die Expression des Aktivierungsmarkers nach Stimulation mit LPS um fast das Zweifache an gegenüber den unstimulierten Proben. Die myeloide Zellen aus KO Tieren zeigen nach LPS-Stimulation ein mit 37 % signifikant höheres Expressionslevel im Vergleich zu myeloiden Zellen aus WT Tieren (Teilabb. 21A). CD11c+ Zellen zeigen nach LPS-Stimulation in KO Tieren eine Aufregulation des Ak- tivierungsmarkers um das 2,4-fache gegenüber den unbehandelten Zellen (Teilabb. 21B). Ähnlich mit einem 2,1-fach höherem CD86-Expressionslevel verhalten sich die stimulierten CD11c+ Zellen aus den WT Tieren im Vergleich zu unbehandelten Zellen. In Teilabb. 21C sieht man ebenfalls, dass LPS behandelte B-Zellen aus KO Tieren 92 Ergebnisse eine ca. 34 % höhere CD86-Expression aufweisen im Vergleich zu stimulierten B-Zel- len aus WT Tieren. Die Teilabb. 21D zeigt für stimulierte Makrophagen eine ähnliche Genotyp-spezifische Veränderung der CD86-Expression, hier beträgt die Expressions- zunahme in KO Tieren ca. 20 % mehr gegenüber den Makrophagen aus WT Tieren. A CD11b+ Zellen B CD11c+ Zellen * ns 2.5 3 2.0 2 1.5 1.0 1 0.5 0.0 0 - LPS - LPS C CD19+ Zellen D CD68+ Zellen ns ns 3 3 2 2 1 1 0 0 - LPS - LPS Abb. 21: Analysen zum Reifungszustand von Milzzellen aus WT und KO Mäusen Dargestellt ist die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) des kostimulatorischen Moleküls CD86 auf CD11b+(A), CD11c+ (B), CD19+ (C) und CD68+(D) unstimulierten (-) und 24 Stunden mit 100 ng/ml LPS stimulierten (LPS) Milzzellen. Die Daten sind normiert auf die CD86-Expression in unbehandelten WT Milzzellen. In den jeweiligen Diagrammen sind links (-) die unstimu- lierten und rechts (LPS) die 24 Stunden mit LPS behandelten Milzzellen dargestellt. Die Expression dieser Aktivierungsmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert gebildet und + Stan- dardfehler von jeweils 20-25 individuellen Mäusen pro Gruppe und Genotyp bestimmt. Statistik: ns = nicht signifikant; *p < 0,05; T-Test. 93 Relative CD86 Expression Relative CD86 Expression [MFI x-fach WT] [MFI x-fach WT] Relative CD86 Expression Relative CD86 Expression [MFI x-fach WT] [MFI x-fach WT] Ergebnisse Immunzellen, die aus dem Knochenmark von KSRP-defizienten Mäusen analysiert wurden, zeigen keine signifikanten, immunphänotypischen Unterschiede im Vergleich zu WT. In dem Blut von KO Mäusen konnte eine signifikant geringere Frequenz an myeloiden CD11+ Zellen bzw. an neutrophilen Granulozyten nachgewiesen werden. Weitere signifikante Unterschiede konnten mit stimulierten Milzzellen gezeigt werden, sowohl pDCs (CD11b-CD11b+) als auch BZ (CD11b-CD19+) sind in einer signifikant höheren Frequenz in den Milzen von KO Mäusen vorhanden. Die LPS-Stimulation be- wirkt weiterhin eine tendenziell stärkere Expression des Aktivierungsmarkers CD86 auf den prominenten Immunzellpopulationen in der Milz von KSRP-defizienten Mäu- sen. Die T-Zellen zählen ebenfalls zu der Haupt-Zellpopulation in der Milz, die Analy- sen dazu werden in einem separaten Kapitel 4.5 zusammengefasst. Im nächsten/fol- genden Kapitel soll geklärt werden, ob die gerade beschriebenen Unterschiede vom Immunphänotyp auf eine differenzielle Viabilität der Zellen zurückzuführen ist. 94 Ergebnisse 4.2 Viabilität von Immunzellen Einige Unterschiede in der Immunzell-Frequenz von KSRP-defizienten Mäusen konn- ten bereits in den vorherigen Untersuchungen beobachtet werden. Diese Veränderun- gen könnten unterschiedliche Gründe haben. Eine nahliegende Frage, die in diesem Kontext untersucht werden soll ist, ob KSRP mit der Viabilität der Zellen interferiert. Daher soll in den folgenden Experimenten geklärt werden, ob die zelluläre Apoptose- und Nekroserate zwischen den Genotypen variiert. Dazu wurde die Viabilität der un- terschiedlichen Immunzellpopulationen unter basalen Bedingungen und nach 24-stün- diger Inkubation mit Stimulanzien wie TNF-a und LPS untersucht. Beide Substanzen haben Einfluss auf diverse immunregulatorische Funktionen, sind aber auch durch ihre Beteiligung an unterschiedlichen Signaltransduktionsprozessen in der Lage proapoptotische Effekte zu begünstigen [227-232]. Frühapoptotische Zellen lassen sich durch Annexin V nachweisen, wohingegen Zellen, die durch FVD (fixable viability dye) oder 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) angefärbt werden, als nekrotisch bezeichnet werden. In der frühen Phase des Zelltodes kommt es zum Transfer von Phosphatidylserin (PS), einen Zellmembranbestandteil, von der Innenseite der Zellmembran zur Membranaußenseite. Annexin V bindet Ca2+abhängig an Phospholipid-Proteine mit einer hohen Affinität für PS und wird daher als Nachweis für apoptotische Zellen verwendet [193, 194]. Tote und spätnekrotische Zellen lassen sich dagegen mit den „Vitalfarbstoffen“ FVD und 7-AAD färben. Diese Reagenzien dringen in Zellen, die keine intakte Zellmembran besitzen, ein und interkalieren in die DNA dieser Zellen [233]. 95 Ergebnisse 4.2.1 Quantifizierung von apoptotischen Knochenmarkszellen In Abb. 22 sind primäre FACS-Viabilitäts-Analysen von einer repräsentativen Messung dargestellt. In den Diagrammen sind die nekrotischen Knochenmarkszellen (y-Achse) gegen frühapoptotische Zellen (x-Achse) aufgetragen. Mit Hilfe der eingeteilten Quad- ranten lassen sich Aussagen über den prozentualen Anteil der positiv gefärbten Kno- chenmarkszellen treffen, wobei jeweils im ersten Quadraten lebende Zellen dargestellt werden. In der folgenden Abb. 23 wurde die Gesamt-Frequenz von Annexin V mit den unterschiedlichen Bedingungen zwischen den Genotypen quantitativ ausgewertet. Abb. 22: Repräsentative FACS-Analysen der Viabilität von Knochenmark-abgeleiteten Vorläu- ferzellen Dargestellt sind primäre FACS-Daten von Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen aus WT und KO Mäusen unter basalen Bedingungen (Ctrl) und nach 24-stündiger Behandlung mit (20ng/ml) TNF-a und (100ng/ml) LPS. Die Detektion von FVD (fixable viability dye), sowie Annexin V erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Hierbei sind die lebenden Zellen im ersten Quad- ranten (Q8) dargestellt. Zu sehen ist ein repräsentativer Durchgang von drei durchgeführten Messungen. Die Auswertung dieser Daten erfolgte mit FlowJo. 96 Ergebnisse Teilabb. 23A zeigt die prozentuale Apoptoserate der Gesamtvorläuferzellen, welche aus Knochenmark von WT und KSRP KO Mäusen isoliert wurden. Die Vorläuferzellen aus WT und KO Tieren zeigen bereits ohne Behandlung eine Apoptoserate von ca. 30 %. TNF-a bewirkt eine minimale Zunahme der apoptotischen Zellen um 4 % in Kno- chenmarkszellen von WT und um 8 % in Knochenmarkszellen von KO Mäusen. Etwas höher mit einem größeren Standardfehler liegt die Apoptoserate nach LPS-Behand- lung Genotyp-unspezifisch bei ca. 45 %. Die Teilabb. 23B zeigt, dass unter basalen Bedingungen in dem gesamten Knochenmark aus WT und KO Tieren ca. 10 % der myeloiden CD11b+ Zellen Annexin V positiv sind und somit apoptotisch. TNF-a erhöht die Frequenz von Annexin V in myeloiden WT Zellen um ca. 3 %, mit 4 % Erhöhung ist somit die Apoptoserate in myeloiden KO Zellen ähnlich. Auch hier zeigt LPS einen etwas stärken apoptotischen Effekt mit 10 % höheren Frequenz in WT und 7 % höher Frequenz von Annexin V gegenüber den unbehandelten Kontrollen. In Teilabb. 23C wurde die Apoptoserate von neutrophilen Granulozyten im Knochenmark analysiert. Entsprechend der Viabilität von myeloiden Zellen sind die Ergebnisse auch hier Geno- typ-unspezifisch. 97 Ergebnisse Vorläuferzellen Abb. 23: Quantifizierung der Viabilitäts- A Analysen in Knochenmarks-abgeleiteten WT KO Vorläuferzellen 60 In den Diagrammen sind apoptotische Knochenmarkszel-len aus KO und WT Mäusen unter basalen Bedingungen (Ctrl) und nach 24-stündige Inkubation mit TNF-a (20 ng/ml) und LPS (100ng/ml) dargestellt. Während Teilabb. 40 A die Viabilitätsrate von den gesamt isolierten Vorläufer-zellen zeigt, sind in Abb. B alle myeloide Zellen und in Abb. C spezifisch die neutrophilen Granulozyten darge- stellt. Die Detektion von Annexin V wurde mittels Durch- 20 flusszytometrie analysiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standardfehler von jeweils drei individuellen Mäusen pro Gruppe und Genotyp. 0 Ctrl TNFα LPS Ctrl TNFα LPS B C CD11b+ Zellen Ly6G+ Zellen WT KO WT KO 25 30 20 20 15 10 10 5 0 Ctrl TNFα LPS Ctrl TNFα LPS 0 Ctrl TNFα LPS Ctrl TNFα LPS 4.2.2 Quantifizierung apoptotischer Milzzellen In Abb. 24 sind primäre FACS-Viabilitäts-Analysen von einer repräsentativen Messung dargestellt, die Daten sind vergleichbar mit Abb. 22 (s. Anhang Abb. 63) Aus Teilabbildung 24A wird ersichtlich, dass unbehandelte Milzzellen aus WT Tieren mit 44 % eine vergleichbare Apoptoserate aufweisen, wie Milzzellen aus KSRP KO Tieren. Der Einfluss von Stimulanzien bewirkt in Milzzellen eine Verringerung der apoptotischen Zellen. Die Annexin V Frequenz in den Milzzellen von WT Tieren sinkt um 3 % nach Inkubation mit TNF-a und um 18 % nach LPS-Zugabe, ähnlich verringert sich die Apoptoserate um 8 % nach Inkubation mit TNF-a und um 20 % nach Behand- lung mit LPS in Milzzellen von KO Tieren gegenüber den entsprechenden unbehan- delten Kontrollen. Bei unbehandelten WT CD19+ B-Zellen liegt die Apoptoserate bei 98 Apoptotische Zellen Apoptotische Zellen [%] [%] Apoptotische Zellen [%] Ergebnisse 64 %, verglichen mit KO CD19+ B-Zellen ist dort die Apoptoserate mit 55 % geringer. Mit 2 % geringerem Anteil an apoptotischen Zellen in WT B-Zellen und 4 % in KO B- Zellen bewirkt TNF-a nur minimale Veränderungen gegenüber unbehandelten Proben (Teilabb. 24B). LPS-Zugabe bewirkt eine deutlichere Abnahme von apoptotischen Zel- len um 22 % in WT B-Zellen und 15 % in KO B-Zellen gegenüber den unbehandelten Kontrollen. A Milzzellen Abb. 24: Quantifizierung der Vi-abilitäts-Analysen von Milzzel- WT KO len In den Diagrammen sind apoptotische Milz- 60 zellen aus KO und WT Mäusen unter basa- len Bedingungen (Ctrl) und nach 24-stündi- ger Inkubation mit TNF-a (20 ng/ml) und LPS (100 ng/ml) dargestellt. Während Teil- abb. A die Viabilitätsrate von den gesamten 40 isolierten Milzzellen zeigt, sind in Abb. B spezifisch B-Zellen dargestellt. TNF-a wurde mit 20 und LPS 100 ng/ml einge- setzt. Die Detektion von Annexin V wurde 20 mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standardfehler von jeweils drei individuel- len Mäusen pro Gruppe und Genotyp. 0 Ctrl TNFα LPS Ctrl TNFα LPS B CD19+ Zellen WT KO 80 60 40 20 0 Ctrl TNFα LPS Ctrl TNFα LPS 99 Apoptotische Zellen Apoptotische Zellen [%] [%] Ergebnisse 4.2.3 Quantifizierung apoptotischer PBMC Die primären FACS-Daten der Lebend/tot-Färbung myeloider PBMC zeigen eine deut- lich höhere Frequenz an lebenden Zellpopulationen im Vergleich zu Zellpopulationen aus Milz oder Knochenmark (Abb. 25). Bei diesen repräsentativen Messungen sieht man bereits im ersten Quadranten von Kontroll-KO-Mäusen ein um ca. 12 % verrin- gerten Anteil an lebenden CD11b+ Zellen gegenüber dem WT. Während in den vorhe- rigen Analysen der überwiegende Anteil an toten Zellen als FVD und Annexin V dop- peltpositiv dokumentiert wurde, überwiegen in diesen Messungen prozentual die früh- apoptotischen (FVD-AnnexinV+) Zellen. Die Apoptoserate steigt in myeloiden Zellen von unbehandelten KSRP-KO Mäusen aber auch in Mäusen, denen 20 mg/kg LPS appliziert wurde, um etwa das doppelte an im Vergleich zu Mäusen ohne KSRP KO. Abb. 25: Repräsentative Vitabili- tätsmessung myeloider Zellen aus dem peripheren Blut Dargestellt sind primäre FACS-Daten von myeloiden CD11b+ Zellen aus unbehandel- ten KO und WT Mäusen (Ctrl), sowie aus Mäusen, die für 6 Stunden mit 20 mg/kg LPS i.p. gespritzt wurden. Die Detektion von FVD (fixable viability dye), sowie von Annexin V erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Hierbei sind die lebenden Zellen im ersten Quadran- ten (Q4) dargestellt. Zu sehen ist ein reprä- sentativer Durchgang von jeweils 7-10 unter- suchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Die Auswertung dieser Daten erfolgte mit FlowJo [241]. 100 Ergebnisse Die quantifizierten Viabilitätsdaten sind normiert auf die unterschiedlichen Messungen der jeweiligen unbehandelten WT Kontrolle (Ctrl), wodurch die Genotyp-spezifische Veränderung verdeutlicht wird. Vergleicht man die Apoptoserate der Gesamt-PBMC aus unbehandelten Mäusen, so verringert sich die Frequenz von Annexin V positiver Zellen in KO Mäusen signifikant um ca. 33 % (Teilabb 26A). Mäuse, denen für 6 Stun- den LPS appliziert wurde, zeigen ebenfalls eine geringere Frequenz an Annexin V positiven Zellen, in WT PBMC sinkt die Apoptoserate um 62 %, ähnlich wie in PBMC aus KO Mäusen mit 66 % gegenüber den WT Kontrollen. Betrachtet man die B-Zellen aus dem peripheren Blut, ist lediglich eine moderate Verringerung der Annexin V Fre- quenz in WT Mäusen, die mit LPS behandelt wurden, zu beobachten. Andere Gruppen zeigen keine Viabilitäts-Veränderungen von peripheren B-Zellen im Vergleich zu Kon- troll-WT Mäusen. Der deutlichste Unterschied ist zwischen CD11b+ myeloiden Zellen zu erkennen (Teilabb. 26C). Übereinstimmend mit primären FACS-Analysen, lässt sich in unbehandelten KO Mäusen eine ca. 2,5-fach höhere Frequenz an apoptoti- schen myeloiden Zellen messen, im Vergleich zu unbehandelten WT Mäusen. Die Apoptoserate von myeloiden WT Zellen in LPS-behandelten Mäusen erreicht zwar ebenfalls einen 1,44-fachen höheren Wert, jedoch ist die Frequenz an apoptotischen myeloiden Zellen in KO Tieren ca. 2,9-fach höher als bei den WT Kontrollen. Diese Genotyp-spezifischen Unterschiede sind statistisch signifikant. 101 Ergebnisse A PBMC Abb. 26: Quantifizierung der Via-bilitäts-Analysen von PBMC WT In den Diagrammen sind apoptotische PBMC KO (A), B-Zellen (B) und myeloide Zellen (C) aus 400 unbehandelten KO und WT Mäusen (Ctrl), sowie aus Mäusen, die für 6 Stunden mit 20 mg/kg LPS i.p. gespritzt wurden, dargestellt. 300 Die Detektion von Annexin V erfolgte mittels ns Durchflusszytometrie und wurde auf die Ex- pression in unbehandelten WT PBMC nor- * ns miert. Aus den jeweiligen Normierungen 200 wurde der Mittelwert gebildet und ± Standard- fehler von jeweils 7-10 individuellen Mäusen pro Gruppe und Genotyp bestimmt. Statistik: 100 ns = nicht signifikant *p < 0,05; ***p < 0,001; One-way ANOVA. 0 Ctrl LPS Ctrl LPS B CD19+ Zellen WT KO 400 300 200 100 0 Ctrl LPS Ctrl LPS C CD11b+ Zellen WT KO **** 400 **** ns 300 200 100 0 Ctrl LPS Ctrl LPS 102 Apoptotische Zellen Apoptotische Zellen Apoptotische Zellen [% von WT Ctrl] [% von WT Ctrl] [% von WT Ctrl] Ergebnisse Um zu überprüfen, ob es sich bei den myeloiden CD11b+ Zellen um neutrophile Gra- nulozyten handelt, wurde in einem kleineren Umfang mit vier Tieren pro Genotyp die Apoptoserate von Ly6G+ Zellen bestimmt. Anders als bei der Gesamtpopulation an CD11b+ Zellen verringert sich die Apoptoserate von unbehandelten KO Mäusen um 19 % im Vergleich zum WT. LPS-behandelte Mäuse zeigen Genotyp-unspezifisch eine ca. 30-prozentige (± 3%) Frequenz an apoptotischen Zellen. + Abb. 27: Quantifizierung der Via-Ly6G Zellen bilitäts-Analysen von PBMC WT KO In den Diagrammen sind apoptotische Ly6G + Zellen aus unbehandelten KO und WT Mäu- 50 sen (Ctrl), sowie aus Mäusen, die für 6 Stun-den mit 20 mg/kg LPS i.p. gespritzt wurden, * dargestellt. Die Detektion von Annexin V 40 wurde mittels Durchflusszytometrie analy- siert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert und ± Standardfehler von jeweils drei individu- 30 ellen Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Sta- tistik: *p < 0,05; T-Test. 20 10 0 Ctrl LPS Ctrl LPS Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Viabilität von den gesamten myeloiden Zellen aus dem Blut von KSRP-defizienten Mäusen stark eingeschränkt ist (Abb. 27). Neutrophile Granulozyten zeigen zwar im Blut eine geringere Frequenz der Zellpopulation (Abb. 16), aber keine erhöhte Sterblichkeit (Abb. 27). Daher wurde nach weiteren funktionellen Parametern analysiert und im nachfolgenden Kapitel 4.3 die Migrationsfähigkeit untersucht. Für diejenigen Immunzell-Populationen, für die keine Unterschiede in der Frequenz und in der Viabilität nachgewiesen werden konnten, gibt es auch keine Unterschiede in der metabolischen Aktivität (Anhang: Abb. 65-68). 103 Apoptotische Zellen [%] Ergebnisse 4.3 Migrationsfähigkeit von Immunzellen Mit den vorherigen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass neutrophile Granulozy- ten zwar mit einer geringeren Zell-Frequenz im Blut vorkommen, jedoch nicht verstärkt apoptotisch/nekrotisch sind. Als eine mögliche Ursache könnte eine gestörte Migrati- onsfähigkeit, die Einfluss auf das Auswandern dieser Zellen in die Peripherie nimmt, in Betracht gezogen werden. Die Motilität bzw. die Migration von Immunzellen lässt sich durch sogenannte „Lock- stoffe“ (Chemokine) steuern. Daher können bspw. Immunzellen am Entzündungsherd über Sekretion spezifischer Chemokine gezielt benötigte Immunzellen rekrutieren [234]. In Vorversuchen wurden die optimalen Bedingungen für die Migrations-Assays etab- liert. Daher wurden die nachfolgenden Versuche mit 5x105 Zellen pro 24-Loch-Platte und mit Transwell-Einsätzen mit einer Porengröße von 5 µm durchgeführt. Abb. 28 zeigt repräsentative FACS-Daten der Migration Ly6G+ Knochenmarkszellen aus KSRP-defizienten und WT Mäusen. Die neutrophilen Granulozyten aus WT Mäu- sen zeigen ohne die Anwesenheit des Chemokins eine Migration von ca. 10 % der ursprünglich eingesetzten 5x105 Knochenmarkszellen. Neutrophile Granulozyten aus KO Mäusen zeigen eine vergleichbare Migration von ca. 15 %. In Anwesenheit des KC-Chemokins (s. Kapitel 3.2.9) steigt die Migration in WT Ly6G+ Zellen auf ca. 40 %, Zellen aus KO Mäusen zeigen dagegen mit ca. 68 % die höchste Migrationsrate. 104 Ergebnisse Abb. 28: Repräsentative Ana- lysen der Migration neutrophi- ler Granulozyten aus dem Knochenmark Dargestellt sind primäre FACS-Daten von Ly6G+ (neutrophile Oberflächenmar- ker) Oberflachen) Knochenmarkszellen, die ex vivo im Transwell-System ohne (Ctrl) und mit Chemokin (KC) migriert sind. Die Migration wurde über einen Zeitraum von 4 h analysiert. Die rot ein- gegrenzte Population entspricht dem prozentualen Anteil der migrierten Ly6G+ Zellen von einer repräsentativen WT und KO Maus. Die Messung und Auswertung dieser Daten erfolgte am BD AcuriiTM C6. Die Quantifizierung der Daten von jeweils sechs durchgeführten Messungen ergab eine statistisch signifikante höhere Migrationsrate von KSRP-defizienten neutrophilen Granulozyten im Vergleich zu den WT Granulozyten. Die basale Migrationsrate von neutrophilen Zellen aus WT Mäusen liegt Genotyp-unspezifisch bei 10 % (± 3 %). In Anwesenheit von KC steigt die Migration von WT Neutrophilen auf 44 % und in neutro- philen Zellen von KO Mäusen mit einem signifikanten Unterschied auf 56 %. BMMA 150 80 Abb. 29: Quantitative Analysen WT der Migration von neutrophilen KO * Granulozyten aus dem Kno- 100 60 chenmark Zusehen ist der prozentuale Anteil von Ly6G+ (neutrophile Oberflächenmarker) 40 Knochenmarkszellen aus WT und KO 50 Mäusen, die ex vivo im Transwell-System ohne (Ctrl) und mit Chemokin (KC) mig- riert sind. Die Detektion von Ly6G+ Zellen 20 wurde mittels Durchflusszytometrie analy- 0 siert. Die Daten repräsentieren den Mittel- - LPS wert und + Standardfehler von jeweils 0 sechs untersuchten Mäusen pro Gruppe Ctrl KC Ctrl KC und Genotyp. Statistik: *p < 0,05; T-Test. 105 F480+ Zellen [% of parental] Migrierte Ly6G+ Zellen [%] Ergebnisse Parallel zu den neutrophilen Granulozyten wurde eine Vergleichspopulation mitgeführt (Abb. 30). Dazu wurden Knochenmarkszellen über neun Tage zu Makrophagen diffe- renziert (s. Kapitel 3.2.3.1). Makrophagen zeigen unter basalen Bedingungen Geno- typ-unspezifisch eine etwas höhere Migration von 26 % im Vergleich zu neutrophilen Granulozyten. Unter Einfluss von MCP-1 (s. Kapitel 3.2.9) steigt die Motilität von WT BM-Mf um ca. 25 %, vergleichbar ähnlich steigt auch die Makrophagen Migration aus KO Mäusen. 60 Abb. 30: Quantitative Analyse der Migration von BM-Mf Zusehen ist der prozentuale Anteil von BM- Mf aus WT und KO Mäusen, die ex vivo im 40 Transwell-System ohne (Ctrl) und mit Che-mokin (MCP1) migriert sind. Die Detektion von Makrophagen wurde mittels Durch- flusszytometrie analysiert. Die Daten reprä- sentieren den Mittelwert und + Standard- 20 fehler von jeweils vier untersuchten Mäu- sen pro Gruppe und Genotyp. 0 Ctrl MCP1 Ctrl MCP1 Die Ergebnisse zeigen eine leicht verbesserte Motilität und Chemotaxis von neutrophi- len Granulozyten aus KSRP-defizienten Mäusen im Vergleich zu Kontroll-Zellen. Es lässt sich daraus schlussfolgern, dass die Granulozyten keinen Defekt in der Migration aufweisen. 106 Migrierte Makrophagen [%] Ergebnisse 4.4 Zytokinproduktion von LPS-stimulierten Antigen präsentieren- den Zellen Aus eigenen Vorarbeiten und Daten aus der Literatur ist bekannt, dass KSRP durch die Bindung an die ARE-Sequenzen in der 3’-UTR der mRNAs von pro-inflammatori- schen Proteinen wie IL-6, IL-8, iNOS und TNF-a deren mRNA-Abbau begünstigt [29, 32, 35, 45, 46]. Eine weitere Publikation [49] zeigt, dass KSRP-defiziente Mäuse durch höhere IFN-a und -b Level besser gegen Virus-Infektionen geschützt sind, da auch hier KSRP über mRNA-Stabilität die genannten Interferone reguliert. Dadurch wird der regulatorische Einfluss von KSRP auf die pro-inflammatorische Ge- nexpression deutlich. Genauere Untersuchungen zum Zytokin-Expressionsmuster von unterschiedlichen Immunzellpopulationen sollen in dieser Arbeit die zentrale Rolle von KSRP bei der pro-inflammatorischen Immunzellregulation spezifizieren. Allgemein wird angenommen, dass Zytokine regulierende Funktionen im Wachstum und der Dif- ferenzierung von Zellen einnehmen [235, 236]. Einen ebenso großen Einfluss haben Zytokine auf die Aktivierung und Steuerung unseres Immunsystems. Somit ist deren Einfluss in der Immunzellregulation unvermeidlich. In den folgenden Experimenten sollte der Einfluss von KSRP auf die Zytokinexpression einzelner Immunzellpopulationen analysiert werden. Dazu wurden in Vorversuchen Zeit-Kinetikstudien durchgeführt, bei denen Immunzellen mit sub- und optimaler Dosis an TNF-a und LPS behandelt wurden und die sezernierenden Zytokine im Zellüber- stand nach 1, 3, 6 und 24 Stunden gesammelt und analysiert wurden. Damit sollte nicht nur der idealste Zeitpunkt, sondern auch die passende Konzentration des Stimu- lus für die Zytokinproduktion bestimmt werden. Dabei konnte ermittelt werden, dass sich die TNF-a Stimulation mit sub- und optimaler Dosis für die Zytokinproduktion nicht eignete (Daten nicht gezeigt). Die verwendete LPS Konzentration von 100 ng/ml zeigte dabei den stärksten stimulierenden Effekt und wurde daher in folgenden Experimenten verwendet. 107 Ergebnisse 4.4.1 Zytokinmuster-Analysen von Milzzellen Milzzellen (siehe Kapitel 3.2.5 und 3.2.6) wurden mit 100 ng/ml LPS (optimale Dosis) stimuliert, die dadurch produzierten Zytokine wurden aus dem Zellüberstand gesam- melt und mit Hilfe des CBA Flex Set der Firma BD Biosciences analysiert. A B 50 WT ns 300 KO 40 200 30 20 100 10 0 0 1 3 6 24 1 3 6 24 Stunden Stunden C D 25 100 20 80 * 15 60 10 40 5 20 0 0 1 3 6 24 1 3 6 24 Stunden Stunden Abb. 31: Zeitkinetik der Zytokinproduktion von Milzzellen aus KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Produktion von IFN-g (A), TNF-a (B), IL-10 (C) und IL-6 (D) von LPS (100 ng/ml) stimulierten Milzzellen. Die Konzentrationen von diesen Zytokinen wurden aus dem Zellkulturüberstand nach 1, 3, 6 und 24 Stunden über CBA quantifi- ziert. Wiedergegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler von jeweils drei untersuchten individuellen Mäusen pro Genotyp. Statistik: ns = nicht signifikant; *p < 0,05; T-Test. 108 IL-10 (pg/ml) IFNγ (pg/ml) IL-6 (pg/ml) TNFα (pg/ml) Ergebnisse IFN-g lässt sich erst nach 24-stündiger Inkubation mit LPS in moderaten Mengen im Zellüberstand von WT Milzzellen nachweisen (Teilabb. 31A). Eine deutlich höhere IFN- g Menge von ca. 30 pg/ml konnte im Überstand von Milzzellen aus KO Tieren gemes- sen werden. Durch die heterogenen Werte einzelner Tiere ist dieser Unterschied in dem hier vorliegenden Umfang statistisch nicht signifikant. Teilabb. 31B zeigt, dass TNF-a bereits nach 1 Stunde im Überstand von WT Milzzellen (13,34 pg/ml) und KO Milzzellen (20,59 pg/ml) nachgewiesen werden kann. Die Zytokinproduktion steigt nach 3 Stunden im WT auf 48,22 pg/ml und auf 75,12 pg/ml in KO Zellen an. Nach 6 Stunden scheint die Produktion von TNF-a in Milzzellen von WT Mäusen bei 132,24 pg/ml und in Zellen von KO Mäusen bei 216,60 pg/ml ein Maximum anzunehmen, da nach 24 Stunden die TNF-a Konzentration im WT auf 129,24 pg/ml und im KO auf 169 pg/ml absinkt. Geringe IL-10 Mengen lassen sich nach einer Stunde im Überstand von WT (1,54 ng/ml) und KO Milzzellen (3,2 pg/ml) nachweisen, die nach 3 Stunden Ge- notyp-unspezifisch bei 2,75 pg/ml liegen (Teilabb. 31C). Nach 6 Stunden Stimulation steigt die IL-10 Konzentration im Überstand von KO Milzzellen auf 8,22 pg/ml an, im Vergleich zu 3,66 pg/ml in WT Milzzellen. Nach 24-stündiger Stimulation hält sich der moderate Unterschied mit einer IL-10 Konzentration von 12,9 pg/ml im Überstand vom WT gegenüber 17,03 pg/ml im Überstand von KO Milzzellen. Auch die IL-6 Produktion zeigt nach 1- (2-3 pg/ml) und 6- stündiger Stimulation (9-10 pg/ml) keine Unterschiede zwischen den Genotypen. Nach 24 Stunden wird der Unterschied signifikant und liegt bei WT Milzzellen bei 28,23 pg/ml und in KO Milzzellen bei 51,18 pg/ml. Mit Hilfe der Zeitkinetik konnte der 24 Stunden-Wert als idealer Zeitpunkt für den Nach- weis von Zytokinen im Zellüberstand für weitere Untersuchungen festgelegt werden. Die folgenden Experimente wurden mit einer höheren Mauszahl von mindestens 25 Mäusen pro Genotyp durchgeführt. Betrachtet man sich in der Teilabb. 32A die IFN-g Produktion nach 24-stündiger Sti- mulation mit LPS, so wird deutlich, dass mit einem höheren Probenumfang der bereits beobachtete Unterschied in Teilabb. 32A nun auch statistisch signifikant ist. Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäusen produzieren 28,99 pg/ml IFN-g im Vergleich zu (14,458 pg/ml) Milzzellen in WT Mäusen. Der Unterschied in der TNF-a Produktion (Teilabb. 109 Ergebnisse 31B) ist trotz der erhöhten Mauszahl nicht signifikant, die TNF-a Mengen liegen Ge- notyp-unspezifisch relativ konstant bei ca. 312 pg/ml ± 12 pg/ml. In Teilabb. 32C ist die IL-10 Produktion aus KSRP-defizienten Milzzellen leicht erhöht (64,05 pg/ml), ge- genüber Milzzellen aus WT Mäusen (56,32 pg/ml). Der signifikante Unterschied in der IL-6 Produktion konnte durch weitere Experimente nicht bestätigt werden (Teilabb. 32D), hier bleibt der tendenzielle Unterschied erhalten. Die IL-6 Konzentration im Zell- überstand von Milzzellen aus WT Mäusen liegt bei ca. 33 pg/ml im Vergleich zu 41,72 pg/ml im Überstand von KSRP-defizienten Milzzellen. In den vorangehenden Untersu- chungen waren die IL-1b Konzentrationen in den Milzüberständen zu gering um eine aussagekräftige Quantifizierung durchführen zu können. Mit der Erhöhung des Pro- benumfangs konnte nun die IL-1b-Produktion von stimulierten Milzzellen nachgewie- sen werden (Teilabb. 32E). Die IL-1b Konzentration liegt bei Milzzellen aus WT Tieren bei 9,3 pg/ml und vergleichbar mit 12,33 pg/ml in Überständen von KSRP-defizienten Milzzellen. 110 Ergebnisse A B 40 ** 400 30 300 20 200 10 100 0 0 WT KO WT KO C D 80 60 60 40 40 20 20 0 WT KO 0 WT KO E 20 Abb. 32: Zytokinmuster-Analysen von Milz- zellen aus KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Produktion von IFN-g (A), TNF-a (B), IL-10 15 (C), IL-6 (D) und IL-1b (E) von Milzzellen, die für 24 Stunden mit 100 ng/ml LPS stimuliert wurden. Die Zytokinkonzentra- tion wurde mit Hilfe des CBA Flex Set der Firma DB 10 Bioscience bestimmt. Die Daten repräsentieren den Mittel- wert + Standardfehler von jeweils 25-33 untersuchten indivi- duellen Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Statistik: **p < 5 0,01; T-Test. 0 WT KO 111 IL-1β (pg/ml) IL-10 (pg/ml) IFNγ (pg/ml) IL-6 (pg/ml) TNFα (pg/ml) Ergebnisse 4.4.2 Zytokinmuster-Analysen von BM-DC Neben den Milzzellen, die aus unterschiedlichen Immunzelltypen bestehen, wurde auch spezifischer in einer definierten Immunzellpopulation nach dem intrinsischen Po- tential Zytokine zu produzieren untersucht. Dazu wurden wie in Kapitel 3.2.1 beschrie- ben dendritische Zellen aus Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen über kolonie- stimulierende Faktoren wie GM-CSF dendritische Zellen differenziert. Auch hier wurde in Vorversuchen eine Zeitkinetik erstellt und mit unterschiedlichen Konzentrationen von Stimulanzen gearbeitet. Die besten Ergebnisse wurden nach 24-stündiger Stimu- lation mit 100ng/ml LPS (optimalen Dosis) erzielt. A ns=0,06 B 5000 60 * 4000 40 3000 2000 20 1000 0 0 WT KO WT KO C ns=0,06 Abb. 33: Zytokinmuster-Analysen von BM-DC 15000 aus KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Produktion von TNF-a (A), IL-10 (B), und IL-6 (C) von BM-DC, die für 24 Stunden mit 100 ng/ml LPS 10000 stimuliert wurden. Die Zytokinkonzentration wurde mit Hilfe des CBA Flex Set der Firma DB Bioscience bestimmt. Die Daten repräsentieren den Mittelwert + Standardfehler von je- weils drei untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp. 5000 Statistik: ns = nicht signifikant; *p < 0,05; T-Test. 0 WT KO 112 IL-6 (pg/ml) TNFα (pg/ml) IL-10 (pg/ml) Ergebnisse Teilabb. 33A zeigt im BM-DC Überstand von KSRP KO Mäusen höhere Mengen an TNF-a (4084,84 pg/ml), als im Vergleich zum Überstand (3261,5 pg/ml) von WT BM- DC. Deutlicher wird es für die Produktion von IL-10 (Teilabb. 33B): hier produzieren KSRP-defiziente BM-DC signifikant höhere Mengen an IL-10 gegenüber den Kontroll- Zellen. Auch die Konzentration an IL-6 scheint mit 11676,72 pg/ml im Überstand von KO BM-DC tendenziell höher zu liegen als im Überstand (10145,45 pg/ml) von WT BM-DC. 4.4.3 Zytokinmuster-Analysen von BM-Mf Parallel zur Differenzierung von BM-DC wurden aus Knochenmark-abgeleiteten Vor- läuferzellen auch Makrophagen mit M-CSF angereichert. Unter den gleichen Bedin- gungen wie bei BM-DC, wurden die Zytokine im Zellüberstand von Makrophagen quantifiziert. A B 10 2000 8 1500 6 1000 4 2 500 0 0 WT KO WT KO C 800 Abb. 34: Zytokinmuster-Analysen von BM-Mf KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Produktion IFN-g (A), TNF-a (B) und IL-10 (C) 600 von BM- Mf, die für 24 Stunden mit 100 ng/ml LPS stimuliert wurden. Die Zytokinkonzentration wurde mit Hilfe des CBA Flex 400 Set der Firma DB Bioscience bestimmt. Die Daten repräsentie- ren den Mittelwert + Standardfehler von jeweils vier untersuch- ten Mäusen pro Genotyp. 200 0 WT KO 113 IL-10 (pg/ml) IFNγ (pg/ml) TNFα (pg/ml) Ergebnisse Nach LPS-Zugabe ließen sich nur geringe Mengen an IFN-g im Überstand von Makro- phagen nachweisen (Teilabb. 34A), während im Überstand von BM-DC gar kein IFN- g detektiert werden konnte. Weitere detektierbare Zytokine wie TNF-a (Teilabb. 34B) und IL-10 (Teilabb. 34C) wurden mit vergleichbaren Konzentrationsmengen im Über- stand nachgewiesen und zeigen somit keine Genotyp-spezifische Zytokin Produktion in Makrophagen. Stimulierte Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäusen produzieren deutlich höhere IFN- g Mengen, die in beispielhaft untersuchten spezifischen Zelltypen nicht nachgewiesen wurden. Des Weiteren konnte die signifikant höhere IL-10 Produktion in BM-DC in sti- mulierten Makrophagen nicht bestätigt werden. KSRP scheint Zelltyp-spezifisch die Zytokinproduktion in Antigen präsentierenden Zel- len (APC) zu modulieren. Ebenso konnte nachgewiesen werden, dass KSRP den Phä- notyp, die Viabilität und Motilität von myeloide APC beeinflusst. Daher soll in folgenden Untersuchungen geklärt werden, ob KSRP auch einen intrinsischen Effekt auf den T- Zell Immunphänotyp ausübt. 4.5 T-Zell-Immunphänotyp T-Zellen gehören dem adaptiven Immunsystem an, dennoch besitzen sie übergrei- fende Funktionen und interagieren mit dem angeborenen Immunsystem. Allgemein unterscheidet man beim adaptiven Immunsystem zwischen humoraler und zellvermit- telter Immunantwort [237, 238]. Die zellvermittelte Immunantwort richtet sich primär gegen bakteriell oder viral infizierte sowie entartete körpereigene Zellen und wird von CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) durchgeführt. Während bei humoraler Im- munantwort überwiegend CD4+ T-Helfer-Zellen an der Vermittlung von Antikörper pro- duzierenden und sezernierenden B-Lymphozyten beteiligt sind [239, 240]. T-Zellen sind in der Lage pathogenes, prozessiertes Material (Antigene) abhängig von ihrem TCR über MHC-Moleküle auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen zu 114 Ergebnisse erkennen und Immunantworten zu induzieren [241, 242]. In diesem Zusammenhang werden Zytokine produziert, die die Steuerung der Immunantwort beeinflussen. Welchen Einfluss KSRP auf den T-Zell-Immunphänotyp hat und welche damit einher- gehenden Funktionen verändert werden, soll mit den folgenden Experimenten geklärt werden. In den Untersuchungen wurden aus KSRP WT und KO Mäusen die Milzzellen aufge- reinigt (Kapitel 3.2.5) und mittels Durchflusszytometrie unter basalen Bedingungen die Frequenz der Gesamtzellpopulation der CD3+ T-Zellen bestimmt. Weiterhin wurde spezifischer nach den CD4+ und CD8+ TZ-Subpopulationen geschaut und den Aktivie- rungszustand zwischen den genannten Subpopulationen verglichen. In Teilabb. 35A ist ganz deutlich zu erkennen, dass es keine Unterschiede, in der Fre- quenz von CD3+ Zellen, zwischen den Genotypen gibt. Genotypen-unabhängig liegt die Frequenz von CD3+ Zellen bei ca. 34 %. Teilabb. 35B zeigt, dass die Frequenz der CD4+ T-Zellpopulation in beiden Genotypen bei ca. 50 % der gesamten T-Zellpopula- tion liegt. Auch der Anteil der CD8+ T-Zellpopulation liegt unabhängig vom Genotyp bei ca. 36 % und zeigt damit übereinstimmend mit den vorherigen Daten keinen Un- terschied in der Verteilung der TZ-Subpopulation. A 40 Abb. 35: Frequenz-Analyse von T-Lymphozy- ten aus der Milz In Teilabbildung A ist der prozentuale Anteil der gesamten 30 CD3+ T-Zellpopulation als Diagramm dargestellt. Teilabbil- dung B zeigt den prozentualen Anteil der CD3+CD4+ und Teil- abb. C der CD3+CD8+ TZ-Subpopulation. Die Expression der 20 Oberflächenmarker wurden mittels Durchflusszytometrie ana- lysiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert + SEM von 16 individuellen Mäusen pro Genotyp. 10 0 WT KO B C 60 40 30 40 20 20 10 0 0 WT KO WT KO 115 CD4+ Zellen CD3+ Zellen [% der CD3+ Zellen] [%] CD8+ Zellen [% der CD3+ Zellen] Ergebnisse Abb. 36 zeigt die Expression des Aktivierungsmarkers CD25 auf CD4+ und CD8+ T- Zellen. Von den gesamt analysierten CD3+ T-Zellen exprimieren 5,5 % an CD4+ TZ aus WT Mäusen den Aktivierungsmarker und ca. 6 % CD4+ TZ aus KO Mäusen. Auf CD8+ TZ lässt sich die Expression von CD25 Genotyp-unabhängig mit ca. 2 % bestim- men. 8 + + Abb. 36: Frequenz-Analyse von CD4 CD8 aktivierten T-Lymphozyten aus der Milz Dargestellt ist der prozentuale Anteil des Ak- 6 tivierungsmarkers CD25 auf doppelt positi-ven CD3+CD4+ (links) und CD3+CD8+ (rechts) T-Zellen aus der Milz. Die Expression des Ak- tivierungsmarkers wurde mittels Durch- flusszytometrie analysiert. Die Daten reprä- 4 sentieren den Mittelwert + SEM von jeweils 16 untersuchten Mäusen pro Gruppe und Ge- notyp. 2 0 WT KO WT KO Die Frequenz der CD3+ Zellen aus der Milz von KSRP-defizienten Mäusen unterschei- den sich nicht von Kontroll-Mäusen. Ebenfalls zeigen deren T-Zell-Subpopulation ver- gleichbare Frequenzen, gleiches konnte in den Blutanalysen gezeigt werden (Kapitel 2.1.2). 116 CD25+ Zellen [% der CD3+ Zellen] Ergebnisse 4.5.1 Genotypische Unterschiede in der Viabilität der T-Zellen Es konnten auf Frequenz-Ebene keine Genotyp-spezifischen Unterschiede zwischen den untersuchten T-Zellpopulationen beobachtet werden. Um Veränderungen in der Viabilität ausschließen zu können, wurden wie in Kapitel 4.2 beschrieben auch für T- Zellen Viabilitäts-Analysen durchgeführt. Dazu wurden CD3+ TZ unter basalen Bedin- gungen, aber auch in Mäusen, denen 20 mg/kg LPS (in vivo) appliziert wurde, unter- sucht. Die Untersuchung der Milzzellen erfolgte ebenfalls unter basalen Bedingungen, aber auch nach 24-stündigem Einfluss mit 100ng/ml LPS (ex vitro) (Kapitel 3.2.6). Die Apoptoserate der T-Zellen ist in Abb. 37 dargestellt. Dazu wurden die apoptoti- schen CD3+ T-Zellen von unbehandelten WT Mäusen (Ctrl) als 100 % definiert und der Anteil der apoptotischen Zellen unter den anderen Bedingungen dazu in Relation gesetzt. T-Zellen aus WT Mäusen, die mit LPS behandelt wurden, zeigen im Vergleich zur Kontroll-Gruppe keine relevanten Veränderungen in der Apoptose. Ähnlich verhält sich die Apoptoserate von CD3+ TZ aus KSRP KO Mäusen gegenüber den Kontroll- Proben. T-Zellen aus LPS behandelten KO Mäusen zeigen gegenüber den Kontroll- Proben eine Zunahme der Apoptoserate um ca. 24 %. Dieser Unterschied ist aber aufgrund der heterogenen Werte nicht signifikant. CD3+ Zellen Abb. 37: Quantitative Viabilitäts- WT KO Analysen von CD3+ TZ aus dem 300 peripheren Blut Das Diagramm zeigt apoptotische CD3+ TZ aus unbehandelten KO und WT Mäusen (Ctrl), sowie aus Mäusen, die für 6 Stunden mit 20 mg/kg LPS i.p. gespritzt. Die Detek- 200 tion von Annexin V wurde mittels Durch- flusszytometrie durchgeführt und normiert auf die Expression in unbehandelten WT PBMC. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert gebildet ± Standardfeh- 100 ler von jeweils 7-10 individuellen Mäusen pro Gruppe und Genotyp bestimmt. 0 Ctrl LPS Ctrl LPS 117 Apoptotische Zellen [% von WT Ctrl] Ergebnisse Im kleineren Umfang wurde der Vollständigkeitshalber die Apoptoserate von CD3+ T- Zellen auch in der Milz untersucht. In den Milzzellen von unbehandelten WT Mäusen, liegt der Anteil an apoptotischen CD3+ T-Zellen bei ca. 36 % (Abb. 38). Ebenfalls unverändert mit 36 % liegt die Apopto- serate bei T-Zellen aus unbehandelten KSRP KO Mäusen. LPS scheint die Frequenz an apoptotischen Zellen zu verringern, dies Genotyp-unspezifisch auf ca. 19 %. CD3+ Zellen WT KO Abb. 38: Quantitative Viabili-täts-Analysen von CD3+ TC 50 aus der Milz Das Diagramm zeigt apoptotische CD3+ 40 TC aus der Milz von KO und WT Mäu-sen, unter basalen Bedingungen (Ctrl) und nach 24-stündigem Einfluss mit 30 100ng/ml LPS. Die Detektion von An-nexin V wurde mittels Durchflusszyto- metrie durchgeführt. Die Daten reprä- 20 sentieren den Mittelwert ± Standardfeh-ler von jeweils drei untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp. 10 0 Ctrl LPS Ctrl LPS Mit Hilfe dieser Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass die Abwesenheit von KSRP keinen deutlichen Einfluss auf die Viabilität von CD3+ T-Zellen nimmt, auch unter Ein- fluss von LPS. 118 Apoptotische Zellen [%] Ergebnisse 4.5.2 Untersuchung der T-Zellproliferation KSRP scheint bei T-Zellen in der Peripherie keinen Einfluss auf den Phänotyp zu ha- ben. Die Viabilität von KSRP-defizienten T-Zellen scheint ebenfalls unbeeinträchtigt zu sein. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit soll die Proliferation von KSRP-defizienten T-Zellen analysiert werden. Dadurch soll geklärt werden, ob und welche Einschränkungen T- Lymphozyten in Abwesenheit von KSRP aufweisen. T-Zellen müssen im Stande sein zu proliferieren, um ihre Aufgaben im Immunsystem effektiv ausüben und spezifische Antigene erkennen zu können [243]. Dazu wurden alle in der Milz enthaltenen T-Zell Subpopulationen (wie in Kapitel 3.2.5 beschrieben) über Nylonwolle isoliert und polyklonal mit CD3 und CD28 AK für einen T-Zell-Proliferationsassay stimuliert (Kapitel 3.2.6 & 3.2.7). Abb. 39 zeigt die eingebaute Menge an 3H-Thymidin in „counts per minute“ (cpm), welche proportional zu T-Zellproliferation ist. Hierbei wird die Proliferation zwischen den Genotypen verglichen. Betrachtet man sich die Proliferationsrate für die höchste eingesetzte T-Zahl (5x105 Zellen), zeigen die T-Zellen in KSRP-KO Mäusen eine deut- lich höhere (21233 cpm) Proliferation gegenüber den Kontroll-Tieren (15390 cpm). Bei sinkender Anzahl der eingesetzten T-Zellmenge verringert sich zwar der Unterschied in der Proliferation zwischen den Genotypen, die Tendenz bleibt jedoch erhalten. Die tendenziell höhere T-Zellproliferation in KSRP-defizienten Mäusen war jedoch nicht signifikant. 119 Ergebnisse 25000 KO WT 20000 15000 10000 50000 25000 12500 6250 TZ Anzahl Abb. 39: Proliferation von isolierten T-Zellen aus der Milz von KSRP KO und WT Mäusen nach polyklonaler Stimulation Dargestellt sind unterschiedliche T-Zellanzahlen polyklonal stimulierter T-Zellen aus KO (rot) und WT (grün) Mäusen. Die über Nylonwolle aufgereinigten T-Zellen wurden für 90 Std. mit anti-CD3 (1µg/ml) und anti-CD28 (2µg/ml) polyklonal stimuliert. In den letzten 18 Std. der Inkubation wurde zu den proliferierenden T-Zellen 3H Thymidin (0,5µCi/Vertiefung) zugegeben. Das in die T-Zellen eingebaute 3H Thymidin wurde mit Hilfe des Szintillationszählers als „count per minute“ (cpm) analysiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standardfehler von jeweils 20-25 Tieren/Genotyp. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass trotz mangelnder signifikanter Unter- schiede in Viabilität und im Phänotyp der T-Zellen aus KSRP-defizienten Mäusen die Proliferation stärker induziert zu sein scheint. Da T-Zellen basierend auf dem von ihnen produzierten Zytokinmuster unterschiedliche Funktionen ausüben und wir in vorherige Untersuchungen in APC zelltyp-spezifische Unterschiede aufwiesen, sollte der Einfluss von KSRP auf die Zytokinproduktion von T-Zellen untersucht werden . 120 cpm Ergebnisse 4.5.3 Zytokinproduktion von polyklonal stimulierten T-Zellen T-Zellen werden durch das Zytokinmilieu gesteuert und üben viele ihrer Funktionen über Zytokine aus. So werden B-Zell-Effektorfunktionen durch IFN-g unterstützt und weitere regulatorischen Funktionen durch IL-10 ausgeübt [244, 245]. Um Hinweise auf sichtbare Beteiligung von KSRP auf T-Zell Subpopulationen zu erhalten, wurden iso- lierte T-Zellen polyklonal stimuliert und das von ihnen produzierte Zytokinmuster im T- Zell-Überstand bestimmt (3.2.5.1; 3.2.6 u. 3.3.4). In Abb. 40 ist die im T-Zell-Überstand mittels CBA gemessene Zytokinkonzentration dargestellt. Die analysierten Zytokinkonzentrationen von polyklonal stimulierten T-Zel- len aus WT Mäusen als 1 definiert und die gemessenen Zytokinkonzentrationen aus Überständen von KO Mäusen dazu in Relation gesetzt. T-Zellen aus KSRP-KO Mäusen produzieren signifikant weniger IFN-g Mengen im Ver- gleich zu T-Zellen aus WT Mäusen (Teilabb. 40A). Im Gegensatz dazu wird IL-10 Ge- notyp-unspezifisch in gleichen Mengen produziert (Teilabb. 40B). Die IL-12 Produktion liegt ähnlich wie IL-10 Genotyp-unspezifisch auf gleichem Level (Teilabb. 40C). Die Zytokine IL-1b und TNF-a (Anhang: Abb. 70A+B) zeigen keine Unterschiede zwischen den Genotypen in den gemessenen Zytokinkonzentrationen. IL-17, IL-9, IL-5 und IL-4 zeigen nach der Quantifizierung signifikant höhere Konzentrationen im T-Zell-Über- stand von KO Mäusen im Vergleich zu T-Zellen aus WT Mäusen (Teilabb.40D, E, F u. H). Auch IL-13 scheint in höheren Konzentrationen im T-Zell-Überstand von KSRP- defizienten Mäusen vorzukommen, dieser Unterschied ist statistisch nicht signifikant (Teilabb. 40G). 121 Ergebnisse A B ** 1.51.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 WT KO WT KO C D 2.0 2.0 * 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 WT KO WT KO E ** F 5 2.0 * 4 1.5 3 1.0 2 1 0.5 0 0.0 WT KO WT KO G 2.0 H 2.5 * 1.5 2.0 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 WT KO WT KO Abb. 40: Zytokinmuster-Analysen von T-Zellen aus KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Konzentration von IFN-g (A), IL-10 (B), IL-12 (C), IL-17 (D), IL-9 (E), IL-5 (D), IL-13 (G) und IL-4 (H) aus dem Überstand polyklonal stimulierter T-Zellen. Nach Aufreinigung durch Nylonwolle, wurden die Zellen für 90 Std. mit anti-CD3 (1µg/ml) und anti-CD28 (2µg/ml) polyklonal stimuliert. Die Zytokinmessung wurde mit Hilfe des CBA Flex Set der Firma DB Bioscience durchgeführt. Die Daten wurden auf die jeweilige Zytokinkonzentration in WT-Mäusen normiert und repräsentieren den Mittelwert + Standardfehler von jeweils 15-25 individuellen Mäusen pro Genotyp. Statistik: *p < 0,05; **p < 0,01; T-Test. 122 Relative IL-13 Konzentration Relative IL-9 Koncentration Relative IL-12 Konzentration Relative IFNγ Konzentration [x-fach WT] [x-fach WT] [x-fach WT] [x-fach WT] Relative IL-4 Konzentration Relative IL-5 Konzentration Relative IL-17 Konzentration Relative IL-10 Konzentration [x-fach WT] [x-fach WT] [x-fach WT] [x-fach WT] Ergebnisse Aus den analysierten Zytokinen-Daten geht hervor, dass T-Zellen aus KSRP-defizien- ten Mäusen deutlich weniger TH1 assoziierte Zytokine (IFN-g) und im Gegenzug mehr an TH2 assoziierten Zytokinen (IL-5, IL-4, IL-9, IL-17) produzieren. KSRP scheint diese Veränderung des Zytokinmusters hervorzurufen. 4.6 Charakterisierung von T-Zell-Subpopulationen Die bereits erwähnten CD8+ und CD4+ positiven TZ-Subpopulationen sind mit unter- schiedlichen Funktionen hauptsächlich an adaptiven Immunantworten beteiligt [240]. In diesem Kapitel werden über Magnetic-Bead-Separation-System (MACS) (K. 3.2.5.2) aufgereinigte TZ-Subpopulationen näher charakterisiert. 4.6.1 Immunphänotypisierung von CD4+ und CD8+ T-Zellen Mit Hilfe des MACS wurden aus Milzzellen CD4+ und CD8+ positive T-Zellen isolierten und für 90 Stunden polyklonal mit CD3 und CD28 AK stimuliert. Anschließend wurde die Identität sowie der Aktivierungszustand mittels Durchflusszytometrie analysiert. In Teilabb. 41A sind primäre Dotplots von jeweils einer repräsentativen WT und KSRP KO Maus dargestellt. Aufgetragen sind CD4 gegen CD25, die ersten Quadranten (Q4) zeigen die negativen (CD25-CD4-) T-Zellen und im dritten Quadranten (Q2) sind die doppelt positiven (CD25+CD4+) T-Zellen dargestellt. Die Quantifizierung in Teilabb. 41B zeigt, dass polyklonal stimulierte CD4+ T-Zellen aus KO Mäusen einen fast drei- fach so hohen Aktivierungszustand aufweisen, gegenüber den CD4+ T-Zellen aus WT Mäusen. 123 Ergebnisse A B Abb. 41: Frequenz-Analyse von aktivierten CD4+ T-Zellen aus der Milz In Teilabb. A sind primäre FACS-Daten eines repräsentativen Durchgangs von 2-3 durchgeführten Messungen dargestellt. Teilabb. B zeigt den prozentualen Anteil der CD25+CD4+ doppelt positiven T-Zellen. Die Expression der Oberflächen- und Aktivierungsmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert + Standardfehler von jeweils 2-3 untersuchten Mäusen pro Genotyp. Statistik: *p < 0,05; T-Test. Aus den primären FACS-Daten in Teilabb. 42A sind keine Unterschiede in der Fre- quenz der doppelt positiven CD25+CD8+ T-Zellen zu erkennen, auch nach Quantifizie- rung der Daten (Teilabb. 42B) wird deutlich, dass CD8+ T-Zellen keine Unterschiede zwischen den Genotypen in der CD25-Expression aufweisen. 124 Ergebnisse A B Abb. 42: Frequenz-Analyse von aktivierten CD8+ T-Zellen aus der Milz In Teilabb. A sind primäre FACS-Daten eines repräsentativen Durchgangs von 2-3 durchgeführten Messungen dargestellt. Teilabb. B zeigt den prozentualen Anteil der CD25+CD8+ doppelt positiven T-Zellen. Die Expression der Oberflächen- und Aktivierungsmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert + Standardfehler von jeweils 2-3 untersuchten Mäusen pro Genotyp. Aus den Ergebnissen geht hervor, dass die KSRP Defizienz T-Zelltyp spezifisch für einen höheren Aktivierungszustand in CD4+ T-Zellen verantwortlich ist. 125 Ergebnisse 4.6.2 T-Zellproliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen Als nächstes sollte auch für die mittels MACS separierten CD4+ und CD8+ TZ-Subpo- pulationen ein Proliferationsassay durchgeführt werden. Dies dient der Klärung, ob sich ein KSRP-Defizit auch funktional auf die Expansion der unterschiedlichen Subpo- pulationen auswirken kann. Abb. 43: Proliferation von iso- A lierten CD4+ und CD8+ T-Zellen Dargestellt sind unterschiedliche T-Zellan- zahlen an polyklonal stimulierte CD4+ (A) und CD8+ T-Zellen (B) aus KO (rot) und WT (grün) Mäusen. Diese über MACS aufge- reinigten T-Zellen wurden für 90 Std. mit anti-CD3 (1µg/ml) und anti-CD28 (2µg/ml) polyklonal stimuliert. In den letzten 18 Std. der Inkubation wurde zu den proliferieren- den T-Zellen 3H Thymidin (0,5µCi/Vertie- fung) zugegeben. Das in die T-Zellen ein- gebaute 3H Thymidin wurde mit Hilfe des Szintillationszählers als „count per minute“ (cpm) analysiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert und ± Standardfehler von je- weils 3 Tieren/Genotyp. Statistik: *p < 0,05; **p < 0,01; T-Test. B 126 Ergebnisse In Abb. 43 ist die Proliferation von CD4+ (A) und CD8+ T-Zellen (B) nebeneinander dargestellt. In Teilabb. 43A ist deutlich zu erkennen, dass die polyklonal stimulierten CD4+ T-Zellen aus KSRP-defizienten Mäusen eine signifikant höhere Proliferations- rate im Vergleich zu CD4+ T-Zellen aus WT Mäusen aufweisen. Dies konnte für unter- schiedliche T-Zell Anzahlen (5x104, 2,5x104, 12,5x104) gezeigt werden. CD8+ T-Zellen zeigen dagegen keine eindeutigen Unterschiede in der T-Zell Proliferation (Teilabb. 43B). Die Proliferationsrate der am höchsten eingesetzten CD8+ T-Zellmenge für KSRP KO und WT Mäusen erreicht aufgrund des Standardfehlers einen ähnlichen Wert. Bei geringeren T-Zellzahlen fällt die Proliferationsrate der T-Zellen aus KSRP KO Mäusen unterhalb des Proliferationsniveaus von T-Zellen aus den Kontrollmäusen. Die Ergebnisse der Proliferationsanalysen bestätigen den signifikant erhöhten Aktivie- rungszustand in CD4+ T-Zellen aus KO-Tieren. Die erhöhte Proliferationsrate der CD4+ T-Zellen könnte wahrscheinlich die tendenziell gesteigerte Proliferation der Gesamt-T- Zellen erklären. Dieser Unterschied (Abb. 39) lässt sich durch die signifikant hohe Proliferation von CD4+ T-Zellen begründen. 127 Ergebnisse 4.6.3 Zytokinproduktion von CD4+ und CD8+ T-Zellen Da in Kapitel 4.5.3 bereits signifikante Unterschiede in der Zytokinproduktion der KSRP-defizienten T-Zellen beobachtet wurden, sollten nun die spezifischen Subpopu- lationen untersucht werden. Daher wurden über MACS isolierte CD4+ und CD8+ TZ- Subpopulationen für 90 Stunden polyklonal stimuliert und das Zytokinmuster aus dem T-Zell Überstand mit Hilfe von CBA analysiert. In den Überständen aus CD8+ T-Zellen konnte IFN-g und IL-10 nachgewiesen und quantifiziert werden. In Teilabb. 43A ist gezeigt, dass im T-Zell Überstand von CD8+ T-Zellen aus KSRP-defizienten Mäusen eine signifikant geringere Menge an IFN-g (690 pg/ml) nachgewiesen wurde im Vergleich zu Kontrolle (1072 pg/ml). Teilabb. 44B zeigt eine sehr geringe Konzentration an IL-10, die sich nicht zwischen den beiden Genotypen unterscheidet. CD8+ TC CD8+ TC A B 1500 ** 100 80 1000 60 40 500 20 0 0 WT KO WT KO Abb. 44: Zytokinmuster-Analysen von CD8+ T-Zellen aus KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Konzentration von IFN-g (A) und IL-10 (B) in den Überständen von CD8+ T-Zellen. Diese über MACS aufge- reinigten T-Zellen wurden für 90 Std. mit anti-CD3 (1µg/ml) und anti-CD28 (2µg/ml) polyklonal stimuliert und die Zytokin Kon- zentration im Zellüberstand mit Hilfe des CBA Flex Set der Firma DB Bioscience analysiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert + Standardfehler von jeweils 3 untersuchten Mäusen pro Genotyp. Statistik: **p < 0,01; T-Test. 128 IFNγ (pg/ml) IL-10 (pg/ml) Ergebnisse Vergleichbar zu CD8+ T-Zellen wurden im Überstand von KSRP-defizienten CD4+ T- Zellen ebenfalls leicht geringere Konzentrationen an IFN-g nachgewiesen (Teilabb. 45A). Die Konzentration von IFN-g liegt im Überstand von KO Mäusen bei 4432,6 pg/ml und unterscheidet sich nicht signifikant im Vergleich zu Kontroll-Proben (ca. 5000 pg/ml). Sehr eindeutig wird der Unterschied in der IL-10 Produktion (Teilabb. 45B). Im Überstand von KSRP-defizienten Mäusen konnte eine 6-fach höhere Konzentration an IL-10 gegenüber der Kontrolle nachgewiesen werden. IL-17 scheint ebenfalls stärker durch T-Zellen in KO Tieren (194 pg/ml) produziert zu werden als durch CD4+ T-Zellen (70 pg/ml) aus den WT Mäusen. Dieser Unterschied zeigt jedoch keine statistische Signifikanz (Teilabb. 45C). Eindeutiger wird es für die IL-9 Produktion: KSRP-defizi- ente CD4+ T-Zellen produzieren fast die doppelte Menge an IL-9 gegenüber den Kon- troll-Zellen (Teilabb. 45D). Während IL-5, aufgrund hoher Schwankungen, keinen Un- terschied in der Zytokinproduktion zwischen den Genotypen aufweist (Teilabb. 45E), konnten signifikant höhere IL-13 Konzentrationen im Überstand von KSRP-defizienten Mäusen im Vergleich zu Kontrolle nachgewiesen werden (Teilabb. 45F). 129 Ergebnisse CD4+ TC CD4+ TC A B 6000 8000 *** 6000 4000 4000 2000 2000 0 0 WT KO WT KO + CD4 + TC C CD4 TC D 300 * 300 200 200 100 100 0 0 WT KO WT KO E CD4 + TC + F CD4 TC 800 4000 * 600 3000 400 2000 200 1000 0 0 WT KO WT KO Abb. 45: Zytokinmuster-Analysen von CD4+ T-Zellen aus KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Konzentration von IFN-g (A), IL-10 (B), IL-17 (C), IL-9 (D), IL-5 (E) und IL-13 (F) in den Überständen von CD4+ T-Zellen. Diese über MACS aufgereinigten T-Zellen wurden für 90 Std. mit anti-CD3 (1µg/ml) und anti-CD28 (2µg/ml) polyklonal stimuliert und die Zytokin Konzentration im Zellüberstand mit Hilfe des CBA Flex Set der Firma DB Bioscience analysiert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert + Standardfehler von jeweils 3 untersuchten Mäusen pro Genotyp. Statistik: *p < 0,05; ***p < 0,001; T-Test. 130 IL-5 (pg/ml) IL-17 (pg/ml) IFNγ (pg/ml) IL-13 (pg/ml) IL-9 (pg/ml) IL-10 (pg/ml) Ergebnisse Die Zytokinmessungen erfolgten 90 Stunden nach polyklonaler Stimulation aus Über- ständen von T-Zellen, welche auch für Proliferationassays verwendet wurden. Dadurch ist es möglich, den signifikant stärker proliferierenden CD4+ T-Zellen das ent- sprechende Zytokinmilieu zuzuordnen. Dies liefert erste Hinweise auf eventuelle TZ Subpopulationen, die für diesen Effekt verantwortlich sein könnten. In weiteren Experimenten wurde mit Hilfe einer Zeitkinetik die Zytokinexpression von polyklonal stimulierter CD4+ T-Zellen genauer untersucht, mit dem Hintergrund Unter- schiede in der Zytokinproduktion bereits zu früheren Zeitpunkten zu erfassen und Sät- tigungsbereiche ausschließen zu können. Untersucht wurde die Zytokinproduktion mit- tels CBA bereits nach 0, 1, 3, 6, 24, 48 und 72 Stunden aus über MACS aufgereinigte und polyklonal stimulierten CD4+ T-Zellen aus KSRP KO und WT Tieren. Zu den Zeit- punkten unter 6 Stunden konnten keine von den untersuchten Zytokinen im T-Zell Überstand nachgewiesen werden, daher wurden die Zytokinmengen in der Zeitkinetik ab 6 Stunden dargestellt. Die IFN-g Produktion in Teilabb. 46A zeigt eine Genotyp-unspezifische Zunahme be- ginnend nach 24-stündiger Stimulation. IL-10 konnte in vorherigen Untersuchungen nach 90 Stunden in signifikant höheren Konzentrationen im Zellüberstand von KSRP- defizienten CD4+ T-Zellen nachgewiesen werden. In Teilabb. 46B scheint die Konzent- ration von IL-10 schon nach 72 Stunden deutlich im T-Zell Überstand von KSRP-defi- zienten Tieren gegenüber der Kontrolle erhöht zu sein. Nach 24 Stunden Stimulation konnten im Überstand von KSRP-KO Tieren bereits höhere Mengen (ca. 30 pg/ml) an IL-17 gemessen werden, im Vergleich zur Kontrolle (Teilabb. 46C). Nach 48-stündiger Stimulation wird dieser Unterschied zwar etwas deutlicher, bewegt sich aber auch nach 72-stündiger Stimulation mit ca. 100 pg/ml mehr IL-17 im Überstand von KSRP- KO T-Zellen im Vergleich zu Kontroll- T-Zellen. Der IL-17 Konzentrationsunterschied ist zwischen KSRP-KO und WT T-Zellen nicht signifikant. Dieser Unterschied wird nach 48-stündiger Stimulation deutlicher, liegt aber aufgrund von heterogenen Werten auch nach 72 Stunden bei ca. 130 pg/ml. KO T-Zellen scheinen IL-9 erst nach 48- stündiger Stimulation in höheren Mengen im Vergleich zur Kontroll-Zellen zu sezernie- ren, dieser Unterschied wird nach 72-stündiger Stimulation deutlicher (Teilabb 46D) und aus vorherigen Untersuchungen konnten wir nach 90 Stunden einen signifikanten 131 Ergebnisse Unterschied für die IL-9 Produktion nachweisen (Teilabb. 45D). Die IL-5 Konzentratio- nen wiesen nach 90-stündiger Stimulation keine signifikanten Unterschiede zwischen den Genotypen auf (Teilabb. 45E). In Teilabb. 46E ist die Zeitkinetik für IL-5 dargestellt, hierbei wurden bereits nach 24 Stunden Stimulation höhere IL-5 Mengen im T-Zell Überstand von KSRP-defizienten Mäusen im Vergleich zum Kontroll-Überstand ge- messen. Dieser Unterschied wird nach 48-stündiger Stimulation deutlicher und signifi- kant nach 72 Stunden. IL-13 scheint erst nach 48 Stunden in deutlich messbaren Men- gen im Überstanden nachweisbar zu sein (Teilabb. 46F). Ähnlich wie IL-5 zeigte auch IL-13 einen erst tendenziellen Unterschied, der erst nach 72-stündiger Stimulation mit höheren IL-13 Mengen im Überstand von KSRP-defizienten Mäusen (2095 pg/ml) ge- genüber dem Kontroll-Überstand (1066 pg/ml) signifikant wurde. IL-2 wird primär von T-Zellen autokrin zur Proliferation genutzt, aus diesem Grund ist es besonders wichtig dieses Zytokin zu früheren Zeitpunkten nachzuweisen [246, 247]. Bereits nach 6 Stunden Stimulation konnte IL-2 in sehr geringen Konzentrationen Ge- notyp-unspezifisch nachgewiesen werden (Teilabb 46G). Die IL-2 Konzentration steigt nach 24 Stunden Genotyp-unspezifisch auf ca. 2000 pg/ml an und erreicht nach 48 Stunden den Sättigungsbereich, sodass es nach 72 Stunden zu einer Abnahme der Konzentration von IL-2 (auf ca. 1800 pg/ml) kommt. Die isolierten CD4+ T-Zellen bestätigen die bereits beobachteten Unterschiede der Milz T-Zellpopulation zwischen den Genotypen sowohl in der T-Zellproliferation als auch in der Zytokinproduktion. Auch die Ergebnisse der Zeitkinetik bestätigen die vorherigen Daten. 132 Ergebnisse A B 5000 WT 2000 WT ns KO KO 4000 1500 3000 1000 2000 1000 500 0 0 6 24 48 72 6 24 48 72 Stunden Stunden C D 250 WT 150 WT ns= 0,057 KO KO 200 150 100 100 50 50 0 0 6 24 48 72 6 24 48 72 Stunden Stunden E F * * 80 WT 2500 WT KO KO 2000 60 1500 40 1000 20 500 0 0 6 24 48 72 6 24 48 72 Stunden Stunden G 4000 WT Abb. 46: Zeitkinetik der Zytokinproduktion KO von CD4 + T-Zellen aus KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Konzentration von IFN-g (A), IL-10 (B), IL- 3000 17 (C) und IL-9 (D), IL-5 (E), IL-13 (F) und IL-2 (G) aus dem Überstand polyklonal stimulierter CD4+ T-Zellen. Diese über 2000 MACS aufgereinigten T-Zellen wurden mit anti-CD3 (1µg/ml) und anti-CD28 (2µg/ml) polyklonal stimuliert und die Zytokin Konzentration im Zellüberstand nach 6, 24, 48 und 72 Std. 1000 mit Hilfe des CBA Flex Set der Firma DB Bioscience quanti- fiziert. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standard- fehler von jeweils 3-4 untersuchten Mäusen pro Genotyp. 0 Statistik: ns = nicht signifikant; *p < 0,05; T-Test. 6 24 48 72 Stunden 133 IL-2 (pg/ml) IL-5 (pg/ml) IL-17 (pg/ml) IFNγ (pg/ml) IL-13 (pg/ml) IL-9 (pg/ml) IL-10 (pg/ml) Ergebnisse IL-5 weist aufgrund hoher Schwankungen keinen Unterschied in der Zytokinproduktion zwischen den Genotypen von CD4+ T-Zellen auf. Mit der höheren Versuchsanzahl in der Zeitkinetik konnte daraufhin der tendenzielle Unterschied statistisch belegt wer- den. Zusammenfassend kann gezeigt werden, dass KSRP-defiziente Mäuse unter basalen Bedingungen keine Unterschiede in der Frequenz der T-Zellen (CD3+) aufweisen. So- wohl die TZ-Subpopulationen (CD4+ u. CD8+) aus der Milz als auch aus dem periphe- ren Blut zeigen keine Unterschiede in der Verteilung und der Viabilität zwischen den Genotypen. Die Proliferation scheint in gesamten T-Zellen aus KSRP-defizienten Mäu- sen erhöht zu sein. Das Zytokinmuster deutet mit geringerer IFN-g und höheren IL-17, IL-9, IL-4, IL-5 und IL-13 Konzentrationen auf einen TH2-Shift hin. Isolierte CD4+ T- Zellen aus KSRP KO Mäusen zeigen eine statistisch signifikant höhere Proliferation. Dies konnte für CD8+ T-Zellen aus KO Tieren nicht nachgewiesen werden. FACS- Analysen bestätigen mit einer Signifikanz den erhöhten Aktivierungszustand von CD4+ T-Zellen. Zusätzliche CBA-Analysen von CD4+ T-Zellen verdeutlichen neben der be- reits dokumentierten verstärkten Produktion von IL-9, IL-13 usw. auch eine signifikant höhere Produktion von IL-10. Diese genotypisch spezifischen Unterschiede konnten mit Hilfe der Zytokin Zeitkinetik untermauert werden. Im folgenden Kapitel soll der Einfluss von KSRP in pro-inflammatorischen und immu- nologischen Prozessen im Gesamtorganismus untersuchen werden, um im Modell der chronischen Entzündung weitere Informationen über die Aktivität des RNA-bindenden Proteins in immunologischen Prozessen zu erfahren. 4.7 Analysen im experimentellen Tiermodell der Kollagen Antikörper induzierten Arthritis Anhand vorheriger Experimente konnten wir in KSRP-defizienten Mäusen zeigen, dass deutliche Effekte in Bezug auf die Immunzell-Frequenz bei myeloiden Zellen (Abb. 16) zu beobachten waren. Die Kapazität dieser Zellen scheint aufgrund erhöhter Sterberate (Abb. 26) eingeschränkt zu sein. 134 Ergebnisse Auf T-Zell-Ebene konnten ebenfalls signifikante Unterschiede in der Immunzell-Fre- quenz beobachtet werden, wenn diese aktiviert vorliegen (Abb. 41). Am interessantes- ten ist bei CD4+ T-Zellen der TH2-Shift mit dem deutlich höheren Anteil des anti-in- flammatorischen Zytokins IL-10 (Abb. 45). Diese vor allem ex vivo Ergebnisse sollen mit einem entsprechenden Krankheitsmo- dell überprüft werden. Dabei soll geklärt werden ob die bisher erhobenen Ergebnisse zu einem anderen “outcome“ einer chronisch entzündlichen Erkrankung in KSRP-de- fizienten Mäuse führen. Daher wurde ein murines Krankheitsmodell gewählt, in dem aktivierte myeloide Zellen und eine verstärkte Beteiligung an aktivierten TH1-Zellen eine wichtige Rolle spielen [175, 200]. Ein klassisches tierexperimentelles Modell der rheumatoiden Arthritis (RA) ist die Kollagen-(CII)-induzierte Arthritis (CIA) [160, 248]. Es ist jedoch bekannt, dass nicht alle Mäusestämme für die CIA empfindlich sind. Da- bei können die besten Ergebnisse in dem DBA/1-Stamm erzielt werden (Kapitel 3.4.5). Die Mäuse mit dem inaktivierten KSRP-Gen wurden allerdings auf Hintergrund des C57BL/6-Stammes generiert [171]. Aus diesem Grund wird die Kollagen-Antikörper- induzierten Arthritis (CAIA) verwendet, die in C57BL/6-Mäusen erfolgreich als Autoim- munitätsmodell etabliert ist. Bei dieser Methode wird die CAIA in den Mäusen durch die Applikation von 5 monoklonalen Kollagen-Antikörpern und einer zusätzlichen Be- handlung mit LPS ausgelöst. Im Unterschied zum klassischen CIA-Modell beginnt die Schwellung der Pfoten in der CAIA bereits ca. drei Tagen nach der Antikörper-/LPS- Applikation und erreicht laut Literatur bis zum neunten Tag die maximale Ausprägung des Arthritis-Phänotyps (Kapitel 3.4.4) [200]. Um die Rolle von KSRP für die Pathoge- nese der CAIA zu charakterisieren, wurden phänotypische und weitere Analysen auf Zellebene durchgeführt. Daher wurde bei den behandelten Mäusen die schwere des Krankheitsverlaufs mit der täglichen Bestimmung des Arthritis-Index dokumentiert und an Tag 9 die Mäuse getötet um histologische und immunologische Analysen durchzu- führen (s. Versuchsaufbau Abb. 2). 135 Ergebnisse 4.7.1 Krankheitsverlauf von KSRP-defizienten Mäusen nach CAIA Teilabb. 47 zeigt den phänotypische Krankheitsverlauf von allen behandelten Mäusen, der als Arthritis-Index (s. Tabelle 14) dokumentiert wurde. WT Mäuse, welche mit AK behandelt wurden, zeigen bereits nach dem 5. Tag ge- schwollene Pfoten. Es wurden stärkere Schwellung der Pfoten ab Tag 6 nach CAIA- Induktion bei WT-Tieren gegenüber KSRP-defizienten Mäusen beobachtet. Während sich der AI in KSRP KO Mäusen nach Tag 8 zu verringern scheint, verschlimmert sich der Krankheitsverlauf in WT Mäusen bis Tag 9 weiter. Die KSRP-defizienten Mäuse entwickeln eine signifikant geringere Arthritis-Symptomatik im Vergleich zu WT Mäu- sen. 8 *** *** WT PBS KO PBS *** WT AK KO AK 6 ** ### 4 *** AK LPS 2 ns ns ns ns ns ns $$$ 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tag Abb. 47: Darstellung des Arthritis-Index für KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Entwicklung des Arthritis-Index von CAIA in WT und KO Mäusen. WT (AK) und KO (AK) Mäuse wurden an Tag 0 mit einem Gemisch aus 5 spezifischen Kollagen-II-Antikörpern (2,54 mg/Maus) behandelt, während den Kontroll-Grup- pen WT (Ctrl) und KO (Ctrl) PBS gespritzt wurde. An Tag 3 erhielten die Mäuse in der behandelten Gruppe 50 µg/Maus LPS und die Kontroll-Gruppen 0,9% NaCl. Die Entwicklung des klinischen Arthritis-Phänotyps wurde ab Tag 3 bis Tag 9 dokumen- tiert und als Mittelwert des Arthritis-Index dargestellt (AI, ± Standardfehler). Am Versuchsende (Tag 9) wurden die Mäuse (n=10-15) durch zervikale Dislokation getötet und die Organe für weitere Analysen entnommen. (Statistik: ***: p < 0.001; ns: nicht signifikant gegen. AK-behandelte KSRP-/- Mäuse; ###: p < 0.001; gegen. PBS-behandelte KSRP WT Mäuse; $$$: p < 0.001 gegen PBS-behandelte KSRP-/- Mäuse [241]) 136 Arthrits Index Ergebnisse 4.7.2 Histopathologische Analysen von KSRP-defizienten Mäusen nach CAIA Pathophysiologische Veränderungen in den Gelenken von AK-behandelten Mäusen sollen mittels der Übersichtsfärbung (Kapitel 3.4.4.2) dargestellt werden. Dadurch soll vor allem die Infiltration der Immunzellen und die Schwere der Entzündung beurteilt werden. Die histologischen Paraffinschnitte der Pfoten wurden in Kooperation mit dem Institut für Allgemeine Pathologie in der Universitätsmedizin Mainz unter Leitung der MTA Silke Mitschke angefertigt. Abb. 48: Histopathologische Darstellung von H&E gefärbten Mauspfoten Dargestellt sind repräsentative 5 µm dicke Schnitte von KO und WT Mauspfoten, die mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt wur- den. Die Pfoten stammen von KSRP WT und KO Mäusen und wurden an Tag 9 nach CAIA-Induktion aus Kontroll- (A+B) (Ctrl) und mit Antikörper gegen Kollagen behandelten Tieren (C+D) (AK) entnommen. Diese wurden zunächst 24 Stunden in 4% Formaldehyd fixiert, sowie für 3-4 Wochen in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung decalcifiziert und dehydriert und anschließend in Paraffin eingebettet. Die lichtmikroskopischen Aufnahmen, wurden mit dem Nano Zoomer Scanner erstellt und die Auswertung erfolgte mit der NDP.view2 Software. Die schwarzen Pfeile deuten Stellen in den Gelenken an, in welche Immunzellen infiltriert sind [241]. 137 Ergebnisse Abb. 48 zeigt repräsentative H&E gefärbte Paraffinschnitte der Pfoten von WT und KSRP-defizienten Mäusen, in denen durch die Einfärbung die Unterscheidung zwi- schen Zellkernen und interzellulärer Substanz ermöglicht wird. Teilabb. 48A+B zeigen die Verteilung der Immunzellen unter basalen Bedingungen im Synovia des Gelenkes. Die Gelenke von CAIA-behandelten WT Mäusen (Teilabb. 48C) zeigen eine höhere Infiltration der Immunzellen im Vergleich zu Gelenken von KSRP-defizienten Mäusen (Teilabb. 48D). Die Pfeile deuten auf die stark von Immunzellen infiltrierten (dunkleren) Bereiche im Gelenk hin. Die mit Antikörpern gegen Kollagen behandelten KSRP-defizienten Mäuse zeigen eine signifikant geringere Krankheitssymptomatik im Vergleich zu WT Mäusen. Überein- stimmend mit dem AI konnte in den histologischen Übersichtsfärbungen auch eine ge- ringe Immunzell-Infiltration in den Pfoten von KSRP-KO Tieren nachgewiesen werden. 4.7.3 Immunphänotypisierung von Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäusen an Tag 9 nach CAIA Induktion Weitere Untersuchungen auf Immunzellebene wurden mit Milzzellen durchgeführt. Dazu wurden die Milzzellen wie in Kapitel 3.2.5 beschrieben von allen behandelten Maus-Gruppen im CAIA-Versuch präpariert und untersucht. Ein Teil der isolierten Milz- zellen wurden direkt nach dem Präparieren mit Hilfe der Durchflusszytometrie (3.3.2) analysiert. Die verbleibenden Zellen wurden aufgeteilt und die eine Hälfte mit LPS (100 ng/ml) für 24 Stunden stimuliert während die andere Hälfte der Zellen unstimuliert bei gleichen Bedingungen inkubiert wurde (3.2.6). Nach 24 Stunden wurden Zytokine in dem Zellüberstand mittels CBA-Analysen (3.3.4) bestimmt und die Zellen ebenfalls mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert. Die Immunzell-Frequenz von direkt ex vivo untersuchten Milzzellen zeigten keine Un- terschiede zu den ausgesäten und unbehandelten Milzzellen, daher wurden im Fol- genden nur die Ergebnisse von den unstimulierten und stimulierten Milzzellen gezeigt. 138 Ergebnisse In Abb. 49 ist der prozentuale Anteil von den unterschiedlich behandelten Immunzellen in Relation zu unbehandelten und unstimulierten Milzzellen aus WT Tieren dargestellt. Teilabb. 49A zeigt eine signifikant reduzierte CD11b Expression (myeloide Zellen) in LPS-stimulierten Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäusen, im Vergleich zur LPS-be- handelten Wildtyp-Kontrolle. Milzzellen aus AK-behandelten Mäusen zeigen eine Zu- nahme der Gesamtfrequenz an CD11b+ in WT und KO Milzzellen gegenüber den Kon- troll-Tieren. Vergleicht man die relative CD11b-Expression innerhalb der Gruppen, er- kennt man in unstimulierten Milzzellen von AK-behandelten Mäusen ebenfalls eine Abnahme der CD11b+ Zellen in KO Tieren, gegenüber den WT Tieren. Restimuliert man diese Milzzellen mit LPS, erhält man eine statistisch signifikante Reduktion von CD11b+ Zellen in KSRP-defizienten Milzzellen im Vergleich zu WT Milzzellen. Die Ex- pression von CD11c (DCs) scheint in Milzzellen von KSRP-defizienten Mäusen, unter basalen Bedingungen aber auch nach LPS-Behandlung, leicht erhöht zu sein, ist je- doch nicht statistisch signifikant (Teilabb. 49B). Milzzellen aus AK-behandelten Mäu- sen zeigen Genotyp-unspezifisch eine etwas verringerte CD11c Expression. Für CD19+ Milzzellen (B-Zellen) konnte in diesem Versuch kein Genotyp-spezifischer Un- terschied in der CD19-Expression sowohl bei Kontroll-Tieren als auch in Tieren, die mit AK behandelt wurden, erfasst werden (Teilabb. 49C). In Teilabb. 49D erkennt man eine geringe Zunahme der CD68-Expression (Makrophagen) in KO Milzzellen aus AK- unbehandelten Mäusen. Milzzellen aus AK-behandelten Mäusen zeigen unabhängig von der Stimulation, einen umgekehrten Effekt. Sowohl die tendenzielle Zunahme in KO Kontroll-Mäusen, als auch die geringe Abnahme der CD68-Expression in AK-be- handelten KO Mäusen, sind statistisch nicht signifikant. Der Aktivierungsmarker CD86 zeigt nach LPS-Behandlung erwartungsgemäß Genotyp-unspezifisch in Kontroll-Mäu- sen ein höheres Expressionsniveau, (Teilabb. 49E). LPS-stimulierte Milzzellen aus AK-behandelten Mäusen weisen im Vergleich zu stimulierten Kontroll-Zellen deutlich geringere CD86-Expressionslevels auf, die jedoch im Vergleich zu unstimulierten Kon- troll-Milzzellen dennoch erhöht sind. 139 Ergebnisse In Abb. 50 wurde der prozentuale Anteil von spezifischen Immunzelltypen zwischen den Genotypen verglichen. Teilabb. 50A zeigt keine Unterschiede zwischen der Frequenz an CD11b+CD68- Zellen von unstimulierten und mit LPS stimulierten Milzzellen aus Kontroll-Tieren. Nach der Behandlung mit Antikörpern gegen das Kollagen weisen KSRP-defiziente Mäuse ver- gleichbar mit den reinen CD11b+ Milzzellen (Teilabb. 49A) verringerte Frequenzen auf. Auch die Frequenz-Analysen von Makrophagen (Teilabb. 50B) zeigen keinen signifi- kanten Unterschied zwischen den Genotypen und somit ein identisches Bild, wie es in Teilabb. 49D beschrieben wurde. Myeloide DC (Teilabb. 50C) aus KSRP-defizienten Mäusen zeigen unter Kontroll-Be- dingungen eine erhöhte Anzahl von CD11b+CD11c+ Zellen und nach LPS Stimulation sogar mit einem statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zu Kontroll-Zellen. Dieser Unterschied konnte in Milzzellen aus Mäusen, die mit Antikörpern gegen Kol- lagen behandelt wurden, nicht mehr nachgewiesen werden. Plasmacytoide DC schei- nen in KO Kontroll-Mäusen ebenfalls in einer etwas höheren Frequenz im Vergleich zu WT pDC vorhanden zu sein, dieser Unterschied ist jedoch statistisch nicht signifi- kant (Teilabb.50 D). Mäuse die mit AK-behandelt wurden, weisen in der Milz Genotyp- unspezifisch geringere Frequenzen an pDC auf. Die CD11b-CD19+ BZ-Subpopulation zeigt sowohl in Milzzellen aus Kontroll-Mäusen, als auch in Milzzellen aus CAIA-be- handelten Mäusen keine Unterschiede in der Frequenz zwischen den Genotypen auf (Teilabb. 50E). Die CD11b+ B-Zell-Subpopulation zeigt ebenfalls keine signifikanten Unterschiede in der Frequenz der Expression zwischen den Genotypen in Kontroll- Mäusen (Teilabb. 50F). CAIA-behandelte Mäuse scheinen in den Milzzellen diese Im- munzellpopulation Genotyp-unspezifisch, in höheren Leveln zu exprimieren. 140 Ergebnisse CD11b+ Zellen CD11c + Zellen A B BMMA Ctrl AK Ctrl AK 4 1.5 150 WT ns=0,07 ns=0,09 KO 100 3 * * 1.0 50 150 150 WT WT 150 150 150 WT WT WT 150 WT 150 150 WT WT 2KO KO KO KO KO KO 0 KO KO - LPS 100 100 100 100 100 100 100 100 0.5 1 50 50 50 50 50 50 50 50 0 0 0 0 0 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS - - LPS LPS- - LPS LPS C CD19 + Zellen + D CD68 Zellen Ctrl AK Ctrl AK 1.5 2.0 1.5 1.0 150 150 WT WT 150 150 WT WT 150 150 WT WT KO 150 150 WT WT KO KO KO 1.0KO KO KO KO 100 100 100 100 100 100 0.5 100 100 50 0.550 50 50 50 50 50 50 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS 0 0 0.0 0 0- - LPS LPS- - LPS LPS E CD86+ Zellen Ctrl AK Abb. 49: Zellfrequenz-Analysen aus Milzzellen 2.5 von WT und KO Mäusen Tag 9 nach CAIA In- duktion Dargestellt ist der prozentuale Anteil von CD11b+ (A), CD11c+ 2.0 (B), CD19+ (C), CD68+ (D) und CD86+ (E) Milzzellen von unbe- handelten (Ctrl) und mit Antikörper (AK) behandelten WT und KO Mäusen. Die Daten sind in der jeweiligen Gruppe auf die 150 150 1.5WT WT 150 WT Expression in unbehandelten WT Milzzellen normiert. In den 150 WT KO jeweiligen Diagrammen sind links (-) die unstimulierten und KO KO KO rechts (LPS) die 24 Stunden mit LPS (100 ng/ml) behandelten 100 1.0 Milzzellen dargestellt. Die Expression dieser Oberflächenmar-100 100 100 ker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Aus den je- weiligen Normierungen wurde der Mittelwert + Standardfehler gebildet aus jeweils 10-15 untersuchten Mäusen pro Gruppe 50 50 0.5 50 50 und Genotyp. 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS 141 F480+ Zellen [% of parental] + CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] [%][%] + CD11c+ Zellen CD11c+ CD11c Zellen Zellen [%] Relat[i%ve] Frequenz CD86+ Zellen Relat[i%ve] Frequenz CD19+ Zellen Relative Frequenz CD11b+ Zellen [x-fach unstim. WT Ctrl] [x-fach unstim. WT Ctrl] [x-fach unstim. WT Ctrl] + CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] [%] [%] + CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen Relat[i%ve] Frequenz CD68+ Zellen Relat[iv%e] Frequenz CD11c+ Zellen [x-fach unstim. WT Ctrl] [x-fach unstim. WT Ctrl] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] Ergebnisse Makrophagen mDCs BMMA A Ctrl AK B Ctrl AK C Ctrl AK 5 2.0 150 2.0 WT *** KO 100 4 * 1.5 1.5 ns=0,07 50 150 150 3WT WT 150 WT150 150 WT WT 150 WT 150 150 WT WT 150 WT KO KO 150 WT 150KO KO KO 150 WT WT 0 KO 1.0 KO KO 1.0KO KO - LPS KO KO 100 100 2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0.5 50 50 1 50 50 50 50 0.550 50 50 50 50 50 0 0 0 0 0 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPpS-DCs- LPS LPS - - LPBS2-LZPSe-llen - LPS LPS 0 0 0.0 0 0- - LPSB1LP-ZS-ellen- LPS LPS D Ctrl AK E Ctrl AK F Ctrl AK 1.5 1.5 2.0 1.5 1.0 1.0 150 WT 150 WT150 WT 150 150 WT 150 WT WT 150 150 WT WT 150 150 WT WT 150 WT WT KO KOKO KO KO KO KO 150 KO 1.0KO KO KO KO 100 100100 100 100 100 100 100 100 0.5 100 100 1000.5 50 50 50 0.550 50 50 50 50 50 50 50 50 0 0 0.0 0 0 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS 0 0 0.0 0 0- - LPS LPS- - LPS LPS - - LPS LPS- - LPS LPS Abb. 50: Zellfrequenz-Analysen aus Milzzellen von WT und KO Mäusen an Tag 9 nach CAIA Induktion Dargestellt ist der prozentuale Anteil von CD11b+CD68- (myeloide Zellen) (A), CD11b+CD68+ (Makrophagen) (B), CD11b+CD11c+ (mDC) (C), CD11b-CD11c+ (pDC)) (D), CD11b-CD19+ (BC) (E) und CD11b+CD19- (BC) (F) Zellen aus der Milz von unbehandelten (Ctrl) und mit Antikörper (AK) behandelten WT und KO Mäusen. Die Daten sind in der jeweiligen Gruppe auf die Expression in unbehan- delten WT Milzzellen normiert. In den jeweiligen Diagrammen sind links (-) die unstimulierten und rechts (LPS) die 24 Stunden mit LPS (100 ng/ml) behandelten Milzzellen dargestellt. Die Expression dieser Oberflächenmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert + Standardfehler gebildet für jeweils 10-15 untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Statistik: ns = nicht signifikant; *p < 0,05; ***p < 0,001. T-Test. 142 F480+ Zellen [% of parental] + CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] [%]+ CD11c+ Zellen CD11c Zellen[%] Relative [F%re]quenz CD11b-CD11c+ Zellen Relative Frequenz CD11b+CD68- Zellen [x-fach unstim. WT Ctrl] [x-fach unstim. WT Ctrl] + CD11c + Zellen CD11c Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen Relative[ F%re]quenz CD11b-CD19+ Zellen Relative [F%re]quenz CD11b+CD68+ Zellen [x-fach unstim. WT Ctrl [x-fach unstim. WT Ctrl] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen Relative [F%re]quenz CD11b+CD19+ Zellen Relative F[%re]quenz CD11b+CD11c+ Zellen [x-fach unstim. WT Ctrl [x-fach unstim. WT Ctrl CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] Ergebnisse Der prozentuale Anteil der Immunzellen aus den Milzen von Mäusen an Tag 9 nach CAIA Induktion, zeigen vor allem übereinstimmend mit den myeloiden Zellpopulatio- nen aus dem Blut (4.1.2), signifikant geringere Frequenzen (Abb. 49A) in den KSRP- defizienten Mäusen. + Durch Messung der mittleren Fluoreszenzintensität von CD11b Zellen in CAIA-be- handelten Mäusen, konnte ebenfalls eine signifikante Abnahme der CD11b-Expres- sion in Milzzellen von KO Mäusen nachweisen werden (s. Anhang: Abb. 71). Untersu- chungen zum Reifungszustand dieser unterschiedlichen Immunzellpopulationen wur- den ebenfalls in der Milz von CAIA-behandelten Mäusen durchgeführt (s. Anhang: Abb. 72). Die Effekte sind vergleichbar mit den Ergebnissen aus Kapitel 4.1.3. und zeigen einen erhöhten Aktivierungszustand von myeloiden Zellen aus KSRP-defizien- ten Mäusen im Vergleich zu unstimulierten Kontroll-Tieren. Es wurden keine starken Veränderungen in Bezug auf die Frequenz der unstimulierten und mit LPS-stimulierten Immunzellen in der Milz aus AK-behandelten Mäusen im Ver- gleich zu den Kontrollgruppen beobachtet. Um Auszuschließen, dass mögliche Unter- schiede zwischen den einzelnen Gruppen durch die Wahl der Versuchslänge nicht zu erkennen waren, wurden die Versuche zu einem früheren Zeitpunkt wiederholt. 143 Ergebnisse 4.7.4 Immunphänotypisierung von Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäusen an Tag 5 nach CAIA Induktion Im Folgenden sollen die gleichen Analysen wie in Kapitel 4.7.3 zu einem früheren Zeit- punkt durchgeführt werden. Nach Induktion von CAIA konnten in den behandelten Mäusen bereits ab dem fünften Tag phänotypische Veränderungen beobachtet wer- den. Daher wird ebenfalls an dem fünften Tag nach der CAIA-Induktion der Immun- phänotyp in der Milz von den behandelten Mäusen untersucht, um bereits in dieser Effektorphase weitere Unterschiede auf Immunzell-Ebene erfassen zu können (siehe Versuchsaufbau Abb. 3). In Abb. 51 ist die Frequenz spezifischer Oberflächenrezeptoren in der Milz von „Kurz- zeit-CAIA“-behandelten Mäusen (Tag 5) dargestellt. Signifikante Unterschiede in der Frequenz von CD11b exprimierender Zellen konnten in diesem Versuch in den Kon- troll-Tieren nicht nachgewiesen werden (Teilabb. 51A). Am fünften Tag nach CAIA- + Behandlung ist das Expressionsniveau von CD11b Zellen im Gesamten höher als an + Tag 9, unabhängig vom Genotyp und Stimulation. Die Expression von CD11c auf Zellen steigt nach LPS Stimulation in KSRP-defizienten Kontroll-Mäusen signifikant an, dieser Unterschied konnte auch in vorherigen Untersuchung beobachtet werden + (Teilabb. 51B). An Tag 5 nach CAIA-Induktion ist das Expressionsniveau von CD11c Zellen zwar deutlich höher als in den unbehandelten Kontroll-Tieren, unterscheidet + sich aber nicht zwischen den Genotypen. Die Expression von CD19 (Teilabb. 51C) + und CD68 (Teilabb. 51D) Zellen in LPS-Stimulierten Milzzellen von Kontroll-Tieren bestätigten die vorherigen Ergebnisse. Die Expression beider Oberflächenmarker nimmt in Tieren am fünften Tag nach AK-Behandlung Genotyp-unspezifisch zu. Das etwas höhere Expressionslevel des Aktivierungsmarkers CD86 in Milzzellen von KSRP-defizienten Mäusen bestätigt ebenfalls die Ergebnisse aus vorherigen Untersu- chungen (Teilabb. 51E). Milzzellen aus CAIA-behandelten Mäusen zeigen Stimulati- ons-unabhängig einen höheren Aktivierungszustand. 144 Ergebnisse + CD11c+ CD11b Zellen ZellenA B BMMA Ctrl AK Ctrl AK 4 4 150 WT KO 100 3 3 50 150 150 WT WT 150 WT150 150 WT WT 150 WT 150 150 WT WT 2KO KO KO 2KO0 KO KO KO - LPS * KO 100 100 100 100 100 100 100 100 1 1 50 50 50 50 50 50 50 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS - - LPS LPS- - LPS LPS CD19+ Zellen CD68+ Zellen C Ctrl AK D Ctrl AK 2.0 2.0 1.5 1.5 150 WT *150 WT 150 WT WT 150 150 WT150 WT 150 150 WT WT 1.0KO KO KO KO 1.0KO KO KO KO 100 100 100 100 100 100 100 100 0.5 0.5 50 50 50 50 50 50 50 50 0 0 0.0 0 0 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS - - LPS LPS- - LPS LPS CD86+ Zellen E Ctrl AK Abb. 51: Zellfrequenz-Analysen aus Milzzel- 2.5 len von WT und KO Mäusen an Tag 5 nach CAIA Induktion Dargestellt ist der prozentuale Anteil von CD11b+ (A), 2.0 ns=0,09 CD11c+ (B), CD19+ (C), CD68+ (D) und CD86+ (E) Zellen aus der Milz von unbehandelten (Ctrl) und mit Antikörper (AK) behandelten WT und KO Mäusen. Die Daten sind in der je- 150 150 1.5WTns=W0T,05 150 WT WT weiligen Gruppe auf die Expression in unbehandelten WT 150 KO KO Milzzellen normiert. In den jeweiligen Diagrammen sind links KO KO (-) die unstimulierten und rechts (LPS) die 24 Stunden mit 100 100 1.0 100 LPS (100 ng/ml) behandelten Milzzellen dargestellt. Die Ex-100 pression dieser Oberflächenmarker wurde mittels Durch- flusszytometrie analysiert. Aus den jeweiligen Normierungen 50 wurde der Mittelwert + Standardfehler gebildet aus jeweils 50 0.5 50 50 10 untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Statistik: ns = nicht signifikant; *p < 0,05; T-Test. 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS 145 F480+ Zellen [% of parental] + CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] [%] [%]+ CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c Zellen[%] Relat[i%ve] Frequenz CD86+ Zellen Relat[i%ve] Frequenz CD19+ Zellen Relative Frequenz CD11b+ Zellen [x-fach unstim. WT Ctrl] [x-fach unstim. WT Ctrl] [x-fach unstim. WT Ctrl] + CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] [%][%] + CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] [%] [%] CD11c+ + Zellen CD11c Zellen [%] [%] + CD11c+ Zellen CD11c Zellen[%] Relat[i%ve] Frequenz CD68+ Zellen Relative Frequenz CD11c+ Zellen [x-fach unstim. WT Ctrl] [x-fach unstim. WT Ctrl] CD11c+ Zellen CD11c + Zellen [%] [%] + CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] [%] Ergebnisse + - Die Frequenz der CD11b CD68 myeloiden Zellpopulation ist am fünften Tag nach CAIA-Induktion in den Milzen um das ca. 3-fache höher als in den Milzen von Kontroll- + + Mäusen (Teilabb. 52A). Auch die CD11b CD68 Makrophagen zeigen einen Genotyp- unspezifischen 3-fachen Anstieg der Frequenz in der Milz an Tag 5 (Teilabb. 52B). Unbehandelte Milzzellen zeigen vergleichbar mit vorherigen Ergebnissen eine erhöhte Frequenz von mDC in KSRP KO Mäusen (Teilabb. 52C). Die Frequenz von AK-unbe- handelten mDC sowie von pDC ist in den Kontroll-Mäusen nach LPS-Behandlung hö- her als in den unstimulierten Kontroll-Zellen (Teilabb. 53 B+C). Jedoch ist ein deutli- cher Unterschied in der Frequenz von mDC und pDC nach AK-Behandlung zu be- obachten. Am 5. Tag nach CAIA-Induktion nimmt die Frequenz von mDC gegenüber den Kontroll-Tieren ab, während die Frequenz der pDC fast um das zehnfache erhöht - vorliegt. Für die CD11b B-Zell Subpopulation erhalten wir in LPS-stimulierten Milzzel- len aus KO Kontroll-Mäusen eine im Vergleich zu den Kontroll-Zellen höhere Frequenz (Teilabb. 52E). In AK-behandelten Mäusen können dagegen keine Unterschiede in der + Frequenz nachgewiesen werden. In Teilabb. 52F ist gezeigt, dass die CD11b B-Zell Subpopulation in Milzzellen von Kontroll-Tieren nach LPS-Stimulierung Genotyp-un- abhängig in geringerer Frequenz vorliegt. In den Milzen von CAIA-behandelten Mäu- + sen messen wir eine ca. 3-fach höhere Frequenz an CD11b B-Zellen, gegenüber den Kontroll-Mäusen, diese verringert sich ebenfalls nach LPS-Stimulation Genotyp-unab- hängig. 146 Ergebnisse myeloide Zellen Makrophagen pDCs BMMA A Ctrl AK B Ctrl AK C Ctrl AK 5 4 2.0 150 WT KO 100 4 3 1.5 50 150 150 3WT WT 150 WT 150 WT150 WT 150 WT 150 150 WT WT 150 150 WT WT 150 150 WT WT KO KO KO 2KO 0 KO KO KO KO 1.0 KO KO KO KO - LPS 100 100 2 100100 100 100 100 100 100 100 100 100 1 0.5 50 50 1 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.0 0 0 - - LPS mLPDS-Cs - LPS LPS - - LPS BL2PS--Zelle-n LPS LPS - - LBPS1-ZLPeSl-len - LPS LPS D Ctrl AK E Ctrl AK F Ctrl AK 1.5 15 4 3 1.0 10 WT 150 WT 150150 WT WT 150 WT 150 150 150 WT WT 150 150 WT WT 150 WT 150 WT KO 150 WTKO KO KO KO KO KO KO 2KO KO KO KO 100 100100 100 100 100100 100 100 100 100 5 0.5 100 1 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 0 0 0 0 0 0 0 0.0 0 0 0 0 0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS - - LPS LPS- - LPS LPS - - LPS LPS- - LPS LPS Abb. 52: Zellfrequenz-Analysen aus Milzzellen von WT und KO Mäusen an Tag 5 nach CAIA Induktion Dargestellt ist der prozentuale Anteil von CD11b+CD68- (myeloide Zellen) (A), CD11b+CD68+ (Makrophagen) (B), CD11b-CD11c+ (pDC) (C), CD11b+CD11c+ (mDC) (D), CD11b-CD19+ (BC) (E) und CD11b+CD19- (BC) (F) Zellen aus der Milz von unbehandelten (Ctrl) und mit Antikörper (AK) behandelten WT und KO Mäusen. Die Daten sind in der jeweiligen Gruppe auf die Expression in unbehandelten WT Milzzellen normiert. In den jeweiligen Diagrammen sind links (-) die unstimulierten und rechts (LPS) die 24 Stunden mit LPS (100 ng /ml) behandelten Milzzellen dargestellt. Die Expression dieser Oberflächenmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert + Standardfehler gebildet aus jeweils 10 untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp. 147 F480+ Zellen [% of parental] + CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] [%]+ CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] Relative F[%re]quenz CD11b+CD11c+ Zellen Relative Frequenz CD11b+CD68- Zellen [x-fach unstim. WT Ctrl [x-fach unstim. WT Ctrl] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] + CD11c+ Zellen CD11c Zellen [%] [%]+ CD11c+ Zellen CD11c Zellen[%] Relative[ F%re]quenz CD11b-CD19+ Zellen Relative Frequenz CD11b+CD68+ Zellen [x-fach unstim. WT Ctrl [x-fach unstim. WT Ctrl] CD11c+ + Zellen CD11c Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ [%] Zellen CD11c+ Zellen [%] CD11c+ [%] Zellen Relative Frequenz CD11b+CD19+ Zellen Relative [F%re]quenz CD11b-CD11c+ Zellen [x-fach unstim. WT Ctrl [x-fach unstim. WT Ctrl] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c + Zellen [%] Ergebnisse Aus den Frequenz-Analysen von unbehandelten Kontroll-Mäusen erhalten wir weitge- hend übereinstimmend mit vorherigen Analysen (4.1.3) ähnliche Ergebnisse. Die Im- munzell-Frequenz in der Milz von AK-behandelten Mäusen variiert zwischen dem 5. und 9. Tag. Während am fünften Tag nach CAIA-Induktion die Frequenz in der Milz für alle unstimulierte und mit LPS-stimulierten Immunzellpopulationen gegenüber den un- behandelten Kontroll-Mäusen erhöht ist, so verringert sich im Gesamten die jeweiligen Frequenzen am 9. Tag, mit Ausnahme von myeloiden CD11b+ Zellen. Restimulierte CD11b+ Zellen zeigen am 9. Tag nach der CAIA-Induktion vergleichbar mit den Ergeb- nissen aus dem Blut (4.1.2.), eine Genotyp-spezifische signifikant reduzierte Frequenz in Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäusen. Auf MFI-Ebene konnte die insgesamt re- duzierte Expression von CD11b+ Zellen an Tag neun bestätigt werden (Anhang: Abb. 71). Untersuchungen zum Aktivierungszustand bestätigen in den LPS-stimulierten Kontroll-Milzzellen eine tendenzielle höhere Expression des Aktivierungsmarkers CD86 auf den Oberflächen von stimulierten KSRP KO Milzzellen im Vergleich zu Kon- troll-Tieren (Anhang: Abb. 72 u. Abb. 73). In folgenden Untersuchungen sollte das Zytokinmuster von APC ebenfalls an Tag 5 und 9 nach CAIA-Induktion bestimmt werden. 148 Ergebnisse 4.7.5 Zytokinproduktion von Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäu- sen nach CAIA In CAIA-behandelten Mäusen konnte am fünften Tag in der Milz eine Frequenz-Zu- nahme von nahezu allen untersuchten Immunzellpopulationen beobachtet werden. Diese Zunahme der Frequenzen zeigte zwischen den Genotypen keine Unterschiede. Von den isolierten und mit LPS restimulierten Milzzellen wurde zusätzlich im Zellüber- stand die Zytokinmuster mit Hilfe des CBA-Systems bestimmt. In Abb. 53 sind die gemessenen Zytokinkonzentrationen auf die jeweilige Konzentra- tion im Zellüberstand von WT Milzzellen bezogen, um so die Unterschiede zwischen den Genotypen und den einzelnen Gruppen besser zu erfassen. Wie bereits in vorhe- rigen Untersuchungen (K. 4.2.2) nachgewiesen, zeigen Milzzellen aus KSRP-KO Mäu- sen ohne AK-Behandlung eine signifikant (3-fach) höhere IFN-g Produktion im Ver- gleich zu Milzzellen aus WT Mäusen (Teilabb. 53A). Milzzellen produzieren Genotyp- unabhängig am fünften Tag nach Arthritis-Induktion ca. 70 % weniger IFN-g im Ver- gleich zur WT-Kontrolle bei Versuchsbeginn. Am neunten Tag erhöht sich die IFN-g- Produktion in der Milz von KO und WT Mäusen, mit einer deutlicheren Zunahme im Zellüberstand von KO Milzzellen (1,7-fach) gegenüber 1,2-fach im Überstand von WT Milzzellen. Die IL-10 Produktion liegt in unbehandelten KO Milzzellen um ca. 20 % erhöht vor, im Vergleich zur Kontrolle (Teilabb. 53B). Fünf Tage nach CAIA-Behand- lung liegt die Menge an IL-10 Genotyp-unabhängig im Kontroll-Bereich. Erst am neun- ten Tag wurden 2-fach höhere IL-10 Mengen im Überstand von WT Milzzellen und 2,3- fache höhere Mengen im Überstand von KO Milzzellen, im Vergleich zur Kontrolle am Versuchsbeginn, gemessen. IL-1b weist teilweise geringe und sehr heterogene Mess- daten auf (Teilabb. 53C), daher kann man Allgemein betrachtet keine Genotyp-spezi- fischen Unterschiede in der IL-1b Produktion von Milzzellen aus unbehandelten und am 5. Tag nach CAIA-behandelten Mäusen erkennen. Am 9. Tag nach Induktion er- höht sich die IL-1b-Produktion in der Milz von WT Mäusen um das 5,6-fache und um 7,1-fache in der Milz von KO Tieren, dieser Unterschied bleibt aufgrund von hohen Schwankungen statistisch nicht signifikant. Milzzellen produzieren TNF-a in unbehan- delten Mäusen, sowie in AK-behandelten Mäusen an Tag 5 und Tag 9, Genotyp-un- spezifisch in gleichen Mengen (Teilabb. 53D). Milzzellen scheinen am fünften Tag 149 Ergebnisse nach AK-Behandlung unabhängig vom Genotyp ca. 70 % weniger und am neunten Tag ca. 60 % mehr TNF-a im Vergleich zu Kontrolle zu produzieren. A B Ctrl Tag5 Tag9 Ctrl Tag5 Tag9 4 ** 3 3 2 2 1 1 0 0 rl) rl) K) )t K K ) K) l) l) ) ) ) ) T(C (C t A r r( (A (A (A t t AK AK AK AK O T ( C (C ( ( ( ( W K W K O WT KO WT KO W T KO WT KO C D Ctrl Tag5 Tag9 Ctrl Tag5 Tag9 8 2.0 6 1.5 4 1.0 2 0.5 0 rl) rl) K) K) K) 0.0 t t K ) l) l) ) ) ) ) T(C (C T( A (A T(A (A t r tr O O O A K AK AK AK W K W K W K T (C (CO WT ( KO ( WT ( KO ( W K Abb. 53: Zytokinmuster-Analysen von APC nach CAIA-Behandlung Dargestellt ist die Konzentration von IFN-g (A), IL-10 (B), IL-1b (C) und TNF-a (D) in Milzzellen aus unbehandelten (Ctrl) und mit Antikörper (AK) behandelten WT und KO Mäusen im Vergleich. Die Zytokinmessung wurde mit Hilfe des CBA Flex Set der Firma DB Bioscience durchgeführt. Die Daten sind normiert auf die jeweilige relative Zytokinkonzentration von WT Milzzellen und repräsentieren den Mittelwert + Standardfehler von jeweils 15-28 untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Statistik: **p < 0,01; T-Test. 150 Relative IL-1β Konzentration Relative IFNγ Konzentration (x-fach WT(Ctrl)) (x-fach WT(Ctrl)) Relative TNFα Konzentration Relative IL-10 Konzentration (x-fach WT(Ctrl)) (x-fach WT(Ctrl)) Ergebnisse 4.7.6 Zytokinproduktion von T-Zellen aus KSRP-defizienten Mäusen nach CAIA Genotyp-spezifische Unterschiede in der Zytokinproduktion von polyklonal stimulierten T-Zellen konnten bereits in vorherigen Untersuchungen gezeigt werden. Wie sich das Zytokinprofil von restimulierten T-Zellen nach und während einer pro-inflammatori- schen Erkrankung verändert, soll in dem aktuellen Kapitel gezeigt werden. Abb. 54 zeigt die jeweils relativen Zytokinkonzentrationen bezogen auf die WT-Kon- trolle. In Teilabb. 54A ist die signifikant reduzierte IFN-g Konzentration im T-Zellüber- stand von KSRP-defizienten Mäusen zu erkennen. Ähnlich verhält sich der Unter- schied in der IFN-g Produktion zwischen den Genotypen am fünften Tag nach CAIA- Induktion. Am neunten Tag nach CAIA-Induktion verringert sich die IFN-g Produktion in T-Zellen von WT Mäusen um ca. 50 % gegenüber der unbehandelten Kontrolle und erreicht damit ein vergleichbares Zytokinniveau, wie im Überstand von KSRP KO T- Zellen gemessen wurde. IL-10 scheint im T-Zellüberstand von unbehandelten KO Mäusen moderat erhöht zu sein (Teilabb. 54B), gegenüber den WT Kontroll-Zellen. Dieser Unterschied wird deutlicher am fünften Tag nach CAIA-Induktion. Es konnten 1,84-fach mehr IL-10 im Überstand von KO T-Zellen im Vergleich zu 1,43-facher Er- höhung im WT T-Zellüberstand, gegenüber der unbehandelten WT Kontrolle gemes- sen werden. Am neunten Tag wurde im T-Zellüberstand von KSRP-defizienten Mäu- sen eine doppelt so hohe Menge an IL-10 im Vergleich zum Überstand von WT Mäu- sen gemessen. Die T-Zellen aus Kontroll-Mäusen zeigen vergleichbar mit vorherigen Untersuchungen (K. 4.5.3) signifikant höhere IL-17 Mengen im Überstand von KSRP- defizienten Mäusen (Teilabb. 54C). Während am fünften Tag nach CAIA-Induktion die IL-17 Produktion gegenüber der unbehandelten Kontrolle Genotyp-unspezifisch um ca. 25 % reduziert vorliegt, so steigt diese am neunten Tag um das 3,5- im WT und 4,5-fache im Überstand von KO T-Zellen an. Auch die IL-9 Messung in Kontroll-T-Zel- len bestätigt in Teilabb. 54D die auch zuvor gemessene signifikante Zunahme an IL-9 im Überstand von KSRP-defizienten T-Zellen (K. 4.5.3). Dieser Effekt ist am fünften Tag nach CAIA-Induktion abgeschwächt und nicht mehr signifikant. Am neunten Tag steigt die IL-9 Menge in den Überständen Genotyp-unspezifisch um fast das 4-fache 151 Ergebnisse an. IL-5 kann in signifikant höheren Mengen im T-Zellüberstand von unbehandelten KO Mäusen nachgewiesen werden, im Vergleich zu Kontroll-Zellen (Teilabb. 54E). Dieser Effekt ist auch am fünften Tag nach CAIA-Behandlung in abgeschwächter Form noch zu beobachten. Am neunten Tag dagegen verringert sich die IL-5 Konzentration im Überstand von WT und KO T-Zellen und erreicht in beiden Genotypen nur noch ca. 50 % der Ausgangskonzentration. IL-13 konnte ebenfalls in T-Zellüberständen aus un- behandelten KO Mäusen in deutlich höhere Konzentrationen, im Vergleich zum Über- stand aus Kontroll-Zellen, nachgewiesen werden (Teilabb. 54E). Am fünften Tag nach CAIA-Behandlung lässt sich dieser Effekt auch statistisch signifikant belegen und ver- schwindet am neunten Tag vergleichbar mit dem Effekt von IL-5. Für weitere Zytokine wie TNF-a konnte unter basalen Bedingungen und nach Induk- tion der Krankheit kein Unterschied in der Zytokinproduktion festgestellt werden (An- hang: Abb. 74B). Auch für IL-1b konnte kein Unterschied in der Zytokinproduktion von unbehandelten und am fünften Tag mit AK-behandelten T-Zellen zwischen den Geno- typen festgestellt werden (Anhang: Abb. 74A). Man erkennt am neunten Tag eine deut- lich höhere IL-1b Produktion, anhand der höheren IL-1b Menge im Zellüberstand von KO T-Zellen. Dieser Unterschied kann jedoch statistisch nicht bestätigt werden. 152 Ergebnisse A Ctrl Tag5 Tag9 B Ctrl Tag5 Tag9 1.5 ** 2.5 *** 2.0 1.0 1.5 0.5 1.0 0.5 0.0 0.0 ) ) ) ) ) ) Ct rl trl AK AK AK AK tr l) rl) ) ) ) ) T( (C K K K K T( O( T( O( T(C (C t (A (A (A (A W KO W K W K T O W KO W K W T KO C D Ctrl Tag5 Tag9 Ctrl Tag5 Tag9 6 6 ** 4 * 4 2 2 0 0 rl) l) l) ) ) ) ) t trl ) AK ) K) K) K) tr tr AK AK AK AK T(C (C T( O( A T(A (A T (C C ( ( ( ( O O W KO ( T O T O W K W K W K W K W K E Ctrl Tag5 Tag9 F Ctrl Tag5 Tag9 2.0 * 2.0 * 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 rl) rl)t t AK ) K) K) K) trl ) trl ) K) K) )A A A A A AK AK ) (C (C T( C CO( T( ( ( ( T( ( T( ( WT KO W K W K O O O W T KO W K W K Abb. 54: Zytokinmuster-Analysen von T-Zellen nach CAIA-Behandlung Dargestellt ist die Konzentration von IFN-g (A), IL-10 (B), IL-17 (C), IL-9 (D), IL-5 (E) und IL-13 (F) in den Überständen von T- Zellen, die über Nylonwolle aufgereinigt wurden und für 90 Std. mit anti-CD3 (1µg/ml) und anti-CD28 (2µg/ml) polyklonal sti- muliert. Die Zytokinmessung wurde mit Hilfe des CBA-Systems durchgeführt. Die Daten sind normiert auf die jeweilige relative Zytokinkonzentration von WT T-Zellen und repräsentieren den Mittelwert + Standardfehler von jeweils 15-28 untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Statistik: *p < 0,05; **p < 0,01; T-Test. 153 Relative IL-5 Konzentration Relative IL-17 Konzentration Relative IFNγ Konzentration (x-fach WT(Ctrl)) (x-fach WT(Ctrl)) (x-fach WT(Ctrl)) Relative IL-13 Konzentration Relative IL-9 Konzentration Relative IL-10 Konzentration (x-fach WT(Ctrl)) (x-fach WT(Ctrl)) (x-fach WT(Ctrl)) Ergebnisse Zusammenfassend kann gesagt werden, dass KSRP abhängig vom Zelltyp unter- schiedlichen Einfluss auf die Zytokinproduktion nimmt. Während IFN-g in KSRP-defi- zienten Milzzellen signifikant höhere Expressionslevel aufweist, verringert sich das Ex- pressionsniveau in KSRP-defizienten T-Zellen. Allgemein konnte für die Zytokinpro- duktion in Milzzellen Genotyp-unabhängig am fünften Tag eine deutliche Abnahme und am neunten Tag eine deutliche Zunahme der untersuchten Zytokine, mit Aus- nahme von IL-10, nachgewiesen werden. T-Zellen zeigen dagegen am fünften Tag vergleichbar mit unbehandelten T-Zellen ähnliche aber abgeschwächte Unterschiede zwischen den Genotypen in der Zytokinproduktion, die meist am neunten Tag verän- dert vorliegen (Ausnahme IL-10). In weiteren Untersuchungen wurde auch im periphe- ren Blut von Kontroll- und CAIA-behandelten Mäusen an Tag fünf und neun das Zyto- kinmuster analysiert (K. 3.2.4). Bei diesen CBA-Analysen konnten keine eindeutigen Unterschiede in der Zytokinproduktion zwischen den Genotypen und nach AK-Be- handlung festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Mit dem gewählten Krankheitsmodell CAIA (s. 4.7) konnten wir einen veränderten Krankheitsverlauf in Tieren mit inaktiviertem KSRP Gen beobachten. Die Inaktivierung des KSRP-Gens führte aber entgegengesetzt der Erwartung zu einer Abschwächung der Antikörper-induzierten Inflammation. Sowohl die verringerte Symptomatik als auch die reduzierte Immunzell-infiltration in den Pfoten von KSRP-defizienten Mäusen konn- ten sehr deutlich nachgewiesen werden. Die Charakterisierung von Immunzellen in der Milz demonstrierte auch am neunten Tag nach CAIA-Behandlung mit der verrin- gerten Frequenz an myeloiden CD11b+ Zellen den möglichen Einfluss dieses Zelltyps in dem gewählten Krankheitsmodell. Weitere signifikante Unterschiede auf T-Zell- ebene, bezogen auf die bereits in vorherigen Untersuchungen detektierte polarisierte TH2 Antwort, konnten bestätigt werden. Bei diesen KSRP-defizienten T-Zellen deutete vor allem das Zytokinmuster mit der geringeren IFN-g und höheren IL-17, IL-9, IL-4, IL- 5 und IL-13 Konzentrationen auf einen TH2-Shift hin. 154 Ergebnisse 4.8 Analysen im experimentellen Tiermodell des allergischen Asth- mas Im einen aktuellen allergischen Krankheitsmodell sollte der dominierende TH2-Shift in KSRP-defizienten Mäusen bekräftigt werden. Darum wurde das allergische Asth- mamodell gewählt, bei dem das adaptive Immunsystem mit der dominierenden TH2- Antwort eine sehr große Bedeutung hat. In dem vorherigen Krankheitsmodell der Kol- lagen-Antikörper-induzierten-Arthritis wurde eine schwächere Krankheitssymptomatik beobachtet, nun erwarten wir einen umgekehrten Effekt. Die bereits nachgewiesene TH2 und TH9 Polarisierung soll die verstärkte Asthmasymptomatik begünstigen [249, 250]. 