Authors:	Moser, Mirko
Title:	Gene expression analysis in ‘Candidatus Phytoplasma mali’-resistant and -susceptible Malus genotypes
Online publication date:	21-Oct-2010
Year of first publication:	2010
Language:	english
Abstract:	Apple proliferation (AP) disease is the most important graft-transmissible and vector-borne disease of apple in Europe. ‘Candidatus Phytoplasma mali’ (Ca. P. mali) is the causal agent of AP. Apple (Malus x domestica) and other Malus species are the only known woody hosts. In European apple orchards, the cultivars are mainly grafted on one rootstock, M. x domestica cv. M9. M9 like all other M. x domestica cultivars is susceptible to ‘Ca. P. mali’. Resistance to AP was found in the wild genotype Malus sieboldii (MS) and in MS-derived hybrids but they were characterised by poor agronomic value. The breeding of a new rootstock carrying the resistant and the agronomic traits was the major aim of a project of which this work is a part. The objective was to shed light into the unknown resistance mechanism. The plant-phytoplasma interaction was studied by analysing differences between the ‘Ca. P. mali’-resistant and -susceptible genotypes related to constitutively expressed genes or to induced genes during infection. The cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism (cDNA-AFLP) technique was employed in both approaches. Differences related to constitutively expressed genes were identified between two ‘Ca. P. mali’-resistant hybrid genotypes (4551 and H0909) and the ‘Ca. P. mali’-susceptible M9. 232 cDNA-AFLP bands present in the two resistant genotypes but absent in the susceptible one were isolated but several different products associated to each band were found. Therefore, two different macroarray hybridisation experiments were performed with the cDNA-AFLP fragments yielding 40 sequences encoding for genes of unknown function or a wide array of functions including plant defence. In the second approach, individuation and analysis of the induced genes was carried out exploiting an in vitro system in which healthy and ‘Ca. P. mali’-infected micropropagated plants were maintained under controlled conditions. Infection trials using in vitro grafting of ‘Ca. P. mali’ showed that the resistance phenotype could be reproduced in this system. In addition, ex vitro plants were generated as an independent control of the genes differentially expressed in the in vitro plants. The cDNA-AFLP analysis in in vitro plants yielded 63 bands characterised by over-expression in the infected state of both the H0909 and MS genotypes. The major part (37 %) of the associated sequences showed homology with products of unknown function. The other genes were involved in plant defence, energy transport/oxidative stress response, protein metabolism and cellular growth. Real-time qPCR analysis was employed to validate the differential expression of the genes individuated in the cDNA-AFLP analysis. Since no internal controls were available for the study of the gene expression in Malus, an analysis on housekeeping genes was performed. The most stably expressed genes were the elongation factor-1 α (EF1) and the eukaryotic translation initiation factor 4-A (eIF4A). Twelve out of 20 genes investigated through qPCR were significantly differentially expressed in at least one genotype either in in vitro plants or in ex vitro plants. Overall, about 20% of the genes confirmed their cDNA-AFLP expression pattern in M. sieboldii or H0909. On the contrary, 30 % of the genes showed down-regulation or were not differentially expressed. For the remaining 50 % of the genes a contrasting behaviour was observed. The qPCR data could be interpreted as follows: the phytoplasma infection unbalance photosynthetic activity and photorespiration down-regulating genes involved in photosynthesis and in the electron transfer chain. As result, and in contrast to M. x domestica genotypes, an up-regulation of genes of the general response against pathogens was found in MS. These genes involved the pathway of H2O2 and the production of secondary metabolites leading to the hypothesis that a response based on the accumulation of H2O2 in MS would be at the base of its resistance. This resembles a phenomenon known as “recovery” where the spontaneous remission of the symptoms is observed in old susceptible plants but occurring in a stochastic way while the resistance in MS is an inducible but stable feature. As additional product of this work three cDNA-AFLP-derived markers were developed which showed independent distribution among the seedlings of two breeding progenies and were associated to a genomic region characteristic of MS. These markers will contribute to the development of molecular markers for the resistance as well as to map the resistance on the Malus genome. Apfeltriebsucht (AT) Krankheit ist die wichtigste pfropf- und vektorübertragbare Krankheit von Apfel in Europa. "Candidatus Phytoplasma mali '(Ca. P. mali) ist der Erreger der AT. Apfel (Malus x domestica) und andere Malus Arten sind die einzigen bekannten holzigen Wirte. In europäischen Apfelanlagen sind die Sorten vor allem auf einer Unterlage, M. x domestica cv. M9, veredelt. M9 ist wie alle anderen M. x domestica Sorten anfällig für "Ca. P. mali". Resistenz gegen AT wurde im wilden Genotyp Malus sieboldii (MS) und in MS-Hybriden gefunden, welche aber nur geringen agronomischen Wert haben. Die Züchtung einer neuen Unterlage, die Resistenz und agronomischen Eigenschaften verbindet, war das Hauptziel eines Projekts, von dem diese Arbeit ein Teil ist. Das Ziel war, etwas über den unbekannten Resistenzmechanismus zu erfahren. Hierzu wurde die Phytoplasma-Pflanzen-Interaktion durch die Analyse der Unterschiede zwischen den 'Ca. P. mali'-resistenten und -anfälligen Genotypen sowohl im Bezug auf konstitutiv exprimierte Gene als auch in Bezug auf nach Infektion induzierte Gene untersucht. Die cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism (cDNA-AFLP) Technik wurde in beiden Ansätzen verwendet. Unterschiede von konstitutiv exprimierten Genen wurden zwischen zwei "Ca. P. mali'-resistenten Hybrid-Genotypen (4551 und H0909) und dem "Ca. P. mali'-anfälligen M9 identifiziert. 232 cDNA-AFLP-Banden anwesend in den beiden resistenten Genotypen und fehlend in dem anfälligen Genotyp wurden isoliert, aber mehrere verschiedene Produkte waren mit jeder Bande assoziiert. Deshalb wurden zwei verschiedene Makroarray-Hybridisierungsexperimente mit den cDNA- AFLP-Fragmenten durchgeführt. 40 kodierenden Sequenzen für Gene mit unbekannter Funktion sowie eine breite Palette von Funktionen, einschließlich pflanzlicher Abwehr, wurden gefunden. Im zweiten Ansatz wurde die Identifizierung und Analyse induzierter Gene unter Ausnutzung eines in vitro-Systems durchgeführt, in dem gesunde und 'Ca. P. mali'-infizierte Gewebekultur-vermehrte Pflanzen unter kontrollierten Bedingungen gehalten wurden. Infektionsversuche mittels in vitro-Pfropfung von "Ca. P. mali "zeigten, dass der Resistenz-Phänotyp in diesem System reproduziert werden konnte. Darüber hinaus wurden ex vitro-Pflanzen erzeugt und dienten als unabhängige Kontrolle für die in vitro differentiell exprimierten Gene. Die cDNA-AFLP-Analyse in in vitro-Pflanzen ergab 63 Banden, die in infizierten Pflanzen von H0909 und MS überexprimiert waren. Der größte Teil (37%) der zugehörigen Sequenzen zeigte Homologie mit Produkten unbekannter Funktion. Die anderen Gene waren in pflanzlicher Abwehr, Energietransport bzw. Reaktion auf oxydativen Stress, Protein-Stoffwechsel und Zellwachstum involviert. Eine Real-time qPCR Analyse wurde durchgeführt, um die differentielle Expression der Gene zu validieren, welche in der cDNA-AFLP-Analyse gefunden wurde. Da keine internen Kontrollen für die Analyse der Genexpression in Malus zur Verfügung standen, wurde eine Analyse von Genen des Grundstoffwechsels durchgeführt. Die am stabilsten exprimierten Gene waren der Elongationsfaktor-1 α (EF1) und der eukaryotische Translationsfaktor 4A (eIF4A). Zwölf der 20 mittels qPCR untersuchten Gene wurden signifikant differentiell exprimiert, und zwar in mindestens einem Genotyp in in vitro- oder in ex vitro-Pflanzen. Für etwa 20% der Gene konnte ihr cDNA-AFLP Expressionsmuster in MS oder H0909 in in vitro- oder ex vitro- Pflanzen bestätigt werden. Dagegen zeigten 30% der Gene Unterexpression oder waren nicht differentiell exprimiert. Für die restlichen 50% der Gene wurde ein kontrastierendes Verhalten beobachtet. Die qPCR-Daten sind wie folgt interpretierbar: die Phytoplasma-Infektion führt zu einem Ungleichgewicht in der photosynthetischen Aktivität und der Photorespiration, in dem Gene, die in Prozessen wie Photosynthese und Elektronentransfer-Kette beteiligt sind, unterexprimiert werden. Im Ergebnis, und im Gegensatz zu M. x domestica Genotypen, wurde eine Überexpression von Genen der allgemeinen Reaktion auf Pathogene in MS gefunden. Die Identifizierung von Genen für die Produktion von H2O2 und von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen führte zu der Hypothese, dass die Resistenz auf der Akkumulation von H2O2 in MS basiert. Dies ähnelt einem als "recovery" beschriebenen Phänomen, bei dem eine spontane Remission der Symptome auf stochastische Weise in alten anfälligen Pflanzen beobachtet wird. Hingegen ist die Resistenz in MS eine induzierbare, aber stabile Reaktion. Als weiteres Produkt dieser Arbeit wurden drei cDNA-AFLP-Marker entwickelt, die eine unabhängige Verteilung in der Nachkommenschaft von zwei Kreuzungspopulationen zeigten und die mit einer genomischen Region von MS assoziiert wurden. Diese Marker werden zur Entwicklung molekularer Marker für die Resistenz sowie zur Kartierung der Resistenz im Malus-Genom beitragen
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-985
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-24264
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	194 S.
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