Authors:	Hertler, Jasmin
Title:	Synthesis, purification and testing of point-modified messenger RNA
Online publication date:	1-Apr-2022
Year of first publication:	2022
Language:	english
Abstract:	Ribonucleic acids (RNA) are involved in a huge variety of important cellular processes. They have been a subject of scientific research for decades now, and the huge variety of non-canonical nucleosides, namely modifications, that have been discovered, add another layer to the regulatory capabilities of the various RNA species. However, there are gaps in the knowledge regarding some aspects of point-modified messenger RNAs (mRNAs), as mechanistic studies have been performed mainly with short mRNA surrogates. This PhD thesis aims to develop a suitable synthesis method of point-modified mRNA to investigate the influence of modifications on translation efficiency. The mRNA of the enhanced green fluorescent protein with coupled internal ribosomal entry site (IRES-eGFP) served as a model and was first divided retrosynthetically into several fragments, with the middle fragment intended to introduce a modification into the mRNA with point accuracy. Subsequently, the mRNA was reconstituted in a 3 way one pot splint ligation and purified via the newly developed method of real time gel elution. The splint ligation approach was adapted from shorter RNA and adjusted to long RNA species. The purification method was investigated with respect to its practicability and safety against RNA damage, with particular emphasis on gel particles on the one hand and oxidative damage due to irradiation during elution on the other. The obtained point-modified mRNAs were analyzed with focus on the number and position of the respective modification. After confirmed correct incorporation of the desired modification and reconstitution of the full-length mRNA, the obtained modified mRNAs were translated in vitro and the protein yield was measured against the protein yield of an unmodified reference mRNA. In particular, 2'-O-methylations introduced into the Kozak sequence in and around the start codon revealed remarkable results for cap-independent IRES-driven translation, which had not been reported before. Ribonukleinsäuren (RNA) sind in eine große Anzahl wichtiger zellulärer Prozesse involviert. Seit Jahrzehnten werden sie wissenschaftlich erforscht und die riesige Vielfalt nicht-kanonischer Nukeloside, d.h. Modifikationen, die entdeckt wurden, ergänzen die Regulationsmöglichkeiten der verschiedenen RNA Spezies um eine weitere Ebene. Es gibt jedoch Wissenslücken in Bezug auf einige Aspekte punktmodifizierter Boten-RNAs (mRNAs), da mechanistische Studien hauptsächlich mit kurzen mRNA-Surrogaten durchgeführt wurden. Diese Promotionsarbeit zielt deshalb auf dieses Gebiet ab und diente dazu eine geeignete Synthesemethode von Punkt-modifizierten mRNA zu entwickeln um den Einfluss von Modifikationen auf die Translation hin zu untersuchen. Die mRNA des verbesserten grün fluoreszierenden Proteins mit gekoppelter interner ribosomalen Eintrittsstelle (IRES-eGFP) wurde als Model verwendet und es erfolgte zunächst die retrosynthetische Aufspaltung in mehrere Fragmente, wobei das mittlere Fragment dazu diente, eine Modifikation punktgenau in die mRNA einzubringen. Anschließend wurde die mRNA in einer „3-way-one pot“ Splint Ligation rekonstituiert und über die neu entwickelte „real-time“ Gel Elution aufgereinigt. Dabei wurde ein Ansatz der Splint Ligation von kürzeren RNA übernommen und auf lange RNA Spezies angepasst. Die verwendete Aufreinigung wurde hinsichtlich ihrer Praktikabilität und Sicherheit gegenüber RNA Schädigungen untersucht, dabei wurde besonders Wert auf noch vorhandele Gel Partikel einerseits und oxidative Schädigungen durch die Bestrahlung während der Elution andererseits gelegt. Die erhaltenen Punkt-modifizierten mRNAs wurden hinsichtlich der Anzahl und Position der jeweiligen Modifikation hin analysiert. Nach bestätigtem, korrektem Einbau der gewünschten Modifikation und Rekonstitution der volllängen mRNA wurden die erhaltenen modifizierten mRNAs in vitro translatiert und die Proteinausbeute mit der einer unmodifizierten Referenz mRNA verglichen. Dabei zeigten sich besonders bei 2‘-O-methylierungen die in die Kozak Sequenz in und um das Startcodon eingebracht wurden erstaunliche Ergebnisse für die Cap-unabhängige IRES-getriebene Translation, die so bisher noch nicht berichtete worden waren.
DDC:	000 Allgemeines 000 Generalities 500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6809
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-5078b633-7db7-4095-aa29-4f29505749776
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Extent:	xxiv, 141 Seiten (Illustrationen, Diagramme)
Appears in collections:	JGU-Publikationen