Die Evolution der Hämocyaningene in Apogastropoda Einflussfaktor oder Bedingung für die enorme Diversität der Heterobranchia und Caenogastropoda? Dissertation zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften Am Fachbereich Biologie der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Gabriela Giannina Schäfer geb. am 27.01.1992 in Wiesbaden Mainz, April 2021 Dekan: XXXXXXXXXXXXXXXX 1.Berichterstatter: XXXXXXXXXXXXXXXX 2.Berichterstatter: XXXXXXXXXXXXXXXX Tag der mündlichen Prüfung: 08.07.2021 für meine Mutter „Im Licht der Evolution betrachtet ist die Biologie vielleicht die intellektuell befriedigendste und inspirierendste Wissenschaft.“ Theodosius Dobzhansky, 1973 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1 Abstract 2 1 Einleitung 3 1.1 Apogastropoda 4 1.1.1 Heterobranchia 5 1.1.2 Caenogastropoda 7 1.1.3 Aufklärung der Phylogenie 9 1.2 Mollusken-Hämocyanin 10 1.2.1 Grundaufbau der Mollusken-Hämocyanine 10 1.2.2 Die Gene der Mollusken-Hämocyanine 12 1.2.3 Die Evolution der Mollusken-Hämocyaningene 14 1.3 Zielsetzung der Arbeit 17 2 Publikationen 21 2.1 Hemocyanin genes as indicators of habitat shifts in Panpulmonata 25 2.2 Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule 33 2.3 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods 47 2.4 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Gene duplications and intron accumulation in highly diverse gastropods 67 2.5 Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum 87 3 Fazit & Ausblick 101 4 Literaturverzeichnis 103 5 Quellenverzeichnis 109 6 Danksagung 111 7 Lebenslauf 113 8 Erklärung 115 Zusammenfassung Mollusken bilden nach den Arthropoden den zweitgrößten Tierstamm und sind weltweit in nahezu allen Lebensräumen verbreitet. Sie umfassen acht Klassen, von denen die Gastropoda (Schnecken) die mit Abstand größte darstellt. Gastropoden sind sowohl in Salz- und Süßwasser als auch an Land und in diversen Übergangshabitaten zu finden und kommen sogar in extremen Lebensräumen wie der Tiefsee, heißen Quellen, Wüsten und der Arktis und Antarktis vor. Die enorme Diversität dieser Klasse lässt sich insbesondere auf viele Habitatswechsel und damit einhergehende, immens vielfältige Anpassungen der Heterobranchia und Caenogastropoda zurückführen. Diese bilden gemeinsam die Apogastropoda und umfassen über 60.000 der insgesamt etwa 68.000 bisher beschriebenen Gastropoda-Arten. In diesem Zusammenhang habe ich in meiner Doktorarbeit die Evolution der Mollusken- Hämocyaningene innerhalb der Apogastropoda untersucht. Hämocyanine sind die Sauerstofftrans- portproteine der meisten Vertreter dieses Tierstamms und bestehen charakteristischer Weise aus ca. 400 kDa großen Untereinheiten, die sich zu Dekameren oder Di- und Multidekameren zusammenlagern. Als Sauerstofftransporter stellen diese enorm großen Proteine eine wichtige Verbindung zwischen der Umwelt der Tiere und ihrem Metabolismus dar und müssen wegen der Abhängigkeit ihrer Sauerstoffaffinität von der Temperatur und dem Sauerstoffpartialdruck an die Lebensbedingungen der Tiere angepasst sein. Aus diesem Grund war es das Ziel meiner Arbeit, die Hämocyaningene der Apogastropoda genauer zu analysieren und auf mögliche Adaptationen, die während der Evolution dieser Schnecken-Gruppe aufgetreten sind, zu untersuchen. Meine Untersuchungen ergaben, dass sowohl innerhalb der Heterobranchia als auch innerhalb der Caenogastropoda mehrfach unabhängig voneinander Duplikationen der Hämocyaningene aufgetreten sind und zu verschiedenen paralogen Hämocyaningenen geführt haben. Weiterhin zeigen meine Ergebnisse eine strukturelle Besonderheit eines Hämocyanins der Muricidae (Caeno- gastropoda), die eine Abweichung von allen bisher beschriebenen Mollusken-Hämocyaninen darstellt und einen Einblick in die Evolution spezieller Hämocyanin-Strukturen bieten kann. Meine Analysen der Exon-Intron-Strukturen verschiedener Hämocyaningene der Tectipleura (Hetero- branchia) und Caenogastropoda ergaben, dass sich während der Evolution der einzelnen Apogastropoda-Gruppen viele Introns innerhalb der Hämocyaningene gebildet haben und diese sich hierin stark von den Genarchitekturen anderer bisher analysierter Mollusken-Hämocyaningene (10 – 15 Introns) unterscheiden. Während die Hämocyanin-Genstrukturen der Caenogastropoda zwischen verschiedenen Gruppen, sowie zwischen paralogen Genen innerhalb derselben Art stark variieren (28 – 61 Introns), sind die der Tectipleura hoch konserviert (52/53 Introns). Meine Arbeit zeigt somit viele evolutive Erneuerungen der Hämocyaningene innerhalb der Apogastropoda, die mehrfach unabhängig voneinander aufgetreten sind und demnach mögliche Anpassungen an neue Lebensräume darstellen. Seite | 1 Abstract Molluscs form the second largest animal phylum after the arthropods and are distributed in almost all habitats worldwide. They comprise eight classes, of which the Gastropoda (including snails and slugs) is by far the largest. Gastropods inhabit marine, limnic and terrestrial biotopes as well as various transitional habitats and even occur in extreme habitats such as the deep sea, hot springs, deserts and the Arctic and Antarctic. The enormous diversity of this class can be attributed in particular to many habitat shifts and the diverse adaptations of Heterobranchia and Caenogastropoda. Together, these two groups of gastropods form the Apogastropoda and comprise over 60,000 of the approximately 68,000 gastropod species described so far. In this context, I investigated the evolution of the molluscan hemocyanin genes within the Apogastropoda during my doctoral thesis. Hemocyanins are the oxygen transport proteins of most molluscs and characteristically consist of 400 kDa subunits which form decamers or di- and multi- decamers. As oxygen transporters, these extremely large proteins represent an important link between the animals' environment and their metabolism. Due to the dependence of their oxygen affinity on temperature and oxygen partial pressure, they must be well adapted to the living conditions of the animals. For this reason, the aim of my work was to analyze hemocyanin genes of Apogastropoda in more detail and to examine possible adaptations that occurred during the evolution of this group of gastropods. My investigations showed that within Heterobranchia as well as within Caenogastropoda duplications of hemocyanin genes occurred several times independently and led to different paralogous hemocyanin genes. Furthermore, my results show a structural peculiarity of a hemocyanin of Muricidae (Caenogastropoda) which represents a deviation from all previously described molluscan hemocyanins and can offer an insight into the evolution of special hemocyanin structures. My analyses of the exon-intron structures of various hemocyanin genes of Tectipleura (Heterobranchia) and Caenogastropoda showed that during the evolution of the individual Apogastropoda groups many introns were gained within these genes. Thus, hemocyanin gene architectures of Apogastropoda differ remarkably from those of other molluscan hemocyanin genes analyzed so far (10 – 15 introns). While the hemocyanin gene structures of Caenogastropoda vary widely between different groups as well as between paralogous genes within the same species (28- 61 introns), those of Tectipleura are highly conserved (52/53 introns). Thus, my thesis shows many evolutionary renewals of the hemocyanin genes within the Apogastropoda which occurred several times independently and therefore represent possible adaptations to new habitats. Seite | 2 1 Einleitung Weichtiere oder Mollusca (lateinisch molluscus „weich“) sind eine äußerst artenvielfältige, formenreiche und in nahezu allen Lebensräumen vorkommende Tiergruppe. Sie bilden nach den Gliederfüßern (Arthropoda) den zweitgrößten Stamm im Tierreich und umfassen insgesamt acht Klassen (Abb. 1A; Kocot et al., 2011; Smith et al., 2011) – darunter Kopffüßer (Cephalopoda), Muscheln (Bivalvia) und Käferschnecken (Polyplacophora). Die bei weitem größte Klasse der Mollusken stellen die Schnecken (Gastropoda) dar (Abb. 1A). Ihre enorme Artenvielfalt lässt sich unter anderem damit erklären, dass sie als einzige Klasse innerhalb der Weichtiere – zusätzlich zu Salz- und Süßwasser – das Land als Lebensraum erobert haben (Abb. 1B; vgl. Ponder et al., 2019). Das Vorkommen in so vielen verschiedenen Habitaten, die sich in ihren Extremen von der Tiefsee über Wüsten bis in die Polarmeere erstrecken, lässt erkennen, dass während der Evolution der verschiedenen Gastropoda-Gruppen vielfache physiologische Veränderungen sowie Verhaltens- anpassungen aufgetreten sein müssen (Mordan und Wade, 2008). Je nach Lebensraum unterscheiden sich beispielsweise die Anforderungen an Osmoregulation und Temperaturanpassung der Tiere ganz erheblich (vgl. Vermeij und Dudley, 2000; Symanowski und Hildebrandt, 2010; Chao et al., 2020). Gleichzeitig erfordern die verschiedenen Habitate unterschiedliche Formen der Bewegung und der Atmung (Vermeij und Wesselingh F. P., 2002). Hierbei sind neben strukturellen Veränderungen der Organe (z.B. Evolution einer Lunge) auch molekularphysiologische Aspekte wichtig, wie die Adaptation einzelner Proteine an veränderte Anforderungen (Hsia et al., 2013). Ziel meiner Doktorarbeit war deshalb die Untersuchung eines für die Atmung enorm wichtigen Proteins – dem Sauerstofftransporter Hämocyanin – welches ich im Hinblick auf seine Evolution in der besonders diversen Schneckengruppe der Apogastropoda genauer analysieren wollte. Die Hintergründe hierzu werde ich im Folgenden eingehender erläutern und präzisieren. Seite | 3 1 | Einleitung Abb. 1: Systematik der Weichtiere (Mollusca). Neben den phylogenetischen Zusammenhängen zeigen die Stammbäume die ungefähre Anzahl der beschriebenen rezenten Arten sowie die von der Gruppe besiedelten Lebensräume unterteilt in marin (dunkelblau), intertidal (hellblau), limnisch (grün) und terrestrisch (braun). Die Anzahl der Arten sind in Klammern hinter dem jeweiligen Taxon angegeben und basieren auf den Angaben der online Datenbank WoRMS – World Register of Marine Species (2020). (A) Der Stamm der Mollusken umfasst insgesamt acht Klassen (Kocot et al., 2011; Smith et al., 2011) und knapp 81.000 rezente Arten. Die mit Abstand größte Molluskengruppe stellen die Gastropoda dar (B), die wiederum fünf Großgruppen umfasst (Zapata et al., 2014). In dieser Arbeit habe ich Hämocyanine der Heterobranchia und Caenogastropoda untersucht. Diese bilden gemeinsam die Gruppe der Apogastropoda. Die aktuell anerkannte Systematik beider Gruppen sind in Abb. 3 angegeben. 1.1 Apogastropoda Phylogenetische Analysen innerhalb der Gastropoda werden durch deren rasante Radiation, die zu der enormen Diversität dieser Gruppe geführt hat, und das Aussterben diverser Schneckenlinien erschwert, weshalb die Systematik innerhalb dieser Klasse der Mollusken bis heute kontrovers diskutiert wird (Colgan et al., 2007; Ponder et al., 2008; 2019). Unstrittig ist jedoch, dass ihre traditionelle Einteilung in die drei Gruppen Prosobranchia (Vorderkiemer), Opisthobranchia (Hinterkiemer) und Pulmonata (Lungenschnecken) phylogenetisch nicht korrekt ist, da diese zwar Organisationsebenen angeben, jedoch keine Monophyla darstellen (Haszprunar, 1988; Ponder und Lindberg, 1997). Die Gruppe der Apogastropoda wurde in der 1997 von Ponder und Lindberg veröffentlichten und auf morphologischen Merkmalen basierenden Systematik als ein monophyletisches Taxon eingeführt, das die zwei Monophyla Caenogastropoda und Heterobranchia umfasst. Molekular-phylogenetische Analysen bestätigen diese systematischen Zusammenhänge (Aktipis et al., 2008; Zapata et al., 2014; Cunha und Giribet, 2019). Heterobranchia und Caenogastropoda stellen die zwei größten der insgesamt fünf Schneckengruppen dar (siehe Artenanzahl in Abb. 1B), sodass über 60.000 der insgesamt über 68.000 beschriebenen rezenten Schneckenarten den Apogastropoda angehören (WoRMS Editorial Board, 2020). Während die drei anderen Schneckengruppen Patellogastropoda, Vetigastropoda und Neritimorpha eine geringere Artenanzahl sowie eine kleinere Formen- und Habitatvielfalt aufweisen (mit Ausnahmen einiger terrestrischer Neritimorpha ausschließlich marin Seite | 4 Einleitung | 1 oder intertidal lebend), sind Heterobranchia und Caenogastropoda sehr divers und haben fast jeden Lebensraum von der Tiefsee bis in hohe Gebirgslagen besiedelt (Überblick in Ponder et al. 2019). 1.1.1 Heterobranchia Der Name Heterobranchia setzt sich aus dem altgriechischen ἕτερος (hetero) = verschieden und dem griechischen βράγχια (bránchia) = Kieme zusammen und kann deshalb mit Verschiedenkiemer übersetzt werden (Gosselck et al., 2009). Bereits 1840 von Gray erwähnt, erhielt dieser Begriff Mitte der 1980er Jahre Einzug in die moderne Systematik der Gastropoda. Haszprunar (1985, 1988) wählte ihn dabei zur Beschreibung seines neuen phylogenetischen Konzepts, welches viele der traditionell als Opisthobranchia und Pulmonata bezeichneten Schnecken sowie einige Familien der Prosobranchia gemeinsam als eine monophyletische Gruppe beschreibt1. Diese Bezeichnung spiegelt die vielfältigen Anpassungen an unterschiedliche Habitate wider, die diese Gruppe zu der wohl vielfältigsten Gruppe der Schnecken machen. Die Heterobranchia umfassen zwar eine geringere Artenzahl als die Caenogastropoda (Abb. 1B), sind morphologisch allerdings noch diverser und weisen eine enorme Vielfalt unterschiedlichster Farben, Formen und besonderer Merkmale auf (Beispiele in Abb. 2). Ihre Gehäuse beispielsweise variieren nicht nur in Größe, Form und Farbe, sondern sind auf vielfältige Weise in unterschiedlichen Gruppen der Heterobranchia unabhängig voneinander verloren gegangen, stark zurückgebildet oder durch Überwachsung des Mantels nach innen verlagert worden. Während ihrer Evolution haben Heterobranchia vielfach unabhängig voneinander die verschiedensten Lebensräume erobert und umfassen mit Abstand die meisten landlebenden Gastropoda. Obwohl viele phylogenetische Zusammenhänge innerhalb dieser sehr diversen Schneckengruppe noch ungeklärt sind, werden die einzelnen Ordnungen der Heterobranchia mittlerweile in durch mehrere Analysen gut unterstützte Großgruppen eingeteilt (Jörger et al., 2010; Kano et al., 2016). Danach gliedern sie sich in sehr basale („lower“) Heterobranchia und die Euthyneura, die wiederum in Acteonacea, Ringipleura und Tectipleura unterteilt werden (siehe Abb. 3A). Die enorme Arten- und Lebensraumvielfalt geht dabei insbesondere auf die Gruppe der Tectipleura (über 26.000 Arten nach den Angaben der online Datenbank WoRMS – World Register of Marine Species (2020); Abb. 3A) zurück, die sich in Euopisthobranchia und Panpulmonata gliedern (Jörger et al., 2010; Kocot et al., 2013; Wägele et al., 2014; Kano et al., 2016). Die von mir durchgeführten Untersuchungen von Heterobranchia Hämocyaninen beschränken sich deshalb auf diese äußerst vielfältige Schneckengruppe. 1 Zuvor wurden bereits mehrfach große Ähnlichkeiten zwischen Opisthobranchia und Pulmonata beschrieben und einige Linien bereits unter dem Namen „Euthyneura“ zusammengefasst (z.B. in Boettger (1954) und Hyman L. H. (1967)) Seite | 5 1 | Einleitung Abb. 2: Beispiele einiger Heterobranchia. Die abgebildeten Schnecken stellen eine kleine Auswahl unterschiedlicher Heterobranchia-Arten dar, die die Vielfältigkeit dieser Gruppe verdeutlichen soll, jedoch keinerlei Vollständigkeit beansprucht. Die abgebildeten Schnecken stammen aus verschiedenen Gruppen der Heterobranchia und sind unabhängig von phylogenetischen Zusammenhängen nach ihren Habitaten angeordnet und farblich eingerahmt: Meer (dunkelblau), Gezeitenzone (hellblau), Süßwasser (grün), Land (braun). Für diese Lebensräume sind folgende Schnecken exemplarisch abgebildet: marine Schnecken: Aplysia californica (A1), Clione limacina (A2), Tylodina perversa (A3), Placida cremoniana (A4), Oxynoe viridis (A5), Rissoella opalina (A6), Architectonica perspectiva (A7), Melibe leonina (A8), Aplysiopsis elegans (A9); intertidal lebende Schnecken: Siphonaria spec. (B1), Onchidella celtica (B2), Trimusculus mauritianus (B3), Otina ovata (B4); limnische Schnecken: Acochlidium fijiiensis (C1), Stagnicola palustris (C2), Ancylus fluviatilis (C3), Lymnaea stagnalis (C4); terrestrische Schnecken: Isognomostoma isognomostomos (D1), Edentulina spec. (D2), Limax cinereoniger (D3), Cepaea nemoralis (D4), Euhadra peliomphala (D5), Helix pomatia (D6), Liguus virigineus (D7), Achatina fulica (D8), Limax maximus (D9) (alle Bildnachweise im Quellenverzeichnis). Seite | 6 Einleitung | 1 Abb. 3: Systematik der Apogastropoda-Gruppen Heterobranchia und Caenogastropoda. Neben den phylogenetischen Zusammenhängen zeigen die Stammbäume die ungefähre Anzahl rezenter Arten sowie die von der jeweiligen Gruppe besiedelten Lebensräume unterteilt in marin (dunkelblau), intertidal (hellblau), limnisch (grün) und terrestrisch (braun). Die Artenanzahl ist in Klammern hinter dem jeweiligen Taxon angegeben und basiert auf den Angaben der online Datenbank WoRMS (2020). (A) Die Gruppe der Heterobranchia umfasst ca. 29.700 beschriebene rezente Arten, die sich neben den „lower Heterobranchia“ in Acteonacea, Ringipleura und Tectipleura gliedern lassen (Jörger et al., 2010; Kocot et al., 2013; Kano et al., 2016). In meiner Arbeit habe ich einige Hämocyanine aus der Gruppe der Tectipleura untersucht. Diese umfasst die beiden Monophyla Panpulmonata und Euopisthobranchia. (B) Die Gruppe der Caenogastropoda ist mit ca. 32.800 rezenten beschriebenen Arten die größte der fünf Großgruppen der Schnecken. Sie lässt sich in die monophyletische Gruppe der Sorbeoconcha und die paraphyletischen „Architaenioglossa“ unterteilen (vgl. Ponder und Lindberg, 1997, Colgan et al. , 2007, Bouchet et al. 2017 und Ponder et al. 2019). Die exakten phylogenetischen Zusammenhänge der einzelnen Großgruppen zueinander konnten trotz vielfacher Analysen bis heute nicht eindeutig aufgelöst werden. Die hier abgebildete Phylogenie basiert auf dem Stammbaum nach Ponder et al. (2019), der aus den Ergebnissen aktueller morphologischer und molekularer Analysen abgeleitet wurde. Untersucht wurden Hämocyanine aus den fett gedruckten Heterobranchia- und Caenogastropoda- Gruppen. 1.1.2 Caenogastropoda Die Bezeichnung Caenogastropoda wurde bereits 1960 von Cox zur Beschreibung der Systematik der Gastropoda verwendet. Allerdings fasste er darunter einige zueinander paraphyletische Prosobanchia-Gruppen zusammen. In seiner heutigen Bedeutung als eine der fünf großen monophyletischen Schneckengruppen (Zapata et al., 2014) wurde der Begriff 1988 von Haszprunar und 1997 von Ponder und Lindberg eingeführt. Caenogastropoda stellen die artenvielfältigste Gruppe der Gastropoda dar (~ 32.800 beschriebene rezente Arten nach WoRMS Editorial Board, 2020; Abb. 1B). Ihre Vertreter haben zumeist gut erkennbare Schneckenhäuser unterschiedlichster Formen und Farben, die in Größen zwischen 1 und 900 mm vorkommen (Abb. 4). Während ein Großteil der Caenogastropoda marin lebt, gibt es einige Gruppen, die unabhängig voneinander Süßwasser und/oder Land besiedelt und sich dort verbreitet haben (Abb. 3B; vgl. Übersicht in Ponder et al., 2019). Seite | 7 1 | Einleitung Abb. 4: Beispiele einiger Caenogastropoda. Die abgebildeten Schnecken stellen eine kleine Auswahl unterschiedlicher Caenogastropoda-Arten dar, die die Vielfältigkeit dieser Gruppe verdeutlichen soll, jedoch keinerlei Vollständigkeit beansprucht. Die abgebildeten Schnecken stammen aus verschiedenen Gruppen der Caenogastropoda und sind unabhängig von phylogenetischen Zusammenhängen nach ihren Habitaten angeordnet und farblich eingerahmt: Meer (dunkelblau), Gezeitenzone (hellblau), Süßwasser (grün), Land (braun). Für diese Lebensräume sind folgende Schnecken exemplarisch abgebildet: marine Schnecken: Lentigo lentiginosus (A1), Cyphoma gibbosum (A2), Phenacovolva rosea (A3), Chicoreus palmarosae (A4), Lambis scorpius (A5), Dentiovula dorsuosa (A6), Arestorides argus (A7), Rapana venosa (A8); intertidal lebende Schnecken: Telescopium telescopium (B1), Batillaria estuarina (B2), Nodilittorina pyramidalis (B3), Crepidula fornicata (B4), Nucella lapillus (B5); limnische Schnecken: Pomacea bridgesii (C1), Sadleriana fluminensis (C2), Oncomelania hupensis (C3), Melanoides tuberculata (C4), Anentome helena (C5), Melanopsis praemorsa (C6), Emmericia patula (C7), Elimia clara (C8); terrestrische Schnecken: Pupinella rufa (D1), Rhiostoma huberi (D2), Cochlostoma auritum (D3), Terebralia palustris (D4), Pomatias elegans (D5), Cochlostoma septemspirale (D6), Cyclophorus perdix (D7) (alle Bildnachweise im Quellenverzeichnis). Seite | 8 Einleitung | 1 Die Unterteilung der Caenogastropoda in einige Großgruppen wie z.B. Ampullariida und Neogastropoda ist aufgrund morphologischer (Strong, 2003; Simone, 2011) und molekularer (Harasewych et al., 1998; Colgan et al., 2007) Stammbäume mehrfach bestätigt. Die Phylogenie der einzelnen Gruppen untereinander ist hingegen oftmals nicht eindeutig aufgelöst. Insbesondere innerhalb der Großgruppe der Hypsogastropoda, die beispielsweise die Ordnungen Neogastropoda und Littorinida einschließt, ist außer der Unterteilung in zwei Monophyla (solche mit und solche ohne Siphon, siehe Abb. 3B) bis heute keine genaue Auflösung der Systematik möglich (Colgan et al., 2007; Ponder et al., 2008; 2019). Der in Abb. 3B dargestellte Stammbaum entspricht der Phylogenie nach Ponder et al. (2019), die auf der gemeinsamen Betrachtung verschiedener Ergebnisse aktueller morphologischer und molekularen Analysen basiert. 1.1.3 Aufklärung der Phylogenie Die rasante Radiation der Heterobranchia und Caenogastropoda und die vielfach unabhängig voneinander aufgetretenen evolutiven Veränderungen, die zu der enormen Diversität der Apogastropoda geführt haben, erschweren die Rekonstruktion der phylogenetischen Zusammenhänge (Wägele et al., 2008; Ponder et al., 2008; Mordan und Wade, 2008; Zapata et al., 2014; Frýda, 2021). Zur Erforschung der äußerst komplexen Systematik und der weiteren Aufklärung der Evolution dieser vielfältigen Schneckengruppe wurden bereits vielfach phylogenetische Analysen mit sowohl morphologischen als auch molekularen Markern durchgeführt. Diese haben bisher jedoch zu keinen einheitlichen Ergebnissen bezüglich der genauen systematischen Beziehungen innerhalb der jeweiligen Gruppen geführt (vgl. Haszprunar, 1988; Bang et al., 2000; Simone, 2001; Strong, 2003; Collin, 2005; Colgan et al., 2007; Wägele et al., 2008; Jörger et al., 2010; Dinapoli und Klussmann-Kolb, 2010; Zapata et al., 2014; Wägele et al., 2014; Kano et al., 2016; Romero et al., 2016; Bouchet et al., 2017; Cunha und Giribet, 2019). Um Unstimmigkeiten zwischen den einzelnen Ergebnissen unterschiedlicher Analysen aufklären zu können, müssen nach Medina und Collins (2003), Wägele et al. (2008) und Sigwart und Lindberg (2015) immer mehr solcher unterschiedlicher Methoden kombiniert sowie verschiedene Erkenntnisse sukzessive zusammengetragen und miteinander ausgewertet werden. Neben ribosomalen und mitochondrialen Markern müssen hierbei auch nukleäre Gene phylogenetisch untersucht werden, um die Informationsdichte bezüglich evolutiver Veränderungen der Mollusken zu erhöhen (Kocot et al., 2013). In meiner Arbeit habe ich deshalb die Analysen der Mollusken-Hämocyanine, die als molekulare Marker genutzt werden können (Streit et al., 2006; Lieb und Todt, 2008; Wägele et al., 2008; Warnke et al., 2011; Kocot et al., 2011), auf Apogastropoda ausgeweitet, um sie auf mögliche neue Informationen zur Evolution dieser Schneckengruppe zu untersuchen. Seite | 9 1 | Einleitung 1.2 Mollusken-Hämocyanin Hämocyanin ist das Sauerstofftransport-Protein der meisten Mollusken und Arthropoden. In beiden Tierstämmen liegt es extrazellulär in der Hämolymphe vor und färbt diese blau (van Holde und Miller, 1995). Grund für diese Blaufärbung ist die Ausbildung von Histidin-Kupfer(II)-Komplexen in oxygenierten Hämocyanin-Molekülen, deren Grundstruktur bei den Hämocyaninen der beiden Tierstämme gleich ist. Dabei liegen jeweils zwei Kupfer-Ionen vor, die über sechs Histidin-Reste komplexiert sind und je ein Sauerstoff-Molekül reversibel binden können (van Holde und Miller, 1995). Abgesehen von diesen Kupferzentren unterscheiden sich die Hämocyanine der Mollusken und der Arthropoden strukturell sehr stark (sowohl in der Primär-, als auch der Tertiär- und Quartärstruktur) und werden als zwei getrennte Proteinfamilien angesehen (Burmester, 2001). In meiner Arbeit habe ich ausschließlich Mollusken-Hämocyanine untersucht. 1.2.1 Grundaufbau der Mollusken-Hämocyanine Neben einigen zum Teil gruppenspezifischen Unterschieden der Mollusken-Hämocyanine ist der im Folgenden beschriebene prinzipielle Aufbau dieses Sauerstofftransporters hoch konserviert (vgl. Übersichtsartikel zur Struktur der Mollusken-Hämocyanine: van Holde und Miller, 1995; Markl, 2013; Kato et al., 2018). Die Grundstruktur bildet dabei ein partiell gefüllter Hohlzylinder, der aus zehn gleichen Untereinheiten besteht (Abb. 5A). Mit einer Höhe von ca. 18 nm und einem Durchmesser von etwa 35 nm weisen diese 4 MDa Hämocyanin-Dekamere Dimensionen eines mittelgroßen Viruspartikels auf und können mittels Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden. Die elektronenmikroskopische Aufnahme in Abbildung 5B zeigt, dass Hämocyanine in der Hämolymphe von Mollusken sowohl als einzelne Dekamere als auch als Di-, Tri- oder Multidekamere vorliegen. Hämocyanin-Dekamere weisen dabei immer eine fünffache Symmetrie auf, die darauf zurückzuführen ist, dass Hämocyanin-Untereinheiten zunächst zu Dimeren aggregieren, die die eigentliche repetitive Einheit der Dekamere darstellen (siehe gelb/goldene Hervorhebung in Abb. 5A, Siezen und van Bruggen, 1974; Markl, 2013; Gai et al., 2015). Seite | 10 Einleitung | 1 Abb. 5: Grundaufbau der Gastropoda-Hämocyanine. Die Grundstruktur der Mollusken-Hämocyanine stellen Dekamere dar, die partiell gefüllte Hohlzylinder ausbilden und sich häufig zu Didekameren, aber auch zu Tri- oder Multidekameren zusammenlagern. (A) zeigt den Aufbau eines Didekamers. Dieser besteht aus einer äußeren Wand (dunkelblau) und einem in die Mitte des Hohlzylinders ragenden Kragen (hellblau und cyanfarben). Die repetitive Grundeinheit stellen hierbei Dimere dar, die zuerst aggregieren, bevor sich fünf von ihnen zu Dekameren zusammenlagern. Ein solches Dimer ist in der Seitenansicht und der Draufsicht jeweils golden (Wand) und gelb (Kragen) hervorgehoben. Die Abbildung des Didekamers basiert auf der Elektronendichtekarte (9 Å) des Hämocyanins KLH1 der großen Kalifornischen Schlüssellochschnecke Megathura crenulata und ist verändert nach Schäfer et al. (2021). Die transmissionselektronen- mikroskopischen Aufnahmen in (B) zeigen verschiedene Hämocyanin-Moleküle der Schneckenart Nucella lapillus, die für Gastropoden-Hämocyanine charakteristisch sind. Die Anzahl der nebenstehenden Pfeile beschreibt die Art der Moleküle: Einzelpfeil = Dekamer; Doppelpfeil = Didekamer; Trippelpfeil = Tridekamer; Trippelpfeil mit Sternchen = Multidekamer; Pfeil mit „D“ = Draufsicht. In (C) ist der charakteristische Aufbau einer Hämocyanin-Untereinheit (engl. subunit) mit acht funktionellen Einheiten (FU-a bis FU-h; FU aus dem Englischen functional unit) dargestellt. Diese einzelnen Proteindomänen bilden globuläre Substrukturen, die über kurze Linkerpeptide (grau dargestellt) miteinander verbunden sind. Die Farbgebung entspricht der in (A), da FU-a bis FU-f der zehn Untereinheiten eines Dekamers die Wand des Hohlzylinders formen und FU-g und FU-h den Kragen ausbilden. Die einzelnen 400 kDa Untereinheiten der Mollusken-Hämocyanine umfassen im Grundaufbau acht paraloge Domänen, die als funktionelle Einheiten FU-a bis FU-h (FU aus dem Englischen functional unit) bezeichnet werden. Sie bilden jeweils eine globuläre Substruktur der Polypeptidkette und sind durch kurze sogenannte Linkerpeptide miteinander verbunden (Abb. 5C; Lang, 1988; van Holde und Miller, 1995). Jede dieser FUs beinhaltet dabei eine wie oben beschriebene zwei Kupfer-Ionen umfassende Sauerstoff-Bindungsstelle (van Holde und Miller, 1995). Die Anzahl der funktionellen Einheiten weicht aufgrund von Verlusten und/oder Duplikationen einiger dieser FUs bei Seite | 11 1 | Einleitung verschiedenen Mollusken-Hämocyaninen vom Grundaufbau ab (Übersicht in Markl, 2013). Cephalopoda-Hämocyanine enthalten beispielsweise keine FU-h (Lang, 1988; van Holde und Miller, 1995; Miller et al., 1998; Bergmann et al., 2006; Thonig et al., 2014). Der Grundaufbau der Gastropoda-Hämocyanine, auf die in meiner Arbeit der Fokus gerichtet ist, umfasst die oben beschrieben regulären acht FUs (van Holde und Miller, 1995). Die einzelnen funktionellen Einheiten bestehen aus etwa 420 Aminosäuren, die zu einer molekularen Masse von ca. 45 bis 50 kDa pro FU führen. Eine Ausnahme stellt dabei die ca. 60 kDa schwere FU-h dar, die C-terminal etwa 100 zusätzliche Aminosäuren umfasst (Markl, 2013). Der Aufbau verschiedener funktioneller Einheiten ist sehr ähnlich, da viele Bereiche der Primärstruktur, insbesondere solche, die am Aufbau der Kupferbindungsstellen beteiligt sind, hoch konserviert sind. Mittels multipler Sequenzvergleiche (Sequenzalignments) zeigten Miller et al. (1998), dass diese stark konservierten Sequenzmotive in allen paralogen FUs eines Hämocyanins von Enteroctopus dofleini vorhanden sind. Dies unterstützt die bereits 1995 von van Holde und Miller aufgestellte Hypothese, dass die acht Domänen umfassende Hämocyanin-Untereinheit durch Genduplikationen eines monomeren Sauerstofftransport-Proteins, welches einer funktionellen Einheit entspricht, entstanden ist. Drei aufeinanderfolgende Genduplikationen mit anschließenden Genfusionen können dabei zu der Mollusken-Hämocyanin-Untereinheit mit insgesamt acht FUs geführt haben (van Holde und Miller, 1995). Weitere Analysen ergaben, dass die konservierten Sequenzbereiche auch in Hämocyaninen weiterer Cephalopoda-Arten und Vertretern anderer Molluskenklassen wie z.B. den Gastropoda, Bivalvia und Caudofoveata, enthalten sind (Lieb et al., 1999; 2000; 2004; Altenhein et al., 2002; Bergmann et al., 2006; 2007; Lieb und Todt, 2008). Darüber hinaus zeigten multiple Sequenzalignments, dass die einzelnen funktionellen Einheiten, die sich bezüglich ihrer Position in den verschiedener Mollusken-Hämocyanine entsprechen (z.B. FU-c der Hämocyanine HtH und OdH), höhere Sequenzidentitäten aufzeigen, als paraloge FUs des gleichen Hämocyanins (z.B. FU-a, FU-b, … FU-h von HtH). Sie sind daher als ortholog zueinander anzusehen (Lieb et al., 1999; 2000; Lieb und Markl, 2004). Demnach wird angenommen, dass ein Hämocyanin mit acht funktionellen Einheiten bereits vor der Aufspaltung der Mollusken in unterschiedliche Klassen in einem gemeinsamen Vorfahren entstanden ist (Lieb et al., 1999; 2000). 1.2.2 Die Gene der Mollusken-Hämocyanine Die Untergliederung der Polypeptidkette in globuläre funktionelle Einheiten spiegelt sich bereits in der Struktur der Gene wider. Der Grundaufbau eines für ein 400 kDa Hämocyanin kodierenden Gens besteht dabei aus acht Exons, die jeweils für eine funktionelle Einheit kodieren und durch sogenannte Linker-Introns voneinander getrennt sind (Lieb et al., 2001). Die Position dieser stets in Phase 1 vorliegenden Linker-Introns ist über alle bisher untersuchten Mollusken-Hämocyanine hinweg konserviert und liegt innerhalb der für die Linkerpeptide kodierenden Genabschnitte Seite | 12 Einleitung | 1 (Abb. 5C; Lieb et al., 2001). Innerhalb der für die einzelnen funktionellen Einheiten kodierenden Sequenzabschnitte können dabei weitere Introns liegen, die diese Abschnitte in mehrere Exons unterteilen. Diese Introns werden als interne Introns bezeichnet und unterscheiden sich zwischen verschiedenen Mollusken-Gruppen sowohl in Anzahl, Position und Intronphase voneinander (Abb. 6; Lieb et al., 2001; Altenhein et al., 2002; Bergmann et al., 2006; Yao et al., 2019). Abb. 6: Exon-Intron-Strukturen der Mollusken-Hämocyanine. Dargestellt ist die Position der Introns in Bezug auf die kodierende Sequenz der Hämocyaningene. Die einzelnen FU-kodierenden Bereiche der Mollusken- Hämocyanine sind klassenübergreifend durch sogenannte Linker-Introns voneinander getrennt, sodass sie im Grundaufbau einzelne Exons darstellen. Diese Exons sind zum Teil in mehrere Exons unterteilt. Introns, die innerhalb der einzelnen FU-kodierenden Sequenzen liegen, werden als interne Introns bezeichnet. Linker- Introns liegen sowohl in Gastropoda- als auch in Cephalopoda-Hämocyaningenen in Phase 1 vor und befinden sich in allen bisher untersuchten Genstrukturen an gleicher Position bezüglich der cDNA. Im Gegensatz hierzu unterscheiden sich die verschiedenen Hämocyaningene bezüglich der Anzahl, Position und Phase der internen Introns. Bisher wurden Hämocyanin-Genstrukturen folgender Arten veröffentlicht: Haliotis tuberculata (HtH1+2; Lieb et al., 2001; Altenhein et al., 2002), Haliotis diversicolor (HdH1-3; Yao et al., 2019), Megathura crenulata (KLH1+2; Altenhein et al., 2002), Enteroctopus dofleini (OdH; Lieb et al., 2001), Nautilus pompilius (NpH; Bergmann et al., 2006). Abbildung 6 zeigt die bisher veröffentlichten Hämocyanin-Genstrukturen der Vetigastropoda Haliotis tuberculata, Haliotis diversicolor und Megathura crenulata sowie der Cephalopoda Enteroctopus dofleini und Nautilus pompilius. Die Exon-Intron-Strukturen der Vetigastropoda-Hämocyanine beinhalten acht interne Introns (inklusive der im Signalpeptid) und sind hinsichtlich der Lage der Introns in Bezug zur kodierenden Sequenz identisch zueinander (Lieb et al., 2001; Altenhein et al., 2002; Yao et al., 2019). Die Gene der beiden Cephalopoda-Hämocyanine weisen eine jeweils andere Genstruktur mit drei (N. pompilius) bzw. fünf (E. dofleini) internen Introns auf. Bisher unveröffentlichte Ergebnisse aus zwei meiner Doktorarbeit vorausgegangenen Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass die Hämocyanin-Genstrukturen des Kalifornischen Seehasen (Aplysia californica; Streit, 2008) und der Spitzschlammschnecke (Lymnaea stagnalis; Schäfer, 2017) eine deutlich größere Anzahl an internen Introns (46-47) beinhalten. Für A. californica konnte nur ein Hämocyanin identifiziert werden (Streit, 2008), während für L. stagnalis zwei Hämocyanine Seite | 13 1 | Einleitung entdeckt wurden. Die Exon-Intron-Strukturen beider Gene von L. stagnalis unterschieden sich voneinander in nur einem Intron, wobei die Genstruktur mit 46 internen Introns der des Hämocyanins von A. californica entspricht (Schäfer, 2017). A. californica ist eine marin lebende Schnecke, die der Gruppe der Euopisthobranchia angehört. L. stagnalis hingegen ist eine limnisch lebende Lungenschnecke aus der Gruppe der Panpulmonata. Damit gehören beide Schneckenarten zu den Tectipleura und stellen die einzigen bisher untersuchten Hämocyanin-Genstrukturen innerhalb der Heterobranchia dar (Abb. 3A). Auch bei Pomacea canaliculata, einem Vertreter der Caenogastropoda, wurde eine Vielzahl interner Introns in Hämocyaningenen nachgewiesen (Chiumiento et al., 2020). Auf die entsprechenden Ergebnisse von Chiumiento et al., die eine Anzahl interner Introns zwischen 20 und 25 beschreiben, gehe ich an dieser Stelle nicht genauer ein, da sie Unstimmigkeiten enthalten, die ich in meiner Arbeit genauer untersucht und in Kapitel 2.2 korrigiert habe. 1.2.3 Die Evolution der Mollusken-Hämocyaningene Als Sauerstofftransporter stellen Hämocyanine eine wichtige Verbindung zwischen der Außenwelt und dem Metabolismus der Mollusken dar. Durch physiologische Faktoren wie dem pH-Wert und Umwelteinflüsse wie der Temperatur und dem Sauerstoffpartialdruck werden diese respiratorischen Proteine beispielsweise in ihrer Sauerstoffaffinität stark beeinflusst (Miller und van Holde, 1974; Miller, 1985), sodass eine molekulare Anpassung an solche Umweltfaktoren grundlegend für die Physiologie der Tiere ist (Oellermann et al., 2015). Veränderungen der Umwelt in Bezug auf Temperatur und Sauerstoffpartialdruck, wie sie oft mit der Besiedelung neuer Lebensräume einhergehen, müssen deshalb unter anderem zu Adaptationen der Hämocyanine führen. Eine Anpassung an verschiedene Umweltbedingungen stellt beispielsweise eine differentielle Expression unterschiedlicher Hämocyaningene dar. Mehrere Hämocyanin-Isoformen, die durch unterschiedliche Gene exprimiert werden, wurden in Gastropoda (Senozan et al., 1981; Markl et al., 1991; Altenhein et al., 2002; Gebauer et al., 1999; Velkova et al., 2010), in Cephalopoda (Miller et al., 1998; Melzner et al., 2007), in Bivalvia (Bergmann et al., 2007) und in Caudofoveata (Lieb und Todt, 2008) gefunden. Diese paralogen Hämocyanine in den einzelnen Molluskenklassen sind durch Genduplikationen entstanden, die in den verschiedenen Taxa mehrfach unabhängig voneinander stattgefunden haben (Lieb und Markl, 2004). Strobel et al. (2012) zeigten, dass die Sauerstoffversorgung bei Sepia officinalis während der Ontogenese durch die unterschiedliche Expression verschiedener Hämocyanine optimierte wurde. Ein hauptsächlich embryonal exprimiertes Hämocyanin gewährleistet dabei eine gute Sauerstoffversorgung trotz niedrigem Sauerstoffpartialdruck im Ei. Unterschiedliche, Isoform-spezifische Eigenschaften, wie sie z.B. bei den zwei Hämocyaninen von Megathura crenulata beobachtet wurden (verschiedene P50-Werte, Swerdlow et al., 1996), beruhen dabei auf unterschiedlichen Aminosäuresequenzen, die auf Seite | 14 Einleitung | 1 verschieden evolvierte Gene zurückzuführen sind. Unterschiede innerhalb der Primärstrukturen, die unter anderem zu unterschiedlichen Sauerstoffbindungsaffinitäten führen, wurden auch bei Mollusken, die in verschiedenen Lebensräumen vorkommen, beobachtet (Melzner et al., 2007): Hämocyanine von Cephalopoden, die in sauerstoffarmen Gebieten oder in Habitaten mit schwankendem Sauerstoffgehalt leben, haben häufig höhere Sauerstoffaffinitäten, um genügend Sauerstoff binden und in die Zielgewebe transportieren zu können, als solche aus sauerstoffreicheren Gewässern (Finke et al., 1996; Seibel et al., 1999), die meist eine höhere Metabolismusrate aufrecht erhalten und deshalb möglichst viel Sauerstoff an die verschiedenen Gewebe abgeben müssen (Pörtner et al., 1991). Diese Beispiele verdeutlichen die Notwendigkeit der Anpassung der Sauerstoffaffinitäten verschiedener Hämocyanine an die entsprechenden Umweltbedingungen. Neben der Evolution mehrerer Hämocyanin-Paraloge, die zum Teil differentiell exprimiert werden oder stark unterschiedliche physiologische Eigenschaften aufweisen, gibt es auch Hämocyanine mit strukturellen Abweichungen ihrer Untereinheiten vom oben beschriebenen charakteristischen Grundaufbau (z.B. sechs oder zwölf statt acht funktionelle Einheiten; Lieb et al., 2006; 2010). Solche strukturellen Unterschiede haben ebenfalls starken Einfluss auf die Funktion der Proteine und damit auch auf die Physiologie der Mollusken. In der Caenogastropoda-Gruppe Cerithioidea hat sich beispielsweise das sogenannte Mega-Hämocyanin entwickelt (Lieb et al., 2010; Gatsogiannis et al., 2015). Hierbei handelt es sich um ein Tridekamer, dessen äußere Dekamere aus typischen 400 kDa Hämocyanin-Untereinheiten mit den funktionellen Einheiten FU-a bis FU-h bestehen. Zwischen diesen Dekameren befindet sich ein Dekamer, das aus 550 kDa Polypeptidketten aufgebaut ist (Abb. 7). In dem für diese Untereinheit kodierenden Gen sind die Sequenzabschnitte für FU-g und FU-h verloren gegangen. Durch anschließende Domänenduplikationen entwickelten sich sechs zusätzliche FU-f, sodass eine für das Mega-Hämocyanin charakteristische Untereinheit entstanden ist, die insgesamt zwölf funktionelle Einheiten umfasst (Abb 7; Gatsogiannis et al., 2015). Das Mega- Hämocyanin der Cerithioidea weist demnach bei gleicher Größe wie ein Tridekamer, das aus drei charakteristischen 4 MDa Hämocyanindekameren aufgebaut ist, 40 zusätzliche Sauerstoff- bindungsstellen auf. Bei gleicher Viskosität und gleichem kolloid-osmotischem Druck der Hämolymphe kann hierdurch mehr Sauerstoff transportiert werden (Gatsogiannis et al., 2015). Durch unterschiedliche Expression der 400 und der 550 kDa Untereinheiten bilden sich in der Hämolymphe der Cerithioidea dabei unterschiedliche Verhältnisse aus Mega-Tridekameren und typischen Didekameren, was die Sauerstofftransport-Kapazität beeinflusst und so eine Adaptation an verschiedene Umweltbedingungen sein kann. Lieb et al. (2010) stellten die Hypothese auf, dass dieses Phänomen die adaptive Radiation innerhalb dieser Schneckengruppe beschleunigte. Seite | 15 1 | Einleitung Abb. 7: Aufbau des Mega-Hämocyanins von Melanoides tuberculata. (A) Das Mega-Hämocyanin von Melanoides tuberculata stellt ein Tridekamer dar, welches aus zwei typischen 4 MDa Hämocyanin-Dekameren (außen, blau dargestellt) und einem 5,5 MDa Mega-Hämocyanin-Dekamer (mittig, rot dargestellt) besteht. Die äußere Wand wird durch die funktionellen Einheiten FU-a bis FU-f aller drei Dekamere aufgebaut. Der äußere Kragen (hellblau und cyanfarben) setzt sich aus den funktionellen Einheiten FU-g und FU-h der 400 kDa Untereinheiten der außen liegenden Dekamere zusammen. Der innere Rhombus, der die Mitte des Zylinders ausfüllt (rot), besteht aus FU-f1 bis FU-f6 der 550 kDa Untereinheiten des mittleren Mega-Hämocyanin- Dekamers. Die Abbildung des Mega-Hämocyanins basiert auf einem von Jürgen Markl mit CHIMERA simulierten 3D-Volumen bei einer 7 Å-Auflösung auf Basis des pseudoatomaren Modells nach Gatsogiannis et al. (2015) und ist nach Schäfer et al. (2021) verändert. Die transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme in (B) zeigt verschiedene Hämocyanin-Moleküle der Schneckenart M. tuberculata. Es handelt sich hierbei um einzelne 5,5 MDa Dekamere (Einzelpfeil), Didekamere, aus je einem 4 MDa und einem 5,5 MDa Dekamer bestehen (Doppelpfeile), oder wie oben beschriebene Tridekamere mit zwei 4 MDa Dekameren und einem 5,5 MDa Dekamer (Trippelpfeil). In (C) ist sowohl der charakteristische Aufbau einer 400 kDa Hämocyanin- Untereinheit mit acht funktionellen Einheiten (blau) als auch der Aufbau einer 550 kDa Mega-Hämocyanin- Untereinheit mit zwölf funktionellen Einheiten (rot) dargestellt. Diese einzelnen Proteindomänen bilden globuläre Substrukturen, die über kurze Linkerpeptide (grau dargestellt) miteinander verbunden sind. Die Farbgebung der funktionellen Einheiten entspricht der für (A) beschriebenen Darstellung. Die Abhängigkeit der Hämocyanine von den gegebenen Umweltbedingungen zeigt, dass die Evolution der Mollusken mit der Entstehung neuer Arten, sich verändernden Umweltbedingungen und diversen Habitatswechseln eng mit der Adaptation der Hämocyanine verknüpft sein muss. Aufgrund ihrer enormen Größe mit über 10.000 Nukleotiden, die für über 3.400 Aminosäuren kodieren, enthalten diese Sauerstofftransport-Proteine außerdem viele phylogenetische Informationen und können für Sequenzanalysen zur Aufklärung der Systematik der Mollusken Seite | 16 Einleitung | 1 herangezogen werden. Wie oben bereits beschrieben sind zur Auflösung genauer phylogenetischer Zusammenhänge Kombinationen verschiedener phylogenetischer Marker notwendig, sodass Hämocyanine wie bereits bisher (z.B. Kocot et al., 2011) auch in Zukunft weiter in solchen Analysen miteinbezogen werden sollten (Wägele et al., 2008). 1.3 Zielsetzung der Arbeit Duplikationen und Verluste einzelner funktioneller Einheiten, die Entstehung neuer Gene und die Veränderungen der physiologischen Eigenschaften durch die Evolution der Aminosäuresequenzen stellen eine Vielzahl von Veränderungen der Hämocyanine dar, die während der Evolution der Mollusken aufgetreten sind. Die vielfältigen Adaptationen des Sauerstofftransporters sind vermutlich eng mit der großen Diversität der Lebensräume, die von Mollusken besiedelt wurden, verknüpft (vgl. Kapitel 1.2.3). Dies gilt insbesondere für die vielfältige Gruppe der Gastropoda. Die Besiedelung von sehr diversen terrestrischen Biotopen sowie von Flüssen und Seen, aber auch von unterschiedlichen Bereichen des Meeres (Tiefsee, Gezeitenzonen, Brackwasser usw.) gehen unter anderem mit starken Temperaturunterschieden und -veränderungen einher. Anpassungen sind dementsprechend nicht nur an neue Temperaturen, sondern auch an stärkere Temperaturschwankungen nötig, wie sie beispielsweise an Land oder in der Gezeitenzone vorkommen (Steele, 1985). Wie in Kapitel 1.2.3 beschrieben beeinflusst die Temperatur die Sauerstoffaffinität der Mollusken-Hämocyanine sehr stark (Miller, 1985), sodass innerhalb der Gastropoda eine große Anzahl weiterer Adaptationen des Hämocyanins zu erwarten sind, die die Eroberung der unterschiedlichen Lebensräume ermöglicht haben. Auf Grundlage dieser Annahme war es Ziel meiner Doktorarbeit, die Hämocyanine verschiedener Schneckengruppen, die sich bezüglich ihrer Lebensbedingungen und Habitate voneinander unterscheiden, zu untersuchen. Da Apogastropoda die mit Abstand arten- und formenreichsten sowie die weitverbreitetsten Schneckengruppen Heterobranchia und Caenogastropoda beinhaltet, richtete ich den Fokus meiner Untersuchungen auf diese Gastropoda-Gruppe. Die Analysen ihrer Hämocyanine umfassten dabei folgende Zielsetzungen: (i) In den untersuchten Schneckenarten sollte die Anzahl an Hämocyaningenen bestimmt und die Nukleotidsequenzen der kodierenden Genabschnitte erarbeitet werden, um daraus abgeleitete Primärstrukturen für phylogenetische Untersuchungen zu nutzen. Diese sollten zeigen, wie die einzelnen Gene evolviert sind. (ii) Die durchgeführten phylogenetischen Untersuchungen der Hämocyanine sollten außerdem genutzt werden, um zu analysieren, ob Genduplikationen, wie sie bei anderen Mollusken gefunden wurden (vgl. Kapitel 1.2.3), auch in der Gruppe der Heterobranchia und Caenogastropoda aufgetreten sind. Durch Sequenzvergleiche und Stammbaumanalysen sollte hierbei genau untersucht werden, wie weit solche Genduplikationen von Hämocyaninen Seite | 17 1 | Einleitung innerhalb der Apogastropoda verbreitet sind und ob sie mehrfach unabhängig voneinander stattgefunden haben oder auf einige wenige Duplikationen zurückzuführen sind. (iii) Weiterhin sollte mit diesen Analysen untersucht werden, ob es innerhalb der Apogastropoda weitere Hämocyanine mit strukturellen Abweichungen vom Grundaufbau, wie sie zum Beispiel beim Mega-Hämocyanin der Cerithioidea vorkommen (vgl. Kapitel 1.2.3), gibt. (iv) Zusätzlich zu den kodierenden Sequenzen war es Ziel meiner Doktorarbeit auch die Exon-Intron- Strukturen der Hämocyaningene zu analysieren. Die große Anzahl an Introns, wie sie in den Hämocyaningenen von Aplysia californica und Lymnaea stagnalis gefunden wurde, (Streit, 2008; Schäfer, 2017), führt zu der Frage, wann diese Introns entstanden sind und ob sie Ausnahmen oder ein möglicherweise weit verbreitetes Phänomen der Gene innerhalb der Apogastropoda darstellen. Um diese Fragen zu klären, sollten außerdem die Genstrukturen weiterer Hämocyanine aus unterschiedlichen Heterobranchia- und Caenogastropoda-Gruppen untersucht werden (vgl. Kapitel 1.2.3, Abb. 3). Wie in Kapitel 1.1 erläutert, stellt die Gruppe der Apogastropoda eine sehr artenvielfältige und diverse Schneckengruppe dar, sodass ich für diese Untersuchungen gezielt einige Arten und Gruppen auswählen musste. Da meine Arbeit auf der Hypothese basiert, dass insbesondere Habitatswechsel eine starke Adaptation des Hämocyanins erfordern, fokussieren sich meine Untersuchungen innerhalb der Heterobranchia auf verschiedene Arten der Tectipleura. Diese repräsentieren die artenreichste Gruppe der Heterobranchia und besiedeln mit Abstand die vielfältigsten Lebensräume (vgl. Abb. 3A und Kapitel 1.1.1). Dabei habe ich aus unterschiedlichen Untergruppen der Tectipleura, die sowohl Vertreter der Euopisthobranchia als auch der Panpulmonata umfassen und aus unterschiedlichen Lebensräumen stammen (Abb. 3A), Hämocyanin-Sequenzen assembliert, phylogenetisch miteinander verglichen und Genduplikationen untersucht (Kapitel 2.1). Zudem habe ich auch die Exon-Intron-Strukturen dieser Hämocyaningene erarbeitet und analysiert (Kapitel 2.3). Des Weiteren habe ich die Hämocyanine von Vertretern aus den im Folgenden beschriebenen vier großen Caenogastropoda-Gruppen auf Sequenz- und Strukturebene analysiert. Durch biochemische und molekularbiologische Untersuchungen der Hämocyanine der Muricidae (siphonate Hypsogastropoda) konnte ich eine bisher unbekannte Hämocyanin-Struktur beschreiben (Kapitel 2.2). Diese Hämocyanine habe ich ebenso wie einige Hämocyanine der Caenogastropoda-Gruppen Ampullariida, Cerithiida und der asiphonaten Hypsogastropoda in phylogenetischen Analysen miteinander verglichen, Genduplikationen innerhalb dieser Gruppen untersucht und Exon-Intron- Strukturen der Gene analysiert. Der Vergleich der hieraus gewonnenen Ergebnisse mit den Erkenntnissen zu den Hämocyaningenen der Tectipleura ermöglichte schließlich erste allgemeine Rückschlüsse auf die Evolution der Apogastropoda-Hämocyaningene (Kapitel 2.4). Seite | 18 Einleitung | 1 In Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Prof. Reinhard Dallinger aus Innsbruck haben wir in einem weiteren Projekt außerdem Hämocyanine und Metallothioneine gemeinsam auf kupferabhängige Expressionsveränderungen untersucht (Kapitel 2.5). Hintergrund für diese Untersuchung ist die Annahme, dass Kupfer-Metallothioneine an der Hämocyaninsynthese beteiligt sein könnten (Dallinger et al., 2005), da beide Moleküle Kupfer als Liganden enthalten und ihr Syntheseort die Rhogozyten sind (Chabicovsky, 2003; Albrecht et al., 2001; Martin et al., 2011). Seite | 19 Seite | 20 2 Publikationen Die Ergebnisse meiner Dissertation haben schließlich zu fünf Publikationen geführt, in denen wir die Evolution der Hämocyaningene in Apogastropoda analysiert und mögliche Zusammenhänge mit der Diversität dieser Schneckengruppe diskutiert haben. Die Veröffentlichungen beziehen sich auf die Hämocyanine der Tectipleura als Vertreter der Heterobranchia (Kapitel 2.1, 2.3, 2.5) sowie verschiedene Gruppen der Caenogastropoda (Kapitel 2.2, 2.4) und sind im Folgenden kurz zusammengefasst: Die erste Publikation (Kapitel 2.1: HEMOCYANIN GENES AS INDICATORS OF HABITAT SHIFTS IN PANPULMONATA?) stellt die erste überhaupt veröffentlichte phylogenetische Analyse von Hämocyaninen aus der Gruppe der Apogastropoda dar. Dabei untersuchen wir elf verschiedene Hämocyaningene von insgesamt fünf Tectipleura-Arten und zeigen, dass unabhängig voneinander in mindestens drei verschiedenen phylogenetischen Gruppen der Tectipleura ein bis zwei Genduplikationen stattgefunden haben. Diese mehrfach aufgetretenen Genduplikationen stellen einen wesentlichen Unterschied zur Evolution der Hämocyaningene der Lepetellida (Vetigastropoda) dar, da diese höchstwahrscheinlich bereits viel früher in einem gemeinsamen Vorfahren entstanden und bis heute nicht wieder verloren gegangen sind (Lieb und Markl, 2004). Die Duplikationen der Hämocyaningene innerhalb der Tectipleura hingegen sind als später aufgetretene evolutive Erneuerungen anzusehen, die möglicherweise verschiedene Adaptationen der einzelnen Tectipleura-Gruppen an ihre unterschiedlichen Habitate oder Lebensbedingungen darstellen. In der zweiten Publikation (Kapitel 2.2: HEMOCYANINS OF MURICIDAE: NEW ‘INSIGHTS’ UNRAVEL AN ADDITIONAL HIGHLY HYDROPHILIC 800 KDA MASS WITHIN THE MOLECULE) charakterisieren wir die Hämocyanine der beiden Muricidae-Arten Nucella lapillus und Rapana venosa, wobei der Fokus der Veröffentlichung auf den strukturellen Besonderheiten der Hämocyanine NlH2 und RtH2 (benannt nach dem alternativ verwendeten Namen Rapana thomasiana) liegt. Diese beiden orthologen Hämocyanin-Untereinheiten besitzen innerhalb der FU-g 340 (NlH2) bzw. 118 (RtH2) hauptsächlich hydrophile Aminosäuren, die deutlich von dem in der Regel hoch konservierten Grundaufbau der Mollusken-Hämocyanine (vgl. Markl, 2013) abweichen. Diese haben wir sowohl biochemisch als auch mittels Sequenzierung identifiziert und untersucht. Des Weiteren deuten unsere elektronen- mikroskopischen Aufnahmen auf atypische Massen innerhalb einiger Didekamere dieser Muricidae- Seite | 21 2 | Publikationen Hämocyanine hin, die bisher für kein anderes Mollusken-Hämocyanin beschrieben wurden und höchstwahrscheinlich auf eben diese zusätzlichen Aminosäuren zurückzuführen sind. Diese bislang unbekannte Struktur für ein Mollusken-Hämocyanin wird im Hinblick auf die Evolution spezieller Hämocyanin-Architekturen, insbesondere dem Mega-Hämocyanin der Cerithioidea, diskutiert. In der dritten Publikation (Kapitel 2.3: THE EVOLUTION OF HEMOCYANIN GENES IN TECTIPLEURA: A MULTITUDE OF CONSERVED INTRONS IN HIGHLY DIVERSE GASTROPODS) zeigen wir, dass Genstrukturen der Tectipleura- Hämocyanine mit 53 Introns pro Untereinheit eine deutlich größere Anzahl an Introns umfassen als bisher analysierte Mollusken-Hämocyanine (9 – 33 Introns; Lieb et al., 2001; Altenhein et al., 2002; Bergmann et al., 2006; Yao et al., 2019; Chiumiento et al., 2020). Durch die Analyse von Hämocyaninen der Vertreter beider Tectipleura-Gruppen Euopisthobranchia und Panpulmonata weisen wir nach, dass diese Exon-Intron-Struktur bereits in einem gemeinsamen Vorfahren der Tectipleura vor über 200 Millionen Jahren entstanden und seitdem in den untersuchten Gruppen gleichgeblieben ist. Als mögliche Erklärung für diese starke Konservierung der Genarchitektur diskutieren wir mögliche evolutive Vorteile und Zusammenhänge mit der enormen Diversität der Tectipleura. In der vierten Publikation (Kapitel 2.4: THE EVOLUTION OF HEMOCYANIN GENES IN CAENOGASTROPODA: GENE DUPLICATIONS AND INTRON ACCUMULATION IN HIGHLY DIVERSE GASTROPODS) zeigen wir mittels phylogenetischer Analysen, dass auch innerhalb der Caenogastropoda mehrfach unabhängig voneinander Hämocyanin-Genduplikationen aufgetreten sind und in allen untersuchten Gruppen (Ampullariida, Cerithiida und Hypsogastropoda) zu mindestens zwei Hämocyaningenen pro Art geführt haben. Des Weiteren charakterisieren wir Hämocyanin-Genstrukturen innerhalb dieser Caenogastropoda-Gruppen und zeigen, dass diese sich im Vergleich zu Tectipleura-Hämocyaninen deutlich in Anzahl und Lage der Introns voneinander unterscheiden (21 – 54 Introns pro charakteris- tischem Hämocyaningen). Diese variieren sowohl zwischen Hämocyaninen verschiedener Caenogastropoda-Gruppen als auch zwischen paralogen Hämocyaninen innerhalb derselben Art. Auf Grundlage der Maximum-Parsimony-Theorie und phylogenetischer Zusammenhänge leiten wir ein mögliches Szenario für die Evolution der Hämocyanin-Genstrukturen der untersuchten Apogastropoda ab. Dieses zeigt, dass die Anhäufung der Introns vermutlich kontinuierlich und graduell während der Evolution verschiedener Linien der Caenogastropoda stattgefunden und womöglich bereits in einem gemeinsamen Vorfahren aller Apogastropoda (Heterobranchia und Caenogastropoda) begonnen hat. Diese Ergebnisse diskutieren wir schließlich hinsichtlich der in den vorherigen Publikationen aufgestellten Hypothesen (vgl. Kapitel 2.1, 2.2 und 2.3) zu Zusammenhängen zwischen der Evolution der Hämocyaningene und der enormen Diversität dieser Schneckengruppe. Seite | 22 Publikationen | 2 In der fünften Publikation (Kapitel 2.5: RESPONSIVENESS OF METALLOTHIONEIN AND HEMOCYANIN GENES TO CADMIUM AND COPPER EXPOSURE IN THE GARDEN SNAIL CORNU ASPERSUM) zeigen wir, dass kupferexponierte Tiere der Tectipleura-Art Cornu aspersum erhöhte Transkriptionsraten des Kupfer- Metallothioneingens sowie eines Hämocyaningens (CaH αD) aufweisen. Diese Ergebnisse werden bezüglich einer möglichen Funktionsänderung dieses Hämocyanins zur Kupfer-Detoxifikation sowie hinsichtlich der Hypothese, dass Kupfer-Metallothionein als Donator von Kupfer-Ionen für die Hämocyanin-Synthese dienen, diskutiert. Seite | 23 Seite | 24 2.1 Hemocyanin genes as indicators of habitat shifts in Panpulmonata? Gabriela Giannina Schäfer Veronika Pedrini-Martha Raimund Schnegg Reinhard Dallinger Daniel John Jackson Bernhard Lieb Molecular Phylogenetics and Evolution Januar 2019; Volume 130, Pages 99-103 Online: Oktober 2018 https://doi.org/10.1016/j.ympev.2018.10.014 Mein Beitrag: Ich habe sowohl die cDNA-Sequenzen assembliert und analysiert als auch die phylogenetischen Analysen (multiple Sequenzvergleiche und Stammbaum-Berechnung) durchgeführt. Außerdem verfasste ich die Erstversion des Manuskripts und arbeitete die Kommentare der Mitautoren ein. Seite | 25 Seite | 26 Hemocyanin genes as indicators of habitat shifts in Panpulmonata? | 2.1 Seite | 27 2.1 | Hemocyanin genes as indicators of habitat shifts in Panpulmonata? Seite | 28 Hemocyanin genes as indicators of habitat shifts in Panpulmonata? | 2.1 Seite | 29 2.1 | Hemocyanin genes as indicators of habitat shifts in Panpulmonata? Seite | 30 Hemocyanin genes as indicators of habitat shifts in Panpulmonata? | 2.1 Seite | 31 Seite | 32 2.2 Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule Gabriela Giannina Schäfer Lukas Jörg Grebe Frank Depoix Bernhard Lieb Journal of Molecular Evolution Februar 2021; Volume 89, Pages 62-72 Online: Januar 2021 https://doi.org/10.1007/s00239-020-09986-6 Mein Beitrag: Ich habe die Untersuchung von Nucella lapillus als intertidal lebender Vertreter der Caenogastropoda konzipiert und die Probensammlung geplant und mit Kollegen durchgeführt. Außerdem isolierte ich die DNA und RNA für die Sequenzierung, assemblierte die NGS-Daten, analysierte die Nukleotidsequenzen und führte die biochemischen Analysen durch. Ich habe die Erstversion des Manuskripts geschrieben und anschließend die Kommentare von Mitautoren und Reviewern eingearbeitet. Seite | 33 Seite | 34 Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule | 2.2 Seite | 35 2.2 | Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule Seite | 36 Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule | 2.2 Seite | 37 2.2 | Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule Seite | 38 Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule | 2.2 Seite | 39 2.2 | Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule Seite | 40 Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule | 2.2 Seite | 41 2.2 | Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule Seite | 42 Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule | 2.2 Seite | 43 2.2 | Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule Seite | 44 Hemocyanins of Muricidae: New ‘Insights’ Unravel an Additional Highly Hydrophilic 800 kDa Mass Within the Molecule | 2.2 Seite | 45 Seite | 46 2.3 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods Gabriela Giannina Schäfer Veronika Pedrini-Martha Daniel John Jackson Reinhard Dallinger Bernhard Lieb BMC Ecology and Evolution März 2021; Volume 21, Article number: 36 https://doi.org/10.1186/s12862-021-01763-3 Mein Beitrag: Ich habe sowohl die Genstrukturen analysiert und interpretiert als auch einen wesentlichen Teil der Studie konzipiert. Des Weiteren verfasste ich die Erstversion des Manuskripts und arbeitete die Kommentare von Mitautoren und Reviewern ein. Seite | 47 Seite | 48 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods | 2.3 Seite | 49 2.3 | The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods Seite | 50 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods | 2.3 Seite | 51 2.3 | The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods Seite | 52 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods | 2.3 Seite | 53 2.3 | The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods Seite | 54 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods | 2.3 Seite | 55 2.3 | The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods Seite | 56 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods | 2.3 Seite | 57 2.3 | The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods Seite | 58 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods | 2.3 Seite | 59 2.3 | The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods Seite | 60 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods | 2.3 Seite | 61 2.3 | The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods Seite | 62 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods | 2.3 Seite | 63 2.3 | The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods Seite | 64 The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods | 2.3 Seite | 65 2.3 | The evolution of hemocyanin genes in Tectipleura: a multitude of conserved introns in highly diverse gastropods Seite | 66 2.4 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Gene duplications and intron accumulation in highly diverse gastropods Gabriela Giannina Schäfer Lukas Jörg Grebe Robin Schinkel Bernhard Lieb Journal of Molecular Evolution Under Review, eingereicht am: 22.04.2021 Mein Beitrag: Ich habe die Untersuchung der Hämocyanin-Genstrukturen der Caenogastropoda mitkonzipiert und die Probensammlung von Nucella lapillus als intertidal lebender Vertreter dieser Gruppe geplant und mit Kollegen durchgeführt. Außerdem isolierte ich die DNA und RNA für die Sequenzierung und führte die biochemischen Analysen durch. Ich habe gemeinsam mit Lukas Grebe und Robin Schinkel, deren Masterarbeiten ich mitbetreut habe, die NGS-Daten assembliert und die Nukleotidsequenzen analysiert. Weiterhin habe ich die Erstversion des Manuskripts verfasst und anschließend die Kommentare der Mitautoren eingearbeitet. Seite | 67 Seite | 68 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda | 2.4 Seite | 69 2.4 | The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Seite | 70 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda | 2.4 Seite | 71 2.4 | The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Seite | 72 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda | 2.4 Seite | 73 2.4 | The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Seite | 74 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda | 2.4 Seite | 75 2.4 | The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Seite | 76 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda | 2.4 Seite | 77 2.4 | The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Seite | 78 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda | 2.4 Seite | 79 2.4 | The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Seite | 80 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda | 2.4 Seite | 81 2.4 | The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Seite | 82 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda | 2.4 Seite | 83 2.4 | The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Seite | 84 The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda | 2.4 Seite | 85 2.4 | The evolution of hemocyanin genes in Caenogastropoda: Seite | 86 2.5 Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum Veronika Pedrini‐Martha Raimund Schnegg Gabriela Giannina Schäfer Bernhard Lieb Willi Salvenmoser Reinhard Dallinger Journal of Experimental Zoology February 1, 2021; Volume 335, Issue 2, Pages:228–238. Online: November 2020 https://doi.org/10.1002/jez.2425 Mein Beitrag: Ich habe die bioinformatischen Analysen durchgeführt. Dabei verglich ich die Transkriptomdaten der Individuen, die mit Kupfer angereicherter Nahrung gefüttert wurden, mit denen der Kontroll- gruppe hinsichtlich quantitativer Unterschiede der exprimierten Hämocyanin- und Metallothionein- cDNA-Sequenzen. Seite | 87 Seite | 88 Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum | 2.5 Seite | 89 2.5 | Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum Seite | 90 Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum | 2.5 Seite | 91 2.5 | Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum Seite | 92 Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum | 2.5 Seite | 93 2.5 | Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum Seite | 94 Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum | 2.5 Seite | 95 2.5 | Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum Seite | 96 Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum | 2.5 Seite | 97 2.5 | Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum Seite | 98 Responsiveness of metallothionein and hemocyanin genes to cadmium and copper exposure in the garden snail Cornu aspersum | 2.5 Seite | 99 Seite | 100 3 Fazit & Ausblick Die gemeinsame Betrachtung der Ergebnisse zu den Hämocyaninen der Heterobranchia und der Caenogastropoda zeigt, dass die Hämocyaningene innerhalb der Großgruppe der Apogastropoda auf vielfältige Weise evolviert sind. In vielen verschiedenen Linien dieser artenreichsten aller Mollusken- Gruppen haben mehrfach unabhängig voneinander Hämocyanin-Genduplikationen stattgefunden und so zu paralogen Genen geführt. Mit dem Hämocyanin der Muricidae liegt neben dem bereits beschriebenen Mega-Hämocyanin der Cerithioidea eine weitere strukturelle Besonderheit eines Hämocyanins der Caenogastropoda vor. Auch die Genstruktur der Hämocyanine hat sich während der Evolution der Apogastropoda stark verändert. Die Ergebnisse meiner Arbeit zeigen, dass im Laufe der Evolution der Apogastropoda-Hämocyanine vermutlich immer mehr Introns entstanden und erhalten geblieben sind, was zu unterschiedlichen Genstrukturen mit 28 bis 61 Introns führte. In den Hämocyaningenen verschiedener Tectipleura-Gruppen liegt mit Ausnahme eines zusätzlichen Introns, welches wir innerhalb eines Hämocyaningens der Hygrophila entdeckt haben, die gleiche Exon-Intron-Struktur vor. Diese ist demnach höchstwahrscheinlich bereits in einem gemeinsamen Vorfahren der Tectipleura evolviert und seitdem konserviert geblieben, was möglicherweise auf eine Sättigung der Gene mit Introns zurückzuführen ist. Um weitere Aussagen über die Evolution dieser Genstrukturen treffen zu können, sollten in zukünftigen Arbeiten die Hämocyaningene weiterer Heterobranchia, die nicht den Tectipleura angehören, analysiert werden. Durch die Untersuchung von Hämocyaningenen aus der Gruppe der basalen („lower“) Heterobranchia könnten so Rückschlüsse gezogen werden, in wie weit eine Ansammlung von Introns bereits in einem gemeinsamen Vorläufer der Heterobranchia stattgefunden hat. Auch das aufgestellte Szenario zur Evolution der Hämocyanin-Genstrukturen aus Kapitel 2.4 könnte dadurch weiter überprüft werden, um die Entstehung erster interner Introns in einem gemeinsamen Vorfahren aller Apogastropoda zu verifizieren. Meine Ergebnisse aus Kapitel 2.4 zeigen, dass innerhalb der Caenogastropoda Veränderungen der Exon-Intron-Strukturen der Hämocyaningene kontinuierlich während der Evolution der einzelnen Schnecken-Linien stattgefunden haben. Anders als bei den Hämocyaningenen der Tectipleura sind hier verschiedene Introns erst nach den Genduplikationen, die zu den mehrfach heute vorhandenen Caenogastropoda-Hämocyaninen geführt haben, entstanden. Um zu überprüfen, ob es sich bei der Seite | 101 3 | Fazit & Ausblick kontinuierlichen Ansammlung interner Introns tatsächlich um einen allgemeinen Trend innerhalb der Caenogastropoda handelt, sollten in Folgeuntersuchungen auch Hämocyaningene weiterer, bisher diesbezüglich nicht untersuchter Caenogastropoda-Gruppen (Cyclophorida, Viviparida, Campanilida; vgl. Abb. 3) analysiert werden. Aufgrund der im Vergleich zu den Lepetellida (Vetigastropoda) deutlich stärkeren Evolutionsrate der Hämocyaningene in Apogastropoda habe ich schließlich die Hypothese aufgestellt, dass die starke Evolutionsrate mit der enormen Radiation und der großen Diversität der Apogastropoda zusammenhängen oder womöglich sogar eine Voraussetzung für diese darstellen könnte. Um diese Hypothesen weiter überprüfen zu können, ist es notwendig, dass viele weitere Untersuchungen der Hämocyanine bezüglich ihrer physiologischen Eigenschaften (z.B. Temperaturabhängigkeit, Sauerstoffaffinität) folgen, um mögliche funktionelle Veränderungen zu analysieren. Zusammenfassend bietet meine Arbeit damit einen ersten Einblick in die vielfältige Evolution der Hämocyaningene in der Gruppe der Apogastropoda und beschreibt unterschiedliche evolutive Erneuerungen wie Genduplikationen und die Zunahme von Introns in Hämocyaningenen. Sie kann hiermit als Grundlage für weitere Studien zur Erforschung dieser riesigen Sauerstofftransport- Proteine und deren Einfluss auf die Evolution der Diversität der Apogastropoda und der Mollusken im Allgemeinen dienen. Seite | 102 4 Literaturverzeichnis Aktipis, S. W., G. Giribet, D. R. Lindberg, W. F. Ponder (2008): Gastropoda:. An overview and analysis. In: Ponder, W. (Hrsg.): Phylogeny and Evolution of the Mollusca. University of California Press, S. 201–237. Albrecht, U., H. Keller, W. Gebauer, J. Markl (2001): Rhogocytes (pore cells) as the site of hemocyanin biosynthesis in the marine gastropod Haliotis tuberculata. Cell and tissue research 304, 3/2001, S. 455–462. Altenhein, B., J. Markl, B. Lieb (2002): Gene structure and hemocyanin isoform HtH2 from the mollusc Haliotis tuberculata indicate early and late intron hot spots. Gene 301, 1-2/2002, S. 53– 60. Bang, R., R. DeSalle, W. Wheeler (2000): Transformationalism, taxism, and developmental biology in systematics. 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Seite | 107 Seite | 108 5 Quellenverzeichnis Seite # Bild/Spezies Autor Creative Common Version 6 A1 Aplysia californica Chad King public domain (gemeinfrei) 6 A2 Clione limacina Kevin Raskoff public domain (gemeinfrei) 6 A3 Tylodina perversa Parent Géry https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 6 A4 Placida cremoniana Sike Rohrlach https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.0/deed.de 6 A5 Oxynoe viridis Izuzuki Diver https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5/deed.de 6 A6 Rissoella opalina Yasunori Kano https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 6 A7 Architectonica perspectiva Nhobgood Nick Hobgood https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 6 A8 Melibe leonina Cabrillo Marine Aquarium public domain (gemeinfrei) 6 A9 Aplysiopsis elegans Sike Rohrlach https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.0/deed.de 6 B1 Siphonaria spec. Layton, Diana https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 6 B2 Onchidella celtica Eigenes Werk ------------- 6 B3 Trimusculus mauritianus Philippe Bourjon https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 6 B4 Otina ovata Eigenes Werk ------------- 6 C1 Acochlidium fijiiensis Katharina M. Jörger https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.0/deed.de 6 C2 Stagnicola palustris Alexander Mrkvicka https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 6 C3 Ancylus fluviatilis Alexander Mrkvicka https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 6 C4 Lymnaea stagnalis Bj. Schoenmakers public domain (gemeinfrei) 6 D1 Isognomostoma Francesco Welter isognomostomos Schultes public domain (gemeinfrei) 6 D2 Edentulina spec. Bernard DUPONT https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.0/deed.de 6 D3 Limax cinereoniger Holger Krisp https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 6 D4 Cepaea nemoralis Mad Max https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 6 D5 Euhadra peliomphala Takahashi public domain (gemeinfrei) 6 D6 Helix pomatia Waugsberg https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 6 D7 Liguus virigineus Anders Sandberg https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.0/deed.de 6 D8 Achatina fulica Charles J. Sharp https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 6 D9 Limax maximus Michal Manas https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5/deed.de 8 A1 Lentigo lentiginosus Philippe Bourjon https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 8 A2 Cyphoma gibbosum Laszlo Ilyes https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.0/deed.de 8 A3 Phenacovolva rosea Nhobgood Nick Hobgood https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 8 A4 Chicoreus palmarosae Bricktop https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5/deed.de 8 A5 Lambis scorpius Frédéric Ducarme https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 8 A6 Dentiovula dorsuosa Nick Hobgood https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 8 A7 Arestorides argus Elisabeth Morcel https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 8 A8 Rapana venosa George Chernilevsky public domain (gemeinfrei) 8 B1 Telescopium telescopium Toni Wöhrl https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 8 B2 Batillaria estuarina Jan Delsing public domain (gemeinfrei) 8 B3 Nodilittorina pyramidalis Peter Woodard https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 8 B4 Crepidula fornicata Rudolphous https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 8 B5 Nucella lapillus Eigenes Werk -------------- 8 C1 Pomacea bridgesii Stijn Ghesquiere https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 8 C2 Sadleriana fluminensis Alexander Mrkvicka https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 8 C3 Oncomelania hupensis Fred A. Lewis https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 8 C4 Melanoides tuberculata Dennis L. https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.0/deed.de 8 C5 Anentome helena RSX https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 8 C6 Melanopsis praemorsa Alexander Mrkvicka https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 8 C7 Emmericia patula Alexander Mrkvicka https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 8 C8 Elimia clara Whelan NV https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5/deed.de 8 D1 Pupinella rufa Takahashi public domain (gemeinfrei) 8 D2 Rhiostoma huberi Manuel Caballer https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de 8 D3 Cochlostoma auritum Francesco Welter Schultes public domain (gemeinfrei) 8 D4 Terebralia palustris Christoph Kühne https://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.0/deed.de 8 D5 Pomatias elegans Hectonichus https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de 8 D6 Cochlostoma septemspirale Céreric Audibert public domain (gemeinfrei) 8 D7 Cyclophorus perdix H. Zell https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.de Seite | 109 Seite | 110 6 Danksagung Ich danke herzlichst… … XXXXXXXXXXXXXXXX für die Bereitstellung und Betreuung meines Promotionsthemas. Ein großes Dankeschön für das entgegengebrachte Vertrauen, die Unterstützung während der gesamten Zeit meiner Doktorarbeit, die Ermöglichung vieler gewinnbringender Konferenzteilnahmen und erfolgreicher Exkursionen, viele konstruktive Diskussionen und die kritische Durchsicht und Kommentierung der einzelnen Veröffentlichungen sowie dieser Arbeit. Der wertschätzende Umgang und die angenehme Zusammenarbeit haben mich die vergangenen vier Jahre immer wieder motiviert und diese Arbeit möglich gemacht. … XXXXXXXXXXXXXXXX dafür, dass er bereitwillig das Zweitgutachten meiner Doktorarbeit übernommen hat. … XXXXXXXXXXXXXXXX und XXXXXXXXXXXXXXXX sowie XXXXXXXXXXXXXXXX für die angenehme Kooperation und die vielen hilfreichen Kommentare und Denkanstöße beim Überarbeiten gemeinsamer Manuskripte. Vielen Dank außerdem an XXXXXXXXXXXXXXXX und XXXXXXXXXXXXXXXX für die nette Zusammenarbeit. … XXXXXXXXXXXXXXXX und XXXXXXXXXXXXXXXX für die Unterstützung im Labor sowie XXXXXXXXXXXXXXXX für die Durchführung der elektronenmikroskopischen Untersuchungen. … XXXXXXXXXXXXXXXX und XXXXXXXXXXXXXXXX für hilfreiche Ratschläge. … XXXXXXXXXXXXXXXX und XXXXXXXXXXXXXXXX für ihre Unterstützung im alltäglichen Uniwahnsinn. … den ehemaligen Kandidaten der Arbeitsgruppe XXXXXXXX, die auch nachdem sie die Uni verlassen haben immer wieder für mich da waren. Vielen Dank XXXXXXXX, XXXXXXXX und XXXXXXXX für eure Unterstützung, die interessanten Gespräche, tollen Exkursionen, eine wunderbare Konferenz und unheimlich viel Spaß! … XXXXXXXX für ihre stetige Hilfsbereitschaft und Unterstützung, für viele angenehme Unterhaltungen, ein tolles Arbeitsklima und die schöne gemeinsame Zeit in der Arbeitsgruppe. … XXXXXXXX und XXXXXXXX für eine wunderbare Exkursion in die Bretagne und die enorme Hilfe beim erfolgreichen Schneckensammeln, für die stetige Unterstützung, viele lustige Unternehmungen, tolle Gespräche und die einzigartige Arbeitsatmosphäre. … meinen Bachelor- und Master-Kandidaten XXXXXXXX, XXXXXXXX, XXXXXXXX, XXXXXXXX, XXXXXXXX und XXXXXXXX für die tolle und erfolgreiche Zusammenarbeit und eure Unterstützung! … XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX … meiner gesamten Familie! Ein besonderer Dank gilt meiner Mutter, die mich immer unterstützt hat, für mich da war und der ich das für diese Arbeit nötige Selbstvertrauen verdanke. Ein großes Dankeschön geht außerdem an meinen Vater für seine Hilfe und Unterstützung und dafür, dass er mir die Naturwissenschaften nähergebracht hat. Außerdem bedanke ich mich bei meinen Schwestern, auf die ich immer zählen kann, sowie bei Lotti, die mich mehrfach in der Uni besucht und selbst im Urlaub Ausschau nach Schnecken gehalten hat. Seite | 111 Seite | 112 7 Lebenslauf Persönliche Daten Name: Gabriela Giannina Schäfer Wohnort: XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX Email: XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX Geburtstag: XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX Geburtsort: XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX Ausbildung & berufliche Erfahrung ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX Stipendien & Auszeichnungen: ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX ▪ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX Seite | 113 Seite | 114 8 Erklärung Hiermit erkläre ich, die vorliegende Arbeit selbständig und nur mit Hilfe der angegebenen Personen und Mittel (Literatur, Methoden) angefertigt zu haben. Bei den von mir durchgeführten Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis, wie sie in der Satzung der Johannes Gutenberg‐Universität Mainz festgelegt sind, eingehalten. Ort, Datum Gabriela Schäfer Seite | 115