4.8.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität in KSRP-defizienten Mäusen Die Immunisierung und Challenge der Versuchstiere erfolgte mit OVA wie in Abb. 4 dargestellt. Um die Auswirkungen des KSRP Knockdowns auf die nach der Provoka- tion auftretenden Entzündungsreaktionen in der Lunge zu analysieren, wurde begin- nend mit dem Ganzkörper-Plethysmographen die Lungenfunktion analysiert (Kapitel 3.4.6.1.1). Mit Hilfe der AHR, die als charakterliches Merkmal für die Krankheitssymptomatik im Asthmamodell gilt, können die funktionellen Einschränkungen in der Lunge bspw. er- höhter Atemwegswiderstand dokumentiert und analysiert werden [251, 252]. Im Ganz- körper-Plethysmographen wurde der PenH-Wert bestimmt, dazu wurde zunächst die Grundaktivität (baseline) der Versuchstiere aufgenommen und nach weiterer Provo- kation mit Methacholin (6,25; 12,5 und 25mg) (s. Kapitel 3.4.6) die Änderung des PenH-Wertes aufgezeichnet. 155 Ergebnisse In Abb. 55 ist die Atemwegshyperreaktivität von Kontroll- und Ovalbumin-sensibilisier- ten Mäusen dargestellt. Mit OVA sensibilisierte KSRP-defiziente Mäuse scheinen be- reits ohne Zugabe des Stimulus (MCh) einen moderat höheren AHR im Vergleich zu anderen Versuchsgruppen zu haben. Während nach Zugabe von 6,25mg/ml MCh die AHR in WT Mäusen unabhängig von der Behandlung vergleichbar mit der Grundakti- vität bleibt, steigt der PenH-Wert in OVA sensibilisierten KO Mäusen auf 1,8 und in PBS-behandelten KO Mäusen moderat auf 1,4 an. Eine weitere Erhöhung der Metha- cholindosis lässt vor allem die AHR in OVA-behandelten KO Mäusen auf 2,6 und auf 2,1 (PenH) in PBS behandelten KO Mäusen ansteigen. Der PenH-Wert von WT Mäu- sen bleibt behandlungsunabhängig relativ unverändert bei 1,7 ± 0,1 gleich. Eine wei- tere Verdopplung der Dosis auf 25 mg/ml zeigt eine statistisch signifikante Zunahme der AHR in OVA-behandelten KO Mäusen (5,2 PenH) gegenüber den OVA-behandel- ten WT Mäusen (3,4 PenH). 156 Ergebnisse 6 * WT PBS KO PBS WT OVA KO OVA 4 2 baseline 6,25 12,5 25 Konz MeCH [mg/ml] Abb. 55: Analysen der AHR nach Sensibilisierung mit OVA in WT und KSRP-defizienten Mäu- sen Dargestellt ist die AHR als PenH von wie in Abb. 4 gezeigt sensibilisierten WT und KO Mäusen. Alle Versuchsgruppen wurden 24 Stunden nach der dreitägigen Provokation einer invasiven Lungenfunktionsmessung unter ansteigenden Dosen Methacho- lin unterzogen. Dazu wurde anfangs für fünf Minuten die Grundaktivität gemessen und anschließend der Atemwiderstand nach Provokation mit Methacholin (6,25; 12,5; 25mg/ml) aufgezeichnet. Abgebildet sind die Mittelwerte ± SEM der Atemwiderstände von fünf untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp. Statistik: *p < 0,05; T-Test. 157 AHR (PenH) Ergebnisse 4.8.2 Analyse der Immunzellen in der bronchoalveolären Lavage Neben dem funktionellen Parameter der Atemwegsentzündung wurde auch die zellu- läre Zusammensetzung der Bronchiolen und Alveolen in den Versuchstieren mit Hilfe der Lungenspülung BAL untersucht. Beim allergischen Asthma bronchiale korreliert die Schwere der Entzündungsreaktion unter anderem mit der massiven Einwanderung spezifischer Immunzellen in das Lumen der Lunge [253]. Daher wurden die Lungen der Versuchstiere mit einer Kochsalzlösung ausgespült und die Frequenz von den da- rin gewonnen Immunzellen (Makrophagen, Lymphozyten, eosinophile und neutrophile Granulozyten) analysiert (3.4.6.1.3 u. 3.4.6.1.3). In Abb. 56 ist die relative Frequenz der akkumulierten Zellen in der BAL dargestellt. Vergleicht man die Frequenz von eosinophilen und neutrophilen Granulozyten aus den Lungen von PBS-behandelten KSRP KO Mäusen mit den Kontroll-Mäusen, erkennt man eine deutlich verringerte Frequenz in der Gruppe von PBS-KO Mäusen. Aufgrund hoher Schwankungen lässt sich dieser Unterschied statistisch nicht bestätigen. Die OVA-sensibilisierten WT Mäuse zeigen im Vergleich zu Kontroll-Mäusen eine fast 3- fach höhere Frequenz an eosinophilen und nur 0,5-fache Erhöhung an neutrophilen Granulozyten, während Makrophagen um 50 % reduziert vorliegen. OVA-behandelte KO Mäuse weisen vergleichbar zu OVA-behandelten WT Mäusen ähnliche Frequen- zen an eosinophilen Granulozyten auf. Dagegen steigt die Frequenz der neutrophilen Granulozyten in OVA-behandelten KO Mäusen 4-fach so hoch an, gegenüber den OVA WT Mäusen. Mit diesem statistisch signifikanten Unterschied, ist das die deut- lichste Veränderung zwischen den Genotypen. 158 Ergebnisse 600 ** Makrophagen 500 Lymphozyten eosinophile Granulozyten 400 neutrophile Granulozyten 300 200 100 0 WT PBS KO PBS WT OVA KO OVA Abb. 56: Analyse der zellulären Infiltration in der BAL nach Sensibilisierung mit OVA in WT und KSRP-defizienten Mäusen Die Versuchstiere wurden wie in Abb. 4 behandelt und 48 Stunden nach der letzten Provokation die Lunge mit 1 ml Kochsalz- lösung ausgespült. Diese Spülflüssigkeit wurde sedimentiert, die gewonnenen Zellen aus der Spülflüssigkeit wurden auf Ob- jektträgern zentrifugiert und anschließend nach Angaben des Herstellers mittels Diff-QuickÒ Färbeset gefärbt. Die gemessene Frequenz der jeweiligen Immunzellpopulationen aus den PBS-behandelten WT Mäusen wurden als 100 % definiert und dien- ten damit als Kontrollwert. Die Frequenz der Immunzellpopulationen aus anderen Gruppen wurden auf den PBS-behandelten WT bezogen. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert + Standardfehler von fünf untersuchten Mäusen pro Gruppe gebildet. Statistik: **p < 0,01; One-way ANOVA. 159 Relative Frequenz der Zellen in der BAL [x-fach WT BPS] Ergebnisse 4.8.3 Histologische Analysen zur Ermittlung des Entzündungsgrades und der Mukusproduktion in der Lunge Um weitere lokale Entzündungen zu visualisieren und zwischen den Genotypen zu vergleichen, wurden histologische Schnitte des Lungengewebes unter Leitung von Frau Claudia Braun in der histologischen Core Facility der Universitätsmedizin Mainz angefertigt. Dadurch werden mit Hilfe der H&E-Färbung die Zellkerne blau angefärbt und ermöglicht somit die Beurteilung der Zellinfiltration. Die Ermittlung des Entzün- dungsgrades des Lungengewebes gibt weitere Anhaltspunkte zur Schwere der Asth- maerkrankung. Abb. 57: Bestimmung des Entzündungsgrades in der Lunge nach Sensibilisierung mit OVA in WT und KSRP-defizienten Mäusen Dargestellt sind repräsentative 10-fach vergrößerte Gewebeschnitte der Lunge von Kontroll- (PBS) und Sensibilisierten (OVA) Mäusen, die mit H&E gefärbt wurden. Die lichtmikroskopischen Aufnahmen, wurden mit dem Nano Zoomer Scanner erstellt und die Auswertung erfolgte mit der NDP.view2 Software. 160 Ergebnisse In Abb. 57 wurden die H&E gefärbten Lungenschnitte der OVA/PBS-behandelten Ver- suchstieren qualitativ auf Zellinfiltration (Migration) und Gewebeschädigung unter- sucht. In Teilabb. 57A ist ein H&E gefärbter Lungenschnitt einer repräsentativen PBS- behandelten WT Maus dargestellt. Zu sehen ist mittig im Bild ein Blutgefäß flankiert von zwei Bronchien, die restlichen homogenen Muster charakterisieren die Alveolen. In Teilabb. 57B sind ebenfalls mehrere Querschnitte von Bronchien aus einer PBS- behandelten KO Maus zu erkennen. Diese wirken von der Färbung leicht dunkler im Vergleich zur WT Maus. OVA-behandelte WT Mäuse zeigen wie in Teilabb. 57C deut- lich zu erkennen mehr akkumulierte Zellen um die Bronchien herum, der Bereich ist unverkennbar dunkler und das Gewebe scheint beschädigt und aufgerissen zu sein. Der Gewebeschnitt von einer mit OVA behandelten KSRP-defizienten Maus (Teilabb. 58D) zeigt deutlich größere und dunklere Bereiche um die Bronchien herum. Hier scheinen auch deutlich mehr Immunzellen an den Alveolen versammelt vorzuliegen. Die vermehrte Mukusproduktion, durch die Becherzellen im Epithel der Atemwege, ist neben der beschriebenen Entzündungsreaktion in der Lunge, ein weiteres charakte- ristisches Merkmal für Asthma bronchiale. Dabei kommt es zur Verengung der Bron- chien, was zu einer Erschwerung der Atmung führt. Mukusproduzierende Becherzellen werden mittels der periodic acid-schiff (PAS)-Färbung purpurviolett dargestellt (s. K. 3.4.6.1.5). Abb. 58 zeigt repräsentative PAS-Schnitte von OVA/PBS-behandelten KSRP KO und WT Mäusen. Wie zu erwarten, konnten keine mukusproduzierenden Becherzellen in den beiden PBS Kontroll-Gruppen (Teilabb. 58 A+B) nachgewiesen werden. Bei den OVA-behandelten Mäusen beider Genotypen konnte im Vergleich zu unbehandelten Mäusen eine vermehrte Schleimproduktion festgestellt werden (Teilabb. 58 C+D). Die Pfeile markieren die purpurvioletten gefärbten Becherzellen (PAS+ Zellen). 161 Ergebnisse Abb. 58: Bestimmung der Mukusproduktion in der Lunge nach Sensibilisierung mit OVA in WT und KSRP-defizienten Mäusen Dargestellt sind repräsentative 10-fach vergrößerte Gewebeschnitte der Lunge von Kontroll- (PBS) und Sensibilisierten (OVA) Mäusen, die mit PAS gefärbt wurden. Die PAS+ Zellen weisen auf mukusproduzierende Zellen hin, die vereinzelnd mit den schwarzen Pfeilen markiert werden. Die lichtmikroskopischen Aufnahmen, wurden mit dem Nano Zoomer Scanner erstellt und die Auswertung erfolgte mit der NDP.view2 Software. Wie bereits unter Kapitel 2.4.6.1.6 beschrieben erfolgte die Quantifizierung nach ma- nueller Auszählung der schleimsezernierenden Becherzellen im Verhältnis zu den bronchialen Epithelzellen. Der prozentuale Anteil der mukusproduzierenden Becher- zellen liegt bei OVA-behandelten KO Mäusen bei ca. 20 % und damit 10 % höher als bei OVA-behandelten WT Mäusen. 162 Ergebnisse ns= 0,07 30 20 10 0 WT (OVA) KO (OVA) Abb. 59: Quantifizierung der Mukusproduktion in der Lunge nach Sensibilisierung mit OVA in WT und KSRP-defizienten Mäusen Die Anzahl an positiven Becherzellen per Bronchiole wurde ermittelt und auf die Gesamtzahl der bronchialen Epithelzellen der Basalmembran bezogen. Zusammengefasst wurden drei bis fünf Bronchien pro Tier und drei bis vier Mäuse pro Gruppe und als Mittelwert + Standardfehler dargestellt. Statistik: ns = nicht signifikant, T-Test. Die OVA-sensibilisierten KSRP-defizienten Mäuse zeigen mit einer signifikant höheren Atemwegshyperreaktivität funktionelle Einschränkungen und damit eine prominentere Krankheitssymptomatik im Vergleich zu OVA-behandelten WT Mäusen. Die Auswer- tung der BAL-Flüssigkeit ergab einen signifikanten Anstieg an neutrophilen Granulozy- ten in den Lungen von OVA-behandelten KO Mäusen, dies konnte mit der höheren Zell-Filtration in den pathohistologischen, H&E gefärbten Lungenschnitten bestätigt werden. Auch der höhere prozentuale Anteil an mukusbildenden Becherzellen in KSRP-defizienten Mäusen bestätigt den höheren Schwergrad der Entzündung der Atemwege. 163 Mukusproduktion in % Diskussion 5. Diskussion RNA-BP sind in diversen Regulationen der Genexpression involviert. In der vorliegen- den Arbeit liegt der Fokus auf dem regulatorischen RNA-BP KSRP und dessen Ein- fluss auf die Immunzellfunktion und -aktivität. Die Funktion sowie Aktivität von Immun- zellen wird vor allem durch soluble Mediatoren wie Zytokinen beeinflusst, deren Ex- pression wiederum durch RNA-BP moduliert wird [96]. Damit Immunzellen schnell auf pathogene Signale mit einer passenden Immunantwort reagieren können, werden Zy- tokin-kodierende mRNA-Moleküle in spezifischen zytoplasmatischen Strukturen, den Granula, gespeichert sodass die Translation zu einem funktionellen Protein schneller vonstattengehen kann, als durch Initiation einer neuen Transkription möglich wäre [37]. Die 3’-UTR der meisten Zytokin-kodierenden mRNA-Moleküle weisen ARE-Sequen- zen auf, wodurch die Bindung von RNA-BP ermöglicht und die damit verbundene Re- gulation der Translation oder deren Abbau begünstigt werden. Unterschiedliche Publikationen zeigen, dass RNA-BP die RNA-Stabilität von Zytokinen sowohl positiv als auch negativ beeinflussen können [34, 36, 40, 41, 43, 46]. So zeigt die Publikation von Chen et al., dass das RNA-BP HuR an die mRNA von IL-17 bindet, wodurch eine Stabilisation des Transkripts erfolgt, was in einer erhöhten IL-17 mRNA- und Protein-Menge resultiert [254]. Die Abwesenheit von HuR verringert die IL-17 Ex- pression in dem Mausmodell der multiplen Sklerose (experimentelle autoimmune En- zephalomyelitis, EAE) und reduziert somit die Krankheitssymptomatik. Des Weiteren konnte in ex vivo Ergebnissen gezeigt werden, dass die Anwesenheit des RNA-BP HuR einen positiven Effekt auf die RNA-Stabilität von TH2-assoziierten Zytokinen (IL- 4 und IL-13) hat [52-54]. Allerdings konnte die Untersuchung von Gubin et al. entgegen den vorliegenden Befunden nachweisen, dass trotz der Abwesenheit von HuR in ei- nem HuR Knockout-Mausmodell höhere Zytokinmengen an IL-5 und IL-13 vorlagen [55]. Auch in vivo wurde die Pathogenese einer TH2-dominierenden Erkrankung (Asthma) unter Berücksichtigung des HuR-KO charakterisiert. Obwohl in vitro der Einfluss von HuR auf die Expression von TH2-assoziierten Zytokin-mRNAs bereits nachgewiesen 164 Diskussion wurde, konnte im Gesamtorganismus der HuR-defizienten Mäuse auf Grund der Kom- plexität kein wesentlicher Unterschied in der Krankheitssymptomatik im Vergleich zu den Kontroll-Mäusen festgestellt werden. Die vorgestellten Untersuchungen zeigen, wie wichtig die Betrachtung der RNA-BP- vermittelten Regulation der Genexpression im Gesamtorganismus ist. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit versucht, in unterschiedlichen Krankheitsmodellen den bedeu- tenden Einfluss des RNA-BP KSRP vor allem während inflammatorischer Prozesse zu untersuchen und zu verstehen. Das RNA-BP Tristetraprolin (TTP) zählt wie KSRP zu den mRNA negativ (destabilisie- renden) regulierenden Bindeproteinen, da die Expression ihrer Ziel-Gene verringert wird [40-42]. Bros et al. konnte in seinen Untersuchungen (in vitro) in unstimulierten TTP-defizienten DC eine verringerte Expression von kostimulatorischen Molekülen wie CD40 und CD86 gegenüber den unstimulierten WT DC demonstrieren [58]. Da aber der Aktivierungszustand von DC (APC) Einfluss auf die T-Zell stimulatorische Kapazi- tät nimmt, scheint der veränderte Aktivierungszustand von unstimulierten TTP-defizi- enten DC die Proliferation von naiven T-Zellen zu unterdrücken. Weiterhin wurden im Vergleich zu WT DC höhere Mengen an IL-1b mRNA sowie geringere Mengen an TNF-a und IL-10 mRNA in TTP-defizienten DC nachgewiesen. In TTP-defizienten Makrophagen wurden im Vergleich zu WT Makrophagen hingegen höhere Level an TNF-a und GM-CSF gemessen [255, 256]. Ebenfalls konnte in TTP-defizienten Mäu- sen eine extreme Überexpression von pro-inflammatorischen Zytokinen gezeigt wer- den, die wiederum zu einem für RA-Patienten typischen chronisch-entzündlichen Phä- notyp beitragen [57-60]. Dies lässt die Vermutung zu, dass auch in KSRP-defizienten Mäusen der Verlauf von chronischen Erkrankungen verändert sein könnte. Auch für das mRNA destabilisierende RNA-BP KSRP konnte vereinzelnd nachgewie- sen werden, dass es an der Regulation der Aktivität von Immunzellen beteiligt ist. So wurde beispielsweise in KSRP-defizienten Astrozyten eine erhöhte Produktion von TNF-a sowie IL-1b im Vergleich zu Kontroll-Tieren beobachtet [47]. Andere Publikati- onen zeigen, dass in Peritonealzellen (adhärente Monozyten und Makrophagen) von KSRP-defizienten Mäusen die mRNA-Expression von pro-inflammatorischen Media- toren (z.B. TNF-a und iNOS) im Vergleich zu den der Wildtyp-Tieren ebenfalls erhöht vorliegt [46, 49, 215]. Des Weiteren wurden in einem Tiermodell (EAE) mit KSRP-de- 165 Diskussion fizienten Mäusen signifikant erhöhte Mengen an Interferonen (-a und -b), nachgewie- sen, die wiederum zur Verringerung der Krankheitssymptomatik und zum erhöhten Schutz gegen Virus-Infektionen beitragen [49, 50]. Es konnte zudem vereinzelnd dar- gestellt werden, dass bei inflammatorischen Erkrankungen die Beteiligung von regula- torischen RNA-BP maßgeblich ist [57, 60, 61, 254, 257, 258]. Daher liegt der Verdacht nahe, dass auch KSRP an der Pathogenese von inflammatorischen Erkrankungen be- teiligt sein könnte. 5.1 Einfluss von KSRP-KO auf den Krankheitsverlauf von CAIA Um zu verstehen, welche Relevanz KSRP für immunologische Erkrankungen (wie bspw. RA und Asthma) hat, wurde in der vorliegenden Arbeit die Pathogenese von chronisch-inflammatorischen Erkrankungen in vivo untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die CAIA-Methode (s. Kapitel 1.6.3.2 u. 3.4.4) als etabliertes Mausmodell für chronisch-inflammatorische Erkrankungen gewählt, da sich hierbei unabhängig vom genetischen Mausstamm-Hintergrund eine Arthritis induzie- ren lässt. Die Untersuchungen zur KSRP-Funktion wurden an Mäusen durchgeführt, bei denen ein inaktiviertes KSRP-Gen (KSRP KO) vorlag und die unter Kontrollbedin- gungen keine phänotypischen Veränderungen zum Wildtyp aufwiesen [49]. Dabei konnte gezeigt werden, dass die CAIA-behandelten KSRP-defizienten Mäuse einen signifikant geringeren Arthritis Index (AI) im Vergleich zu WT Mäusen aufwiesen (Abb. 47). In Abwesenheit von KSRP entwickelt sich die Krankheitssymptomatik der Arthritis verspätet und deutlich geringer. Dieser unerwartete Befund wiederspricht den Ergebnissen aus der gesichteten Litera- tur [29, 32, 35, 45-47]. So konnten die angeführten Publikationen belegen, dass KSRP als negativer Regulator durch die Bindung an die ARE-Sequenzen in der 3’UTR der mRNAs von pro-inflammatorischen Proteinen (IL-6, IL-8, iNOS und TNF-a), deren mRNA-Abbau begünstigt. Somit konnte in Abwesenheit von KSRP ein erhöhtes pro- inflammatorisches Milieu nachgewiesen werden, weshalb eine verstärkte (pro-in- flammatorische) CAIA-Symptomatik in KSRP-defizienten Mäusen erwartet wurde. 166 Diskussion Übereinstimmend mit dem geringeren AI, zeigte die histologische Übersichtsfärbung eine geringere Infiltration von Immunzellen in den Pfoten von KSRP-defizienten Mäu- sen (Abb. 48). Dabei handelte es sich vor allem um myeloide Zellen (CD11b+, CD68+ und Ly6G+ Zellen), was bereits Frau Schrick in ihrer Arbeit darstellen konnte [259]. Wie ebenfalls aus der Literatur bekannt, stellen vor allem die myeloiden Zellen die haupt- beteiligte Immunzellpopulation dar, die in diesem Mausmodell die CAIA-Symptomatik vorantreiben [175, 176, 178, 260]. Somit scheint die verringerte myeloide Zellzahl zur Reduktion der Krankheitssymptomatik beizutragen. Im Rahmen der CAIA verursachen die gegen Kollagen II gerichteten autoreaktiven Antikörper Entzündungen, indem sie an Gelenkknorpel binden und das Komplement- system beeinflussen [176, 261]. Hierbei können entstehende Komplementfragmente die Sezernierung von pro-inflammatorischen Mediatoren in der Umgebung der Ge- lenke induzieren. Diese Fragmente binden wiederum an Immunkomplexen an oder aktivieren lokale Zellen durch die Bindung an die Fc-Rezeptoren (FcR-Vernetzung). Bei diesen Prozessen werden Monozyten/Makrophagen und neutrophile Granulozyten rekrutiert, die sowohl als Hauptverursacher von CAIA fungieren aber auch gleichzeitig verantwortlich für die Progression dieser Erkrankung zu sein scheinen [175, 176, 178]. In einer weiteren Publikation konnte gezeigt werden, dass im CAIA-Modell die Behand- lung mit Antileukoproteinkeinase, welche die Serin Protease-Aktivität in Leukozyten inhibiert, zu einem Funktionsverlust führt, der vorranging bei neutrophilen Zellen ein- setzt. Dieser Vorgang resultiert wiederum in einer deutlich verringerten Krankheits- symptomatik [260]. Einen regulatorischen Einfluss auf die Pathogenese scheinen da- gegen T- und B-Lymphozyten zu haben, da die Abwesenheit dieser Lymphozyten die Suszeptibilität für CAIA in Mäusen verstärkt [177]. Auch unsere Experimente liefern Hinweise, dass der KSRP KO über Modulation der Lymphozyten den Verlauf der CAIA beeinflussen könnte (s. 5.1.1). In unseren Untersuchungen lag der Fokus unter anderem auf der Charakterisierung der Immunzellverteilung von KSRP-defizienten Mäusen im Vergleich zu WT Mäusen. Daher wurden insbesondere Frequenz-Analysen von Milzzellen am neunten Tag nach CAIA-Induktion in WT und KSRP-KO durchgeführt. In diesem Zusammenhang war vor allem die Frage interessant, ob nach der Antikörper- Applikation Genotyp-spezifische Unterschiede in der Frequenz der Immunzellen auftreten. Durch die Vorteile der ein- fachen Isolation und hohen Ausbeute an Milzzellen, wurde dieses Organ als primäre 167 Diskussion Immunzell-Quelle verwendet (Kapitel 3.2.5). Für die Charakterisierung dieser Immun- zellen wurden typische Oberflächenmarker für myeloide Zellen (CD11b), Makropha- gen (CD68), B-Zellen (CD19), DC Marker (CD11c) und Aktivierungsmarker CD86 ver- wendet (Abb. 49 u. Abb. 50). Aus den Untersuchungen der Milz wird deutlich, dass am neunten Tag nach der Anti- körper-Behandlung die Anzahl der Immunzellen (mit Ausnahme von CD68+ und CD11b+ Zellen) in den behandelten Tieren geringer waren als bei Kontrolltieren. Über- einstimmend mit den myeloiden Zellpopulationen aus dem Blut (Abb. 16), konnte auch hier nach einer zusätzlichen LPS-Behandlung eine signifikant verringerte CD11b-Fre- quenz in KSRP-defizienten Mäusen im Vergleich zu den WT Mäusen verzeichnet wer- den (Abb. 49). Dies wurde durch Untersuchungen der mittleren Fluoreszenzintensität bezüglich der CD11b-Expression bestätigt (Anhang: Abb. 71). Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Frequenz von CD11b+ Zellen in Abwesen- heit von KSRP im peripheren Blut unter basalen Bedingungen signifikant reduziert ist (Abb. 16). Dieser Effekt zeigte sich ebenfalls am neunten Tag nach einer CAIA-Induk- tion in LPS-stimulierten Milzzellen sowie in den Pfoten der Mäuse (Abb. 49 A und Abb. 48). In einer aktuellen Publikation wird das regulatorische posttranskriptionelle Netz- werk vorgestellt, welches in dem Prozess der myeloiden Differenzierung involviert ist [262]. KSRP stellt hierbei den Hauptakteur dar. In dieser Publikation konnte gezeigt werden, dass KSRP die Biogenese (Prozessierung) der miRNA-129 vermittelt (s. Ka- pitel 1.2), welche einen negativen Einfluss auf RUNX1 (run related transcription factor 1) nimmt. RUNX1 unterdrückt wiederum die Granulozyten-Differenzierung durch die Hemmung des G-CSF (granulocyte colonie stimulating factor) Rezeptors und der ver- stärkten Expression des M-CSF Rezeptors. Durch die Aufregulation von miRNA-129, welche durch KSRP begünstigt wird, kann RUNX1 blockiert werden, woraus eine ver- stärkte Granulozyten-Differenzierung sowie eine erhöhte CD11b-Frequenz resultieren. Bei KSRP-KO bleibt demnach die verstärkte miRNA-129 Prozessierung aus, wodurch die Expression von RUNX1 nicht mehr blockiert wird und die Monozyten-Differenzie- rung begünstigt werden kann. Damit lässt sich die verringerte Frequenz an myeloiden CD11b+ Zellen bei Abwesenheit von KSRP erklären. Da die myeloide Zellpopulation entscheidend zur Entwicklung und Progression der Krankheitssymptomatik in CAIA beiträgt, könnte die Verringerung der Zellpopulation in 168 Diskussion einer verringerten Arthritis-Induktion in Mäusen mit inaktiviertem KSRP-Gen resultie- ren [175-178, 260]. Weiterhin könnte man die Expression der miRNA-129 in KO Tieren bspw. mit Hilfe eines PCR-Systems untersuchen, um so eine mögliche verringerte Ex- pression aufzeigen zu können und dadurch Rückschlüsse auf den Einfluss von KSRP auf die CAIA-Entwicklung zu ziehen. Die Auswirkungen des KSRP Knockdowns im CAIA-Modell wurden zusätzlich zu ei- nem früheren Zeitpunkt untersucht (Abb. 3). Dazu wurde die Immunzellphänotypisie- rung bereits am fünften Tag nach der CAIA-Behandlung durchgeführt, um in der Ef- fektorphase der Immunzellen weitere Unterschiede auf Immunzell-Ebene aufzeigen zu können. Allerdings konnten hierbei keine neuen Genotyp-spezifischen Erkenntnisse erlangt werden. Bezogen auf die Gesamt-Frequenz einzelner Zelltyp-spezifischer Oberflächenmarker (Abb. 52) zeigte sich eine deutlich erhöhte Immunzell-Anzahl im Vergleich zu den Nicht-Antikörper-behandelten Kontrolltieren. Diese Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass an Tag fünf nach Applikation der monoklonalen Antikörper die Immunzellen Genotyp-unabhängig zwecks Induktion einer Immunantwort aufreguliert werden, da die Zellpopulationen in der Milz an Tag neun in vergleichsweise geringeren Frequenzen vorkommen. Eine Ausnahme stellen myeloide Zellen dar, da diese auch am neunten Tag nach CAIA-Induktion in Vergleich zu anderen Immunzellen in der Milz mit einer erhöhten Frequenz einhergehen (Abb. 49). Während der akuten Phase im CAIA wird die Gelenkinfiltration überwiegend durch myeloide Zellen wie bspw. neutrophile Granulozyten und Makrophagen dominiert [175, 176]. Tatsächlich konnte bereits nachgewiesen werden, dass schon insbesondere psychologischer Stress sich negativ auf die Verteilung der Immunzellen auswirkt [263]. Vor allem sollen in vivo die während dem Stress freigesetzten Glucocorticoide (Hor- mone) immunsuppressiv wirken. Bailey et al. beschreibt in seiner Arbeit, dass nicht alle Immunzellpopulation von dem Stress betroffen seien und insbesondere myeloide CD11b+ Zellen aber auch Granulozyten deutlich in einem höheren prozentualen Anteil in der Milz im Vergleich zu anderen Immunzellpopulationen vorzufinden sind [264]. Da die CAIA-Behandlung und die damit entstehenden Schmerzen der Mäuse möglicher- weise ebenfalls zu Stress führen, könnte auch dadurch vermutlich die deutlich höhere myeloide Immunzell-Frequenz an Tag neun nach CAIA-Behandlung begründet wer- 169 Diskussion den. Dieser Befund deckt sich auch mit der Genotyp-unabhängigen Zunahme der Fre- quenz von myeloiden Zellen in Mäusen nach CAIA-Behandlung gegenüber den Kon- troll-Tieren. 5.1.1 Effekt von Lymphozyten auf die Induktion von CAIA Wie bereits erwähnt, kann die Induktion von CAIA unabhängig von B- und T-Lympho- zyten stattfinden [177]. Die Depletion von T- und oder B-Lymphozyten führt sogar zu einer stärker ausgeprägten Krankheitssymptomatik. Aus diesem Grund wird die Betei- ligung regulatorischer Lymphozyten-Subpopulationen in der Pathogenese dieser chro- nisch-inflammatorischen Immunerkrankung diskutiert. Über adaptive humorale aber auch zellvermittelte Immunantworten sind die T-Zellen in der Lage, auch mit dem an- geborenen Immunsystem zu interagieren und damit übergreifende Funktionen auszu- üben. Dass regulatorische RNA-BP auch T-Zell-Differenzierung modulieren, konnte bereits für HuR und TTP gezeigt werden. HuR beeinflusst nicht nur den TH2-assozi- ierten Transkriptionsfaktor GATA-3, sondern stabilisiert auch die mRNA der TH2-ver- mittelten mRNA der Zytokine IL-4 und IL-13 [52-55]. Ebenso wurde bereits erwähnt, dass TTP neben TNF-a und GM-CSF auch die mRNA von IL-2 negativ beeinflusst [59, 60, 258]. IL-2 wird neben NK- und B-Zellen überwiegend von aktivierten T-Zellen pro- duziert. Zudem dient es als Zellwachstumsfaktor und steigert autokrin die Zellprolife- ration [98, 243, 246, 247, 265]. Auch KSRP scheint IL-2 negativ zu modulieren, indem es an die 3’UTR der IL-2 mRNA bindet und deren Abbau durch Rekrutierung der De- gradationsmaschenerie begünstigt [32]. In diesem Zusammenhang sollen T-Zellen in Abwesenheit von KSRP näher untersucht werden. Unter basalen Bedingungen wurde die Frequenz der CD3CD4 und CD3CD8 doppelt positiven T-Zellen im peripheren Blut (Abb. 17), sowie in der Milz (Abb. 35) untersucht. Zusätzlich wurde der Aktivierungszustand dieser T-Zell-Subpopulationen mit der De- tektion des typischen T-Zell-Aktivierungsmarkers CD25 nachgewiesen (Abb. 36). Bei der Untersuchung zeigten sich keine Frequenz-Unterschiede zwischen KSRP-defizi- enten T-Zellen und Kontroll-T-Zellen. Auch die Viabiliäts-Assays zeigten keine Geno- typ-spezifischen Unterschiede (Abb. 37 u. Abb. 38). Demnach scheint KSRP in der 170 Diskussion Peripherie unter basalen Bedingungen in naiven T-Zellen keinen Einfluss auf den klas- sischen CD4+ und CD8+ T-Zell-Immunphänotyp zu nehmen. Ob KSRP zu funktionalen Veränderungen nach polyklonaler Stimulation führt, sollte mit T-Zellproliferations-As- says überprüft werden (Kapitel 3.2.7). Damit T-Zellen effektiv ihre Aufgaben im Im- munsystem ausüben können, sollten sie proliferieren, um hierfür eine ausreichende Anzahl an Effektor T-Zellen zur Bekämpfung des Antigens zur Verfügung zu stellen [266]. Die aus der Milz isolierten T-Zellen KSRP-defizienter Mäuse zeigten in den un- terschiedlichen T-Zell Konzentrationen einen tendenziell höheren Einbau des 3H-Thy- midins und somit eine moderat höhere Proliferation (Abb. 39). Um genauere Aussagen über die T-Zell-Subpopulationen treffen zu können, wurden die kompletten T-Zellen aus der Milz mit Hilfe des MACS-Systems nach CD4 und CD8 positiven T-Zellen se- pariert und ebenfalls polyklonal stimuliert (Kapitel 3.2.5.2 u. 3.2.6). Mit dieser Untersu- chung konnte deutlich gezeigt werden, dass die CD4+ TZ-Subpopulation der KSRP- defizienten Mäuse im Vergleich zu den Kontroll-Zellen eine signifikant höhere Prolife- rationsrate aufwiesen, während die Proliferation von CD8+ TZ-Subpopulationen Geno- typ-unspezifisch unverändert blieb (Abb. 43). Um diese Ergebnisse zu überprüfen, wurde der Aktivierungszustand der polyklonal stimulierten TZ-Subpopulationen mit Hilfe von FACS-Analysen untersucht (Kapitel 4.6.1). Auch hier wird deutlich, dass die CD4+ T-Zellpopulation eine signifikant erhöhte Frequenz an aktivierten CD25+ T-Zellen aufweisen (Abb. 41), während die CD8+ T-Zellen Genotyp-unabhängig vergleichbare Level des Aktivierungsmarkers CD25 exprimieren (Abb. 42). Diese verstärkte T-Zell- Proliferation der CD4+ Subpopulation, könnte die Entstehung und die Progression von Entzündungen, sowie von Autoimmunerkrankungen und Allergien entscheidend be- einflussen [106, 267-269], da insbesondere die Aktivierung der Proliferation von CD4+ Effektor-T-Zellen unter anderem entscheidend über das Ausmaß der Krankheits- Symptomatik in allergischem Asthma bestimmen [270]. Auch bei der rheumatoiden Arthritis zählen die CD4+ T-Zellen zur Haupt-Zellpopulationen im entzündlichen Infiltrat in Syniovialgelenken von RA-Patienten [271]. Weiterhin wurden auch Proliferations- Assays mit Gesamt-T-Zellen aus CAIA-behandelten Mäusen durchgeführt, wobei je- doch keine Genotyp-spezifischen Unterschiede festgestellt werden konnten (Daten nicht gezeigt). In diesem Fall müsste man wie in Kapitel 3.2.5.2 beschrieben, mit Hilfe des MACS-Systems die CD4 und CD8 positiven T-Zell separieren, um die Proliferation der jeweiligen T-Zell-Subpopulationen bestimmen zu können. Auch im Asthma-Modell (s. Kapitel 4.8) steht die Untersuchung der CD4+ T-Zell-Proliferation noch aus und 171 Diskussion sollte bei Wiederholung des Experiments ebenfalls untersucht werden, um so die sig- nifikant höhere Proliferationsrate in KSRP-defizienten polyklonal stimulierten T-Zellen zu bestätigen. 5.2 Einfluss von KSRP-KO auf die Immunzellen Bereits vor der CAIA-Induktion wurden die Immunzellen von KSRP-defizienten Mäu- sen aus unterschiedlichen Geweben (Knochenmark, Blut und Milz) mit Hilfe von FACS-Analysen phänotypisch charakterisiert und mit den Immunzellen der Wildtyp- Mäusen verglichen (Kapitel 4.1). In diesem Zusammenhang wurden die Immunzellen mit dem pathogenen Stimulus (LPS) aktiviert, um auch Aussagen über den Reifungs- zustand zu ermöglichen. Die Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen wurden durch Zugabe von GM-CSF und M-CSF zu BM-DC und BM-Mf differenziert und anschlie- ßend mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern charakterisiert (Kapitel 4.1.1). Für diese Zellpopulationen konnten keine Genotyp-spezifischen Unterschiede in der Frequenz beobachtet werden. Die isolierten PBMC aus KSRP-defizienten Mäusen zeigten jedoch im Vergleich zu WT Mäusen eine signifikant reduzierte Frequenz an myeloiden CD11b+ Zellen und Ly6G+ Granulozyten (Abb. 16), während die adaptiven T- und B-Lymphozyten keine Unterschiede in der Frequenz zwischen den Genotypen aufwiesen (Abb. 17). Weitere signifikante Unterschiede in der Frequenz zeigten sich an Hand von isolierten LPS-stimulierten Milzzellen (Kapitel 4.1.3). Sowohl pDCs (CD11b-CD11b+) als auch B- Zellen (CD11b-CD19+) waren in einer signifikant höheren Frequenz in den Milzzellen von KSRP KO Mäusen vorhanden (Abb. 19). In diesem Fall konnte auch für myeloide CD11b+ Zellen ein signifikant erhöhter Aktivierungszustand nach LPS-Stimulation be- obachtet werden (Abb. 21). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die Immunzellen nicht nur Genotyp-spezifisch, sondern auch Gewebe-spezifisch in unterschiedlicher Frequenz vorliegen. 172 Diskussion Besonders deutlich wurde dieser Unterschied im peripheren Blut beobachtet. Hierbei zeigte sich, dass sowohl myeloide CD11b+ Zellen als auch Ly6G+ neutrophile Gra- nulozyten in einer signifikant reduzierten Frequenz in KSRP-defizienten Mäusen vor- kamen. Dieser Befund lässt vermuten, dass die KSRP-defizienten Mäuse bereits unter basalen Bedingungen eine verringerte Anzahl an Immunzellen besitzen, welche für die CAIA Entstehung und Progression essentiell sind [175, 176, 178]. Warum die besag- ten Unterschiede in der Frequenz von myeloiden KSRP-defizienten CD11b+ Zellen auftreten, wurde bereits in Kapitel 5.1 diskutiert. So scheint der Einfluss von KSRP auf die Biogenese (erhöhte Prozessierung) von miR-129 über RUNX1 die myeloide Zell- Differenzierung zu beeinflussen [262]. Warum jedoch die Unterschiede in der Fre- quenz der Immunzellen unter basalen Bedingungen Genotyp-spezifisch insbesondere zwischen Milzzellen und PBMC auftreten und nicht bereits schon im Knochenmark nachgewiesen werden können, kann noch nicht sicher beantwortet werden. Nahelie- gend wäre allerdings die Tatsache, dass die Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzel- len durch eine erhöhte externe Zugabe der Differenzierungsfaktoren M-CSF und GM- CSF gezielt die Differenzierung begünstigen würden, während bei untersuchten Im- munzellen aus der Peripherie (Blut u. Milz) die Differenzierung weitgehend auf natürli- chem/physiologischem Wege durch die Anwesenheit bzw. Abwesenheit von KSPR bestimmt wird. Auch in anderen RNA-BP-KO Mäusen konnten schon ähnliche Verschiebungen der Immunzellfrequenz nachgewiesen werden, wie bspw. in vivo von TTP-defizienten Mäusen. So konnte ein prozentual verringerter Anteil an B- und T-Zellen und zusätzlich eine erhöhte Anzahl an NK sowie an myeloiden Zellen wie Granulozyten und Makro- phagen in Abwesenheit von TTP nachgewiesen werden, wodurch der modulierende Einfluss des RNA-BP TTP auf einzelne Immunzelltypen deutlich wurde [255, 256]. Die Immunfrequenz Unterschiede werden insbesondere aufgrund der verstärkten Anwe- senheit von GM-CSF begründet, da TTP die Stabilität der GM-CSF-mRNA negativ re- guliert und das Fehlen dieses RNA-BP in höheren Mengen GM-CSF resultiert, was wiederum die Granulozyten und die Monozyten Differenzierung positiv beeinflusst. Die verringerte Anzahl an CD11b+ sowie Ly6G+ Immunzellen in KSRP-defizienten Mäusen könnte mit der geringeren Infiltration von Immunzellen in den Pfoten der Tiere an Tag neun nach CAIA Induktion korrelieren (Abb. 48). Dieser Befund, wurde von Frau Schrick ebenfalls mittels mRNA-Analysen bestätigt, indem mRNA Expressionen 173 Diskussion von spezifischen Markergenen der Immunzellen gemessen wurden [259]. Diese Un- terschiede in der Immunzell-Frequenz können auf verschiedene Faktoren zurückzu- führen sein. Eine naheliegende Erklärung für die verringerte Immunzell-Anzahl könnte durch eine geringere Viabilität der Zellen begründet sein, sodass dieser Umstand un- tersucht werden sollte (Kapitel 4.2). Dadurch kann geklärt werden, ob KSRP mit den Mechanismen der zellulären Apoptose und Nekrose interferiert, wodurch eine gerin- gere Zellzahl begründet wäre. Des Weiteren könnte eine gestörte Migration der Zellen die verringerte Frequenz von myeloiden Zellen in der Peripherie und in den Pfoten verursachen. Dies führt als Kon- sequenz zu einer verringerten Inflammation innerhalb der Krankheitssymptomatik. 5.2.1 Viabilität von Immunzellen Bei Einschränkungen der Viabilität von Zellen findet man oft morphologische Verän- derungen der Zelle, die vor allem zum Zelltod führen können. Dabei unterscheidet man zwischen der zufälligen ungeordneten Form des Zelltodes (Nekrose) und dem pro- grammiert gesteuerten Zelltod (Apoptose), der von der Zelle selbst durchgeführt wird. Jedoch lassen sich Apoptose und Nekrose nicht immer voneinander trennen und wer- den daher auch als Aponekrose bezeichnet [272]. Bei der Untersuchung der zellulären Apoptose- und Nekroserate wurden unterschied- liche Immunzelltypen sowohl unter basalen Bedingungen als auch nach Stimulus, be- trachtet. Dabei wurden Substanzen verwendet (TNF-a und LPS), die proapoptotische Effekte in den Zellen begünstigen (Kapitel 4.2). Die genannten Substanzen sind in der Lage über die Bindung der Todesrezeptoren (bspw. TNF-Rezeptor 2, TNFR2) intra- zelluläre Signalkaskaden (bspw. nuclear factor kappaB, NFkB) zu induzieren, die über Aktivierung von Caspasen letztendlich zum Zelltod (Apoptose) führen [228, 273]. Da wie bereits erwähnt sowohl TTP als auch KSRP die Stabilität von TNF-a negativ regu- lieren, beeinflussen diese RNA-BP indirekt die Aktivierung der Todesrezeptoren und somit die daran gekoppelten Signalkaskaden. 174 Diskussion Es erwies sich hierbei, dass die untersuchten Immunzellpopulationen aus dem Kno- chenmark sowie aus der Milz unabhängig von der Behandlung, keine Unterschiede zwischen den Genotypen in der Viabilität aufwiesen (Abb. 23 und Abb. 24). Wiederer- wartend zeigte sich hierbei jedoch die Genotyp-unspezifische Abnahme der Apopto- serate nach LPS-Behandlung in der Milz. Als mögliche Erklärung könnte hierfür die unterschiedliche Zusammensetzung, der Immunzellpopulation dienen. Denn die Im- munzellpopulation in der Milz ist weitgehend heterogen und enthält eine hohe Anzahl an T-Zellen, die wiederum für das Überleben von Immunzellen relevant sein könnten [274]. So können diese T-Zellen nach eigener Stimulation in Kontakt mit aktivierten APC treten und somit die APC mit Hilfe von Überlebenssignalen am Leben halten. Durch LPS lassen sich T-Zellen in der Regel nicht stimulieren, da die klassischen Re- zeptoren wie Toll-like Rezeptoren (TLR) auf den T-Zell-Oberflächen nicht exprimiert werden, wobei die Untersuchungen von Tough et. al eine LPS-vermittelte Stimulation von T-Zellen aufzeigen [275]. Somit könnten in diesem Fall die unteranderem stimu- lierten T-Zellen den Immunzellpopulationen aus der Milz Überlebenssignale vermitteln und damit die Apoptoserate nach Behandlung mit LPS verringern. Im Gegensatz dazu konnte bei der Untersuchung der PBMC eine deutlich erhöhte Mortalität der gesamten myeloiden Zellen von KSRP-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen nachgewiesen werden (Abb. 26). Die signifikant erhöhte Annexin V Frequenz auf CD11b+ Zellen aus KSRP-defizienten Mäusen, demonstriert sehr deut- lich die erhöhte Sterblichkeit dieser Zellen. Während die Immunzellpopulation aus dem Knochenmark und der Milz in vitro 24 Stunden mit 100 ng/ml LPS behandelt wurden, unterscheidet sich die Art des LPS Stimulus bei den PBMC. Denn die PBMC wurden aus Mäusen isoliert, denen 6 Stunden vorher 20 mg/Kg LPS intraperitoneal appliziert wurde. Zusätzlich könnte die unterschiedliche LPS Konzentration aber auch die Wir- kungsdauer und Art der Applikation, sowie die Komplexität des Gesamtorganismus, weitere Apoptose-vermittelte Signalwege begünstigen. Der damit verbundene Mechanismus ist aktuell nicht bekannt, jedoch konnte KSRP bereits als Zell-Zyklus-Regulator identifiziert werden. Die Publikation von Boucas et al. zeigt, dass KSRP die Expression des Zyklin-abhängigen Kinase Inhibitor 1A negativ beeinflusst und somit in Abwesenheit von KSRP die embryonalen Fibroblasten ver- mehrt in G1-Phase vorliegen [276]. 175 Diskussion Interessanterweise zeigen die Viabilitäts-Assays für Ly6G+ neutrophile Granulozyten aus KSRP KO-Mäusen gegenüber den WT Mäusen keine erhöhte, sondern eine ge- ringere Sterblichkeit (Abb. 27). An dieser Stelle wären jedoch weitere Untersuchungen notwendig um den genauen Immunzelltyp mit spezifischen Oberflächenmarkern be- stimmen zu können, damit die spezifische myeloide CD11b+ Zelllinie identifiziert wer- den kann. Dennoch implizieren die erläuterten Ergebnisse, dass in neutrophilen Gra- nulozyten trotz der Abwesenheit von KSRP keine Apoptose-vermittelten Signalwege induziert werden. Zusätzlich wurde die Vitalität mit Hilfe der Messung der metabolischen Aktivität unter- sucht. Dies sollte den Einfluss des KSRP Knockdowns auf Immunzell-Populationen, für die keine Unterschiede in Frequenz und Viabilität nachgewiesen werden konnten, klären (Anhang: Abb. 65, Abb. 66, Abb. 67 u. Abb. 68). Im Vergleich zu WT-Zellen, wies die metabolische Aktivität von KSRP-defizienten Zellen unter basalen und akti- vierten Bedingungen eine tendenziell verringerte Vitalität auf. Dieser Effekt konnte sta- tistisch jedoch nicht bestätigt werden und wurde daher nicht weiter untersucht. 5.2.2 Migration von Immunzellen Um zusätzlich weitere funktionelle Parameter der Immunzellen zu analysieren, wurden gezielt myeloide Zellen, wie die neutrophilen Granulozyten und Makrophagen, in Be- zug auf Migrationseinschränkungen untersucht (Kapitel 4.3). Dabei wurde die Motilität von Makrophagen und neutrophilen Zellen sowohl in Abwesenheit als auch in Anwe- senheit der spezifischen Chemokine KC (Neutrophile) und MCP-1 (Makrophagen) un- tersucht. Während bei Makrophagen keine Unterschiede in der Migration zwischen den Genotypen festgestellt werden konnten (Abb. 30), zeigten KSRP-defiziente neutrophile Granulozyten im Vergleich zu WT-Zellen eine ca. 10 % stärkere Migrati- onsrate (Abb. 29). Diese Ergebnisse widerlegen die anfängliche Hypothese, dass die KSRP-defizienten Mäuse eine dysfunktionale Migration aufgrund von verringerter Fre- quenzen an myeloiden Zellen in der Peripherie und in den Pfoten, aufweisen. Über- einstimmend mit den eigenen Ergebnissen (Abb. 29), konnte auch Sundaram et. al 176 Diskussion den Einfluss von KSRP auf die KC-abhängige Migration belegen [277]. In seinen Ex- perimenten zeigte er, dass KSRP die Reifung der miRNA-198 in der 3’UTR des follista- tin-like 1 (FSTL1)-Transkript begünstigt. Dadurch entscheide die Anwesenheit von KSRP, ob eine funktionelle FSTL-mRNA entstehe oder nicht. Die vollständige Tran- skription der FSTL1-mRNA habe wiederum einen positiven Einfluss auf die Stimulie- rung der KC-Migration, während die Reifung von miRNA-198 die KC-Migration verhin- dere. Dies lässt die Vermutung zu, dass in Abwesenheit von KSRP die Biogenese der miRNA-198 verhindert werden würde und das daraus resultierende FSTL-Transkript die Migration fördere. Der exakte Mechanismus sei jedoch noch nicht bekannt. In un- seren Experimenten muss jedoch berücksichtigt werden, dass das Chemokin KC ex- tern zu den Immunzellen hinzugefügt wurde, was möglicherweise Einfluss auf das Mig- rationsverhalten nehmen könnte. Des Weiteren konnte KSRP in der Literatur mit regulierenden Effekten auf das Migra- tionsverhalten bestimmter Zelltypen in Verbindung gebracht werden. Dabei wurden vor allem entartete maligne Krebs- und Tumorzellen betrachtet [278, 279]. Wie bereits in Kapitel 1.2 erwähnt, reguliert KSRP die Expression des c-myc Protoonkogens und zählt daher als FU-BP2 zu den Mitgliedern der (far upstream sequence element) FUSE-BP-Familie. So konnte in humanen Leberkarzinomzellen die Koexpression von FU-BP1 und FU-BP2 als ein kombiniertes und regulatorisches Zusammenspiel auf posttranskriptioneller Ebene, mit funktionellem Einfluss auf die Zellteilung und Mobilität dargestellt werden. Malz et. al beschreibt, dass FU-BP1 hauptsächlich regulierenden Einfluss auf die Proliferation habe, während FU-BP2 für die Migration verantwortlich sei [278, 279]. Weiterhin soll die FU-BP2-Expression in dem regulatorischen Zusam- menspiel Einfluss auf die Bioverfügbarkeit von FU-BP1 ausüben und es somit negativ regulieren. Zudem wird KSRP mit erhöhter Migration von Osteosarkomzellen in Ver- bindung gebracht, was durch die regulierte Expression von c-myc die Pathogenese von Osteosarkoma begünstigt [278, 279]. Das bisher besser erforschte regulatorische RNA-BP HuR beeinflusst positiv die mRNA-Stabilität von b-Actin. Dieses BP ist in der Zelle sowohl für die Modularität ext- razellulärer Matrix als auch für die Migration der Zellen verantwortlich [280, 281]. Auch KSRP scheint in der posttranskriptionellen Regulation mit b-Actin-mRNA assoziiert zu sein, jedoch wird die exakte Relevanz derzeit noch diskutiert. KSRP wird vor allem in den Neuronen mit dem Transport von b-Actin-mRNA in Verbindung gebracht [282]. 177 Diskussion Unter anderem beschreibt Gu et. al, dass KSRP die zytoplasmatische Lokalisierung der b-Actin mRNA in Fibroblasten und Neuronen fördere und somit zur deren mRNA- Stabilität beitrage [283]. Berichten zufolge, begünstigt KSRP die Migration von bestimmten Zellen [278, 279]. Ob dieser Effekt allerdings auch auf Immunzellen übertragbar ist oder in spezifischen Zelltypen auch negative Migrations-Effekte auslöst, lässt sich aufgrund fehlender und detaillierter Untersuchungen nicht gesichert beantworten. Die Migrationseffizienz ein- zelner Immunzellen wird zudem durch den Reifungszustand bestimmt. Die Aktivierung von Immunzellen veranlasst die Entwicklung zum maturierten Phänotyp, der wiederum Einfluss auf die Funktionalität ausübt [74]. Dadurch kommt es unter anderem zur Ex- pression von unterschiedlicher Oberflächenmolekülen wie Chemokinrezeptoren, Ad- häsionsmolekülen oder Aktivierungsmarkern, die Migrationsverhalten beeinflussen können [284-286]. 5.2.3 Reifungszustand von Immunzellen In dieser Arbeit wurde der Reifungszustand von APC durch fluoreszenz-basierte De- tektion von Antikörpern gegen die Aktivierungsmarker bestimmt (Kapitel 3.3). Im Zuge einer LPS-bedingten Aktivierung sollte geklärt werden, ob die Ausreifung der Immun- zellen unter dem regulatorischen Einfluss von KSRP steht und ob die Abwesenheit von KSRP funktionelle Zellveränderungen verursacht. Knochenmark-differenzierte Mf und DC zeigen unter Kontrollbedingungen sowie nach 24-stündiger Stimulation mit LPS keine Veränderungen in der Expression der Aktivie- rungsrezeptoren zwischen den Genotypen (Abb. 12 und Abb. 14). Somit scheint KSRP keinen Einfluss auf die Regulation der Reifungsmarker in Knochenmark-differenzierten Immunzellen zu haben. Immunzell-Populationen aus der Milz von KSRP-defizienten Mäusen, wie beispiels- weise CD11b positive Zellen, zeigten Genotyp-spezifisch nach 24-stündiger LPS Sti- mulation eine signifikant erhöhte Expression des kostimulatorischen Aktivierungsmar- kers CD86, während für andere Populationen wie CD11c und CD19 positive Zellen 178 Diskussion eine tendenziell erhöhte Expression des Aktivierungsmarkers CD86 zu beobachten war (Abb. 21). In TTP-defizienten Mäusen konnte bereits demonstriert werden, dass in Abwesenheit des regulierenden BP in unstimulierten DC eine verringerte Expression von kostimulatorischen Molekülen (CD40 u. CD86) gegenüber von Kontroll-DC vor- handen war [58]. Somit scheint TTP kostimulatorische Moleküle zu regulieren. Aller- dings sollten hier in unseren Untersuchungen die stimulierten Milzzellen nicht mit den unstimulierten DC verglichen werden, da auch in Untersuchungen von Bros et. al die stimulierten TTP-defizienten DC im Vergleich zu WT DC keine Unterschiede in der Expression der Reifungsmarker zeigten. Im Überstand von KSRP-defizienten Milzzellen konnte nach LPS-Stimulation auch sig- nifikant erhöhte IFN-g Mengen im Vergleich zu Kontroll-Milzzellen nachgewiesen wer- den (Abb. 32). Es ist bekannt, dass auch IFN-g stimulierend auf bestimmte Immunzell- populationen wirken kann, wie bspw. Makrophagen oder CD11b+ myeloide Suppres- sorzellen (myeloid-derived suppressor cells, MDSC) und da insbesondere die KSRP- defiziente CD11b+ Zellpopulation signifikant höhere CD86-Expressionslevel aufweist, liegt der Verdacht nahe, dass die Kombination aus LPS und erhöhten IFN-g Mengen für die erhöhte Reifung der myeloiden CD11b+ Zellpopulation verantwortlich sein könn- ten (Abb. 21) [287]. Um genauere Aussagen zur Identität der CD11b+ Subpopulation tätigen zu können, wären FACS- Untersuchungen mit einer größeren Auswahl immun- spezifischer Oberflächenmarker notwendig. Die Expression des CD86-Moleküls auf der Oberfläche von APC ist essentiell für die Koaktivierung von T-Zellen und wurde aus diesem Grund in folgenden Experimenten mit untersucht [288]. 5.2.3.1 Reifungszustand von Immunzellen nach CAIA-Behandlung Betrachtet man den Reifungszustand einzelner Milzzellpopulationen am fünften und am neunten Tag nach der AK-Applikation im CAIA-Modell, so war CD86 vorrangig in Kontroll-KSRP-defizienten Milzzellpopulationen gegenüber den WT Kontroll-Zellen tendenziell höher exprimiert (Anhang: Abb. 72 u. Abb. 73). Am fünften Tag nach der CAIA-Induktion nahm die Frequenz der LPS- & AK-behandelten Milzzellen im Ver- gleich zur stimulierten AK-unbehandelten Kontroll-Milzzellen deutlich ab, während am 179 Diskussion neunten Tag die Expression von CD86-aktivierten Milzzellpopulationen von LPS- & AK-behandelten MZ wieder präsent auf vergleichbarem Level zu stimulierten Kontroll- Zellen detektiert wurden. Für diese Unterschiede konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Genotypen nachgewiesen werden. Am fünften Tag nahm zwar die Gesamtanzahl der AK-behandelten Immunzellen in der Milz zu (Abb. 51 u. Abb. 52), jedoch ließen sich diese nur verringert aktivieren (Anhang: Abb. 73). Am neunten Tag befanden sich in der Milz von AK-behandelten Mäusen ähnlich wenige Zellen (Abb. 49 u. Abb. 50), die jedoch verstärkt auf die LPS-Aktivierung reagierten und mit einer höheren Frequenz CD86-Moleküle exprimierten (Anhang: Abb. 72). Eine mögliche Ursache für diese unterschiedliche CD86-Expression (zwischen dem fünften und neunten Tag) könnte sein, dass die bereits aktivierten Immunzellpopulationen, die unter Umständen sensitiver auf LPS-Aktivierung reagiert hätten, bereits aus der Milz heraus migriert sind. Nichtsdestotrotz, liefern diese Ergebnisse keine eindeutigen Be- weise für die erhöhte Expression des kostimulatorischen Moleküls CD86 in KSRP-de- fizienten Mäusen. Dennoch gibt es Publikationen, bei denen der Einfluss von RNA-BP auf die Expression kostimulatorischer Faktoren in Immunzellen aufgezeigt werden konnte [289]. So wurde bspw. gezeigt, dass HuR die Aktivierung von Zellen durch eine Erhöhung der CD83- Expression beeinflusst [289]. Wie bereits erwähnt wurde in einem anderen Modell in TPP-defizienten DC ohne Einfluss von Stimulanzien eine verringerte Expression von kostimulatorischen Molekülen wie CD40 und CD86 im Vergleich zu WT DC nachge- wiesen [58]. Nach der Stimulierung der Zellen konnten keine veränderten Expressi- onsmuster zwischen den Genotypen festgestellt werden, weshalb aktuell eine indi- rekte Beeinflussung des regulatorischen RNA-BP TTP auf die Expression der Aktivie- rungsmarker diskutiert wird. Des Weiteren geht man davon aus, dass ähnlich wie bei HuR und TTP, die das gleiche Ziel-Molekül binden (TNF-a-mRNA) und dadurch in einer Wechselwirkung agieren, auch andere regulatorische RNA-BP als „Ersatz“ von KSRP in die Regulation von Oberflächenmolekülen eingreifen könnten [290, 291]. 180 Diskussion 5.3 Einfluss von KSRP-KO auf das Zytokinmuster Des Weiteren werden insbesondere T-Zellen während homöostatischer Prozesse so- wie während einer Immunantwort in ihrer Funktion durch soluble Mediatoren beein- flusst. Das Zytokinmilieu ist dabei entscheidend für Wachstum, Differenzierung sowie Proliferation der Zellen und steuert zusätzlich die Aktivierung und die Suppression der Zellen [235]. Immunzellen sind demzufolge in der Lage, über das produzierte und sezernierte Zyto- kinprofil mit umliegenden Immunzellen zu kommunizieren, sowie die Immunreaktion zu verstärken oder zu beenden. Die posttranskriptionale Regulation dieser Zytokine steht unter der Kontrolle von RNA-BP und kann somit für die korrekte Steuerung der Immunantwort von essentieller Bedeutung sein [95]. Daher kann auch anhand der pro- duzierten bzw. sezernierten Zytokine, die funktionelle Beteiligung der einzelnen Im- munzelltypen nachgewiesen werden. Da T-Zellen im Regelfall durch APC aktiviert und durch APC sezernierte Zytokine angesteuert werden, wurden mit Hilfe von CBA-Ana- lysen (Kapitel 3.3.4) das Zytokinmuster von KSRP-defizienten APC untersucht (Kapitel 4.4). Die Aktivierung und Stimulation der Milzzellen erfolgte für 24 Stunden mit LPS (Kapitel 3.2.6). Die Untersuchungen zeigten, dass stimulierte Milzzellen aus KSRP- defizienten Mäusen signifikant höhere Mengen an IFN-g produzieren (Abb. 32) als Milzzellen aus WT-Tieren. Entgegen der ursprünglichen Erwartung, gab es keinen Ge- notyp-spezifischen Unterschied in der Expression pro-inflammatorischer Zytokine wie TNF-a, IL-1b und IL-6, obwohl eine Überexpression dieser pro-inflammatorischen Zy- tokinen in Abwesenheit von KSRP in der Literatur beschrieben wurde [35, 45, 215]. Über den Einfluss von KSRP auf die IFN-g mRNA-Stabilität ist aktuell nur wenig be- kannt, jedoch konnte TTP als negativer Regulator der IFN-g mRNA-Stabilität beschrie- ben werden [292, 293]. Der Einfluss von KSRP auf die IFN-g mRNA-Stabilität wird in Kapitel 5.3.1 und 5.3.2 näher betrachtet. In der vorliegenden Arbeit konnten jedoch nur tendenziell höhere Mengen pro-inflamm- atorischer Zytokine in der Milz von KSRP-defizienten Mäusen im Vergleich zu WT Mäusen nachgewiesen werden. Während in Voruntersuchungen die IL-6-Produktion einen signifikanten Unterschied aufwies (Abb. 31), konnte dieses Ergebnis in weiteren ausführlicheren Untersuchungen statistisch nicht mehr bestätigt werden (Abb. 32). 181 Diskussion Mit Hilfe von weiteren Untersuchungen kam es zur Dekomplexierung, bei der die Zell- typen aufgetrennt und separat voneinander auf unterschiedliche Weise stimuliert wer- den sollten (Kapitel 3.2.6), wodurch genauere Aussagen über die Zytokin-produzieren- den Zelltypen getroffen werden konnten. So ließen sich signifikant höhere Mengen an IL-10 in Überständen von KSRP KO BM-DC im Vergleich zu WT BM-DC nachweisen (Abb. 33 B), während in Überständen von Makrophagen keine Genotyp-spezifischen Unterschiede zu beobachten waren (Abb. 34). KSRP scheint zelltypspezifisch die Zy- tokinproduktion in APC auf Proteinebene zu modulieren. Auch T-Lymphozyten wurden mit Hilfe des MACS-Systems (Kapitel 3.2.5.2) nach CD4 und CD8 positiven Subpopu- lationen separiert und polyklonal stimuliert, um Anhand des Zytokinmusters das intrin- sische Potential der KSRP KO T-Zellen zu ermitteln (Kapitel 4.6.3). 5.3.1 TH1-assoziierte Zytokin Produktion Zu den typischen TH1-assoziierten Zytokinen zählen unter anderem TNF-a, IL-1b, IL- 12 und insbesondere IFN-g. Es wurden keine großen Unterschiede in der Zytokin Pro- duktion für TNF-a und IL-1b zwischen den Genotypen nachgewiesen, aber sehr wohl bei dem Leitzytokin IFN-g (Abb. 32, Abb. 33, Abb. 34, Abb. 40). In naiven Milzzellen aus KSRP-defizienten Mäusen wurde mehr IFN-g generiert, wobei dieser Unterschied im Verlauf der CAIA nicht mehr vorhanden war (Abb. 32 u. Abb. 53). Im Gegensatz dazu zeigten isolierte und polyklonal stimulierte T-Zellen (Kapitel 3.2.5.1 u. 3.2.6) signifikant geringere Mengen an IFN-g im Zell-Überstand von KSRP- defizienten Mäusen im Vergleich zu WT-Tieren (Abb. 40). Auch dieser Unterschied zwischen den Genotypen ist in der Betrachtung der Zytokinproduktion von polyklonal stimulierten T-Zellen aus CAIA-behandelten Mäusen nicht mehr statistisch signifikant (Abb. 54). IFN-g kann neben seiner Hauptfunktion als pro-inflammatorisches Zytokin auch anti-inflammatorische Effekte, beziehungsweise immunsuppressive Eigenschaf- ten aufweisen. Zu den pro-inflammatorischen Funktionen zählt vor allem die Aktivie- rung von M1-Makrophagen und die Induktion der TH1-Entwicklung [294-296]. In einem nicht ganz so verbreiteten Krankheitsmodell, der Proteoglykan-induzierten Arthritis 182 Diskussion (PGIA), konnten Finnegan et al. demonstrieren, dass eine Neutralisation von IFN-g zu einem abgeschwächten Krankheitsverlauf führt [297]. Aktuellere Publikationen zeigen jedoch auch den protektiven Effekt von IFN-g. Insbesondere wird hervorgehoben, dass IFN-g nicht einfach als pro- oder anti-inflammatorisches Zytokin definiert werden sollte, sondern seine Funktion abhängig von der involvierten Phase in einer Immunreaktion und von den beteiligten Immunzellen betrachtet werden muss [295, 298-300]. In dem eingesetzten CAIA-Krankheitsmodell ist die aktive Beteiligung von M1-Makrophagen, sowie die TH1-vermittelte Immunreaktion für die Entstehung und den Schweregrad der Erkrankung notwendig [165-167]. Die signifikant verringerte IFN-g Produktion in naiven KSRP-defizienten Gesamt-T-Zellen sowie die signifikant erhöhte IL-4 Produktion deu- ten bereits auf eine geringere Aktivität der TH1 Population hin (Abb. 40). Auch im Ver- lauf der CAIA war die signifikant erhöhte IFN-g-Produktion von KSRP-KO APC nicht mehr zu beobachten (Abb. 53 A). Bisher unbekannte Faktoren scheinen somit die IFN- g Produktion in APC während der Krankheitsprogression zu beeinflussen. Laut Litera- tur wird IFN-g im CAIA-Modell überwiegend im Synovium von erkrankten Tieren durch TH1 T-Zellen sezerniert und dient insbesondere der Aktivierung und Rekrutierung von M1-Makropaggen, die wiederum die Inflammation durch die Produktion weiterer pro- inflammatorischer Zytokinen verstärken [301]. Aus dem Zytokinmuster von CAIA-behandelten und restimulierten T-Zellen geht her- vor, dass der anti-inflammatorische Faktor IL-10 in KSRP-defizienten Mäusen gegen- über den WT Mäusen mit hoher Signifikanz verstärkt exprimiert wird (Abb. 54 B). IL- 10 besitzt ein breites Wirkungsspektrum und ist unter anderem in der Lage, die IFN-g Produktion zu beeinflussen [302-304]. Daher liegt die Vermutung nahe, dass in KSRP- defizienten Mäusen das durch T-Zellen sezernierte IL-10, die Genexpression beein- flusst, wodurch weniger pro-inflammatorische Makrophagen und Monozyten aktiviert werden können. Dies könnte wiederum zu einer Verbesserung der Krankheitssympto- matik führen. Um diese Hypothese experimentell zu überprüfen, könnte man in den Pfoten von KSRP-defizienten Mäusen auf mRNA-Ebene sowohl die IFN-g als auch die T-bet (Transkriptionsfaktor für TH1-Zellen) Menge im Vergleich zu WT Mäusen bestim- men, um so zusätzlich eine verringerte TH1-Aktivität, durch die bspw. geringere T-bet Menge in KSRP-KO T-Zellen gegenüber den Kontroll-T-Zellen, bestätigen zu können. 183 Diskussion Die KSRP-defizienten CD8+ T-Zellen zeigten im Überstand signifikant geringere IFN-g Mengen im Vergleich zu den Kontroll-Zellen (Abb. 44), während CD4+ KO T-Zellen keine Unterschiede in der IFN-g-Produktion zwischen den Genotypen aufzuwiesen schienen (Abb. 45 A u. Abb. 46 A). Es sieht also danach aus, dass die CD8+ zytotoxischen T-Zellen aus KSRP-defizienten Mäusen aufgrund von verringerter IFN-g Produktion in ihrer Funktionalität einge- schränkt sein könnten. Dies könnte die verringerte Symptomatik (AI) in KSRP-defizi- enten Mäusen gegenüber den WT Mäusen erklären, da die zelluläre Immunantwort während der Arthritis-Entwicklung möglicherweise verringert war [305]. Die Sympto- matik in der Pathogenese von CAIA-behandelten Mäusen aufgrund von CD8+ T-Zell Defizienz wurde auch von Sheikh et. al beschrieben [306]. In dieser Publikation konnte gezeigt werden, dass durch den Einsatz eines kleinen molekularen Inhibitors (STA-21) unter anderem die Anzahl an CD8+ T-Zellen reduziert werden kann, was zu einem verbesserten klinischen Verlauf der Arthritis bei CAIA-Mäusen führt. 5.3.2 TH2-assoziierte Zytokin Produktion Zu den TH2-assoziierten Zytokinen zählen neben IL-4, IL-5 und IL-13 auch das anti- inflammatorische Zytokin IL-10. IL-10 konnte im Überstand von KSRP-defizienten CD4+ T-Zellen in 5-fach höheren Mengen gegenüber den Kontroll-Zellen nachgewie- sen werden (Abb. 45 B), wohingegen bei CD8+ T-Zellen keine Unterschiede zwischen den Genotypen in der der Zytokinproduktion beobachtet werden konnte (Abb. 44 B). Dieser sehr deutliche Unterschied, der auch am neunten Tag nach der CAIA-Behand- lung in gesamten, restimulierten T-Zellen beobachtet wurde, könnte wohlmöglich für die verringerte Krankheitssymptomatik verantwortlich sein [245]. Wie bereits erwähnt, wirkt das regulatorische anti-inflammatorische IL-10 immunsupprimierend in dem es bspw. Monozyten und Makrophagen in ihrer pro-inflammatorischen Aktivität inhibiert [88]. Gleichzeitig induziert IL-10 die Treg-Differenzierung (s. Kapitel, 5.3.3), die wiede- rum neben IL-10 mit weiteren suppressiven Zytokinen Immunantworten unterdrücken [307]. Darüber hinaus ist die Überexpression von IL-10 relevant für die TH2-Umgebung und zählt daher zu den TH2 assoziierten Zytokinen [303]. Damit übereinstimmend 184 Diskussion wurde im Überstand der gesamten TZ-Population aus KSRP-defizienten Mäusen sig- nifikant höhere Mengen an IL-5 und IL-4 (Abb. 40) nachgewiesen. In MACS isolierten CD4+ T-Zellen konnte auch die vorher nur tendenziell erhöhte Expression von IL-13 (Abb. 40) mit einer statistischen Signifikanz bestätigt werden (Abb. 45 F). Diese Zyto- kine werden von der Subpopulation der TH2-Zellen gebildet und sezerniert, sodass diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Abwesenheit von KSRP die T-Zellen zu einer verstärkten TH2-Antwort polarisiert. Die Ergebnisse demonstrieren, dass KRSP-defizi- ente T-Zellen das intrinsische Potenzial besitzen, insbesondere signifikant höhere Mengen an TH2-Zytokinen zu sezernieren. Dieser Trend geht jedoch, außer bei IL-10, nach der CAIA-Behandlung und im Verlauf der Erkrankung verloren (Abb. 54). Wäh- rend im Vergleich zum Wildtyp nur in den isolierten KSRP-defizienten naiven CD4+ T- Zellen signifikant höhere Mengen an IL-10 gemessen wurden (Abb. 45 B), steigt die IL-10 Produktion am fünften Tag erst tendenziell an und ist daraufhin am neunten Tag nach der CAIA-Behandlung mit einer hohen Signifikanz in der gesamten T-Zell-Popu- lation sichtbar (Abb. 54 B). Die veränderten Expressionen von IL-4 sowie IL-13 in KSRP-defizienten CD4+ T-Zellen könnte indirekt auf die ebenfalls veränderte IL-10- Expression zurückzuführen sein. Gleichzeitig könnte die mRNA-Stabilität von IL-4 und IL-13 unteranderem auch direkt durch KSRP reguliert werden, sodass durch das Feh- len des negativ regulatorischen BP der mRNA-Abbau der genannten Zytokine verrin- gert sein könnte und daher eine erhöhte Menge der TH2-assoziierten Zytokinen vor- handen wäre. Dass die Expression der mRNA der oben benannten Zytokine unter der Kontrolle von RNA-BP stehen, konnte bereits für das BP HuR demonstriert werden. HuR scheint durch die positive Regulation der mRNA die Stabilität die Expression der TH2-asoziierten Zytokine zu begünstigen [52-54]. Diese dominierende TH2-Aktivität in KSRP-defizienten Mäusen kann auch mit der star- ken Proliferation (Abb. 43) und dem signifikant erhöhten Reifungszustand der CD4+ T- Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen in Verbindung gebracht werden (Abb. 41). Es konnte eine signifikant höhere Proliferation von CD4+ T-Zellen gemessen werden, während CD8+ T-Zellen keine Unterschiede in der Proliferation zwischen den Genoty- pen aufwiesen. Auch der erhöhte Reifungszustand der CD4+ T-Zellen anstatt der CD8+ T-Zellen bestätigte die verstärkte Aktivität von CD4+ T-Zellen. Des Weiteren muss berücksichtigt werden, dass KSRP in der posttranskriptionalen Regulation der IL-10 mRNA beteiligt sein könnte, da in der 3’UTR des IL-10 mRNA- 185 Diskussion Moleküls viele ARE enthalten sind, die von RNA-BP als Zielstruktur genutzt werden können [308, 309]. Tatsächlich konnte der relevante Einfluss der RNA-BP TTP und AUF-1 auf die Degradation des IL-10 mRNA-Transkripts bereits beschrieben werden [310-312]. Tudor et. al konnte zeigen, dass TTP für den mRNA-Abbau von IL-10 ver- antwortlich ist. In seinen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass mit p38-mito- genaktivierte Proteinkinase (MAPK) der TTP-vermittelte mRNA-Abbau des anti-in- flammatorischen Zytokins IL-10 verhindert wurde und somit nach LPS Stimulation in BM-Mf eine erhöhte Menge an IL-10 auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden konnte [304]. Auf der anderen Seite zeigte die Arbeit von Sarkar et. al, dass ein weiteres RNA-BP AUF-1 an der 3’UTR des IL-10 mRNA-Moleküls bindet, wobei dieses RNA-BP jedoch primär für die Stabilität des genannten mRNA-Moleküls ver- antwortlich zu sein scheint [310-312]. Aus diesem Grund sollen genauere Untersu- chungen (RNA-Immunpräzipitation (RIP)) klären, ob KSRP ebenfalls an die 3’UTR der IL-10-mRNA binden kann und deren Expression dadurch moduliert. Mit dieser Me- thode ist der Nachweis der Protein-RNA Interaktion möglich, d.h. ob ein Protein an die RNA bindet und wenn ja, an welche RNA Sequenz [313]. Mit Hilfe der RIP-Technik sollen weitere mRNAs wie bspw. die von IFN-g, präziser analysiert werden und dadurch soll geklärt werden, ob KSRP tatsächlich direkt an die 3’UTR der IFN-g-mRNA bindet und ob diese Interaktion möglicherweise die veränderte Expression (Abb. 44 u. Abb. 53 A) begründet. Ebenfalls könnte KSRP über einen indi- rekten Mechanismus wie bspw. die Regulation von miRNAs die IFN-g Produktion be- einflussen [292, 293]. Allerdings ist hierzu in der Literatur nicht viel bekannt. IFN-g spielt eine große Rolle bei der Immunantwort gegen intrazelluläre Pathogene wie virale Infektionen, da es neben der Aktivierung von NK Zellen und Makrophagen auch als Differenzierungssignal für T-Zellen fungiert [292]. Da insbesondere die Stabilität des IFN-g mRNA-Transkripts auch durch das regulatorische RNA-BP TTP negativ beein- flusst wird, ist die fehlerfreie Regulation für die IFN-g Expression von enormer Bedeu- tung. In unseren Experimenten konnte eine veränderte IFN-g Expression nachgewie- sen werden (Abb. 44 u. Abb. 53 A), was darauf hindeutet, dass KSRP an der Regula- tion der IFN-g Expression involviert sein könnte. Wie bereits erwähnt, soll KSRP einen negativen Einfluss auf die IL-2 Expression aus- üben, in dem es die Stabilität der IL-2-mRNA verringert. Dies konnte in vitro mit Jurkat Extrakten und in HeLA Zellen gezeigt werden [32]. In T-Zellen wurde der Einfluss von 186 Diskussion KSRP noch nicht auf die IL-2 Expression untersucht. In den Proliferationsanalysen von KSRP-defizienten CD4+ T-Zellen konnte im Vergleich zu Wildtyp-Zellen auch eine sig- nifikant höhere Proliferationsrate gemessen werden (Abb. 43), was darauf schließen lassen könnte, dass durch die Abwesenheit von KSRP höhere Mengen an IL-2 ent- standen sind, die wiederum das Zellwachstum beeinflussen. IL-2 ist nicht nur als Zell- wachstumsfaktor für eine stärkere T-Zellproliferation verantwortlich, sondern auch in der Lage die Treg-Differenzierung zu begünstigen [247, 314]. In Kapitel 4.6.3 wurde mit Hilfe einer Zeitkinetik die Zytokinproduktion zu früheren Zeitpunkten bestimmt (Abb. 46). Anhand dieser Daten ist deutlich zu erkennen, dass IL-2 im Vergleich zu den an- deren untersuchten Zytokinen, bereits nach einer 24 stündigen Stimulation in einer erhöhten Konzentration im T-Zell-Überstand nachgewiesen werden konnte (Abb. 46 G) und bereits nach einer 48 stündigen Stimulation den Sättigungsbereich erreicht. Entgegen der Erwartung, konnten hier keine höheren Mengen an IL-2 im Überstand von KSRP-defizienten CD4+ T-Zellen gemessen werden. Vermutlich lässt sich das Ergebnis mit dem höheren Bedarf an IL-2 begründen, da der IL-2-Verbrauch der CD4+ T-Zellen steigt, wenn diese stärker proliferieren (IL-2 wird autokrin wieder verbraucht) [246]. Um diesen Sachverhalt genauer untersuchen zu können, müsste man nach der polyklonalen Stimulation der T-Zellen durch Zugabe eines IL-2 Rezeptor Blockers den autokrinen IL-2-Verbrauch verhindern. Damit sollte man nachweisen können, ob in KSRP-defizienten Mäusen tatsächlich eine höhere Stabilität der IL-2-mRNA, aufgrund des Fehlens von KSRP vorliegt. Ein weiteres Indiz für die TH2 polarisierende Immunantwort in den KSRP KO Mäusen ist die Verschiebung der Balance zwischen mDC und pDC, denn in der Arbeit von Mathsuda et al. konnte gezeigt werden, dass der Shift zu pDC, der auch in KSRP- defizienten Mäusen nachgewiesen wurde (Abb. 19), zur Ausprägung des TH2 domi- nierenden Phänotyp führt [315]. 187 Diskussion 5.3.3 Weitere Leitzytokine Wie bereits erläutert, lassen sich die CD4+ T-Zellen abhängig von ihrem Zytokinprofil weiter in TH1 und TH2 aber auch TH17, TH9 und Tregs klassifizieren (s. Kapitel 1.3.3). Die verringerte IFN-g Produktion, das primär von TH1 T-Zell-Subpopulationen produ- ziert wird, und vor allem die erhöhte Produktion von IL-9, IL-10 und IL-13 (Abb. 45) legen eine erhöhte TH9-, Treg- sowie TH2-Aktivität nahe. Um experimentell die Aktivität der jeweiligen T-Zell-Subpopulationen zu bestätigen, bestünde auch die Möglichkeit, auf mRNA-Ebene (qPCR-Analysen) oder per intrazellulärer Antikörper (FACS-Analy- sen) die Anwesenheit von spezifischen T-Zell differenzierenden Transkriptionsfaktoren (TF) zu überprüfen, um so die bspw. erhöhte TH2-Aktivität zu bestätigen. In diesem Fall wäre der Nachweis des Transkriptionsfaktors GATA-3 notwendig. GATA-3 steuert die TH2-Differenzierung und ist der Gegenspieler von T-bet, der als TF die TH1-Diffe- renzierung begünstigt. Somit ließe sich abhängig von der gemessenen Menge der je- weiligen Transkriptionsfaktoren die Anwesenheit der jeweiligen Subpopulation über- prüfen [316]. Die Expression von CD4CD25 (auf der Zelloberfläche) und die Sezernierung von IL- 10 ist vor allem für regulatorische T-Zellen charakteristisch [317]. Vor diesem Hinter- grund, könnten Tregs in diesem Kontext als hauptbeteiligte IL-10-Produzenten betrach- tet werden. Besonders durch ihre Funktion zur Aufrechterhaltung der peripheren Tole- ranz und somit die Unterdrückung der Inflammation, könnten diese Tregs zur Erklärung der verringerten Krankheitssymptomatik in CAIA-behandelten KSRP KO Mäusen bei- tragen [307, 318]. Um diese Hypothese zu bestätigen, wäre in diesem Fall das erhöhte Vorkommen des TF Foxp3 in KSRP-defizienten T-Zellen erforderlich, da dieser TF notwendig ist, um zwischen naive T-Zellen und regulatorischen Effektor T-Zellen (Treg) zu differenzieren. Wie bereits erwähnt, könnte mit Hilfe der Durchflusszytometrie Foxp3 mit intrazellulären Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern markiert und quantifi- ziert werden. Des Weiteren soll erwähnt werden, dass neben der deutlichen TH2-Polarisierung, die durch die sezernierten Zytokine wie IL-5, IL-10 und IL-13 charakterisiert wird, auch ein signifikant höherer Anteil an IL-9 im Überstand von stimulierten KSRP-defizienten CD4+ T-Zellen im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen gemessen wurde (Abb. 40, Abb. 41, Abb. 45, Abb. 46 und Abb. 54). IL-9 wird überwiegend von der Subpopulation der TH9 188 Diskussion Zellen produziert, sodass eine KSRP-Inaktivierung neben dem TH2- wahrscheinlich auch einen TH9-Shift zeigt. Funktionell beeinflusst IL-9 das Wachstum der Mastzellen, vermittelt die pulmonale Eosinophilie, die Expansion von B-Zellen und erhöht die bron- chiale Hyperreaktionsfähigkeit [319-322]. Diese Faktoren begünstigen und verstärken insbesondere die Entwicklung von Asthma. Des Weiteren konnten IL-9 produzierende CD4+ T-Zellen auch mit Autoimmunerkrankungen wie bspw. systematischer Lupus Erythematodes (SLE) oder experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) in Verbindung gebracht werden. In diesen untersuchten Krankheitsmodellen scheint IL- 9 als ein pro-inflammatorisches Zytokin zu fungieren und die Progression der Autoim- munerkrankungen zu fördern [323, 324]. Dieses pleiotrope Erscheinungsbild kann die signifikant erhöhten Level an IL-9 in KSRP-defizienten Mäusen nicht eindeutig mit der abgeschwächten Symptomatik im CAIA-Modell in Einklang bringen. Auch in diesem Fall könnte KSRP über Modulation der mRNA-Stabilität Einfluss auf die IL-9 Expres- sion ausüben, allerdings liegen aktuell über die Regulation der post-transkriptionellen IL-9-Expression keine Ergebnisse vor. Neben den typischen TH2-assoziierten Zytokinen wurden in KSRP-defizienten Kon- troll-T-Zellen auch erhöhte Mengen an IL-17 im Überstand detektiert (Abb. 40 und Abb. 54). IL-17 ist nach heutiger Definition ausschließlich als ein pro-inflammatorisches Zy- tokin zu betrachten und dessen Neutralisation reduziert die Schwere der Inflammation in TH1-vermittelten Krankheitsmodellen [325-329]. Da jedoch die IL-17-Produktion mit dem Fortschreiten der Erkrankung in KSRP-defizienten CAIA Mäusen abnimmt, wird dadurch die Progression der Entzündung scheinbar nicht mehr vorangetrieben (Abb. 54). Auch in diesem Fall könnte möglicherweise der signifikant erhöhte IL-10 Anteil entscheidend zur Verringerung der Progression beitragen. Da IL-10 immunsuppressiv wirkt und insbesondere pro-inflammatorische Immunantworten negativ beeinflusst, könnte IL-10 (ähnlich wie bei IFN-g [302-304]) die IL-17-Produktion durch die Verrin- gerung der TH17-Zellentwicklung steuern. Es kann außerdem nicht ausgeschlossen werden, dass KSRP durch einen direkten oder indirekten Mechanismus die IL-17- mRNA Stabilität beeinflusst und somit durch das Fehlen für die erhöhte IL-17 Menge in KSPR-defizienten Kontroll-Zellen verantwortlich ist (Abb. 40 und Abb. 54). Chen et. al konnte in seiner Arbeit bereits demonstrieren, dass das positiv regulierende RNA- BP HuR die mRNA-Stabilität von IL-17 erhöht [254]. Es wurde außerdem gezeigt, dass in TH17 Zellen aus HuR-KO Mäusen signifikant geringere Mengen an IL-17 mRNA und Protein gegenüber Wildtyp TH17 Zellen vorhanden sind. 189 Diskussion 5.4 KSRP scheint die TH2-Antwort zu limitieren Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die verringerte Krankheitssymptomatik von KSRP-defizienten Mäusen in vivo, wahrscheinlich durch die reduzierte Frequenz an myeloiden CD11b+ Zellen und den verstärkt polarisierenden TH2-Bias, der vor allem in hohen anti-inflammatorischen IL-10 Mengen resultiert, zu begründen ist. Die in die- sem Krankheitsmodell notwendigen, beteiligten Immunzellen, weisen einerseits eine erhöhte Mortalitätsrate auf (Abb. 26), aber andererseits eine verringerte zelluläre zy- totoxische T-Lymphozyten (CTL)- und TH1-Aktivität (Abb. 43, Abb. 44, Abb. 45). Die überschießende TH2-Antwort inhibiert die TH1-Entwicklung und verringert somit die Rekrutierungen und Beteiligung von involvierten Immunzellen (wie bspw. M1-Makro- phagen). Gleichzeitig sind Treg Zellen in der Lage, die Expression von pro-inflammato- rischen Mediatoren sowie die Progression inflammatorischer Effektorzellen zu suppri- mieren und fördern unter anderem in Kombination mit IL-5 und IL-10 die Entwicklung von M2-Makrophagen, was ebenfalls zur Verringerung der Pathogenese führen könnte [77, 78]. Die KSRP-defizienten Mäuse scheinen durch den resultierenden TH2-Phänotyp in dem CAIA Modell besonders gegen TH1-vermittelte Entzündungen geschützt zu sein. Daher soll mit dem CIA-Modell (siehe Kapitel 1.6.3.1), bei dem die Beteiligung der adaptiven Lymphozyten sowie die dominierende TH1-Antwort für die Entwicklung und die Schwere der Erkrankung notwendig ist, der bereits dargestellte polarisierende TH2- Phänotyp im KSRP KO Mäusen kontrolliert werden [106, 123, 167, 330]. Um diese Ergebnisse zu überprüfen, wurden die C57BL/6 KSRP-defizienten Mäuse mit dem DBA/1 Stamm verpaart, um über Rückkreuzung bis zur zehnten Generation das inaktivierte KSRP-Gen auf DBA/1 Hintergrund zu generieren (Kapitel 3.4.1). Damit soll die Suszeptibilität für das klassische und am besten etablierte Tiermodell CIA ge- währleistet werden. Im Vorversuch wurden dazu zur Induktion der CIA aus der Rück- kreuzung des DBA/1xC57BL/6+/- Stammes die F8 Generation verwendet. In diesem Vorversuch sollte in erste Linie die Induzierbarkeit der CIA für DBA/1xC57BL/6-Mäuse geprüft werden, weshalb der Arthritis-Index phänotypisch analysiert wurde (Kapitel 3.4.5). Hierbei konnte beobachtete werden, dass bei DBA/KSRP-defizienten Mäusen 190 Diskussion im Vergleich zu WT Mäusen bereits in der achten Generation eine signifikant verrin- gerte Krankheitssymptomatik vorlag (Abb. 75). Dieser vorläufige Befund bestätigt das für uns unerwartete Ergebnis der verringerten Krankheitssymptomatik im CAIA-Modell. Weiterhin könnte man mit diesen Erkenntnissen schlussfolgern, dass das RNA-BP KSRP nicht nur Einfluss auf die Immunzellen des angeborenen Immunsystems (CAIA- Modell) nimmt, sondern auch für die Regulation der adaptiven Komponenten im Im- munsystem (CIA-Modell) verantwortlich sein könnte. Detailliertere in vivo Untersuchungen zur Charakterisierungen der Immunzellen der DBA/KSRP-defizienten Mäusen sollten mit der F10 Generation erfolgen. Eine weitere Möglichkeit um zu überprüfen, ob KSRP-defiziente Mäuse, begründet durch den TH2-Shift, weniger Entzündungen in einem TH1-dominierenden Inflammati- onsmodell vorweisen, wäre die Darstellung eines TH2-Inflammationsmodells (Allergie bspw. Asthma), da man hierbei davon ausgehen kann, dass eine verstärkte Reaktion beziehungsweise Symptomatik zu beobachten wäre. In diesem Fall wäre die Erklärung für weniger Entzündungen in der CAIA/CIA, zugleich die Antwort auf die Frage, warum es mehr Inflammation im Allergiemodell gibt. 5.5 Einfluss von KSRP-KO auf den Krankheitsverlauf von Asthma bronchiale Für die Induktion einer TH2-dominierenden Inflammation in KSRP-defizienten Mäusen wurde das Asthmamodell gewählt (Kapitel 3.4.6). Da die Verengung der Atemwege mit der Atemwegshyperreaktivität korreliert, wurde die funktionelle Einschränkung in der Lunge mit dem Ganzkörperplethysmographen analysiert (Kapitel 3.4.6.1.1) [251, 252]. Die Ergebnisse zeigen in KSRP-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen einen deutlich erhöhten Atemwegswiderstand sowohl ohne Stimulus (einen moderat erhöhten PenH-Wert) als auch nach Zugabe der höchsten Methacholin-Dosis einen signifikant erhöhten Unterschied zu anderen Versuchsgruppen (Abb. 55). Dieses Er- gebnis spiegelt den Schweregrad der Erkrankung wieder und bestätigt den erwarteten 191 Diskussion Effekt in den KSRP-defizienten Tieren, wenn diese wirklich eine TH2-Polarisierung vor- weisen. Damit konnte die funktionelle Einschränkung der Lungenfunktion, die unter anderem durch die Aktivität der TH2-Zellen vorangetrieben wird [149, 331], in KSRP- defizienten Mäusen demonstriert werden. Darüber hinaus gibt die Betrachtung der zellulären Zusammensetzung der bronchoal- veoläre Lavage (BAL) Aufschluss über die Frequenz der analysierten Immunzellen in der Lunge (Kapitel 4.8.2). Unter basalen Bedingungen wurden zwar tendenziell weni- ger Granulozyten in KSRP-defizienten Mäusen im Vergleich zur Kontroll-Tieren nach- gewiesen, jedoch konnte dieser Trend in OVA-behandelten Mäusen nicht weiter be- stätigt werden (Abb. 56). OVA-behandelte KSRP-defiziente Mäuse zeigten gegenüber den Wildtyp-Tieren eine signifikant höhere Akkumulation von neutrophilen Granulozy- ten in der BAL. Dieses Ergebnis deckt sich soweit auch mit den Daten aus dem Mig- rations-Assay (Abb. 29), bei dem gezeigt werden konnte, dass neutrophile Granulozy- ten aus KSRP-defizienten Mäusen eine signifikant höhere Motilität in Vergleich zu Kon- troll-Zellen aufwiesen. Dieser Zelltyp ist neben den eosinophilen Granulozyten maß- geblich an der asthmatischen Entzündungsreaktion beteiligt [332] und wird hauptsäch- lich von TH2- und TH17-Zellen gesteuert [333-335]. Das Asthmamodell bestätigt die vorherigen in vitro Analysen, dass die T-Zellen in Abwesenheit von KSRP zu einem TH2 Phänotyp polarisieren. Die daraus resultierende Schwere der Entzündung konnte auch mit Hilfe der H&E gefärbten Lungenschnitten nachgewiesen werden (Kapitel 4.8.3). In den Lungen von OVA-behandelten KSRP-defizienten Tieren, konnte eine deutlich stärkere dunkel bläuliche Färbung (Zellkern-Färbung) um die Bronchien herum beobachtet werden (Abb. 57). Diese Gegebenheit lässt sich durch eine erhöhte Zellfiltration (Migration) erklären. Zusätzlich scheint das Gewebe stärker geschädigt zu sein, was auf den Entzündungsgrad und damit auf die Schwere der Asthmaerkrankung zurückzuführen ist [138]. Als ein weiteres charakteristisches Merkmal für den Schwe- regrad der Entzündung in der Lunge, ist die Anzahl (Hyperplasie) von becherförmigen Drüsen (Becherzellen), die von Bedeutung für die Mukussekretion sind [336]. Während der Mukus (Schleim) die Epitheloberfläche in den Atemwegen vor Verletzungen schützt und das Entfernen von bakteriellen und zellulären Ablagerungen aus der Lunge unterstützt, erschwert die Übersekretion des Schleims die Atemfunktion durch die Verengung des Atemwegslumen. Mit Hilfe der histologischen PAS-Färbung des Lungengewebes konnten die mukusproduzierenden Becherzellen purpurviolett darge- stellt werden (Kapitel 3.4.6.1.5 u. 3.4.6.1.6). Diese Ergebnisse demonstrieren deutlich, 192 Diskussion dass in den Lungen der Kontroll-Gruppen der KSRP-defizienten Tiere als auch der Wildtyp-Mäusen keine Becherzellen vorhanden waren (Abb. 58). Die OVA-behandel- ten Tiere zeigten dagegen eindeutig die Anwesenheit dieser mukusproduzierenden Becherzellen. Hierbei ergab sowohl die qualitative als auch die quantitative Auswer- tung eine tendenziell höhere Frequenz an Becherzellen in den Lungen der KSRP-de- fizienten Mäuse (Abb. 59). Somit bekräftigt auch dieses Ergebnis den TH2-polarisie- renden Effekt in den KSRP-defizienten Mäusen, denn IL-4, IL-5, IL-9 sowie insbeson- dere der Einfluss von IL-13, erhöhen die Beteiligung von sezernierenden Zellen [337, 338]. Auch der mögliche TH9-Shift in den KSRP KO Mäusen, der durch die signifikant erhöhten IL-9 Level angedeutet wird, könnte ein essentieller Initiator bei der Entwick- lung von Asthma sein. Dies lässt sich damit erklären, dass die durch IL-9 einherge- hende pulmonale Eosinophile sowie die Expansion von B-Zellen die bronchiale Hyper- reaktionsfähigkeit entscheidend modulieren [319-322]. Übereinstimmend damit wurde in der Literatur auch der Einfluss von IFN-g auf asth- matischen Reaktionen beschrieben. So wurden einerseits bei Asthmatikern signifikant geringere IFN-g Mengen nachgewiesen. Andererseits bewirkte eine Zugabe von IFN- g in Tierexperimenten eine Reduzierung der IL-4 und IL-5 Mengen einhergehend mit dem signifikanten Rückgang an Granulozyten [339-341]. Zusammenfassend bestätigen die Untersuchungen im Asthmamodell die erwartet stärkere Entzündung, die vermutlich durch den dominierenden TH2-Shift in Mäusen mit inaktivierten KSRP-Gen hervorgerufen wird. Damit liegt die Vermutung nahe, dass KSRP zelltypspezifisch an unterschiedlichen posttranskriptionalen Regulationen be- teiligt ist. Im Hinblick auf die Immunzellfunktionen und den Einfluss von KSRP in der Pathogenese von chronisch-inflammatorischen Erkrankungen, wird deutlich, wie kom- plex und vielseitig die Beteiligung des regulatorischen RNA-BP ist. Neben modulieren- den Effekten auf die Migration, Differenzierung sowie auf den Reifungszustand von Immunzellen, werden möglicherweise durch RNA-BP die Expression von löslichen Mediatoren und dadurch vollständige Immunantworten gesteuert. Dies geschieht so- wohl durch stabilisierende als auch durch destabilisierende Effekte auf die mRNA von Mediatoren. In ex vivo Untersuchungen wurde der destabilisierende Effekt von KSRP für pro-inflammatorische Zytokine beschrieben. Entgegen der Erwartung, wurde im Rahmen dieser Dissertation jedoch vor allem der Einfluss auf T-Zellen durch die Pro- duktion von IL-10, IL-13, IL-9 und IFN-g nachgewiesen. Ob KSRP jedoch direkt oder 193 Diskussion nur indirekt an der posttranskriptionalen Regulation beteiligt ist, soll in weiteren spezi- fischeren Experimenten (Bsp. RIP-Analysen) geklärt werden. Abschließend soll im folgenden Kapitel eine Zusammenfassung der vorliegenden Ar- beit dargelegt werden. 194 Zusammenfassung 6. Zusammenfassung KSRP „KH-type splicing regulatory protein“ ist ein Nukleinsäure-bindendes multifunk- tionelles Protein, dass vor allem die Stabilität von diversen immunrelevanten mRNAs reguliert. Da KSRP in Immunzellen des angeborenen sowie adaptiven Immunsystem exprimiert wird, sollte dessen Beteiligung an den Immunzellfunktionen und der Ent- wicklung von chronisch-inflammatorischen Erkrankungen im Gesamtorganismus cha- rakterisiert werden. Die Immunzell-Charakterisierung bzw. -Phänotypisierung erfolgte mit unterschiedli- chen Immunzellpopulationen aus Mäusen mit inaktivierten KSRP-Gen mittels FACS- Analysen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Immunzellfrequenz von myeloiden CD11b+ Granulozyten vor allem in dem periphereren Blut von KSRP-defizienten Mäu- sen gegenüber den Kontroll-Tieren deutlich verringert vorlag. Weiterhin zeigten po- lyklonal stimulierte KSRP-defiziente CD4+ T-Zellen eine erhöhte CD25-Expression so- wie eine verstärkte Proliferation im Vergleich zu WT T-Zellen. Des Weiteren wurde im Zellüberstand von polyklonal stimulierten CD4+ T-Zellen signifikant erhöhte Level an IL-9, IL-10 und IL-13 nachgewiesen, während polyklonal stimulierte KSRP-defiziente CD8+ T-Zellen deutlich geringere Level an IFN-g im Überstand im Vergleich zu Kon- troll-Zellen zeigten. Es muss allerdings noch geklärt werden, ob die veränderte Ex- pression der Zytokine auf einen direkten oder indirekten Einfluss von KSRP zurückzu- führen sind. Um die Relevanz von KSRP für immunologische Erkrankungen zu untersuchen, wurde die Kollagen-Antikörper-induzierte Arthritis (CAIA) als etabliertes Mausmodell für chro- nisch-inflammatorische Erkrankungen gewählt. In CAIA sind überwiegend Neutrophile und Makrophagen als Effektorzellen an der Pathogenese beteiligt. In dem autoimmu- nen Mausmodell entwickelten KSRP-defiziente Mäuse im Vergleich zu den WT Mäu- sen eine deutlich geringere Krankheitssymptomatik. Detaillierte Untersuchungen im CAIA-Modell zeigten eine geringere Infiltration der Pfoten durch Immunzellen einher- gehend mit einer verringerten Inflammation in den Pfoten von KSRP-defizienten Mäu- sen im Vergleich zu WT Mäusen. Restimulierte T-Zellen aus CAIA-behandelten Mäu- sen zeigten im Überstand von KSRP-defizienten T-Zellen deutlich erhöhte Mengen an anti-inflammatorischen IL-10 gegenüber WT Zellen. 195 Zusammenfassung In Gegensatz zum TH1-polarisierenden Inflammationsmodell wurde Asthma bronchi- ale als TH2-dominierendes Allergiemodell gewählt, um die bereits beobachteten Un- terschiede der Immunzellfunktion zwischen den Genotypen zu untermauern. In diesem Sinne wurden in OVA-behandelten KSRP-defizienten Mäusen funktionelle Einschrän- kungen der Lunge, durch einen erhöhten Atemwegswiderstand im Vergleich zu WT Mäusen beobachtet. Mit patho-histologischen Schnitten der Lunge wurde zusätzlich eine stärkere Entzündung, durch eine gesteigerte Zellinfiltration, sowie einer Akkumu- lation von neutrophilen Granulozyten und mukusproduzierenden Becherzellen in KSRP KO Mäusen im Vergleich zu WT Mäusen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass KSRP-defiziente Mäuse wahrscheinlich auf- grund ihres TH2-Phyänotyps im Asthmamodell eine stärkere Entzündung hervorrufen, gleichzeitig jedoch in dem CAIA Modell geschützter gegen TH1-vermittelte Entzündun- gen zu sein scheinen. Somit scheint KSRP im Umkehrschluss für die Inhibierung der TH2-Antwort verantwortlich zu sein. 196 Abstract 7. Abstract The KSRP “KH-type splicing regulatory protein” is a multifunctional nucleic acid-bind- ing protein that seems to regulate the mRNA-stability of many immune-relevant pro- teins. KSRP is expressed in cells of the innate and adaptive immune system, therefore we wanted to analyze the influence of KSRP on the function of immune cells and on the development of chronic-inflammatory diseases in vivo. We characterized diverse immune cell populations from mice with inactivated KSRP gene by flow cytometry. KSRP-deficient mice showed lower frequencies of myeloid CD11b+ cells compared to WT cells, primary in the peripheral blood. Isolated and pol- yclonally stimulated KSRP-deficient CD4+ T cells showed a stronger proliferation and a higher CD25 expression in comparison to WT T cells. Additionally, polyclonally stim- ulated KSRP deficient CD4+ T cells showed increased levels of IL-9, IL-10 and IL-13 in their supernatants compared to WT cells. Supernatants of polyclonally stimulated KSRP-deficient CD8+ T cells contained lower levels of interferon-g compared to super- natants from WT CD8+ T cells. There is still a need for clarification, whether the afore- mentioned changed expression of cytokine is a result of either direct or indirect influ- ence of KSRP. To better understand the impact of KSRP gene inactivation in the pathogenesis of in- flammatory diseases, we used collagen antibody-induced arthritis (CAIA) as an ap- proved mouse model for autoimmune disease. In CAIA, pathogenesis is dependent on immune cells like neutrophils and macrophages. In the inflammatory diseases, we ob- served a much lower arthritis induction in KSRP-deficient mice in comparison to WT mice. Furthermore, we observed less infiltration of immune cells in combination with a decreased expression of pro-inflammatory cytokines in the inflamed joint of KSRP- deficient animals compared to WT animals. Also, in the supernatants of restimulated KSRP-deficient T cells from CAIA treated mice, we measured increased levels of the anti-inflammatory cytokine IL-10. Analysis of KSRP in a predominantly TH2-polarized allergy mouse model was per- formed to underline the results from the TH1-dominated CAIA/CIA inflammatory dis- ease model. 197 Abstract OVA treated KSRP-deficient mice showed functional restrictions of the lung paired with increased airway resistance in comparison to WT mice. Patho-histological sections demonstrated stronger inflammation, caused by a higher cell infiltration as well as a higher accumulation of neutrophils and mucus producing goblet cells in KO mice com- pared to WT mice. In conclusion, KSRP-deficient mice are susceptible for TH2-assiciated allergy diseases like asthma, while being simultaneously more protected against the induction of TH1- mediated inflammatory arthritis. Thus, we assume that KSRP mediated the inhibition of the TH2 immune response. 198 Anhang 8. Anhang Abb. 60: Gating-Strategie für durchflusszytometrische Analysen von BM-DC anhand einer Bei- spielfärbung Zu sehen ist eine repräsentative Darstellung der Gating-Strategie einer WT Maus für die Identifizierung von BM-DC. Die Aus- wertung der Daten erfolgte mit FlowJo. Zuerst wurden die gesamten BMDC eingegrenzt, um Zellen vom Zellschrott zu sepa- rieren. Die Zellen wurden nach den angegebenen Achsen-Parametern aufgetrennt. Die eingegrenzte Population mit dem Pfeil erscheint jeweils im folgenden Diagramm. Im zweiten Schritt wurden die Dubletten „ausgegatet“, damit es nicht zur Verfäl- schung der Daten kommt. Im dritten Schritt wurden die Pacific-Blue gekoppelten CD11c+Zellen (DC Zell-Oberflächenmarker) gegen den FSC-A aufgetrennt und die zusehende Population zur Darstellung des prozentualen Anteils eingegrenzt. A 150 WT Abb. 61: Zellfrequenz-Analy- sen aus Knochenmark diffe- KO renzierten BM-DC und BM-Mf 100 in KO und WT Mäusen In Teilabbildung A ist der prozentuale Anteil der CD11c+ Zellen (BM-DC) ohne Stimulus (-) und nach 24-stündiger Inku- bation mit 100 ng/ml LPS dargestellt. 50 Teilabbildung B zeigt den prozentualen Anteil der F480+ Zellen (Makrophagen) ohne Stimulus (-) und nach 24-stündiger Inkubation mit 100 ng/ml LPS. Die Ex- 0 pression der Oberflächenmarker wurden - LPS mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Immunzell-Frequenzen aus KSRP+/+ B (WT) Mäusen werden als weiße Balken 150 WT abgebildet, während schwarze Balken den KSRP-/- (KO) Mäusen zuzuordnen KO sind. Die Daten repräsentieren den Mit- telwert als % + SEM von 3-4 individuel- len Mäusen pro Gruppe und Genotyp. 100 50 0 - LPS 199 F480+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] Anhang Abb. 62: Expression von Aktivierungsmar- kern auf BM-Mf aus KSRP-defizienten und WT Mäusen Dargestellt sind primäre FACS-Daten eines repräsentativen Durchgangs von jeweils drei durchgeführten Messungen. Die Histogramme zeigen Fluoreszenzintensitäten von den ver- wendeten Aktivierungsmarkern CD40, CD86, CD80 und MHCII. Die grau ausgefüllte Kurve stellt die ungefärbte Kon-trolle (Ctrl) dar, während die gestrichelte Line, die stimulierte und die durchgängige schwarze Line, die unstimulierte Probe darstellt. 200 Anhang Abb. 63: Repräsentative FACS-Analysen der Viabilität von Milzzellen Dargestellt sind primäre FACS-Daten von Milzzellen aus WT und KO Mäusen unter basalen Bedingungen (Ctrl) und nach 24- stündiger Behandlung mit (20ng/ml) TNF-a und (100ng/ml) LPS Die Detektion von FVD (fixable viability dye), sowie von An- nexin V erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Hierbei sind die lebenden Zellen im ersten Quadranten (Q4) dargestellt. Zu sehen ist ein repräsentativer Durchgang von drei durchgeführten Messungen. Die Auswertung dieser Daten erfolgte mit FlowJo. 201 Anhang Abb. 64: Gating-Strate- gie für durchflusszyto- metrische-Analysen mit Beispielfärbung zur Expression des ko- stimulatorischen Mole- küls CD86 auf Milzzel- len Zu sehen ist eine repräsenta- tive Darstellung der Gating- Strategie von einer Wildtyp so- wie einer KO-Maus. Zuerst wurden die gesamten Milzzel- len eingegrenzt, um Zellen vom Zellschrott zu separieren. Die Zellen wurden nach den ange- gebenen Achsen-Parametern aufgetrennt. Die eingegrenzte WT KO Population mit dem Pfeil er- scheint jeweils im folgenden Diagramm. Im nächsten Schritt wurden die PerCP-Cy5.5 ge- koppelten CD19+ Zellen (B- Zell-Oberflächenmarker) ge- gen den FSC-A dargestellt und die CD19+ Population entspre- chend eingegrenzt. Von diesen CD19+ Population wurden alle Zellen die den Aktivierungs- marker CD86+ exprimieren ebenfalls als Population einge- grenzt und von WT und KO Mäusen im Histogramm darge- stellt, umso das Expressionsni- veau und die Intensität zu ver- gleichen. Die Auswertung der Daten erfolgte mit FlowJo. 202 Anhang BMMA A B Stimulus DMSO 150 200 WT KO 100 150 100 75 100 50 50 50 25 0 0 - LPS 0 _ LPS Ctrl. 1% 2% 3% C SNAP D Ionomycin 100 100 75 75 50 50 25 25 0 0 Ctrl. 100µM 250µM 500µM Ctrl. 100nM 250nM 500nM Abb. 65: Metabolische Aktivitäts-Analysen von Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen aus WT und KO Mäusen Dargestellt ist die metabolische Aktivität von unbehandelten (-) Knochenmark-abgeleiteten Vorläuferzellen und nach 24-stün- diger Behandlung mit LPS (A), mit verschieden Konzentrationen an DMSO (B), SNAP (C) und Ionomycin (D). Bei unbehan- delten WT Vorläuferzellen ist die metabolische Aktivität als 100% definiert und dient damit als Kontrollwert. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert gebildet + Standardfehler von jeweils 3 untersuchten Mäusen bestimmt. 203 F480+ Zellen [% of parental] Relative metabolische Aktivität Relative metabolische Aktivität (in % der stim. Kontrolle) (in % der unstim. WT-Kontrolle) Relative metabolische Aktivität Relative metabolische Aktivität (in % der stim. Kontrolle) (in % der stim. Kontrolle) Anhang BMMA A B Stimulus DMSO 150 150 WT KO 100 100 100 75 50 50 50 25 0 0 - LPS 0 _ LPS Ctrl. 1% 2% 3% C D SNAP Ionomycin 100 100 75 75 50 50 25 25 0 0 Ctrl. 100µM 250µM 500µM Ctrl. 100nM 250nM 500nM Abb. 66: Metabolische Aktivitäts-Analysen von Milzzellen aus WT und KO Mäusen Dargestellt ist die metabolische Aktivität von unbehandelten (-) Milzzellen und nach 24-stündiger Behandlung mit LPS (A), mit verschieden Konzentrationen an DMSO (B), SNAP (C) und Ionomycin (D). Bei unbehandelten WT Milzzellen ist die metaboli- sche Aktivität als 100% definiert und dient damit als Kontrollwert. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert ge- bildet + Standardfehler von jeweils 3 untersuchten Mäusen bestimmt. 204 F480+ Zellen [% of parental] Relative metabolische Aktivität Relative metabolische Aktivität (in % der stim. Kontrolle) (in % der unstim. WT-Kontrolle) Relative metabolische Aktivität Relative metabolische Aktivität (in % der stim. Kontrolle) (in % der stim. Kontrolle) Anhang BMMA A Stimulus B DMSO 150 250 WT 100 200 KO 100 75 150 50 100 50 25 50 0 0 0 WT KO WT KO WT KO WT KO - LPS _ LPS Ctrl. 1% 5% 10% Abb. 67: Metabolische Aktivitäts-Analysen von BM-Mf aus WT und KO Mäusen Dargestellt ist die metabolische Aktivität von unbehandelten (-) und nach 24-stündiger behandelte BM-Mf mit LPS (A). In Teilabb. B ist die metabolische Aktivität von BM-Mf unter Einfluss von verschiedenen Konzentrationen an DMSO dargestellt. Bei unbehandelten WT BM-Mf ist die metabolische Aktivität als 100% definiert und dient damit als Kontrollwert. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert gebildet + Standardfehler von jeweils 3 untersuchten Mäusen pro Genotyp bestimmt. BMMA A Stimulus B DMSO 150 150 WT 100 KO 100 100 75 50 50 50 25 0 00 WT KO WT KO WT KO WT KO - LPS _ LPS Ctrl. 1% 5% 10% Abb. 68: Metabolische Aktivitäts-Analysen von BM-DC aus WT und KO Mäusen Dargestellt ist die metabolische Aktivität von unbehandelten (-) und nach 24-stündiger behandelte BM-DC mit LPS (A). In Teilabb. B ist die metabolische Aktivität von BM-DC unter Einfluss von verschiedenen Konzentrationen an DMSO dargestellt. Bei unbehandelten WT BM-DC ist die metabolische Aktivität als 100% definiert und dient damit als Kontrollwert. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert gebildet + Standardfehler von jeweils 3 durchgeführten Mäusen pro Genotyp bestimmt. 205 F480+ Zellen F480+ Zellen [% of parental] [% of parental] Relative metabolische Aktivität Relative metabolische Aktivität (in % der unstim. WT-Kontrolle) (in % der unstim. WT-Kontrolle) Relative metabolische Aktivität Relative metabolische Aktivität (in % der stim. Kontrolle) (in % der stim. Kontrolle) Anhang Abb. 69: Repräsentative FACS-Analysen der Viabilität von Milzzellen Dargestellt sind primäre FACS-Daten von Milzzellen aus WT und KO Mäusen unter basalen Bedingungen (Ctrl) und nach 24- stündiger Behandlung mit (20ng/ml) TNF-a und (100ng/ml) LPS. Die Detektion von FVD (fixable viability dye), sowie von Annexin V erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Hierbei sind die lebenden Zellen im ersten Quadranten (Q4) dargestellt. Zu sehen ist ein repräsentativer Durchgang von drei durchgeführten Messungen. Die Auswertung dieser Daten erfolgte mit FlowJo. 206 Anhang A B 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 WT KO WT KO Abb. 70: Zytokinmuster-Analysen von T-Zellen aus KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Konzentration von IL-1b (A) und TNF-a (B) aus dem Überstand polyklonal stimulierter T-Zellen. Nach Auf- reinigung durch Nylonwolle, wurden die Zellen für 90 Std. mit anti-CD3 (1µg/ml) und anti-CD28 (2µg/ml) polyklonal stimuliert. Die Zytokinmessung wurde mit Hilfe des CBA Flex Set der Firma DB Bioscience durchgeführt. Die Daten wurden auf die jeweilige Zytokinkonzentration in WT Mäusen normiert und repräsentieren den Mittelwert + Standardfehler von jeweils 15-25 untersuchten Mäusen pro Genotyp. CD11b+ Zellen Ctrl AK Abb. 71: Zellfrequenz-Analysen BMMA 2.5 aus Milzzellen von WT und KO ** Mäusen nach CAIA Tag 9 150 WT Dargestellt ist die mittlere Fluoreszenzintensi- KO tät (MFI) von CD11b + (myeloiden) Zellen aus 2.0 der Milz von unbehandelten (Ctrl) und mit An- 100 tikörper (AK) behandelten WT und KO Mäu- sen. Die Daten sind in der jeweiligen Gruppe auf die Expression in unbehandelten WT Milz- 50 150 150 1.5WT WT 150 150 WT WT zellen normiert. In den jeweiligen Diagram- KO KO KO KO men sind links (-) die unstimulierten und rechts (LPS) die 24 Stunden mit LPS behan- 0 - LPS 1.0 delten Milzzellen dargestellt. Die Expression 100 100 100 100 dieser Oberflächenmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Aus den je- weiligen Normierungen wurde der Mittelwert 50 50 0.5 50 50 gebildet + Standardfehler gebildet und für je-weils 10-15 untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp aufgetragen. Statistik: **p < 0,01; T-Test. 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS 207 F480+ Zellen [% of parental] CD11c+ Zellen [%] CD11c+ Zellen Rela[t%iv]e CD11b Expression Relative IL-1β Konzentration [MFI von WT Ctrl] [x-fach WT] CD11c+ Zellen [%] CD11c+ Zellen [%] Relative TNFα Konzentration [x-fach WT] Anhang A CD11b + Zellen CD11c+ B Zellen BMMA Ctrl AK 3 BMMA 3 Ctrl AK 150 WT 150 KO WT 100 KO 100 2 50 2 150 150 WT WT 150 150 W5T0 WT 150 150 WT WT KO KO KO 150 150 WT WT 0 KO KO KO KO KO- LPS 100 100 0100 100 - 1L0P0S 1 100 100 100 1 50 50 50 50 50 50 50 50 0 0 0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS 0 0 0 0 0- - LPS LPS- - LPS LPS C D CD19+ Zellen CD68+ Zellen BMMA 5 Ctrl AKBMMA 5 Ctrl AK 150 150 WT WT 4 KO 4 KO 100 100 50 150 150 3 WT WT 150 150 50 WT 150 150 3WTWT WT 150 150 WT WT KO KO KO KO KO KO KO KO 0 0 - 1L0P0S 100 2 100 100 - 1L0P0S 100 2 100 100 50 50 1 50 50 50 50 1 50 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS - - LPS LPS- - LPS LPS Abb. 72: Analysen zum Reifungszustand aus Milzzellen von WT und KO Mäusen Tag 9 nach CAIA Induktion Dargestellt ist die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) des kostimulatorischen Molekül CD86 auf CD11b+(A), CD11c+ (B), CD19+ (C) und CD68+(D) aus der Milz von unbehandelten (Ctrl) und mit Antikörper (AK) behandelten WT und KO Mäusen. Die Daten sind in der jeweiligen Gruppe auf die Expression in unbehandelten WT Milzzellen normiert. In den jeweiligen Diagram- men sind links (-) die unstimulierten und rechts (LPS) die 24 Stunden mit LPS behandelten Milzzellen dargestellt. Die Expres- sion dieser Oberflächenmarker wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Aus den jeweiligen Normierungen wurde der Mittelwert gebildet + Standardfehler gebildet und für jeweils 10-15 untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp aufgetragen. 208 F480+ Zellen [% of parental] F480+ Zellen [% of parental] CD11c+ Zellen [%] CD11c+ + Zellen CD11c Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen Relative CD86 Expression Re[%lat]ive CD86 Expression [MFI von CD19+ Zellen (WT Ctrl)] [MFI von CD11b+ Zellen (WT Ctrl)] CD11c+ Zellen + [%] CD11c Zellen[%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] F480+ Zellen + [% of parental] F480 Zellen [% of parental] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] Relative CD86 Expression Relative CD86 Expression [MFI von CD68+ Zellen (WT Ctrl)] [MFI von CD11c+ Zellen (WT Ctrl)] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] + CD11c+ CD11c Zellen Zellen [%] [%] Anhang A CD11b+ Zellen B CD11c+ Zellen BMMA Ctrl AK BMMA Ctrl AK 2.5 2.5 150 150 WT WT KO KO 2.0 100 2.0100 50 50 150 150 1.5WT150 1.5WT WT 150 WT 150 WT150 150 WT WT 150 WT KO KOKO KO KO 0 KO KO0 KO- LPS - LPS 100 100 100 1.0100 1.0 100 100 100 100 50 0.5 50 5050 0.5 50 50 50 50 0 0 0.0 0 0 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS- - LPS LPS- - LPS LPS C CD19+ Zellen D CD68+ Zellen BMMA Ctrl AK BMMA Ctrl AK 2.0 2.5 150 150 WT WT KO KO 100 100 2.0 1.5 50 50 150 WT 150 150 1.5WT150 WT WT 150 WT150 150 WT WT 150 WTKO KO KO 0 1.0 KO KO KO KO0 KO- LPS - LPS 100 100 1.0100 100 100 100 100 100 0.5 50 50 50 0.5 50 5050 50 50 0 0 0.0 0 0 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS- - LPS LPS- - LPS LPS E CD86+ Zellen Abb. 73: Analysen zum Reifungszustand aus Milzzellen von WT und KO Mäusen Tag 5 BMMA Ctrl AK nach CAIA Induktion 2.5 Dargestellt ist die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) des 150 WT kostimulatorischen Molekül CD86 auf CD11b +(A), CD11c+ KO (B), CD19 + (C) und CD68+(D) aus der Milz von unbehandel- 100 2.0 ten (Ctrl) und mit Antikörper (AK) behandelten WT und KO Mäusen. Die Daten sind in der jeweiligen Gruppe auf die Ex- pression in unbehandelten WT Milzzellen normiert. In den je- 50 150 150 1.5WT WT 150 WT weiligen Diagrammen sind links (-) die unstimulierten und 150 WT KO rechts (LPS) die 24 Stunden mit LPS behandelten Milzzellen KO 0 KO KO dargestellt. Die Expression dieser Oberflächenmarker wurde - LPS 100 1.0 mittels Durchflusszytometrie analysiert. Aus den jeweiligen 100 100 100 Normierungen wurde der Mittelwert + Standardfehler gebil- det und für jeweils 10 untersuchten Mäusen pro Gruppe und Genotyp aufgetragen. 50 50 0.5 50 50 0 0 0.0 0 0 - - LPS LPS- - LPS LPS 209 F480+ Zellen F480+ Zellen F480+ Zellen [% of parental] [% of parental] [% of parental] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen Re[%lat]ive CD86 Expression Re[%lat]ive CD86 Expression Re[%lat]ive CD86 Expression [MFI von CD86+ Zellen (WT Ctrl)] [MFI von CD19+ Zellen (WT Ctrl)] [MFI von CD11b+ Zellen (WT Ctrl)] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] [%] F480+ Zellen F480+ Zellen [% of parental] [% of parental] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen Re[%lat]ive CD86 Expression Re[%lat]ive CD86 Expression [MFI von CD68+ Zellen (WT Ctrl)] [MFI von CD11c+ Zellen (WT Ctrl)] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] CD11c+ Zellen CD11c+ Zellen [%] [%] Anhang A Ctrl Tag5 Tag9 B Ctrl Tag5 Tag9 6 1.5 4 1.0 2 0.5 0 0.0 rl) ) ) ) ) ) Ct Ct rl l) l) ) ) ) ) ( ( T(A K AK AK AK tr tr AK AK AK AK T O( ( ( (C (C T( ( T( (W KO W K W T KO O O WT KO W K W K Abb. 74: Zytokinmuster-Analysen von T-Zellen nach CAIA-Behandlung Dargestellt ist die Konzentration von IL-1b (A) und TNF-a (B) aus dem Überstand polyklonal stimulierter T-Zellen. Nach Auf- reinigung durch Nylonwolle, wurden die T-Zellen für 90 Std. mit anti-CD3 (1µg/ml) und anti-CD28 (2µg/ml) polyklonal stimuliert. Dabei handelt es sich um T-Zellen aus unbehandelten (Ctrl) und mit Antikörper (AK) behandelten WT und KO Mäusen. Die Zytokinmessung wurde mit Hilfe des CBA Flex Set der Firma DB Bioscience durchgeführt. Die Daten wurden auf die jeweilige Zytokinkonzentration in WT-Mäusen normiert und repräsentieren den Mittelwert + Standardfehler von jeweils 15-28 untersuch- ten Mäusen pro Gruppe und Genotyp. 10 WT * ns KO ** 5 BOOST BOOST 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 Tag Abb. 75: Darstellung des Arthritis-Index für KO und WT Mäusen Dargestellt ist die Entwicklung des Arthritis-Index von CIA in WT und KO Mäusen. Die Mäuse wurden an Tag 0 mit 50 µl CII- Lsg. (bestehend aus 1:1 mit Hühner-Kollagen II 100µg und CFA) im Schwanzansatz intradermal immunisiert. Die Immunisie- rung (boost) wurde an Tag 21 und 31 wiederholt. Die Entwicklung des klinischen Arthritis-Phänotyps wurde ab dem Tag 18 bis Tag 38 dokumentiert und als Mittelwert des Arthritis-Index dargestellt (AI, ± Standardfehler. (Statistik; ns: nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01; T-Test)) 210 Relative IL-1β Konzentration Arthritis Index (x-fach WT(Ctrl)) Relative TNFα Konzentration (x-fach WT(Ctrl)) Danksagung 9. Danksagung 211 Erklärung 10. Erklärung Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die im Literaturverzeichnis angegebenen Quellen benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder noch nicht veröf- fentlichten Quellen entnommen sind, sind als solche kenntlich gemacht. Die Zeichnun- gen oder Abbildungen in dieser Arbeit sind von mir selbst erstellt oder mit einem ent- sprechenden Quellennachweis versehen worden. _______________________ ____________________ Ort, Datum Rudolf Käfer 212 Literaturverzeichnis 11. Literaturverzeichnis 1. Natoli, G., Specialized chromatin patterns in the control of inflammatory gene expression. Curr Top Microbiol Immunol, 2011. 349: p. 61-72. 2. Newman, R., J. McHugh, and M. Turner, RNA binding proteins as regulators of immune cell biology. Clin Exp Immunol, 2016. 183(1): p. 37-49. 3. Frangou, E.A., G.K. Bertsias, and D.T. Boumpas, Gene expression and regulation in systemic lupus erythematosus. Eur J Clin Invest, 2013. 43(10): p. 1084-96. 4. Tuller, T., et al., Common and specific signatures of gene expression and protein-protein interactions in autoimmune diseases. Genes Immun, 2013. 14(2): p. 67-82. 5. Liu, R.Y., et al., Activation of p38 mitogen-activated protein kinase is required for tumor necrosis factor-alpha -supported proliferation of leukemia and lymphoma cell lines. J Biol Chem, 2000. 275(28): p. 21086-93. 6. Falvo, J.V., et al., Epigenetic control of cytokine gene expression: regulation of the TNF/LT locus and T helper cell differentiation. Adv Immunol, 2013. 118: p. 37-128. 7. Zhang, Y., Transcriptional regulation by histone ubiquitination and deubiquitination. Genes Dev, 2003. 17(22): p. 2733-40. 8. Roeder, R.G., The complexities of eukaryotic transcription initiation: regulation of preinitiation complex assembly. Trends Biochem Sci, 1991. 16(11): p. 402-8. 9. de Klerk, E. and P.A. t Hoen, Alternative mRNA transcription, processing, and translation: insights from RNA sequencing. Trends Genet, 2015. 31(3): p. 128-39. 10. Moore, M.J. and N.J. Proudfoot, Pre-mRNA processing reaches back to transcription and ahead to translation. Cell, 2009. 136(4): p. 688-700. 11. Grosso, A.R., et al., Tissue-specific splicing factor gene expression signatures. Nucleic Acids Res, 2008. 36(15): p. 4823-32. 12. Darnell, J.E., Jr., Reflections on the history of pre-mRNA processing and highlights of current knowledge: a unified picture. RNA, 2013. 19(4): p. 443-60. 13. Yaniv, K. and J.K. Yisraeli, Defining cis-acting elements and trans-acting factors in RNA localization. Int Rev Cytol, 2001. 203: p. 521-39. 14. Newbury, S.F., Control of mRNA stability in eukaryotes. Biochem Soc Trans, 2006. 34(Pt 1): p. 30-4. 15. Min, H., et al., A new regulatory protein, KSRP, mediates exon inclusion through an intronic splicing enhancer. Genes Dev, 1997. 11(8): p. 1023-36. 16. Kelemen, O., et al., Function of alternative splicing. Gene, 2013. 514(1): p. 1-30. 17. Moore, M.J. and P.A. Sharp, Evidence for two active sites in the spliceosome provided by stereochemistry of pre-mRNA splicing. Nature, 1993. 365(6444): p. 364-8. 18. Wagner, S.D. and J.A. Berglund, Alternative pre-mRNA splicing. Methods Mol Biol, 2014. 1126: p. 45-54. 213 Literaturverzeichnis 19. Hall, M.P., S. Huang, and D.L. Black, Differentiation-induced colocalization of the KH-type splicing regulatory protein with polypyrimidine tract binding protein and the c-src pre-mRNA. Mol Biol Cell, 2004. 15(2): p. 774-86. 20. He, L., A. Weber, and D. Levens, Nuclear targeting determinants of the far upstream element binding protein, a c-myc transcription factor. Nucleic Acids Res, 2000. 28(22): p. 4558-65. 21. Danckwardt, S., et al., p38 MAPK controls prothrombin expression by regulated RNA 3' end processing. Mol Cell, 2011. 41(3): p. 298-310. 22. Lellek, H., et al., Purification and molecular cloning of a novel essential component of the apolipoprotein B mRNA editing enzyme-complex. J Biol Chem, 2000. 275(26): p. 19848-56. 23. Ruggiero, T., et al., LPS induces KH-type splicing regulatory protein-dependent processing of microRNA-155 precursors in macrophages. FASEB J, 2009. 23(9): p. 2898-908. 24. Filipowicz, W., S.N. Bhattacharyya, and N. Sonenberg, Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genet, 2008. 9(2): p. 102-14. 25. Su, L.C., et al., Role of microRNA-155 in rheumatoid arthritis. Int J Rheum Dis, 2017. 20(11): p. 1631-1637. 26. Chou, C.F., et al., KSRP ablation enhances brown fat gene program in white adipose tissue through reduced miR-150 expression. Diabetes, 2014. 63(9): p. 2949-61. 27. Lin, Y.Y., et al., KSRP and MicroRNA 145 are negative regulators of lipolysis in white adipose tissue. Mol Cell Biol, 2014. 34(12): p. 2339-49. 28. Giovarelli, M., et al., H19 long noncoding RNA controls the mRNA decay promoting function of KSRP. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014. 111(47): p. E5023-8. 29. Briata, P., et al., KSRP, many functions for a single protein. Front Biosci (Landmark Ed), 2011. 16: p. 1787-96. 30. Trabucchi, M., et al., The RNA-binding protein KSRP promotes the biogenesis of a subset of microRNAs. Nature, 2009. 459(7249): p. 1010-4. 31. Briata, P., et al., Diverse roles of the nucleic acid-binding protein KHSRP in cell differentiation and disease. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2016. 7(2): p. 227-40. 32. Gherzi, R., et al., A KH domain RNA binding protein, KSRP, promotes ARE-directed mRNA turnover by recruiting the degradation machinery. Mol Cell, 2004. 14(5): p. 571-83. 33. Chen, C.Y. and A.B. Shyu, AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation. Trends Biochem Sci, 1995. 20(11): p. 465-70. 34. Chen, C.Y., et al., AU binding proteins recruit the exosome to degrade ARE-containing mRNAs. Cell, 2001. 107(4): p. 451-64. 35. Dhamija, S., et al., Interleukin-1 activates synthesis of interleukin-6 by interfering with a KH- type splicing regulatory protein (KSRP)-dependent translational silencing mechanism. J Biol Chem, 2011. 286(38): p. 33279-88. 36. Gao, M., et al., A novel mRNA-decapping activity in HeLa cytoplasmic extracts is regulated by AU-rich elements. EMBO J, 2001. 20(5): p. 1134-43. 37. Anderson, P., Post-transcriptional control of cytokine production. Nat Immunol, 2008. 9(4): p. 353-9. 38. Anderson, P., Post-transcriptional regulons coordinate the initiation and resolution of inflammation. Nat Rev Immunol, 2010. 10(1): p. 24-35. 214 Literaturverzeichnis 39. Szostak, E. and F. Gebauer, Translational control by 3'-UTR-binding proteins. Brief Funct Genomics, 2013. 12(1): p. 58-65. 40. Bollig, F., et al., Affinity purification of ARE-binding proteins identifies polyA-binding protein 1 as a potential substrate in MK2-induced mRNA stabilization. Biochem Biophys Res Commun, 2003. 301(3): p. 665-70. 41. Haneklaus, M., et al., The RNA-binding protein Tristetraprolin (TTP) is a critical negative regulator of the NLRP3 inflammasome. J Biol Chem, 2017. 292(17): p. 6869-6881. 42. Gratacos, F.M. and G. Brewer, The role of AUF1 in regulated mRNA decay. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2010. 1(3): p. 457-73. 43. Quijada, L., et al., Expression of the human RNA-binding protein HuR in Trypanosoma brucei increases the abundance of mRNAs containing AU-rich regulatory elements. Nucleic Acids Res, 2002. 30(20): p. 4414-24. 44. Khabar, K.S., Post-transcriptional control during chronic inflammation and cancer: a focus on AU-rich elements. Cell Mol Life Sci, 2010. 67(17): p. 2937-55. 45. Winzen, R., et al., Functional analysis of KSRP interaction with the AU-rich element of interleukin-8 and identification of inflammatory mRNA targets. Mol Cell Biol, 2007. 27(23): p. 8388-400. 46. Linker, K., et al., Involvement of KSRP in the post-transcriptional regulation of human iNOS expression-complex interplay of KSRP with TTP and HuR. Nucleic Acids Res, 2005. 33(15): p. 4813-27. 47. Li, X., et al., KSRP: a checkpoint for inflammatory cytokine production in astrocytes. Glia, 2012. 60(11): p. 1773-84. 48. Nguyen-Chi, M. and D. Morello, [Aberrant regulation of mRNA 3' untranslated region in cancers and inflammation]. Med Sci (Paris), 2008. 24(3): p. 290-6. 49. Lin, W.J., et al., Posttranscriptional control of type I interferon genes by KSRP in the innate immune response against viral infection. Mol Cell Biol, 2011. 31(16): p. 3196-207. 50. Briata, P., et al., Functional and molecular insights into KSRP function in mRNA decay. Biochim Biophys Acta, 2013. 1829(6-7): p. 689-94. 51. Beisang, D. and P.R. Bohjanen, Perspectives on the ARE as it turns 25 years old. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2012. 3(5): p. 719-31. 52. Yarovinsky, T.O., et al., Early exposure to IL-4 stabilizes IL-4 mRNA in CD4+ T cells via RNA- binding protein HuR. J Immunol, 2006. 177(7): p. 4426-35. 53. Casolaro, V., et al., Posttranscriptional regulation of IL-13 in T cells: role of the RNA-binding protein HuR. J Allergy Clin Immunol, 2008. 121(4): p. 853-9 e4. 54. Stellato, C., et al., Coordinate regulation of GATA-3 and Th2 cytokine gene expression by the RNA-binding protein HuR. J Immunol, 2011. 187(1): p. 441-9. 55. Gubin, M.M., et al., Conditional knockout of the RNA-binding protein HuR in CD4(+) T cells reveals a gene dosage effect on cytokine production. Mol Med, 2014. 20: p. 93-108. 56. Zhou, H., et al., RNA-binding proteins in neurological diseases. Sci China Life Sci, 2014. 57(4): p. 432-44. 57. Carballo, E. and P.J. Blackshear, Roles of tumor necrosis factor-alpha receptor subtypes in the pathogenesis of the tristetraprolin-deficiency syndrome. Blood, 2001. 98(8): p. 2389-95. 58. Bros, M., et al., The RNA binding protein tristetraprolin influences the activation state of murine dendritic cells. Mol Immunol, 2010. 47(5): p. 1161-70. 215 Literaturverzeichnis 59. Bollmann, F., et al., Endothelial dysfunction in tristetraprolin-deficient mice is not caused by enhanced tumor necrosis factor-alpha expression. J Biol Chem, 2014. 289(22): p. 15653-65. 60. Taylor, G.A., et al., A pathogenetic role for TNF alpha in the syndrome of cachexia, arthritis, and autoimmunity resulting from tristetraprolin (TTP) deficiency. Immunity, 1996. 4(5): p. 445- 54. 61. Lu, J.Y., N. Sadri, and R.J. Schneider, Endotoxic shock in AUF1 knockout mice mediated by failure to degrade proinflammatory cytokine mRNAs. Genes Dev, 2006. 20(22): p. 3174-84. 62. Sarkar, S., et al., RNA-binding protein AUF1 regulates lipopolysaccharide-induced IL10 expression by activating IkappaB kinase complex in monocytes. Mol Cell Biol, 2011. 31(4): p. 602-15. 63. Xia, Z., et al., Cold-inducible RNA-binding protein (CIRP) regulates target mRNA stabilization in the mouse testis. FEBS Lett, 2012. 586(19): p. 3299-308. 64. Qiang, X., et al., Cold-inducible RNA-binding protein (CIRP) triggers inflammatory responses in hemorrhagic shock and sepsis. Nat Med, 2013. 19(11): p. 1489-1495. 65. Massberg, S., et al., Immunosurveillance by hematopoietic progenitor cells trafficking through blood, lymph, and peripheral tissues. Cell, 2007. 131(5): p. 994-1008. 66. Li, C.L. and G.R. Johnson, Murine hematopoietic stem and progenitor cells: I. Enrichment and biologic characterization. Blood, 1995. 85(6): p. 1472-9. 67. Laird, D.J., U.H. von Andrian, and A.J. Wagers, Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell, 2008. 132(4): p. 612-30. 68. Janeway, C.A., Jr. and R. Medzhitov, Innate immune recognition. Annu Rev Immunol, 2002. 20: p. 197-216. 69. Iwasaki, A. and R. Medzhitov, Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science, 2010. 327(5963): p. 291-5. 70. Kafasla, P., A. Skliris, and D.L. Kontoyiannis, Post-transcriptional coordination of immunological responses by RNA-binding proteins. Nat Immunol, 2014. 15(6): p. 492-502. 71. Palm, N.W. and R. Medzhitov, Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev, 2009. 227(1): p. 221-33. 72. Flores-Romo, L., In vivo maturation and migration of dendritic cells. Immunology, 2001. 102(3): p. 255-62. 73. Randolph, G.J., V. Angeli, and M.A. Swartz, Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol, 2005. 5(8): p. 617-28. 74. Alvarez, D., E.H. Vollmann, and U.H. von Andrian, Mechanisms and consequences of dendritic cell migration. Immunity, 2008. 29(3): p. 325-42. 75. Adams, S., D.W. O'Neill, and N. Bhardwaj, Recent advances in dendritic cell biology. J Clin Immunol, 2005. 25(3): p. 177-88. 76. Mosser, D.M. and J.P. Edwards, Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol, 2008. 8(12): p. 958-69. 77. Italiani, P. and D. Boraschi, From Monocytes to M1/M2 Macrophages: Phenotypical vs. Functional Differentiation. Front Immunol, 2014. 5: p. 514. 78. Mills, C.D., et al., M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol, 2000. 164(12): p. 6166-73. 216 Literaturverzeichnis 79. Benoit, M., B. Desnues, and J.L. Mege, Macrophage polarization in bacterial infections. J Immunol, 2008. 181(6): p. 3733-9. 80. Chen, X. and P.E. Jensen, The role of B lymphocytes as antigen-presenting cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 2008. 56(2): p. 77-83. 81. Kaminski, D.A., et al., Advances in human B cell phenotypic profiling. Front Immunol, 2012. 3: p. 302. 82. Cerutti, A., I. Puga, and M. Cols, New helping friends for B cells. Eur J Immunol, 2012. 42(8): p. 1956-68. 83. Parkin, J. and B. Cohen, An overview of the immune system. Lancet, 2001. 357(9270): p. 1777- 89. 84. Youngman, K.R., et al., Correlation of tissue distribution, developmental phenotype, and intestinal homing receptor expression of antigen-specific B cells during the murine anti- rotavirus immune response. J Immunol, 2002. 168(5): p. 2173-81. 85. Cerutti, A., The regulation of IgA class switching. Nat Rev Immunol, 2008. 8(6): p. 421-34. 86. Mauri, C., et al., Prevention of arthritis by interleukin 10-producing B cells. J Exp Med, 2003. 197(4): p. 489-501. 87. Stenvinkel, P., et al., IL-10, IL-6, and TNF-alpha: central factors in the altered cytokine network of uremia--the good, the bad, and the ugly. Kidney Int, 2005. 67(4): p. 1216-33. 88. Fiorentino, D.F., et al., IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. J Immunol, 1991. 147(11): p. 3815-22. 89. Horiuchi, T., et al., Transmembrane TNF-alpha: structure, function and interaction with anti- TNF agents. Rheumatology (Oxford), 2010. 49(7): p. 1215-28. 90. Piguet, P.F., et al., Tumor necrosis factor/cachectin is an effector of skin and gut lesions of the acute phase of graft-vs.-host disease. J Exp Med, 1987. 166(5): p. 1280-9. 91. Tracey, K.J. and A. Cerami, Tumor necrosis factor, other cytokines and disease. Annu Rev Cell Biol, 1993. 9: p. 317-43. 92. Giroir, B.P., T. Brown, and B. Beutler, Constitutive synthesis of tumor necrosis factor in the thymus. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(11): p. 4864-8. 93. Vilcek, J. and T.H. Lee, Tumor necrosis factor. New insights into the molecular mechanisms of its multiple actions. J Biol Chem, 1991. 266(12): p. 7313-6. 94. Dayer, J.M., B. Beutler, and A. Cerami, Cachectin/tumor necrosis factor stimulates collagenase and prostaglandin E2 production by human synovial cells and dermal fibroblasts. J Exp Med, 1985. 162(6): p. 2163-8. 95. Salerno, F. and M.C. Wolkers, T-cells require post-transcriptional regulation for accurate immune responses. Biochem Soc Trans, 2015. 43(6): p. 1201-7. 96. Carpenter, S., et al., Post-transcriptional regulation of gene expression in innate immunity. Nat Rev Immunol, 2014. 14(6): p. 361-76. 97. Abbas, A.K., K.M. Murphy, and A. Sher, Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature, 1996. 383(6603): p. 787-93. 98. Smith, K.A., Interleukin-2: inception, impact, and implications. Science, 1988. 240(4856): p. 1169-76. 99. Luckheeram, R.V., et al., CD4(+)T cells: differentiation and functions. Clin Dev Immunol, 2012. 2012: p. 925135. 217 Literaturverzeichnis 100. Mosmann, T.R., et al., Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. 1986. J Immunol, 2005. 175(1): p. 5-14. 101. Flesch, I.E., et al., Early interleukin 12 production by macrophages in response to mycobacterial infection depends on interferon gamma and tumor necrosis factor alpha. J Exp Med, 1995. 181(5): p. 1615-21. 102. Zhu, J., H. Yamane, and W.E. Paul, Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annu Rev Immunol, 2010. 28: p. 445-89. 103. Kaplan, M.H., M.M. Hufford, and M.R. Olson, The development and in vivo function of T helper 9 cells. Nat Rev Immunol, 2015. 15(5): p. 295-307. 104. Ivanov, II, et al., The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell, 2006. 126(6): p. 1121-33. 105. O'Garra, A., L. Steinman, and K. Gijbels, CD4+ T-cell subsets in autoimmunity. Curr Opin Immunol, 1997. 9(6): p. 872-83. 106. Hirahara, K. and T. Nakayama, CD4+ T-cell subsets in inflammatory diseases: beyond the Th1/Th2 paradigm. Int Immunol, 2016. 28(4): p. 163-71. 107. Borregaard, N., Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity, 2010. 33(5): p. 657-70. 108. Simon, H.U., Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev, 2003. 193: p. 101-10. 109. Niggli, V., Signaling to migration in neutrophils: importance of localized pathways. Int J Biochem Cell Biol, 2003. 35(12): p. 1619-38. 110. Durr, M.C., et al., Neutrophil chemotaxis by pathogen-associated molecular patterns-- formylated peptides are crucial but not the sole neutrophil attractants produced by Staphylococcus aureus. Cell Microbiol, 2006. 8(2): p. 207-17. 111. Kobayashi, S.D., et al., Neutrophils in the innate immune response. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 2005. 53(6): p. 505-17. 112. Fahy, J.V., et al., Prominent neutrophilic inflammation in sputum from subjects with asthma exacerbation. J Allergy Clin Immunol, 1995. 95(4): p. 843-52. 113. Jatakanon, A., et al., Neutrophilic inflammation in severe persistent asthma. Am J Respir Crit Care Med, 1999. 160(5 Pt 1): p. 1532-9. 114. Gibson, P.G., J.L. Simpson, and N. Saltos, Heterogeneity of airway inflammation in persistent asthma : evidence of neutrophilic inflammation and increased sputum interleukin-8. Chest, 2001. 119(5): p. 1329-36. 115. Foley, S.C. and Q. Hamid, Images in allergy and immunology: neutrophils in asthma. J Allergy Clin Immunol, 2007. 119(5): p. 1282-6. 116. Kamradt, T. and N.A. Mitchison, Tolerance and autoimmunity. N Engl J Med, 2001. 344(9): p. 655-64. 117. Germain, R.N., T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol, 2002. 2(5): p. 309-22. 118. Swat, W., et al., Clonal deletion of immature CD4+8+ thymocytes in suspension culture by extrathymic antigen-presenting cells. Nature, 1991. 351(6322): p. 150-3. 119. Schwartz, R.H., T cell clonal anergy. Curr Opin Immunol, 1997. 9(3): p. 351-7. 120. Goodnow, C.C., et al., Induction of self-tolerance in mature peripheral B lymphocytes. Nature, 1989. 342(6248): p. 385-91. 218 Literaturverzeichnis 121. Romagnani, S., The role of lymphocytes in allergic disease. J Allergy Clin Immunol, 2000. 105(3): p. 399-408. 122. Larche, M., C.A. Akdis, and R. Valenta, Immunological mechanisms of allergen-specific immunotherapy. Nat Rev Immunol, 2006. 6(10): p. 761-71. 123. Asano, M., et al., Autoimmune disease as a consequence of developmental abnormality of a T cell subpopulation. J Exp Med, 1996. 184(2): p. 387-96. 124. Myasoedova, E., et al., Epidemiology of rheumatoid arthritis: rheumatoid arthritis and mortality. Curr Rheumatol Rep, 2010. 12(5): p. 379-85. 125. Choy, E.H. and G.S. Panayi, Cytokine pathways and joint inflammation in rheumatoid arthritis. N Engl J Med, 2001. 344(12): p. 907-16. 126. Cutolo, M., et al., Estrogens and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci, 2006. 1089: p. 538- 47. 127. Voulgari, P.V., Emerging drugs for rheumatoid arthritis. Expert Opin Emerg Drugs, 2008. 13(1): p. 175-96. 128. Scott, D.L., F. Wolfe, and T.W. Huizinga, Rheumatoid arthritis. Lancet, 2010. 376(9746): p. 1094-108. 129. Gravallese, E.M. and S.R. Goldring, Cellular mechanisms and the role of cytokines in bone erosions in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2000. 43(10): p. 2143-51. 130. Edwards, C.J. and C. Cooper, Early environmental factors and rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol, 2006. 143(1): p. 1-5. 131. Vassilopoulos, D. and L.H. Calabrese, Virally associated arthritis 2008: clinical, epidemiologic, and pathophysiologic considerations. Arthritis Res Ther, 2008. 10(5): p. 215. 132. Gorman, J.D. and L.A. Criswell, The shared epitope and severity of rheumatoid arthritis. Rheum Dis Clin North Am, 2002. 28(1): p. 59-78. 133. Newton, J.L., et al., A review of the MHC genetics of rheumatoid arthritis. Genes Immun, 2004. 5(3): p. 151-7. 134. Firestein, G.S., Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature, 2003. 423(6937): p. 356-61. 135. Pap, T., et al., Fibroblast biology. Role of synovial fibroblasts in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Arthritis Res, 2000. 2(5): p. 361-7. 136. Martel-Pelletier, J. and J.P. Pelletier, Is osteoarthritis a disease involving only cartilage or other articular tissues? Eklem Hastalik Cerrahisi, 2010. 21(1): p. 2-14. 137. The-World-Health-Organization, Asthma Fact sheets. Updated April 2017: p. http://www.who.int/respiratory/asthma/en/. 138. Holgate, S.T., Pathogenesis of asthma. Clin Exp Allergy, 2008. 38(6): p. 872-97. 139. Fuhlbrigge, A.L., Asthma severity and asthma control: symptoms, pulmonary function, and inflammatory markers. Curr Opin Pulm Med, 2004. 10(1): p. 1-6. 140. Murphy, D.M. and P.M. O'Byrne, Recent advances in the pathophysiology of asthma. Chest, 2010. 137(6): p. 1417-26. 141. Beeh, K.M. and R. Buhl, [Pathogenesis of bronchial asthma--unveiling new therapeutic prospects]. Med Klin (Munich), 2001. 96(1): p. 15-25. 142. Humbert, M., et al., The immunopathology of extrinsic (atopic) and intrinsic (non-atopic) asthma: more similarities than differences. Immunol Today, 1999. 20(11): p. 528-33. 219 Literaturverzeichnis 143. Kim, H.Y., R.H. DeKruyff, and D.T. Umetsu, The many paths to asthma: phenotype shaped by innate and adaptive immunity. Nat Immunol, 2010. 11(7): p. 577-84. 144. Busse, W.W. and R.F. Lemanske, Jr., Asthma. N Engl J Med, 2001. 344(5): p. 350-62. 145. Galli, S.J., M. Tsai, and A.M. Piliponsky, The development of allergic inflammation. Nature, 2008. 454(7203): p. 445-54. 146. Bloemen, K., et al., The allergic cascade: review of the most important molecules in the asthmatic lung. Immunol Lett, 2007. 113(1): p. 6-18. 147. Galli, S.J. and M. Tsai, IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med, 2012. 18(5): p. 693-704. 148. Georas, S.N., et al., T-helper cell type-2 regulation in allergic disease. Eur Respir J, 2005. 26(6): p. 1119-37. 149. Bosnjak, B., et al., Treatment of allergic asthma: modulation of Th2 cells and their responses. Respir Res, 2011. 12: p. 114. 150. Temann, U.A., et al., IL9 leads to airway inflammation by inducing IL13 expression in airway epithelial cells. Int Immunol, 2007. 19(1): p. 1-10. 151. Oboki, K., et al., Th17 and allergy. Allergol Int, 2008. 57(2): p. 121-34. 152. Doe, C., et al., Expression of the T helper 17-associated cytokines IL-17A and IL-17F in asthma and COPD. Chest, 2010. 138(5): p. 1140-7. 153. Schnyder-Candrian, S., et al., Interleukin-17 is a negative regulator of established allergic asthma. J Exp Med, 2006. 203(12): p. 2715-25. 154. Akdis, M., et al., TH17 and TH22 cells: a confusion of antimicrobial response with tissue inflammation versus protection. J Allergy Clin Immunol, 2012. 129(6): p. 1438-49; quiz1450-1. 155. Montoliu, L. and C.B. Whitelaw, Using standard nomenclature to adequately name transgenes, knockout gene alleles and any mutation associated to a genetically modified mouse strain. Transgenic Res, 2011. 20(2): p. 435-40. 156. Nandakumar, K.S. and R. Holmdahl, Arthritis induced with cartilage-specific antibodiesis IL-4- dependent. Eur J Immunol, 2006. 36(6): p. 1608-18. 157. MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT, Warum erforschen Wissenschafler Mäuse? Updated 2018. Fakten: p. https://www.mpg.de/10888547/warum-erforschen-wissenschaftler-maeuse 158. Cho, Y.G., et al., Type II collagen autoimmunity in a mouse model of human rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev, 2007. 7(1): p. 65-70. 159. Hegen, M., et al., Utility of animal models for identification of potential therapeutics for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, 2008. 67(11): p. 1505-15. 160. Moore, A.R., Collagen-induced arthritis. Methods Mol Biol, 2003. 225: p. 175-9. 161. Snir, O., et al., Multifunctional T cell reactivity with native and glycosylated type II collagen in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2012. 64(8): p. 2482-8. 162. Ellis, J.S., et al., Adjuvant composition determines the induction of type II collagen-induced arthritis. Scand J Immunol, 1992. 36(1): p. 49-56. 163. Nandakumar, K.S. and R. Holmdahl, Efficient promotion of collagen antibody induced arthritis (CAIA) using four monoclonal antibodies specific for the major epitopes recognized in both collagen induced arthritis and rheumatoid arthritis. J Immunol Methods, 2005. 304(1-2): p. 126-36. 220 Literaturverzeichnis 164. Seki, N., et al., Type II collagen-induced murine arthritis. I. Induction and perpetuation of arthritis require synergy between humoral and cell-mediated immunity. J Immunol, 1988. 140(5): p. 1477-84. 165. Boissier, M.C., et al., Biphasic effect of interferon-gamma in murine collagen-induced arthritis. Eur J Immunol, 1995. 25(5): p. 1184-90. 166. Germann, T., et al., Administration of interleukin 12 in combination with type II collagen induces severe arthritis in DBA/1 mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(11): p. 4823-7. 167. Mauritz, N.J., et al., Treatment with gamma-interferon triggers the onset of collagen arthritis in mice. Arthritis Rheum, 1988. 31(10): p. 1297-304. 168. Moder, K.G., et al., Prevention of collagen induced arthritis in mice by treatment with an antibody directed against the T cell receptor alpha beta framework. Autoimmunity, 1992. 11(4): p. 219-24. 169. Corthay, A., et al., Collagen-induced arthritis development requires alpha beta T cells but not gamma delta T cells: studies with T cell-deficient (TCR mutant) mice. Int Immunol, 1999. 11(7): p. 1065-73. 170. Svensson, L., et al., B cell-deficient mice do not develop type II collagen-induced arthritis (CIA). Clin Exp Immunol, 1998. 111(3): p. 521-6. 171. Pan, M., et al., Resistance to development of collagen-induced arthritis in C57BL/6 mice is due to a defect in secondary, but not in primary, immune response. J Clin Immunol, 2004. 24(5): p. 481-91. 172. Wooley, P.H., et al., Type II collagen-induced arthritis in mice. I. Major histocompatibility complex (I region) linkage and antibody correlates. J Exp Med, 1981. 154(3): p. 688-700. 173. Backlund, J., et al., C57BL/6 mice need MHC class II Aq to develop collagen-induced arthritis dependent on autoreactive T cells. Ann Rheum Dis, 2013. 72(7): p. 1225-32. 174. Gonzalez-Gay, M.A., et al., Protective role of major histocompatibility complex class II Ebd transgene on collagen-induced arthritis. J Exp Med, 1994. 180(4): p. 1559-64. 175. Nandakumar, K.S., L. Svensson, and R. Holmdahl, Collagen type II-specific monoclonal antibody-induced arthritis in mice: description of the disease and the influence of age, sex, and genes. Am J Pathol, 2003. 163(5): p. 1827-37. 176. Nandakumar, K.S. and R. Holmdahl, Antibody-induced arthritis: disease mechanisms and genes involved at the effector phase of arthritis. Arthritis Res Ther, 2006. 8(6): p. 223. 177. Nandakumar, K.S., et al., Collagen type II (CII)-specific antibodies induce arthritis in the absence of T or B cells but the arthritis progression is enhanced by CII-reactive T cells. Arthritis Res Ther, 2004. 6(6): p. R544-50. 178. Udalova, I.A., A. Mantovani, and M. Feldmann, Macrophage heterogeneity in the context of rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol, 2016. 12(8): p. 472-85. 179. Shinagawa, K. and M. Kojima, Mouse model of airway remodeling: strain differences. Am J Respir Crit Care Med, 2003. 168(8): p. 959-67. 180. Melgert, B.N., et al., Female mice are more susceptible to the development of allergic airway inflammation than male mice. Clin Exp Allergy, 2005. 35(11): p. 1496-503. 181. Gueders, M.M., et al., Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflamm Res, 2009. 58(12): p. 845-54. 221 Literaturverzeichnis 182. Renz, H., et al., Aerosolized antigen exposure without adjuvant causes increased IgE production and increased airway responsiveness in the mouse. J Allergy Clin Immunol, 1992. 89(6): p. 1127-38. 183. Besnard, A.G., et al., Inflammasome-IL-1-Th17 response in allergic lung inflammation. J Mol Cell Biol, 2012. 4(1): p. 3-10. 184. Wakashin, H., et al., IL-23 and Th17 cells enhance Th2-cell-mediated eosinophilic airway inflammation in mice. Am J Respir Crit Care Med, 2008. 178(10): p. 1023-32. 185. Murdoch, J.R. and C.M. Lloyd, Resolution of allergic airway inflammation and airway hyperreactivity is mediated by IL-17-producing {gamma}{delta}T cells. Am J Respir Crit Care Med, 2010. 182(4): p. 464-76. 186. Unkeless, J.C., Characterization of a monoclonal antibody directed against mouse macrophage and lymphocyte Fc receptors. J Exp Med, 1979. 150(3): p. 580-96. 187. Scheicher, C., et al., Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. J Immunol Methods, 1992. 154(2): p. 253-64. 188. Lutz, M.B., et al., An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of immunological methods, 1999. 223(1): p. 77-92. 189. Boyum, A., Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Introduction. Scand J Clin Lab Invest Suppl, 1968. 97: p. 7. 190. Gunzer, M., et al., Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J Immunol Methods, 2001. 258(1-2): p. 55-63. 191. Denizot, F. and R. Lang, Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods, 1986. 89(2): p. 271-7. 192. Boin, F., et al., Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS One, 2017. 12(11): p. e0188916. 193. Fadok, V.A., et al., Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol, 1992. 148(7): p. 2207- 16. 194. Martin, S.J., et al., Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J Exp Med, 1995. 182(5): p. 1545-56. 195. Morgan, E., et al., Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin Immunol, 2004. 110(3): p. 252-66. 196. Brand, D.D., A.H. Kang, and E.F. Rosloniec, Immunopathogenesis of collagen arthritis. Springer Semin Immunopathol, 2003. 25(1): p. 3-18. 197. Courtenay, J.S., et al., Immunisation against heterologous type II collagen induces arthritis in mice. Nature, 1980. 283(5748): p. 666-8. 198. Campbell, I.K., J.A. Hamilton, and I.P. Wicks, Collagen-induced arthritis in C57BL/6 (H-2b) mice: new insights into an important disease model of rheumatoid arthritis. Eur J Immunol, 2000. 30(6): p. 1568-75. 222 Literaturverzeichnis 199. Kikawada, E., D.M. Lenda, and V.R. Kelley, IL-12 deficiency in MRL-Fas(lpr) mice delays nephritis and intrarenal IFN-gamma expression, and diminishes systemic pathology. J Immunol, 2003. 170(7): p. 3915-25. 200. Nandakumar, K.S. and R. Holmdahl, Collagen antibody induced arthritis. Methods Mol Med, 2007. 136: p. 215-23. 201. Haggerty, J.M., et al., Segmentation of epidermal tissue with histopathological damage in images of haematoxylin and eosin stained human skin. BMC Med Imaging, 2014. 14: p. 7. 202. Welsch, U. and U. Schumacher, Lectinhistochemical observations on the bronchial glands and the goblet cells of the airway epithelium of marine diving mammals. Acta Histochem Suppl, 1988. 36: p. 255-61. 203. Kumar, R.K. and P.S. Foster, Modeling allergic asthma in mice: pitfalls and opportunities. Am J Respir Cell Mol Biol, 2002. 27(3): p. 267-72. 204. Nials, A.T. and S. Uddin, Mouse models of allergic asthma: acute and chronic allergen challenge. Dis Model Mech, 2008. 1(4-5): p. 213-20. 205. Shin, Y.S., K. Takeda, and E.W. Gelfand, Understanding asthma using animal models. Allergy Asthma Immunol Res, 2009. 1(1): p. 10-8. 206. Schwarze, J., et al., IL-5 and eosinophils are essential for the development of airway hyperresponsiveness following acute respiratory syncytial virus infection. J Immunol, 1999. 162(5): p. 2997-3004. 207. Hamelmann, E., et al., Development of eosinophilic airway inflammation and airway hyperresponsiveness requires interleukin-5 but not immunoglobulin E or B lymphocytes. Am J Respir Cell Mol Biol, 1999. 21(4): p. 480-9. 208. Jain, V.V., et al., CpG-oligodeoxynucleotides inhibit airway remodeling in a murine model of chronic asthma. J Allergy Clin Immunol, 2002. 110(6): p. 867-72. 209. Hamelmann, E. and E.W. Gelfand, Role of IL-5 in the development of allergen-induced airway hyperresponsiveness. Int Arch Allergy Immunol, 1999. 120(1): p. 8-16. 210. Temelkovski, J., et al., An improved murine model of asthma: selective airway inflammation, epithelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerosolised allergen. Thorax, 1998. 53(10): p. 849-56. 211. Maxeiner, J.H., et al., A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat Protoc, 2007. 2(1): p. 105-12. 212. McMillan, S.J. and C.M. Lloyd, Prolonged allergen challenge in mice leads to persistent airway remodelling. Clin Exp Allergy, 2004. 34(3): p. 497-507. 213. Baum, S., The PAS Reaction for Staining Cell Walls. CSH Protoc, 2008. 2008: p. pdb prot4956. 214. Fang, Y.O. and U. Welsch, A histochemical study of the distribution of lectin binding sites in the developing oocytes of the lancelet Branchiostoma belcheri. Cell Tissue Res, 1995. 280(2): p. 427-34. 215. Bollmann, F., et al., Resveratrol post-transcriptionally regulates pro-inflammatory gene expression via regulation of KSRP RNA binding activity. Nucleic Acids Res, 2014. 42(20): p. 12555-69. 216. Lin, K.K. and M.A. Goodell, Detection of hematopoietic stem cells by flow cytometry. Methods Cell Biol, 2011. 103: p. 21-30. 217. Till, J.E. and C.E. Mc, A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res, 1961. 14: p. 213-22. 223 Literaturverzeichnis 218. Adachi, Y., et al., Immature dendritic cells (CD11c+ CD3- B220- cells) present in mouse peripheral blood. Immunobiology, 2002. 206(4): p. 354-67. 219. Smeaton, T.C., Migration of polymorphonuclear neutrophils and macrophages from bone marrow to the peritoneal cavity after (3H)-thymidine labelling of rat tibial bone marrow in vivo. Aust J Exp Biol Med Sci, 1984. 62 ( Pt 4): p. 453-63. 220. Corkum, C.P., et al., Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT) and standard density gradient. BMC Immunol, 2015. 16: p. 48. 221. Doeing, D.C., J.L. Borowicz, and E.T. Crockett, Gender dimorphism in differential peripheral blood leukocyte counts in mice using cardiac, tail, foot, and saphenous vein puncture methods. BMC Clin Pathol, 2003. 3(1): p. 3. 222. Mestas, J. and C.C. Hughes, Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol, 2004. 172(5): p. 2731-8. 223. Haley, P.J., Species differences in the structure and function of the immune system. Toxicology, 2003. 188(1): p. 49-71. 224. Gordon, S. and P.R. Taylor, Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol, 2005. 5(12): p. 953-64. 225. Mebius, R.E. and G. Kraal, Structure and function of the spleen. Nat Rev Immunol, 2005. 5(8): p. 606-16. 226. Tiron, A. and C. Vasilescu, [Role of the spleen in immunity. Immunologic consequences of splenectomy]. Chirurgia (Bucur), 2008. 103(3): p. 255-63. 227. Arch, R.H., R.W. Gedrich, and C.B. Thompson, Tumor necrosis factor receptor-associated factors (TRAFs)--a family of adapter proteins that regulates life and death. Genes Dev, 1998. 12(18): p. 2821-30. 228. Ashkenazi, A., Targeting death and decoy receptors of the tumour-necrosis factor superfamily. Nat Rev Cancer, 2002. 2(6): p. 420-30. 229. MacEwan, D.J., TNF receptor subtype signalling: differences and cellular consequences. Cell Signal, 2002. 14(6): p. 477-92. 230. MacEwan, D.J., TNF ligands and receptors--a matter of life and death. Br J Pharmacol, 2002. 135(4): p. 855-75. 231. Suzuki, T., et al., Mechanisms involved in apoptosis of human macrophages induced by lipopolysaccharide from Actinobacillus actinomycetemcomitans in the presence of cycloheximide. Infect Immun, 2004. 72(4): p. 1856-65. 232. Choi, K.B., et al., Lipopolysaccharide mediates endothelial apoptosis by a FADD-dependent pathway. J Biol Chem, 1998. 273(32): p. 20185-8. 233. Wlodkowic, D., et al., Apoptosis and beyond: cytometry in studies of programmed cell death. Methods Cell Biol, 2011. 103: p. 55-98. 234. Zlotnik, A. and O. Yoshie, Chemokines: a new classification system and their role in immunity. Immunity, 2000. 12(2): p. 121-7. 235. Borish, L.C. and J.W. Steinke, 2. Cytokines and chemokines. J Allergy Clin Immunol, 2003. 111(2 Suppl): p. S460-75. 236. Ozaki, K. and W.J. Leonard, Cytokine and cytokine receptor pleiotropy and redundancy. J Biol Chem, 2002. 277(33): p. 29355-8. 224 Literaturverzeichnis 237. Gershon, R.K. and K. Kondo, Cell interactions in the induction of tolerance: the role of thymic lymphocytes. Immunology, 1970. 18(5): p. 723-37. 238. Parnes, J.R., Molecular biology and function of CD4 and CD8. Adv Immunol, 1989. 44: p. 265- 311. 239. Romagnani, S., T-cell subsets (Th1 versus Th2). Ann Allergy Asthma Immunol, 2000. 85(1): p. 9- 18; quiz 18, 21. 240. Seder, R.A. and R. Ahmed, Similarities and differences in CD4+ and CD8+ effector and memory T cell generation. Nat Immunol, 2003. 4(9): p. 835-42. 241. Foy, T.M., et al., Immune regulation by CD40 and its ligand GP39. Annu Rev Immunol, 1996. 14: p. 591-617. 242. Konig, R., L.Y. Huang, and R.N. Germain, MHC class II interaction with CD4 mediated by a region analogous to the MHC class I binding site for CD8. Nature, 1992. 356(6372): p. 796-8. 243. Sprent, J., et al., T-cell proliferation in vivo and the role of cytokines. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2000. 355(1395): p. 317-22. 244. Ferber, I.A., et al., GATA-3 significantly downregulates IFN-gamma production from developing Th1 cells in addition to inducing IL-4 and IL-5 levels. Clin Immunol, 1999. 91(2): p. 134-44. 245. Saraiva, M. and A. O'Garra, The regulation of IL-10 production by immune cells. Nat Rev Immunol, 2010. 10(3): p. 170-81. 246. Diamantstein, T., et al., Studies on interleukin 2 receptor expression and IL-2 production by murine T cell lymphomas. Br J Cancer, 1985. 51(1): p. 23-30. 247. Moon, B.I., T.H. Kim, and J.Y. Seoh, Functional Modulation of Regulatory T Cells by IL-2. PLoS One, 2015. 10(11): p. e0141864. 248. Caplazi, P., et al., Mouse Models of Rheumatoid Arthritis. Vet Pathol, 2015. 52(5): p. 819-26. 249. Xing, J., Y. Wu, and B. Ni, Th9: a new player in asthma pathogenesis? J Asthma, 2011. 48(2): p. 115-25. 250. Zhou, Q., et al., Relationship of circulating chemerin and omentin levels with Th17 and Th9 cell immune responses in patients with asthma. J Asthma, 2017: p. 1-9. 251. Blyth, D.I., et al., Lung inflammation and epithelial changes in a murine model of atopic asthma. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996. 14(5): p. 425-38. 252. Epstein, M.M., Do mouse models of allergic asthma mimic clinical disease? Int Arch Allergy Immunol, 2004. 133(1): p. 84-100. 253. Zuurbier, A.E., et al., Neutrophils enhance eosinophil migration across monolayers of lung epithelial cells. Clin Exp Allergy, 2001. 31(3): p. 444-52. 254. Chen, J., et al., Posttranscriptional gene regulation of IL-17 by the RNA-binding protein HuR is required for initiation of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol, 2013. 191(11): p. 5441-50. 255. Carballo, E., G.S. Gilkeson, and P.J. Blackshear, Bone marrow transplantation reproduces the tristetraprolin-deficiency syndrome in recombination activating gene-2 (-/-) mice. Evidence that monocyte/macrophage progenitors may be responsible for TNFalpha overproduction. J Clin Invest, 1997. 100(5): p. 986-95. 256. Carballo, E., W.S. Lai, and P.J. Blackshear, Evidence that tristetraprolin is a physiological regulator of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor messenger RNA deadenylation and stability. Blood, 2000. 95(6): p. 1891-9. 225 Literaturverzeichnis 257. Khabar, K.S., The AU-rich transcriptome: more than interferons and cytokines, and its role in disease. J Interferon Cytokine Res, 2005. 25(1): p. 1-10. 258. Brooks, S.A. and P.J. Blackshear, Tristetraprolin (TTP): interactions with mRNA and proteins, and current thoughts on mechanisms of action. Biochim Biophys Acta, 2013. 1829(6-7): p. 666- 79. 259. Kafer, R., et al., Inactivation of the KSRP gene modifies collagen antibody induced arthritis. Mol Immunol, 2017. 87: p. 207-216. 260. Sehnert, B., et al., Antileukoproteinase: modulation of neutrophil function and therapeutic effects on anti-type II collagen antibody-induced arthritis. Arthritis Rheum, 2004. 50(7): p. 2347-59. 261. Khachigian, L.M., Collagen antibody-induced arthritis. Nat Protoc, 2006. 1(5): p. 2512-6. 262. Zhao, H., et al., KSRP specifies monocytic and granulocytic differentiation through regulating miR-129 biogenesis and RUNX1 expression. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 1428. 263. Jiang, W., et al., Spleen contributes to restraint stress induced changes in blood leukocytes distribution. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 6501. 264. Bailey, M.T., et al., Repeated social defeat increases the bactericidal activity of splenic macrophages through a Toll-like receptor-dependent pathway. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2007. 293(3): p. R1180-90. 265. Rosenberg, S.A., IL-2: the first effective immunotherapy for human cancer. J Immunol, 2014. 192(12): p. 5451-8. 266. Martin, C.E., et al., Homeostatic proliferation of mature T cells. Methods Mol Biol, 2013. 979: p. 81-106. 267. Cabrera-Perez, J., et al., Impact of sepsis on CD4 T cell immunity. J Leukoc Biol, 2014. 96(5): p. 767-77. 268. Ulivieri, C. and C.T. Baldari, T-cell-based immunotherapy of autoimmune diseases. Expert Rev Vaccines, 2013. 12(3): p. 297-310. 269. Wambre, E., E.A. James, and W.W. Kwok, Characterization of CD4+ T cell subsets in allergy. Curr Opin Immunol, 2012. 24(6): p. 700-6. 270. Benayoun, L., et al., Regulation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma expression in human asthmatic airways: relationship with proliferation, apoptosis, and airway remodeling. Am J Respir Crit Care Med, 2001. 164(8 Pt 1): p. 1487-94. 271. Obata, Y., et al., The epigenetic regulator Uhrf1 facilitates the proliferation and maturation of colonic regulatory T cells. Nat Immunol, 2014. 15(6): p. 571-9. 272. Formigli, L., et al., Aponecrosis: morphological and biochemical exploration of a syncretic process of cell death sharing apoptosis and necrosis. J Cell Physiol, 2000. 182(1): p. 41-9. 273. Wajant, H., K. Pfizenmaier, and P. Scheurich, Tumor necrosis factor signaling. Cell Death Differ, 2003. 10(1): p. 45-65. 274. Dye, J.R., et al., B cell receptor cross-talk: exposure to lipopolysaccharide induces an alternate pathway for B cell receptor-induced ERK phosphorylation and NF-kappa B activation. J Immunol, 2007. 179(1): p. 229-35. 275. Tough, D.F., S. Sun, and J. Sprent, T cell stimulation in vivo by lipopolysaccharide (LPS). J Exp Med, 1997. 185(12): p. 2089-94. 226 Literaturverzeichnis 276. Boucas, J., et al., Label-Free Protein-RNA Interactome Analysis Identifies Khsrp Signaling Downstream of the p38/Mk2 Kinase Complex as a Critical Modulator of Cell Cycle Progression. PLoS One, 2015. 10(5): p. e0125745. 277. Sundaram, G.M., et al., 'See-saw' expression of microRNA-198 and FSTL1 from a single transcript in wound healing. Nature, 2013. 495(7439): p. 103-6. 278. Pruksakorn, D., et al., Overexpression of KH-type splicing regulatory protein regulates proliferation, migration, and implantation ability of osteosarcoma. Int J Oncol, 2016. 49(3): p. 903-12. 279. Malz, M., et al., Overexpression of far upstream element binding proteins: a mechanism regulating proliferation and migration in liver cancer cells. Hepatology, 2009. 50(4): p. 1130-9. 280. Dormoy-Raclet, V., et al., The RNA-binding protein HuR promotes cell migration and cell invasion by stabilizing the beta-actin mRNA in a U-rich-element-dependent manner. Mol Cell Biol, 2007. 27(15): p. 5365-80. 281. Yamazaki, D., S. Kurisu, and T. Takenawa, Regulation of cancer cell motility through actin reorganization. Cancer Sci, 2005. 96(7): p. 379-86. 282. Tadesse, H., et al., KH-type splicing regulatory protein interacts with survival motor neuron protein and is misregulated in spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet, 2008. 17(4): p. 506- 24. 283. Gu, W., et al., A predominantly nuclear protein affecting cytoplasmic localization of beta-actin mRNA in fibroblasts and neurons. J Cell Biol, 2002. 156(1): p. 41-51. 284. Blidberg, K., et al., Increased neutrophil migration in smokers with or without chronic obstructive pulmonary disease. Respirology, 2012. 17(5): p. 854-60. 285. Lyck, R. and G. Enzmann, The physiological roles of ICAM-1 and ICAM-2 in neutrophil migration into tissues. Curr Opin Hematol, 2015. 22(1): p. 53-9. 286. Martin-Granados, C., et al., A key role for PTP1B in dendritic cell maturation, migration, and T cell activation. J Mol Cell Biol, 2015. 7(6): p. 517-28. 287. Greifenberg, V., et al., Myeloid-derived suppressor cell activation by combined LPS and IFN- gamma treatment impairs DC development. Eur J Immunol, 2009. 39(10): p. 2865-76. 288. Nakajima, A. and M. Azuma, [Costimulatory molecules in autoimmunity: role of CD28/CTLA4- CD80/CD86]. Nihon Rinsho, 1997. 55(6): p. 1419-24. 289. Prechtel, A.T., et al., Expression of CD83 is regulated by HuR via a novel cis-active coding region RNA element. J Biol Chem, 2006. 281(16): p. 10912-25. 290. Eberhardt, W., et al., Modulation of mRNA stability as a novel therapeutic approach. Pharmacol Ther, 2007. 114(1): p. 56-73. 291. Hinman, M.N. and H. Lou, Diverse molecular functions of Hu proteins. Cell Mol Life Sci, 2008. 65(20): p. 3168-81. 292. Ogilvie, R.L., et al., Tristetraprolin mediates interferon-gamma mRNA decay. J Biol Chem, 2009. 284(17): p. 11216-23. 293. Savan, R., Post-transcriptional regulation of interferons and their signaling pathways. J Interferon Cytokine Res, 2014. 34(5): p. 318-29. 294. Collart, M.A., et al., Gamma interferon enhances macrophage transcription of the tumor necrosis factor/cachectin, interleukin 1, and urokinase genes, which are controlled by short- lived repressors. J Exp Med, 1986. 164(6): p. 2113-8. 227 Literaturverzeichnis 295. Feuerer, M., et al., Self-limitation of Th1-mediated inflammation by IFN-gamma. J Immunol, 2006. 176(5): p. 2857-63. 296. Rep, M.H., et al., Treatment with depleting CD4 monoclonal antibody results in a preferential loss of circulating naive T cells but does not affect IFN-gamma secreting TH1 cells in humans. J Clin Invest, 1997. 99(9): p. 2225-31. 297. Finnegan, A., et al., IL-4 and IL-12 regulate proteoglycan-induced arthritis through Stat- dependent mechanisms. J Immunol, 2002. 169(6): p. 3345-52. 298. Chu, C.Q., et al., IFNgamma deficient C57BL/6 (H-2b) mice develop collagen induced arthritis with predominant usage of T cell receptor Vbeta6 and Vbeta8 in arthritic joints. Ann Rheum Dis, 2003. 62(10): p. 983-90. 299. Kelchtermans, H., A. Billiau, and P. Matthys, How interferon-gamma keeps autoimmune diseases in check. Trends Immunol, 2008. 29(10): p. 479-86. 300. Lee, J., et al., Interferon gamma suppresses collagen-induced arthritis by regulation of Th17 through the induction of indoleamine-2,3-deoxygenase. PLoS One, 2013. 8(4): p. e60900. 301. Mitamura, M., et al., T cells are involved in the development of arthritis induced by anti-type II collagen antibody. Int Immunopharmacol, 2007. 7(10): p. 1360-8. 302. Ogawa, Y., E.A. Duru, and B.T. Ameredes, Role of IL-10 in the resolution of airway inflammation. Curr Mol Med, 2008. 8(5): p. 437-45. 303. Fiorentino, D.F., M.W. Bond, and T.R. Mosmann, Two types of mouse T helper cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones. J Exp Med, 1989. 170(6): p. 2081-95. 304. Del Prete, G., et al., Human IL-10 is produced by both type 1 helper (Th1) and type 2 helper (Th2) T cell clones and inhibits their antigen-specific proliferation and cytokine production. J Immunol, 1993. 150(2): p. 353-60. 305. de Araujo-Souza, P.S., S.C. Hanschke, and J.P. Viola, Epigenetic control of interferon-gamma expression in CD8 T cells. J Immunol Res, 2015. 2015: p. 849573. 306. Ahmad, S.F., et al., STA-21, a STAT-3 inhibitor, attenuates the development and progression of inflammation in collagen antibody-induced arthritis. Immunobiology, 2017. 222(2): p. 206-217. 307. Roncarolo, M.G., et al., Tr1 cells and the counter-regulation of immunity: natural mechanisms and therapeutic applications. Curr Top Microbiol Immunol, 2014. 380: p. 39-68. 308. Kishore, R., et al., Cutting edge: clustered AU-rich elements are the target of IL-10-mediated mRNA destabilization in mouse macrophages. J Immunol, 1999. 162(5): p. 2457-61. 309. Powell, M.J., et al., Posttranscriptional regulation of IL-10 gene expression through sequences in the 3'-untranslated region. J Immunol, 2000. 165(1): p. 292-6. 310. Tudor, C., et al., The p38 MAPK pathway inhibits tristetraprolin-directed decay of interleukin- 10 and pro-inflammatory mediator mRNAs in murine macrophages. FEBS Lett, 2009. 583(12): p. 1933-8. 311. Sarkar, S., et al., AUF1 isoform-specific regulation of anti-inflammatory IL10 expression in monocytes. J Interferon Cytokine Res, 2008. 28(11): p. 679-91. 312. Krishnamurthy, P., et al., Myocardial knockdown of mRNA-stabilizing protein HuR attenuates post-MI inflammatory response and left ventricular dysfunction in IL-10-null mice. FASEB J, 2010. 24(7): p. 2484-94. 313. Gagliardi, M. and M.R. Matarazzo, RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86. 228 Literaturverzeichnis 314. Malek, T.R., The biology of interleukin-2. Annu Rev Immunol, 2008. 26: p. 453-79. 315. Matsuda, H., et al., Alteration of balance between myeloid dendritic cells and plasmacytoid dendritic cells in peripheral blood of patients with asthma. Am J Respir Crit Care Med, 2002. 166(8): p. 1050-4. 316. Zheng, W. and R.A. Flavell, The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell, 1997. 89(4): p. 587-96. 317. Cohen, J.L. and B.L. Salomon, Therapeutic potential of CD4+ CD25+ regulatory T cells in allogeneic transplantation. Cytotherapy, 2005. 7(2): p. 166-70. 318. Pellerin, L., et al., Regulatory T cells and their roles in immune dysregulation and allergy. Immunol Res, 2014. 58(2-3): p. 358-68. 319. Renauld, J.C., et al., Interleukin-9 and its receptor: involvement in mast cell differentiation and T cell oncogenesis. J Leukoc Biol, 1995. 57(3): p. 353-60. 320. McLane, M.P., et al., Interleukin-9 promotes allergen-induced eosinophilic inflammation and airway hyperresponsiveness in transgenic mice. Am J Respir Cell Mol Biol, 1998. 19(5): p. 713- 20. 321. Dong, Q., et al., IL-9 induces chemokine expression in lung epithelial cells and baseline airway eosinophilia in transgenic mice. Eur J Immunol, 1999. 29(7): p. 2130-9. 322. Vink, A., et al., Interleukin 9-induced in vivo expansion of the B-1 lymphocyte population. J Exp Med, 1999. 189(9): p. 1413-23. 323. Li, H., et al., IL-9 is important for T-cell activation and differentiation in autoimmune inflammation of the central nervous system. Eur J Immunol, 2011. 41(8): p. 2197-206. 324. Ouyang, H., et al., Increased interleukin9 and CD4+IL-9+ T cells in patients with systemic lupus erythematosus. Mol Med Rep, 2013. 7(3): p. 1031-7. 325. Chabaud, M., et al., Human interleukin-17: A T cell-derived proinflammatory cytokine produced by the rheumatoid synovium. Arthritis Rheum, 1999. 42(5): p. 963-70. 326. Lubberts, E., et al., IL-1-independent role of IL-17 in synovial inflammation and joint destruction during collagen-induced arthritis. J Immunol, 2001. 167(2): p. 1004-13. 327. Nakae, S., et al., Suppression of immune induction of collagen-induced arthritis in IL-17- deficient mice. J Immunol, 2003. 171(11): p. 6173-7. 328. Komiyama, Y., et al., IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol, 2006. 177(1): p. 566-73. 329. Irmler, I.M., M. Gajda, and R. Brauer, Exacerbation of antigen-induced arthritis in IFN-gamma- deficient mice as a result of unrestricted IL-17 response. J Immunol, 2007. 179(9): p. 6228-36. 330. Berner, B., et al., Analysis of Th1 and Th2 cytokines expressing CD4+ and CD8+ T cells in rheumatoid arthritis by flow cytometry. J Rheumatol, 2000. 27(5): p. 1128-35. 331. Komai, M., et al., Role of Th2 responses in the development of allergen-induced airway remodelling in a murine model of allergic asthma. Br J Pharmacol, 2003. 138(5): p. 912-20. 332. De Vooght, V., et al., Neutrophil and eosinophil granulocytes as key players in a mouse model of chemical-induced asthma. Toxicol Sci, 2013. 131(2): p. 406-18. 333. Venkayya, R., et al., The Th2 lymphocyte products IL-4 and IL-13 rapidly induce airway hyperresponsiveness through direct effects on resident airway cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 2002. 26(2): p. 202-8. 334. Wynn, T.A., IL-13 effector functions. Annu Rev Immunol, 2003. 21: p. 425-56. 229 Literaturverzeichnis 335. Choy, D.F., et al., TH2 and TH17 inflammatory pathways are reciprocally regulated in asthma. Sci Transl Med, 2015. 7(301): p. 301ra129. 336. Tagaya, E. and J. Tamaoki, Mechanisms of airway remodeling in asthma. Allergol Int, 2007. 56(4): p. 331-40. 337. Laoukili, J., et al., IL-13 alters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. J Clin Invest, 2001. 108(12): p. 1817-24. 338. Shim, J.J., et al., IL-13 induces mucin production by stimulating epidermal growth factor receptors and by activating neutrophils. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2001. 280(1): p. L134-40. 339. Fukushima, A., et al., Mice lacking the IFN-gamma receptor or fyn develop severe experimental autoimmune uveoretinitis characterized by different immune responses. Immunogenetics, 2005. 57(5): p. 337-43. 340. Hohler, T., et al., A genetic basis for IFN-gamma production and T-bet expression in humans. J Immunol, 2005. 175(8): p. 5457-62. 341. Finotto, S., et al., Development of spontaneous airway changes consistent with human asthma in mice lacking T-bet. Science, 2002. 295(5553): p. 336-8. 230 Publikationen 12. Publikationen Teile der vorliegenden Arbeit wurden in Fachzeitschriften oder als Kongressbeiträge publiziert. Publikationen 2018 The RNA binding protein KSRP affects T cell functions Käfer R, Schmidtke L, Schrick K, Montermann E, Bros M, Kleinert H, Pautz A. zur Publikation eingereicht 2018 The KH-type splicing regulatory protein (KSRP) regulates type III interferon ex- pression posttranscriptionally Schmidtke L, Schrick K, Saurin S, Käfer R, Gather F, Weinmann-Menke J, Kleinert H, Pautz A. Biochem J. 2018 Dec 21 2017 Inactivation of the KSRP gene modifies collagen antibody induced arthritis Käfer R, Schrick K, Schmidtke L, Montermann E, Hobernik D, Bros M, Chen CY, Kleinert H, Andrea P. Mol Immunol. 2017 Jul; 87:207-216. Epub 2017 May 13. Abstract / Poster 2016 The role of the RNA binding protein KH-type splicing regulatory protein (KSRP) in pro-inflammatory gene expression Käfer R, Schrick K, Schmidtke L, Montermann E, Mitschke S, Bros, Kleinert H, Pautz A. 46th Annual Meeting German Society for Immunology (DGfI), 27-30.11.2016 in Hamburg 231 Lebenslauf 13. Lebenslauf PERSÖNLICHE DATEN SCHULISCHE UND AKADEMISCHE AUSBILDUNG 232