Authors:	Barthels, Fabian
Title:	Tools for the Design and Characterization of Covalent Cysteine Protease Inhibitors
Online publication date:	6-Apr-2022
Year of first publication:	2022
Language:	english
Abstract:	The research of covalent cysteine protease inhibitors is on the cutting edge of drug discovery, as the recent U.S. Food and Drug Administration’s approval of the very first registered inhibitor nirmatrelvir demonstrated that covalent inhibitors of this target class have finally arrived in reality. The repertoire of potential cysteine-reactive inhibitors was yet found to be tremendous and new chemotypes are constantly being discovered and characterized. In this regard, tuning the reactivity of the electrophilic warhead is essential for the successful development of cysteine protease inhibitors, and hence, the search for those is often synonymous with the quest for new covalent warheads. In this dissertation, novel warheads for addressing the catalytic cysteine residues of S. aureus sortase A and T. brucei rhodesiense cathepsin L (rhodesain) were developed and characterized. Rhodesain and sortase A each represent a drug target with disease relevance; rhodesain for the neglected parasite-borne African sleeping sickness and sortase A for antibiotic-resistant pathogenic Gram-positive bacteria such as S. aureus. However, rhodesain and sortase A are unrelated cysteine proteases that prefer different warhead chemotypes highlighted by their very distinctive catalytic mechanisms. In the course of this work, mechanistic investigations and optimizations of six warhead chemotypes were performed. Enzyme kinetic, biophysical, and quantum chemical methods were used to elucidate the underlying reaction mechanisms and to find rational approaches to increase biological effectiveness and selectivity. Disulfanylbenzamides and sulfonylpyrimidines were shown to be potent and selective irreversible inhibitors of the S. aureus sortase A, and these were investigated as novel resistance-preventing anti-virulence agents during cell-based biofilm inhibition experiments. Four additional rhodesain-targeting warheads were investigated, namely substituted naphthoquinones, fluorodinitroarenes, fluorovinyl sulfones, and vinylogous arginine Michael acceptors. The first three of which featured a covalent-reversible course of inhibition which proved to be an advantageous property across all chemotypes for avoiding off-target reactivity and cellular toxicity. Instrumental hurdles arose recurrently during the investigation of the new warhead entities which were addressed by the development of open-source hardware and software that contributed to the solution of synthetic and biochemical questions. The development of a liquid-handling and peptide synthesis robot (FINDUS), a differential scanning fluorometer (openDSF), and a web toolkit for crystallographic analysis of normalized B-factors (BANΔIT) highlight the focus of this work to invent chemical, technical, and conceptual tools for drug discovery. Die Erforschung kovalenter Cysteinprotease-Inhibitoren ist ein wichtiger Bestandteil der gegenwärtigen Wirkstoffforschung, denn die jüngste Zulassung des ersten registrierten Inhibitors Nirmatrelvir durch die US-amerikanische Food and Drug Administration hat gezeigt, dass kovalente Inhibitoren dieser Enzymklasse endlich in der Realität angekommen sind. Das Repertoire potenzieller Cystein-reaktiver Inhibitoren ist unerschöpflich und es werden ständig neue Chemotypen entdeckt und charakterisiert. In dieser Hinsicht ist die Modulation der Reaktivität des elektrophilen Warheads von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von klinisch-erfolgreichen Cysteinprotease-Inhibitoren. In dieser Dissertation wurden neuartige Warheads für die katalytischen Cysteinreste von S. aureus Sortase A und T. brucei rhodesiense Cathepsin L (Rhodesain) entwickelt und mechanistisch charakterisiert. Rhodesain und Sortase A stellen jeweils ein pharmakologisch-relevantes Zielenzym für eine humanpathogene Erkrankung dar. Rhodesain für die vernachlässigte, durch Parasiten übertragene Afrikanische Schlafkrankheit und Sortase A für antibiotikaresistente pathogene Gram-positive Bakterien. Rhodesain und Sortase A sind nicht miteinander verwandte Cysteinproteasen, die aufgrund ihres unterschiedlichen Katalysemechanismus recht unterschiedliche Warhead-Chemotypen bevorzugen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mechanistische Untersuchungen und Optimierungen von sechs verschiedenen Warhead-Chemotypen durchgeführt. Enzymkinetische, biophysikalische und quantenchemische Methoden wurden eingesetzt, um die zugrundeliegenden Reaktionsmechanismen aufzuklären und rationale Ansätze zur Verbesserung der biologischen Wirksamkeit und Selektivität zu finden. Disulfanylbenzamide und Sulfonylpyrimidine erwiesen sich als potente und selektive Inhibitoren der S. aureus Sortase A und wurden in zellbasierten Biofilm-Experimenten als neuartige resistenzarme Antivirulenz-Wirkstoffe untersucht. Vier weitere für Rhodesain entwickelte Warheads (substituierte Naphthochinone, Fluordinitroarene, Fluorvinylsulfone und vinyloge Arginin-Michael-Akzeptoren) wurden zudem mechanistisch untersucht. Dabei wiesen die drei erstgenannten einen kovalent-reversiblen Hemmmechanismus auf, was sich bei allen Chemotypen als vorteilhaftes Attribut zur Vermeidung von Off-Target-Reaktivität und zellulärer Toxizität erwies. Bei der Untersuchung der neuartigen Warheads traten immer wieder instrumentelle Hürden auf, die durch die Entwicklung von Open-Source-Hardware und -Software überwunden werden konnten, welche zur Lösung synthetischer und biochemischer Fragen beitrugen. Die Entwicklung eines Roboters zur Assayvorbereitung und Peptidsynthese (FINDUS), eines Differential-Scanning-Fluorometers (openDSF) und eines Web-Toolkits für die kristallografische Analyse normalisierter B-Faktoren (BANΔIT) verdeutlichen den Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Entwicklung chemischer, technischer und konzeptioneller Werkzeuge für die grundlegende Wirkstofferforschung.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6830
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-b58b6b6e-5d2c-4a1d-9008-5a866a2f917e5
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	VIII, 295 Seiten, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen