Authors:	Schülke, Stefan
Title:	Flagellin : allergen fusion proteins as novel vaccines for the treatment of severe type I allergies
Online publication date:	8-Jun-2011
Year of first publication:	2011
Language:	english
Abstract:	Over the last decades the prevalence of food allergies has continually increased on a world wide scale. While there are effective treatments available for bee and wasp venom allergic patients, there is currently no established therapy for the treatment of severe food allergies. Aim of the project was to genetically fuse different food allergens with the immune modulating Toll-like receptor 5 (TLR5)-ligand flagellin and to test these constructs for their immune modulatory capacities both in vitro and in vivo. Chicken ovalbumin (Ova) as model antigen, Pru p 3, and Ara h 2 the respective major allergens from peach and peanut were used as allergens. The potential vaccine candidates were characterized by protein biochemical methods (purity, folding, endotoxin contaminations). Moreover, their immune modulating effects on cell culture lines (TLR5-receptor activation) and primary mouse immune cells (myeloid and plasmacytoid dendritic cells) were investigated. Additionally, the prophylactic and therapeutic use of the flagellin Ova fusion protein (rflaA:Ova) were investigated in a mouse model of intestinal allergy. In myeloid dendritic cells (mDC) stimulation with the fusion proteins led to a strong cell activation and cytokine secretion. Here, the fusion proteins proved to be a much stronger stimulus than the equimolar amount of both proteins provided alone or as a mixture. Noteworthy, stimulation with rflaA:Ova induced the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 from mDC. In co-culture experiments this IL-10 secretion suppressed the Ova-induced secretion of Th1 and Th2 cytokines from Ova-specific CD4 T cells. Using MyD88-deficient mDC this repression of cytokine secretion was shown to be TLR-dependent. Finally, the potency of the rflaA:Ova construct was investigated in a mouse model of Ova-induced intestinal allergy. In a prophylactic vaccination approach rflaA:Ova was shown to prevent the establishment of the intestinal allergy and all associated symptoms (weight loss, temperature drop, soft faeces). This fusion protein-mediated protection was accompanied by a reduced T cell activation, and reduced Th2 cytokines in intestinal homogenates. These effects were paralleled by a strong induction of Ova-specific IgG2a antibodies in rflaA:Ova-vaccinated sera, while Ova-specific IgE antibody production was significantly reduced. Therapeutic vaccination with rflaA:Ova reduced allergic symptoms and T cell activation but did not influence weight loss and antibody production. In all in vivo experiments vaccination with both proteins either provided alone or as a mixture did not have comparable effects. Future experiments aim at elucidating the mechanism and further optimization of the therapeutic vaccination approach. The results presented in this thesis demonstrate, that fusion proteins containing flagellin have strong immune modulatory capacities both in vitro and in vivo. Therefore, such constructs are promising vaccine candidates for the therapy of type I allergies. Die Prävalenz von Lebensmittelallergien hat weltweit in den letzten Jahrzenten stark zugenommen. Während zum Beispiel für Wespen- oder Bienengiftallergiker wirksame Therapien verfügbar sind, gibt es zum momentanen Zeitpunkt keine etablierte Behandlung für schwere Lebensmittelallergien. Ziel des Projektes war es mit Hilfe gentechnischer Methoden verschiedene Lebensmittelallergene mit dem immunstimulierenden Toll-Like Rezeptor 5 (TLR5)-Liganden Flagellin zu fusionieren und deren immunmodulatorische Kapazität sowohl in vitro als auch in vivo zu ermitteln. Die verwendeten Allergene waren Hühner-Ovalbumin (Ova) als Modellantigen, sowie Pru p 3 und Ara h 2, die Hauptallergene aus Pfirsich und Erdnuss. Dabei wurden die potentiellen Vakzinkandidaten sowohl proteinbiochemisch (Reinheit, Faltung, Endotoxinkonzentration), als auch deren Effekte auf Zellkulturlinien (TLR5-Rezeptoraktivierung) und primäre Immunzellen (myeloide und plasmazytoide Dendritische Zellen der Maus) charakterisiert. Darüber hinaus wurde die Wirksamkeit der Fusionskonstrukte prophylaktisch und therapeutisch im Mausmodell untersucht. Für myeloide Dendritische Zellen (mDCs) konnte eine starke Aktivierung und Zytokinsekretion nach Stimulation mit dem Fusionskonstrukt nachgewiesen werden. Hierbei zeigte sich, dass das Fusionsprotein in Bezug auf Zellaktivierung und Zytokinsekretion einen sehr viel stärker Stimulus darstellte als die equimolare Menge beider Komponenten bereitgestellt entweder als Einzelproteine oder als Mixtur. Von besonderer Bedeutung war die Sekretion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10, welches in Ko-Kulturen mit Ova-spezifischen T-Zellen eine Repression der durch Ova-induzierten Sekretion von Th1 und Th2 Zytokinen bewirkte. Mittels MyD88 defizienter Mäusen konnte gezeigt werden, dass diese Repression TLR-abhängig ist. Abschließend wurde die Potenz des Konstrukts im Mausmodell untersucht. Hierbei kam ein Modell der akuten Ova-vermittelten intestinalen Allergie zum Einsatz. Dort konnte gezeigt werden, dass das Flagellin:Ovalbumin Fusionskonstrukt (rflaA:Ova) in der Lage war in einem prophylaktischen Ansatz die Entstehung der intestinalen Allergie und aller damit verbundenen Symptome (Gewichtsverlust, Temperaturabfall, Durchfall) zu verhindern. Der durch das Fusionsprotein vermittelte Schutz gegen die intestinale Allergie wurde begleitet von einer reduzierten T Zell Aktivierung, sowie verringerten Mengen an Th2 Zytokinen in Darmhomogenaten. Zusätzlich konnte in Seren Flagellin:Ovalbumin behandelter Tiere eine starke Induktion Ova-spezifischer IgG2a-Antikörper gemessen werden, während gleichzeitig die Produktion Ova-spezifischer IgE-Antikörper supprimiert wurde. Therapeutische Vakzinierung mit rflaA:Ova führte zu einer Reduktion der allergischen Symptome und T-Zellaktivierung, hatte aber keinen Einfluss auf Gewichtsverlust und Antikörperproduktion. In allen in vivo Experimenten zeigte eine Vakzinierung mit beiden Proteinen alleine oder als Mixtur keine vergleichbaren Effekte. Weitere Untersuchungen haben zum Ziel den Wirkmechanismus zu ermitteln und die Wirksamkeit des Konstrukts in einem therapeutischen Ansatz zu evaluieren. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass Flagellin-enthaltende Fusionsproteine eine starke immunmodulierende Wirkung sowohl in vitro als auch in vivo haben und deswegen vielversprechende Vakzinkandidaten für die Therapie von Typ I Allergien sind.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4795
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-27854
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen