Authors:	Murr, Angelika
Title:	Detektion und Synthese eines liganden-gesteuerten Ionenkanals im mikrofluidischen Analysesystem
Online publication date:	30-May-2011
Year of first publication:	2011
Language:	german
Abstract:	Membranproteine spielen eine wichtige Rolle bei physiologischen Prozessen wie Signalweiterleitung oder Immunreaktion. Deshalb stehen sie im Fokus der pharmakologischen Wirkstoffentwicklung und es besteht großes Interesse, Membranproteinbasierte Biosensoren zu entwickeln, die sich z.B. als Screening-Plattformen eignen. Allerdings stellt die Handhabung von Membranproteinen wegen ihrer amphiphilen Struktur eine große Herausforderung dar. Membranproteine werden meist in Zellkultur oder in bakteriellen Expressionssystemen synthetisiert. Diese Verfahren liefern aber oft nur eine geringe Ausbeute und erlauben wenig Kontrolle über die Expressionsbedingungen. Als alternativer Ansatz bietet sich stattdessen die in vitro Synthese von Proteinen an, die in einer zellfreien Umgebung stattfindet. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines miniaturisierten Analysesystems, das Aktivitätsmessungen an in vitro synthetisierten Ionenkanälen erlaubt. Dafür wurde ein Labon- Chip entwickelt, der elektrochemische und optische Nachweismethoden in parallelen Anätzen ermöglicht. Als amphiphile Umgebung für die Inkorporation von Membranproteinen wurden vier verschieden biomimetische Membranaufbauten hinsichtlich ihrer Dichtigkeit und ihrer Reproduzierbarkeit untersucht. Als Methode fanden insbesondere die Impedanzspektroskpie und die Oberflächenplasmonen-Resonanzspektroskopie Anwendung. Die peptide cushioned Bilyer Lipid Membranes (pcBLM) eignete sich dabei am besten für Untersuchungen an Membranproteinen. Zur Detektion der Ionenkanalaktivität wurde eine neue Messmethode etabliert, die auf der Messung der Impedanz bei fester Frequenz basiert und u.a. eine Aussage über die Änderung des Membranwiderstandes bei Aktivierung erlaubt. Am Beispiel des nicotinischen Acetylcholinrezeptors (nAchR) konnte gezeigt werden, dass sich die Aktivität von Ionenkanälen mit dem entwickelten Chip-System nachweisen ließ. Die Spezifität der Methode konnte durch verschiedene Kontrollen wie die Zugabe eines nicht-aktivierenden Liganden oder Inhibition des Rezeptors nachgewiesen werden. Weiterhin konnte die in vitro Synthese des Ionenkanals a7 nAchR durch Radioaktivmarkierung nachgewiesen werden. Die Inkorporation des Rezeptors in die biomimetischen Membranen wurde mit Immunodetektion und elektrochemischen Methoden untersucht. Es zeigte sich, dass die funktionelle Inkorporation des a7 nAchR davon abhing, welcher biomimetische Membranaufbau verwendet wurde. Membrane proteins play imortant roles in various physiological proesses like signal transduction or immunoreaction. Moreover they represent the vast majority of drug targets. This leads to a huge interest in developing membrane protein-based biosensors that can be used for example as screening platforms. Nevertheless the handling of membrane proteins is rather difficult due to their amphiphilic structure. Mostely they are expressed in cell lines or bacterial expression systems. This often results in low yields of purifyed protein and allows little control over the expression conitions. An alternative strategy is the in vitro expression of proteins in a cell-free environment. The aim of the work was the development of a miniaturized analysis system that allows the activity detection of in vitro expressed ion channels. Therefore a lab-on-chip was developed that could be used simultaneously for electrochemical and optical detection. As amphiphilic environment for membrane proteins four biomimetic membranes were tested. Their density and reproducibility were examined by impedance spectroscopy and surface plasmon resonance spectroscopy. Among the four tested membranes the so called peptide cushioned bilayer lipid membrane (pcBLM) could be identified as the most suitable for ion channel detection. For the measurement of ion channel activity a new electrochemical method was established that provides information about the changes in membrane resistence. With the nicotinic acetylcholine receptor (nAchR) as a model protein it was demonstrated that the analysis system could be applied or the detection of ion channel activity. The specifity of the metod was verified by different controls like addition of a non-binding ligand or inhibition of the protein. The in vitro expression of the ion channel a7 nAchR was shown by radioactive labelling.The incorporation of the receptor was analysed by immunodetection and electrochemical methods. It was found that the functional incorporation of the a7 nAchR depended on the type of the biomimeic membrane.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4792
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-27826
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen